Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Faculdade de Medicina

Programa de Ps-Graduao em Medicina: Cincias Mdicas

COMPARAO DOS RESULTADOS DE HEMOGRAMAS DO CONTADOR ELETRNICO ABX PENTRA 60 COM A

MICROSCOPIA.

Felipe Goulart Monteiro

Orientadora: Lcia Mariano da Rocha Silla

Porto Alegre

2005

2

COMPARAO DOS RESULTADOS DE HEMOGRAMAS DO CONTADOR ELETRNICO ABX PENTRA 60 COM A MICROSCOPIA.

Felipe Goulart Monteiro

Dissertao apresentada como exigncia para a obteno do titulo de Mestre em Cincias Mdicas pelo Programa de Ps-Graduao em Medicina: Cincias Mdicas da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.

Orientadora: Lcia Mariano da Rocha Silla

Porto Alegre 2005

3

Ficha Catalogrfica

G694c Monteiro, Felipe Goulart Comparao dos resultados de hemogramas do contador

eletrnico ABX PENTRA 60 com a microscopia / Felipe Goulart Monteiro ; orient. Lcia Mariano da Rocha Silla. 2005.

90 f. ; il.

Dissertao (mestrado) Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Faculdade de Medicina. Programa de Ps-Graduao Medicina: Cincias Mdicas. Porto Alegre, BR-RS, 2005.

1. Contagem de clulas sangneas 2. Microscopia 3. Testes hematolgicos : Instrumentao I. Silla, Lcia Marian da Rocha II. Ttulo.

NLM: QY 402 Catalogao Biblioteca FAMED/HCPA

4

DEDICATORIA

Dedico este trabalho aos meus pais Odilmar Figueiredo Monteiro e Arcilete A.

Goulart Monteiro, aos meus irmos Odilon Monteiro Neto e Ana Paula Goulart

Monteiro e a minha namorada Roberta de Novaes.

5

AGRADECIMENTOS

Agradeo a minha orientadora, Lcia Mariano da Rocha Silla, que no hesitou em

aceitar este projeto, investindo tempo, carinho e dedicao na sua execuo.

Agradeo ao Alan Birck, pela importante colaborao na anlise estatstica e por

sua amizade.

Agradeo em especial aos colegas Celito Luiz Diel, Nicole Rego de Aquino e

Rafael Moresco pelas dicas e auxilio nesta dissertao. Por sua amizade e auxilio

nas horas mais difceis. Aos amigos Rodrigo Herscovitz, Gustavo Galant Vollmer e

Rafael Failace por suas amizades e apoio para a realizao deste estudo.

Agradeo a Bioqumica Alzira do Carmo Aquino, proprietria do Laboratrio Unilab,

que possibilitou este estudo no seu servio, bem como os demais funcionrios.

Agradeo ao curso de Ps-Graduao em Medicina: Cincias Mdica da

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, bem como seu corpo docente e

funcionrios pelo auxlio e desenvolvimento que contriburam para a concretizao

deste projeto.

Agradeo a Imensido Azul

6

SUMRIO

SUMRIO............................................................................................................................ vi LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................... viii

LISTA DE TABELAS............................................................................................................ xi

LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................................ xii

I INTRODUO............................................................................................................... 14 II REVISO BIBLIOGRFICA........................................................................................... 16

II.1. HEMATOPOESE ......................................................................................................... 16

II.2. CLULAS SANGUNEAS ........................................................................................... 18 II.2.1. Clulas Vermelhas ................................................................................................... 18

II.2.2. Clulas Brancas ....................................................................................................... 18

II.2.3. Plaquetas ................................................................................................................. 19

II.3. COLETA DE HEMOGRAMA ........................................................................................ 19

II.4. ESFREGAO SANGUNEO EM LMINA ................................................................... 22 II.5. COLORAO DO ESFREGAO ................................................................................ 24 II.6.CARACTERSTICAS DAS CLULAS SANGUNEAS ................................................... 25 II.6.1. Clulas Vermelhas .................................................................................................... 25

II.6.1.1 Principais anemias ................................................................................................. 28

II.6.2 Clulas brancas ......................................................................................................... 30

II.6.2.1.Neutrfilo ................................................................................................................ 30

II.6.2.2 Basfilo .................................................................................................................. 32

II.6.2.3 Eosinfilo ................................................................................................................ 33

7

II.6.2.4. Linfcito.................................................................................................................. 34

II.6.2.5 Moncito ................................................................................................................. 36

II.6.2.6 Principais desordens dos leuccitos........................................................................ 37

II.6.2.6.1 No proliferativas ................................................................................................. 37

II.6.2.6.2 Proliferativas ........................................................................................................ 38

II.6.3 Plaquetas................................................................................................................... 39

II.6.3.1 Principais desordens das plaquetas ........................................................................ 40

II.6.3.1.1 Trombocitopenia..................................................................................................... 40

II.6.3.1.2 Trombocitose.......................................................................................................... 40

II.7. METODOLOGIAS EM HEMATOLOGIA......................................................................... 41

III OBJETIVOS ................................................................................................................ 47

III.1. OBJETIVOS GERAIS ................................................................................................. 47

II.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS ........................................................................................ 47

IV REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................................ 48

Comparison Of Counter Abx Pentra 60 Automated Analysis Of Blood Cells And

Blood Smear Microscopy Examination ........................................................................... 53

Comparao Dos Resultados De Hemogramas Do Contador Eletrnico Abx Pentra 60

Com A Microscopia............................................................................................................. 72

8

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Hematopoese: Esquema simplificado da diferenciao das clulas hematopoticas

(modificado de Zago, 2001). ............................................................................................... 17

Figura 2: Veias anticubitais utilizadas na coleta de sangue perifrico (A), puno venosa utilizando seringa e agulha (B), Puno venosa a vcuo (modificado de Bain, 2004)...................................................................................................................................... 20

Figura 3: Demonstrao das reas para coleta de sangue capilar feito com lanceta em

coletas difceis/crianas (modificado de Bain, 2004)............................................................. 22

Figura 4: Distenso sangunea em lmina de vidro 24 X 76 mm (modificado de Bain,2004).............................................................................................................................. 23

Figura 5: Distenso sangunea em lmina com ngulo de 25 a 30 (modificado de

Bain,2004).............................................................................................................................. 23

Figura 6: Diagramas do modo de percorrer as distenses de sangue para contagem

diferencial de leuccitos: a) leitura ao longo da distenso, b) mtodo em Ameia, c) mtodo em Ameia modificado (modifcado de Bain, 2004)................................................................. 25

9

Figura 7: Clulas vermelhas em indivduo normal (modificado de Heckner, 2000)...................................................................................................................................... 26

Figura 8: Microcitose (VCM de 62 fl) (modificado de Bain, 2004). ...................................... 27

Figura 9: Macrocitose (VCM de 105 fl) (modificado de Bain, 2004). ................................... 27

Figura 10: Neutrfilo do sangue perifrico de indivduo sadio (modificado de Bain, 2004)...................................................................................................................................... 31

Figura 11: Basfilo do sangue perifrico de indivduo sadio (modificado de Heckner, 2000)...................................................................................................................................... 33

Figura 12: Eosinfilo do sangue perifrico de indivduo sadio (modificado de Heckner, 2000)...................................................................................................................................... 34

Figura 13: Linfcito do sangue perifrico de indivduo sadio (modificado de Heckner, 2000)...................................................................................................................................... 35

Figura 14: Moncito do sangue perifrico de indivduo sadio (modificado de Heckner, 2000)...................................................................................................................................... 36

Figura 15: Plaquetas do sangue perifrico de indivduo sadio (Heckner, 2000).................. 39

10

Figura 16: Metodologia de impedncia (Clinical Case Studies)........................................... 41

11

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Alteraes hematolgicas no identificadas pelos contadores

eletrnicos.............................................................................................................................. 45

Tabela 2 Parmetros numricos de limites do servio de hematologia do Unilab

(Laboratrio de Unidos de Pesquisas Clnicas Ltda Porto Alegre RS BR).................... 46

ARTIGO

Tabela I: Valores de concordncia (Kappa), modificada de Dawson 2001................................................................................................................................60 e 80

Tabela II: Correlao entre trs analistas clnicos, com os respectivos valores de

concordncia..................................................................................................................61 e 81

Tabela III: Alteraes de WBC do mtodo automtico e do mtodo manual................63 e 82

Tabela IV: Correlao entre ABX Pentra 60 (Franca) e a microscopia ptica, mostrando valores de correlao (Kappa).......................................................................................64 e 83

12

ABREVIATURAS

AIDS Sndrome da imuno deficincia humana

ALL Leucemia linfide aguda

CHCM Concentrao hemoglobnica corpuscular mdia

CID coagulao intravascular disseminada

CLL Leucemia linfide crnica

CTH Clula tronco hematopotica

DHSS Sistema Seqencial Hidrodinmica Duplo

DNA cido Desoxirribonuclico EDTA Etilenodiaminotetractico

EPIs Equipamentos de proteo individual

fl fentolitro

FLAGS Alarmes patolgicos

G6PD glicose 6 fosfato desidrogenase

GP IIb Glicoprotena II b

GP IIIa Glicoprotena III a

HbA hemoglobina A

HCM Hemoglobina corpuscular mdia

HDNB doena hemoltica do recm nascido

HGB hemoglobina

HTC hematcrito

IgE Imunoglobulina E

LMA Leucemia mielide aguda

13

LMC Leucemia mielide crnica

LIC/RM Clulas Imaturas

MDSS Sistema de Multi-distribuio de amostras

mm milmetros

PBM Protena Bsica Maior

PLQ Plaquetas

PNH Hemoglobinria Paroxstica Noturna

PTI prpura trombocitopenia idioptica

PK piruvato kinase

NK natural killer

RBC Eritrcitos

RDW Amplitude de distribuio (volumtrica) dos eritrcitos RNA cido ribonuclico SPSS Statistical parckage for the social sciences

WBC Leuccitos

VCM Volume corpuscular mdio

m micrmetro

14

I. INTRODUO

O hemograma o exame laboratorial de rotina para avaliao qualitativa e

quantitativa dos elementos figurados do sangue perifrico, sendo um dos exames mais

solicitados para obteno de diagnsticos, avaliaes clnicas e acompanhamento evolutivo

das diversas doenas humanas. O exame completo deve conter o eritrograma, o

leucograma, a contagem de plaquetas e uma descrio da observao da lmina ou

esfregao sanguneo. O hemograma um coadjuvante til em todos os setores da clnica, e um toque final do especialista o transforma numa abrangente lista de dados e valores para o

diagnstico final do mdico.

A metodologia manual para contagem dos leuccitos foi utilizada isoladamente por

um longo perodo. Aps o advento da Automao, surgiram trabalhos cientficos

questionando os mtodos de automao e manual.(Rumke, 1985; Dutcher, 1985; Nakul, 2003).

Desde a introduo da tecnologia com automao na dcada de 50, surgiram vrios

equipamentos que permitiram aos laboratrios agilidade para a liberao de resultados. Isto

culminou na dcada de 80, na fabricao de modelos altamente sofisticados que permitiam

aspirar, diluir e fornecer toda a srie de parmetros numricos. A partir de ento, abriu-se

uma nova era em hematologia laboratorial. Sem a velocidade e habilidade dos modernos

contadores automatizados em hematologia, os laboratrios clnicos seriam incapazes de

analisar eficientemente o grande volume de amostras que recebem diariamente. Os

instrumentos automatizados oferecem alta sensibilidade e preciso na quantificao das

clulas sanguneas (Ryan, 1995), bem como na contagem diferencial de leuccitos, sendo que desde 1980 o uso da anlise diferencial de leuccitos automatizada tem se tornado

comum em grande nmero de laboratrios (Matsuno & Ishizuka, 1998).

15

No entanto, algumas amostras analisadas pelos contadores automatizados de

clulas ainda requerem avaliao atravs do esfregao de sangue perifrico para permitir a

observao de anormalidades morfolgicas (Ryan, 1995). Atualmente, na maioria dos laboratrios que utilizam contadores eletrnicos, a microscopia s realizada em casos

selecionados, de acordo com o protocolo local. (Toledo, 2002).

Mesmo com a tecnologia eletrnica a observao do analista clnico ao microscpio

ainda indispensvel. Os elementos celulares patolgicos chegam a ser registrados pelo

aparelho, porm no so identificados sob o ponto de vista qualitativo. Comea aqui o

campo do diagnstico visual atravs do microscpio. O exame junto ao microscpio exige uma rigorosa disciplina, deve-se relacionar os dados da automao com os da microscopia

e julgar se so condizentes (Arroyo, 2005). Devido a disseminao do uso da automao para a contagem e anlise das clulas sanguneas desejvel que dentro de cada servio se estabelea um procedimento operacional padro, no sentido de determinar quais as

amostras que devem ser analisadas pelo microscpio tico.

A metodologia de automao tem sido cada vez mais utilizada nos laboratrios de

anlises clnicas. Este estudo vem contribuir com os j existentes sobre o analisador

automtico ABX Pentra 60(Montpellier Frana), estabelecendo um protocolo de liberao

direta, ou seja; sem anlise microscpica para esse equipamento no servio do laboratrio Unilab e quantificar a necessidade de profissionais habilitados no setor de hematologia.

16

II. REVISO BIBLIOGRFICA

II.1. HEMATOPOESE

O sangue total constitudo de uma poro acelular (plasma) e outra celular. O plasma corresponde a 55% do volume do sangue, sendo que 92% gua e 8% de

protenas, sais e outros. A poro celular corresponde 45% do volume total do sangue e

composto por glbulos vermelhos, brancos e plaquetas.

As clulas sanguneas so oriundas da clula me, ou clula tronco (stem cell), hematopotica (CTH), a qual possui alta capacidade de renovao e diferenciao. As CTH so encontradas na medula ssea, sangue perifrico e cordo umbilical. Nos adultos so

mais encontradas nos ossos esponjosos, externo, ossos ilacos e costelas. J na fase pr-natal a CTH encontrada em quase todos os ossos at seis meses de idade (Weissman, 2000).

Existem trs perodos na hematopoese durante a gestao: perodo embrionrio que

dura aproximadamente at o terceiro ms de vida fetal e ocorre no saco vitelno, perodo

hepatoesplnico que predomina do quarto ao sexto ms de vida fetal e o perodo medular,

quando de forma progressiva, a cavidade medular dos ossos passa a ser o stio preferencial

da hematopoese (Rego, 2001).

17

Um adulto normal produz por dia 6 bilhes de clulas por quilo, 2,5 bilhes de

eritrcitos, 1 bilho de leuccitos e 2,5 bilhes de plaquetas. Em condies normais a

hematopoese (proliferao e diferenciao) ocorre na medula ssea, garantindo o nmero de clulas maduras na circulao (Rego, 2001).

As clulas sanguneas podem ser de origem mielide, que se diferenciam para as

linhagens granulocticas, eritrocitrias, monocitrias e megacariocitrias, ou de origem

linfide, que se diferenciam em linfcitos T e B (figura 1).

Figura 1: Hematopoese: Esquema simplificado da diferenciao das clulas hematopoticas (modificado de Zago, 2001).

18

II.2. CLULAS SANGUNEAS

II.2.1. Clulas Vermelhas

As clulas sanguneas vermelhas so as mais abundantes no corpo. A contagem

normal das clulas est entre 4,5 e 6,5 milhes de clulas/mm3. Embora as hemcias sejam clulas anucleadas, constitudas apenas por uma membrana plasmtica e citoplasma, so

bastante complexas. Originam-se na medula ssea pela proliferao e maturao dos

eritroblastos, fenmeno chamado de eritropeoese, regulado pela eritropoetina que o

principal fator de crescimento envolvido (Zago, 2001).

Os eritrcitos ou hemcias normais, tm forma de disco circular e bicncavo. Essa

forma nica permite a clula ter uma rea superficial muito maior onde a troca gasosa

ocorrer. A hemoglobina a protena responsvel por esta funo. A hemoglobina constitui

95% das protenas das hemcias. No adulto a hemoglobina encontrada nas hemcias

predominantemente a hemoglobina A (HbA) (Vallada, 1988).

II.2.2. Clulas Brancas

Os leuccitos ou glbulos brancos (WBC), formam o grupo mais heterogneo de clulas do sangue, tanto do ponto de vista morfolgico quanto fisiolgico. Embora os

leuccitos desempenhem papel pela defesa do organismo, cada subtipo detm funes

bastante especficas e distintas entre si, que em conjunto, estruturam o sistema imunolgico. So classificados em dois grupos principais, os granulcitos (que tem grnulos no citoplasma das clulas) e os agranulcitos, que no possuem grnulos. Dos granulcitos

19

destacamos os neutrfilos, basfilos e os eosinfilos, e dos agranulcitos, os linfcitos,

plasmcitos e moncitos (Nascimento, 20022).

II.2.3. Plaquetas

Megacariocitopoese o processo celular de proliferao (por citocinas pleiotrpicas) e diferenciao dos megacaricitos, levando a produo de plaquetas. A produo diria em

um adulto normal chega a 100 trilhes de clulas (Wendling, 1999; Italiano, 1999). As plaquetas vivem em mdia cerca de 10 dias na circulao sangunea. Elas tm as

funes de hemostasia e coagulao sangunea (conteno inicial do sangue) (Hanson, 1985).

II.3. COLETA DO HEMOGRAMA

A coleta de material de fundamental importncia para a realizao de um

hemograma. Esta pode ser feita a qualquer hora do dia, evitando apenas coletas feitas aps

as refeies e duas horas aps exerccios. No adulto o sangue geralmente coletado de

veias da fossa antecubital (figura 2), com agulha e seringa ou tubo a vcuo. Nos adultos as seringas utilizadas so 25 X 8 mm ou 25 X 9 mm com agulhas com 0,9 e 0,8 mm de calibre.

Para as crianas as agulhas utilizadas so de 25 x 6 mm ou 25 X 7 com 0,7 e 0,6 mm de

calibre (ICSH, 1993).

20

A) B)

C)

Figura 2: Veias anticubitais utilizadas na coleta de sangue perifrico (A), puno venosa utilizando seringa e agulha (B), Puno venosa a vcuo (modificado de Bain, 2004).

Um anticoagulante deve ser utilizado para impedir a coagulao do sangue devido

sua remoo do corpo. O (EDTA) Etilenodiaminotetractico o anticoagulante mais utilizados nos laboratrios de hematologia, pois preserva melhor o volume celular e

morfologia, alm de permitir um tempo de estoque mais longo com pouco efeito sobre a

estabilidade da amostra. Amostras colhidas em postos distantes podem ser feitos com

preciso pelo analisador automtico em at 8 horas se for hemograma normal e at 6 horas

se no for hemograma normal (Gallo Rocha, 1997). Heparina (alguns testes bioqumicos e

21

hematolgicos), citrato de sdio (coagulao), fluoretode sdio (alguns testes bioqumicos) so anticoagulantes adicionais usados para procedimentos especializados (Dale, 1998).

A veia cubital mediana a preferida, por ser mais grossa e firme, mas a ceflica e a

baslica so igualmente satisfatrias. Para evidenciar a veia para a coleta, utiliza-se garrote,

que deve ser colocado 10 cm acima do local da puno, por no mximo 1 minuto, pois, a

hemoconcentrao provoca 2% de aumento das cifras hematimtricas (Van Kampen, 1983; Mull, 1993). Logo aps a escolha do local de coleta feita a assepsia do local utilizando

lcool a 70%. A agulha deve ser introduzida na veia escolhida com um ngulo de 15. Logo

que o sangue inicie sua entrada para a seringa o garrote solto e a coleta deve ser feita

lentamente para evitar hemlise. Aps retirada da agulha, uma presso com o dedo polegar

em um algodo por cinco minutos sem dobrar o brao importante para que no ocorra

leses no paciente. Dano ao nervo cutneo antebraquial lateral uma rarssima

complicao da puno das veias da fossa antecubital. (Sander, 2004). A lmina com o esfregao sanguneo deve ser feita no ato da coleta (Gallo Rocha, 1997).

Em recm nascidos, lactentes e adultos com veias de difceis acessos, pode ser

necessria a coleta de sangue por puno na pele, chamado de sangue capilar ou

arteriolar, ou coleta em artrias (desaconselhvel). O sangue capilar pode ser obtido atravs de um ferimento causado por uma lanceta na superfcie plantar do calcanhar e

lbulo da orelha (em bebs e crianas com menos de 2 anos), e em crianas maiores e adultos nos dedos das mos (figura 3). A coleta feita por lanceta pode dar resultados falso-positivos, como contagem de plaquetas mais baixas, os ndices hematimtricos 17% mais

altos e contagem de leuccitos 20% mais altas (Brecher, 1953).

22

A) B) Figura 3: Demonstrao das reas para coleta de sangue capilar feito com lanceta em coletas

difceis/crianas (modificado de Bain, 2004).

II.4. ESFREGAO SANGUNEO EM LMINA

O material coletado encaminhado para o setor de hematologia onde ser

processado (leitura automtica e anlise do esfregao). Para realizar uma boa distenso sangunea deve-se utilizar lminas de vidro 24 X 76 mm limpas e desengorduradas (figura 4). Uma gota de sangue colocado com auxlio de um tubo capilar prximo extremidade

23

da lmina, com uma lmina distensora aplicado um ngulo de 25 a 30, e com um

movimento suave e uniforme distende-se o sangue (figura 5).

figura 4: Distenso sangunea em lmina de vidro 24 X 76 mm (modificado de Bain, 2004).

Figura 5: Distenso sangunea em lmina com ngulo de 25 a 30 (modificado de Bain, 2004).

24

II. 5. COLORAO DO ESFREGAO

Aps distenso, a lmina segue para a colorao. Este um dos passos mais

importantes na identificao de unidades celulares. A finalidade da colorao facilitar a

observao microscpica de clulas e diferenci-las de acordo com suas caractersticas

tintoriais. Para este fim, utiliza-se componentes essenciais dos corantes de Romanowsky

(criador do corante) (Wittekind, 1979). Compe os componentes: bsico (catinico), como azul de metileno, que confere cor azul aos cidos nuclicos cido desoxirribonuclico (DNA) e cido ribonuclico (RNA), s nucleoprotenas, aos grnulos dos basfilos e, fracamente, aos grnulos dos eosinfilos. Alm do corante cido (aninico), como o eosinato de violeta, que confere cor laranja hemoglobina. Os dois corantes so usualmente dissolvidos em lcool metlico para fixao. Esta colorao tambm chamada de Giemsa (Savi, 2002).

No esfregao sanguneo j corado as clulas sanguneas (eritrcitos, leuccitos e plaquetas) comeam a ser analisadas do ponto de vista qualitativo, com a anlise microscpica das clulas sanguneas. A anlise do esfregao pode ser feita de trs

maneiras: ao longo da disteno, mtodo de Ameia e mtodo de Ameia modificado (figura 6).

25

Figura 6: Diagramas do modo de percorrer as distenses de sangue para contagem diferencial de leuccitos: a) ao longo da distenso, b) mtodo em Ameia, c) mtodo em Ameia modificado (modifcado de Bain, 2004).

II.6. CARACTERSTICAS DAS CLULAS SANGUNEAS

II.6.1. Clulas Vermelhas (RBC)

Os eritrcitos apresentam um contorno circular com dimetro mdio de 7,5 m, com

uma rea central mais plida ocupando um tero da clula (figura 7). Nesse elemento celular podem acontecer alteraes quanto ao seu nmero, tamanho, forma, distribuio e

colorao (Vallada, 1988).

O eritrograma definido por trs valores primrios: hematcrito em percentual (HTC), hemoglobina em gramas por decilitro (HGB) e concentrao das hemcias por unidade de volume em mm3 (RBC), e trs valores chamados de ndices hematimtricos, que so calculados, ou obtidos pela anlise dos valores primrios: volume corpuscular mdio

26

medido em fentolitro (VCM), hemoglobina corpuscular mdia medida em picograma (HCM) e concentrao hemoglobnica corpuscular mdia, medida em gramas por decilitro (CHCM) ou percentagem (Van Kampen, 1983). O VCM calculado pela frmula VCM = HTC/RBC, o HCM calculado pela frmula HCM = HGB/RBC e o CHCM calculado pela frmula CHCM

= HGB/HTC.

Figura 7: Clulas vermelhas em indivduo normal (modificado de Heckner, 2000).

Sob condies normais todos os RBCs possuem volume, forma e colorao

semelhantes. Estas caractersticas so refletidas nos ndices hematimtricos, descritos

acima (VCM, HCM, CHCM) e no red cell distribution width (RDW), ou amplitude de distribuio dos eritrcitos. Este ltimo um dado obtido apenas na automao, por um

clculo, e estima o grau de anisocitose das hemcias.

De acordo com os ndices primrios podemos ter eritrcitos normocticos (VCM 80 100 fl), macrocticos (VCM > 100fl), microcticos (VCM < 80fl). O ndice de anisocitose (vrios tamanhos ao mesmo tempo) obtido pelo RDW. Microcitose (figura 8) e macrocitose (figura 9) podem ser encontrados nas anemias hipocrmicas, talassemias e anemias

27

refratrias, respectivamente (Willians, 1976). No exerccio da clnica, resultados com alteraes microcticas e macrocticas devem ser bem valorizados e estudados

(Nascimento, 2001).

Figura 8: Microcitose (VCM de 62 fl) (modificado de Bain, 2004).

Figura 9: Macrocitose (VCM de 105 fl) (modificado de Bain, 2004).

28

As clulas vermelhas podem ser classificadas do ponto de vista da colorao como:

normocrmicas (tem a quantidade normal de hemoglobina), hipercrmicas (maior intensidade de cor que o normal), hipocrmicas (clulas plidas) e anisocromia (variabilidade no grau de colorao). Essas alteraes podem ser expressas pelo HCM que informa a quantidade de hemoglobina dentro das hemcias.

Pecilocitose o termo utilizado quando h um nmero exagerado de clulas de

forma anormal (pecilcitos). Destas variaes destacam-se: esferocitose, eliptocitos, ovalcitos, dacricitos, equincitos, acantcitos, estomatcitos, drepancitos e clulas alvo

(Coutinho, 2001).

Existem muitas condies que contribuem para desordens das clulas vermelhas. A

desordem mais comum que afeta a clulas vermelhas a anemia, ou decrscimo na

quantidade de clulas sanguneas e/ou hemoglobina. H uma grande variedade de causas

abrangendo de perda de sangue crnica a deficincias nutricionais.

II.6.1.1. Principais Anemias

Anemia devido perda de sangue

Aguda: perda repentina de sangue com choque (principalmente no trato gastrointestinal como lceras etc);

Crnica: perda de sangue crnica e em pequenas quantidades;

29

Anemia devido deficincia de fatores de clulas vermelhas

Deficincia de nutriente essencial: (ferro, vitamina B12 e cido flico / folato). Se qualquer um desses nutrientes no est disponvel em quantidade

suficiente atravs da ingesto ou se h um problema de metabolismo ou

absoro, resulta em anemia. So normalmente referidas como anemias por

deficincia de ferro ou anemias megaloblsticas;

Outras desordens: funo renal, funo do fgado, funo de sistema

endcrino, infiltrao na medula ssea.

Anemia aplstica

Anemia sideroblstica

Anemia devido deficincia na produo de clulas vermelhas

Desordens de membrana

Esferocitose hereditria

Eliptocitose hereditria

Estomatocitose hereditria

Hemoglobinria Paroxstica Noturna (PNH)

Desordens de hemoglobina: hemoglobinopatias - Ex: Doenas de

hemoglobinas S, C, D e E, onde a mais comum a anemia falciforme,

talassemias (beta talassemia a mais comum)

Desordens metablicas (mais comuns so: glicose 6 fosfato desidrogenase (G6PD) e piruvato kinase (PK)

30

Desordens adquiridas ou extrnseca: agentes qumicos (chumbo), agentes infecciosos (malria), agentes fsicos (substituio da vlvula cardaca), venenos de animais e anemia imuno-hemoltica (doena hemoltica do recm nascido: HDNB)

II.6.2.Clulas Brancas (WBC)

II.6.2.1. Neutrfilo

Os granulcitos neutrfilos, ou simplesmente neutrfilo, so assim chamados pela

sua tonalidade neutra nas coloraes de Romanowsky. Tem como principal funo prevenir

ou retardar infeces e ainda evitar a ao de agentes estranhos por fagocitose (processo de ingesto de pequenas partculas para dentro da clula, digesto enzimtica e expulso

dos resduos). Tambm so importantes nos processos inflamatrios quando essas clulas migram rapidamente para o local da inflamao fazendo quimiotaxia (Falco, 2001).

O neutrfilo maduro mede de 12 a 15 m de dimetro. O citoplasma acidfilo, com

muitos grnulos finos. O ncleo possui cromatina em grumos, sendo dividido em 2 a 5

lbulos distintos, ligados por estreitos filamentos de heterocromatina densa, limitados pela

membrana nuclear (figura 10). O ncleo tende a adotar uma disposio aproximadamente circular, pois, na clula viva, os lbulos nucleares esto dispostos em crculo ao redor do

centrossomo. Na mulher pode se ver o drumstik, um apndice em baqueta de tambor, ou

em gota, projetando-se do ncleo de uma pequena percentagem de clulas. No corpo humano estas clulas tm uma vida mdia de 7 a 6 horas (Bain, 2004).

31

Figura 10: Neutrfilo do sangue perifrico de indivduo sadio (modificado de Bain, 2004).

Os estgios de maturao entre o mieloblasto e metamielcito apresentam-se

predominantemente na medula ssea e no so encontrados normalmente no sangue

perifrico, exceto em situaes patolgicas. Os neutrfilos bastonetes so encontrados em

pequena quantidade no sangue perifrico em condies normais. Entre as principais

alteraes e anormalidades que podem estar presentes no ncleo dos neutrfilos

destacamos abaixo.

Desvio a esquerda: gravidez, infeco, hipoxia e choque

Hipersegmentao: eritropoese megaloblstica, deficincia de ferro, uremia e

infeco

Hiposegmentacao: anomalia de Pelger-Huet, bilobulados com anomalias

congnitas, anomalia de Pelger-Huet adquirida

Aumento de projees nucleares: sndrome de Turner

Ncleo em anel: (LMC) leucemia mielide crnica, (LMA) leucemia mielide aguda, anemia megaloblstica

32

Entre as principais alteraes e anormalidades do citoplasma dos neurfilos

destacamos:

granulao reduzida: sndromes mielodisplsicas, deficincia congnita da

lactoferrina

Granulao aumentada: gravidez, infeco, inflamao, anemia aplstica,

anomalia de Alder Reilly, leucemia neutroflica crnica

Vacuolizao: infeco, intoxicao alcolica, anomalia de Jordan, deficincia

de carnitina.

Corpos de Dohle: infeces, inflamao, queimadura, gravidez, LMA,

sndromes mielodisplsicas, anomalia de May-Hengglin

Material fagocitado: infeces bacterianas e fngicas, malria, leishmaniose,

mieloma mltiplo, carcinomas, tumor de Wilms, lpus eritematoso sistmico.

II.6.2.2. Basfilo

Os basfilos so capazes de realizar fagocitose, mas no est certo que esta seja sua principal funo. Pela possibilidade de liberar histamina para fora das clulas, acredita-

se que eles tenham funo secretora, tambm parecem estar envolvidos em reaes de

hipersensibilidade imediata (pois possuem receptores IgE em sua membrana), como asma alrgica e algumas reaes de hipersensibilidade tardia como alergias de contato. Seu

tamanho semelhante ao do neutrfilo, medindo de 10 a 14 m de dimetro, apresentam

ncleo central com 2 ou 3 lbulos, com tamanho intermedirio entre os dos neutrfilos e o

dos eosinfios. O citoplasma abundante com grnulos grandes, grosseiros e uniformes, de

cor pretoazulado, os quais so capazes de obscurecer o ncleo (figura 11). Os grnulos podem estar em nmero reduzido nas sndromes mieloproliferativas e mielodisplsicas e em

33

alergias agudas. No sangue perifrico os basfilos so geralmente encontrados em

pequenos nmeros, se encontrados. A contagem varia de 0 a 100 clulas/mm3 ou 0 1%

(Falco, 2001).

Figura 11: Basfilo do sangue perifrico de indivduo sadio (modificado de Heckner, 2000).

II.6.2.3. Eosinfilo

Os eosinfilos medem de 12 17 m de dimetro, ligeiramente maior que o

neutrfilo. Tem ncleo com 2 ou 3 lbulos (geralmente bi-lobulado), citoplasma coberto por grnulos esfricos (eosinfilos) e grandes que coram-se de laranja-avermelhado, caracterstica peculiar de alta afinidade dos grnulos pela eosina (Savi, 2002). (figura 12). Os grnulos so formados principalmente por uma protena chamada de Protena Bsica

Maior (PBM), esta responsvel pelas duas principais funes: mediao de processos inflamatrios associados a alergia, a defesa contra parasitas metazorios helmnticos, em

certos distrbios cutneos alrgicos, neoplsicos e inflamao aguda. (Rue, 2001). Eosinofilia deve ser um parmetro considerado quando ocorrer infeco parasitria, mas

este aspecto merece relevncia no conjunto dos fatores de diagnstico de parasitoses e

34

jamais como indicador isolado de alguma patologia (Rue, 2001). Uma contagem normal de eosinfilos varia de 50 a 250 clulas/mm3 ou 1 4%. Sua granulao anormal em vrios

defeitos genticos, incluindo a sndrome de Chediak Higashi e anomalia de Alder Reilly,

onde os grnulos mostram-se cinza- esverdeados.

Figura 12: Eosinfilo do sangue perifrico de indivduo sadio (modificado de Heckner, 2000).

II.6.2.4. Linfcitos

Os linfcitos so pequenas clulas mononucleares sem grnulos no citoplasma. So

os menores dentre os leuccitos, um pouco maiores do que as clulas vermelhas, contm

10 a 16m de dimetro. Apresentam ncleo redondo e homogneo que fica intensamente

corado, o citoplasma escasso (figura 13). Eles so divididos em grupos, dos quais os principais so os linfcitos T, B e NK (natural killer). Os linfcitos B correspondem a 5 a 15% dos linfcitos, originam-se de um precursor da medula ssea e tm a funo de sintetizar os

anticorpos contra antgenos especficos. J os linfcitos T tm a peculiaridade de completar

seu processo de maturao no timo, tm a funo de controle da resposta imunolgica, em

todos os nveis, desempenhando tambm e de forma especfica a defesa contra agentes

intra-celulares como vrus e clulas estranhas como enxertos alognios e clulas tumorais.

35

Estes linfcitos correspondem de 65 a 80% dos linfcitos circulantes. Por ltimo, os linfcitos

NK so a minoria das clulas linfides em circulao e originam-se, como as demais, de um

precursor linfide na medula ssea. Sua principal funo de destruir clulas alvo, agindo

sobre clulas tumorais e clulas infectadas por vrus (Nicola, 1989; Heckner 2000).

Figura 13: Linfcito do sangue perifrico de indivduo sadio (modificado de Heckner, 2000).

A estimulao ou ativao dos linfcitos leva a alteraes fisiolgicas que culminam

tambm por alterar a sua morfologia, assumindo uma forma mais imatura (linfoblasto) ou mesmo linfoplasmocitose. Anormalidades morfolgicas e hereditrias dos linfcitos

acontecem na sndrome de Chediak Higashi e na anomalia de Alder Reilly.

36

II.6.2.5. Moncitos

Os moncitos so as maiores clulas normais do sangue, com dimetro de 12 a

20m. So clulas de formato irregular com ncleo grande, oval ou dentado e posicionado

centralmente, com citoplasma abundante, de colorao cinza ou azul claro acinzentado,

com vrios vacolos e com pequenos grnulos finos. A cromatina delicada,

predominantemente frouxa, com estreitos filamentos ligando pequenas reas de cromatina

mais densa (figura 14). Sua principal funo a fagocitose de partculas grandes, corpos estranhos e destruio de clulas tumorais. Nos tecidos, os moncitos evoluem a

macrfagos, que esto associados a vrios estados infecciosos e inflamatrios, doenas

malignas e as parasitoses. A contagem normal destas clulas de 50 a 800 clulas/mm3 ou

1- 8%, estas clulas tm meia-vida curta de 4 8 horas (Martinez-Pomares, 1996).

Figura 14: Moncito do sangue perifrico de indivduo sadio (modificado de Bain, 2004).

Os mais imaturos so chamados de monoblastos e os de diferenciao

intermediria, de promielcitos, encontrados na medula ssea em condies normais.

37

II.6.2.6. Principais Desordem dos Leuccitos

As desordens dos leuccitos podem ser divididas em dois grupos gerais: desordens

no proliferativas e proliferativas, conforme segue abaixo:

II.6.2.6.1. No Proliferativas

Neutrofilia: Infeco localizada (apendicite), infeco sistmica (septicemia), acidose diabtica, drogas txicas/qumicas (ex: chumbo, corticosteroides), estmulos fsicos/ emocionais, hemorragia e hemlise.

Neutropenia: hipoplasia mieloide (agranulocitose), estgios iniciais de infeces e hiperesplenismo.

Eosinofilia: doena alrgica (asma), desordens de pele (eczema), infestaes parasitas, doenas infecciosas (febre escarlate) e sndrome de Loeffler.

Eosinopenia: Estresse agudo e estados inflamatrios agudos.

Basofilia: reaes alrgicas, leucemia mieide e policitemia Vera.

Basopenia: em tratamento com corticoesterides, infeces agudas e stress.

Monocitose: estgio de recuperao de infeco aguda e endocardite

bacteriana subaguda.

Monocitopenia: em leucemias (Hairy cell).

Linfocitose: infeces, pertussis tosse comprida, mononucleose infecciosa,

infeco por citomegalovrus, toxoplasmose, desordens auto imunes (lpus eritematoso sistmico) e cncer.

38

Linfocitopenia: desordens de deficincia imunolgica (AIDS), casos avanados de doena de Hodgkin

II.6.2.6.2. Proliferativas

Leucemias mieloproliferativas:

LMA (leucemia mielide aguda) Leucemia mieloblstica aguda (M1 e M2), Leucemia promieloctica aguda (M3), Leucemia mielomonoctica aguda (M4 e M5) e sndrome DiGuglielmo/ eritroleucemia (M6).

LMC (Leucemia mielide crnica).

Policitemia Vera - mielofibrose com metaplasia mielide e sndromes

mielodisplsicas pr-leucemia.

Leucemias linfoproliferativas:

Leucemia linfide aguda (ALL).

Leucemia linfide crnica (CLL).

Leucemia Hairy Cell.

Linfomas malignos (Doena de Hodgkin e linfoma no Hodgkin).

39

II.6.3. Plaquetas

As plaquetas so pequenas clulas em forma de disco de aproximadamente 2 3

m de dimetro. No esfregao sanguneo so os menores elementos. So formadas de

fragmentos do citoplasma do seu precursor, o megacaricito (presente na medula), e o tempo mdio de vida de 10 dias no sangue (figura 16). Sua membrana plasmtica rica em fosfolipdes e glicoprotenas, sendo as ltimas receptoras para diversos fatores, como

Von Willerbrand e o fibrinognio, assim como responsveis pelas funes de adeso,

agregao e ativao plaquetria (Falco, 2001). Esta pequena clula muito importante pois tem as funes de hemostasia e coagulao sangunea (conteno inicial do sangue). Uma contagem normal de plaquetas na faixa de 140.000 a 440.000 celulas/mm3.

Figura 15: Plaquetas do sangue perifrico de indivduo sadio (Heckner, 2000).

O tamanho das plaquetas pode ser avaliado ao microscpio comparando-se o

dimetro destas com a dos eritrcitos ou com micrometro ocular. Macrotrombcitos a

nomeao a plaquetas com tamanho acima de 4 m e esta alterao pode estar ligada a

vrias doenas congnitas (Sndrome de Bernard Soulier, S. Epstein, S.Sebastian, anomalia de Chediak Higashi, anomalia de May Hengglin entre outras), ou adquiridas

40

(prpuras, policitemia Vera, LMC, leucemia megacarioblstica entre outras) (Wendling, 1999).

II.6.3.1. Principais Desordens das Plaquetas

As desordens de plaquetas podem ser classificadas como quantitativas

(trombocitopenia ou trombocitose) ou qualitativas.

II.6.3.1.1. Trombocitopenia

Presena de petquias ou prpuras, que so hemorragias superficiais de

colorao avermelhada ou purprica.

Irradiao, drogas quimioteraputicas, infiltrao na medula ssea, prpura

trombocitopnica idioptica (PTI) e coagulao intravascular disseminada (CID).

II.6.3.1.2. Trombocitose

Ps esplenectomia.

Respostas a traumas e infeces.

Policitemia Vera.

41

II.7. METODOLOGIAS EM HEMATOLOGIA

Na maioria dos contadores hematolgicos o princpio da contagem baseado na

impedncia, que a mudana de pulsos eltricos produzidos pelas clulas quando passam

atravs de uma micro-abertura calibrada com dois eletrodos localizados em cada lado da

abertura (Figura 16). As clulas, suspensas em um diluente (ABX diluent (ABX Pentra 60

- Montpellier Frana) condutor de corrente eltrica, passam atravs desta micro-abertura, aumentando a resistncia do caminho eltrico entre os dois eletrodos, emitindo pulsos que

so amplificados e analisados por um microprocessador. A amplitude (magnitude) de cada pulso eltrico indica o volume da clula. So feitas duas contagens de 10.000 clulas em 5

segundos, com um jato do fluido ABX cleaner (Montpellier Frana) entre as duas a fim

de efetuar limpeza (Nascimento, 20022).

Figura 16: Metodologia de impedncia (Clinical Case Studies)

42

Outra metodologia encontrada em alguns contadores hematolgicos a citometria

de fluxo. Esta tcnica til em situaes nas quais as clulas precisam ser contadas e

separadas por subpopulaes. Utiliza sondas fluorescentes que se fixam em determinados

componentes das clulas quando combinados com amostra de sangue. A amostra ento

processada por um mtodo de difrao de luz. Os padres de difrao das clulas

marcadas pela florescncia so especficos para certos tipos de clulas. O citmetro de

fluxo um sofisticado microscpio, com capacidade de analisar rapidamente mltiplas

propriedades de clulas isoladas e suspensas num meio lquido. As clulas passam a uma

velocidade muito rpida, em fila nica, atravs de um feixe luminoso de grande intensidade.

Cada clula emite sinais luminosos fluorescentes e espalhados ao atravessar o feixe de luz.

Esses sinais luminosos so amplificados e convertidos em sinais eltricos, que esto

digitados e processados, armazenados e exibidos graficamente por um computador.

Na amostra sangunea com o diluente eletroltico, as hemcias so lisadas (ABX

Alphalyse ABX Pentra 60 - Montpellier Frana) e a partir da trs volumes dessa amostra

so separados e transferidos para diferentes canais:

A First Dilution Chanel Cmara de primeira diluio;

B - Matriz de LMNE (LMNE matrix channel) onde dispensado o reativo (ABX

Eosinofix - Montpellier Frana) que fixa o ncleo do eosinfilo com uma colorao

especfica. Os linfcitos e moncitos apresentam alteraes diferenciadas: a membrana do

linfcito se desloca completamente para o ncleo e a do moncito parcialmente. Os

neutrfilos no so afetados pois possuem uma protena protetora de membrana

(Nascimento, 20022) C RBC/PLT channel Cmara de RBC e Plaquetas;

D WBC/Baso channel Canal de contagem de leuccito.

43

Existem vrias diferenas entre a contagem por automao e a contagem manual,

entre elas as principais:

A - Nmero de Clulas: Na contagem manual so contadas entre 100 a 200 clulas,

como preconizado por diversos autores (Koepke, 1985). Na automao o resultado liberado obtido atravs de um maior nmero de clulas contadas, pois so duas contagens de

10.000 clulas (Nascimento, 20021; Nascimento, 20022), totalizando 20.000 clulas. A contagem manual vem sendo menos utilizada com o surgimento de novos equipamentos

automatizados, a freqncia em que realizada gira em torno de 10% a 15% no

departamento de hematologia do Hospital St. Marys, London (Bain, 2005).

B - Distribuio das Clulas: A contagem manual feita em esfregao sangneo

sobre lmina de vidro onde a diferena de tamanhos, gravidades especficas, aderncias

entre os diversos tipos de leuccitos caracterizam uma distribuio irregular. Por se tratar de

sangue sem anticoagulante, a maioria dos neutrfilos e dos moncitos se concentram nas

margens e na cauda do esfregao (Vallada, 1988; Wintrobe, 1979), diferente do visto na corrente sangnea. Na automao se utiliza o sangue total com anticoagulante. As

hemcias so lisadas em diluente eletroltico. Cada tipo de leuccito, aps corado e

diferenciado, agrupado e contado no momento da passagem da clula por uma micro-

abertura, o que gera a emisso de pulsos eltricos. Na automao as duas contagens -

relativa e absoluta - so executadas de modo semelhante, isto , em um fluxo que tem uma

distribuio semelhante da corrente sangunea.

C - Linfcitos Tpicos H margem de erro de aproximadamente 25% na contagem

manual de linfcitos, o que torna mais freqente o achado de valores normais e elevados,

quando comparada automao (Dutcher, 1985).

44

D Moncitos e neutrfilos - No esfregao sangneo em lmina de vidro, os

moncitos se concentram no mesmo local que os neutrfilos (Vallada, 1998; Wintrobe, 1979) e estes, geralmente em maior quantidade. Na contagem manual, os neutrfilos so mais freqentemente visualizados e assim, atinge-se, s suas custas, rapidamente uma

contagem de 100 a 200 clulas, o que pode gerar um erro em torno de 10% a 100 % na

contagem manual dos moncitos (Dutcher, 1985).

Grandes centros de patologia clnica, pelo alto volume de amostras em suas rotinas,

vm confeccionando esfregaos somente para amostras que tenham alarmes patolgicos. O

setor de hematologia do Centro de Medicina Diagnstica Fleury (So Paulo SP, Brasil) confecciona esfregaos quando os parmetros ultrapassam os limites de variao definidos

pelo servio ou para pacientes com diagnstico prvio de doena hematolgica e/ou

investigando afeces como toxoplasmose, mononucleose e citomegalia. Nestes casos

gerado um alerta (flags) que obriga automaticamente a confeco de esfregaos (Toledo, 2002). A observao em esfregao junto com os resultados da automao evitam erros de diagonstico em um contexto clnico (Bain, 2005).

Mesmo com a tecnologia eletrnica a observao do analista clnico ao microscpio

ainda indispensvel. Os elementos celulares patolgicos chegam a ser registrados pelo

aparelho, porm no so identificados sob o ponto de vista qualitativo. Comea aqui o

campo do diagnstico visual atravs do microscpio (Heckner, 2000). Para esse fim utiliza-se objetivas com aumento de 40 ou 50 e objetiva de imerso de 100 aumentos. O exame junto ao microscpio exige uma rigorosa disciplina, deve-se relacionar os dados da automao com os da microscopia e julgar se so condizentes. Na tabela 1 mostramos alteraes

45

hematolgicas no identificadas pelos contadores hematolgicos.

Tabela 1 Alteraes hematolgicas no identificadas pelos contadores eletrnicos. ERITROGRAMA Policromatofilia

Pecilocitose Eliptcitos Esfercitos Acantcitos Incluses (Howell-Jolly, pontilhado basfilo) Clulas em alvo Rouleaux Drepancito ou hemcia falciforme Plasmdium falciparum Malria

LEUCOGRAMA Granulaes txicas Hipersegmentacao Basto de Auer Desvio esquerda sem neutrofilia Corpos de Dhle Anomalia de Pelger-Hut Plasmcitos Linfcitos atpicos sem linfocitose Blastos

46

Tabela 2 Parmetros numricos de limites do servio de hematologia do Unilab (Laboratrio de Unidos de Pesquisas Clnicas Ltda Porto Alegre RS BR). Eritrcitos (milhes/L) Hemoglobina (g/dL) Hematcrito (%) VCM (fL) HCM (pg) CHCM (%) RDW (%)

Leuccitos (/L) Neutrfilos (/L) Neutrfilos (%) Linfcitos (/L) Linfcitos (%) Moncitos (/L) Moncitos (%) Eosinfilos (/L) Eosinfilos (%)

Plaquetas (/L)

5,8 18,0 < 35,0 >53,0 100,0 33% 36,0 15,0

12000 8000 70 4500 50 1000 2 >10 0 >700 0 >7

500000

A metodologia de automao tem sido cada vez mais utilizada nos laboratrios de

anlises clnicas, tornando necessrio estudos que venham determinar a confiabilidade

destes aparelhos em nosso meio. Este estudo vem contribuir com os j existentes sobre o

analisador automtico ABX Pentra 60(Montpellier Frana).

47

III. OBJETIVOS

III.1 OBJETIVO GERAL

Comparar os resultados dos hemogramas do analisador automtico ABX Pentra 60

(Montpellier Frana) do Unilab (Laboratrio Unidos de Pesquisas Clnicas Ltda) com a microscopia ptica e determinar a concordncia entre os dois mtodos, avaliando assim o

desempenho do contador automtico.

III.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Permitir a criao de protocolos para liberao automtica de hemogramas, sem

necessidade de exames complementares, e programar a necessidade de profissionais no

setor de hematologia.

48

IV. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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53

COMPARISON OF COUNTER ABX PENTRA 60 AUTOMATED ANALYSIS OF BLOOD CELLS AND BLOOD SMEAR MICROSCOPY EXAMINATION

Felipe Goulart Monteiro1,2, Lcia Mariano da Rocha Silla1,2

1Programa de Ps-Graduao em Medicina: Cincias Mdicas, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil. 2Servio de Hematologia Clnica e Transplante de Medula ssea, Hospital de Clnicas de Porto Alegre, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil.

Financial Support: FIPE/HCPA

Correspondence Address: gmfifo@hotmail.com

Key Words: Blood, Automated blood counting, optical microscopy.

54

Abstract

The blood counting is a routine laboratorial test which is done to have a quantitative

and qualitative evaluation of the elements present in the peripheral blood. The complete test

should contain the eritrogram, the leucogram, the platelet counting, and a description of the

observation of the blood smear. Nowadays the clinical laboratories would not be able to

efficiently analyze the great volume of samples that they daily receive without the speed and

ability of modern automated systems in hematology. The automated systems offer high

sensibility and accuracy in the quantification of the blood cells. The aim of this study was to

compare the results of blood counts obtained by the automated blood counter ABX Pentra

60, broadly used in the routine of the clinical laboratories with the results obtained by the

analysis of blood smear in the optical microscopy, and to determine the agreement between

these two methods. A thousand blood samples from adults were used for the

accomplishment of blood counts. Each sample was analyzed by the automated blood

counter and by use of optical microscopy also. From all of the blood counts accomplished by

the equipment, 40,1% were considered abnormal and the optical microscopy blood smear

analysis revealed abnormalities in 39,9% of the blood smears. A very great agreement

values were found for the counting of the white and red blood cells, and good agreement

values for the platelets. The ABX Pentra 60 was shown satisfactory for the routine in the

clinical laboratory; it is easy handling and it shows the main Flags in a safe way. We suggest

that the results with normal blood counting and excellent agreement counting (Kappa > 0.93) could be directly liberated from the automated system without a complementary evaluation

by the professionals. From the managerial point of view this condition could to reduce 86% of

worked hours in the clinical laboratory.

55

Introduction

The blood cells counting is a routine laboratorial test commonly utilized in the clinical

practice for qualitative and quantitative assessment of the cellular elements of peripheral

blood, not only as a tool for diagnosis but also for the follow up of various illnesses. It

accesses the red blood cells, white blood cells and platelets counts, and the microscopic

examination of blood smear which is considered the gold standard for evaluation of the cells

morphology. The leucocytes manual counting was used for a long time before the arrival of

the automated systems for blood cell counting (1,2,3).

Several automated systems for blood counting was developed since the introduction

of the automated technology for blood counting in 50's. These systems provided more

accuracy and agility during the blood counting in the clinical laboratories. The most

sophisticated models of automated blood counting systems were developed in 80's. These

automated systems are fundamental for the analysis of the increased number of samples

which is remit to the clinical laboratories. These systems offer high sensibility and accuracy

for the blood counting and for the leucocytes differential counting (4,5).

Some samples analyzed by the automated systems require the evaluation of blood

smear microscopy examination for evaluation of morphological abnormalities (4). The automated systems for blood counting were used in the majority of clinical laboratories, and the blood smear microscopy examination is only performed on selected situations which

varies according to the protocols of each laboratory (6).

Even with the automated systems for blood counting the blood smear microscopy

examination by clinical analyst is still necessary. The pathological cell elements can be

registered by the equipment, however, some elements are not identified by the automated

systems. Thus, the microscopy examination of blood smear requires a severe discipline and

the association with the others parameters obtained in the automated analyzer also (7).

56

The automated systems printed some alarms or flags in the situations that occur

possible abnormalities. Due to the large variability of flags and the dissemination of the use

of automated systems for blood counting, it is recommended that each laboratory established

some standard procedures in the situations that occur flags.

A new generation of automated systems has been used in the routine of the clinical

laboratories, including the Sysmex SE- 9500 (Ramsey, Minnesota - USA), ABX Cobas Veja (Montpellier - France), Cobas Argos 5 diff (Roche - Switzerland), Coulter STKS

(Fullerton, California - USA), ABX Pentra 80 (Montpellier - France), Abbott CELL DYN 4000 (Illinois - USA), Bayer Advia (Holliston, Massachusetts - USA) and ABX Pentra 120 (Montpellier - France) (7-13).

Siekmeier et al. (2001) investigated the association between ABX Pentra 120

(Montpellier - France), Coulter STKS (Fullerton, California - USA) and microscopic examination of blood cells, and this study reported a agreement for neutrophiles,

lymphocytes and eosinophiles. However, it was found Kappa = 0,581 for the correlation to

monocytes. It was also observed a poor correlation for immature cells, including mielocytes,

metamielocytes and promielocytes (8). A poor correlation to the basophiles was already described in literature (9,14).

Peng et al. (2001) reported a close correlation between the results of red blood cells, white blood cells ans platelets counts obtained by the Sysmex SE-950 (Ramsey, Minnesota - USA) and obtained by the microscopic examination (9).

Arroyo et al. (2005) recently reported a good association between the results of relative counting of neutrophiles, lymphocytes, eosinophiles and immature cells obtained by

ABX Pentra 80 (Montpellier - France) and obtained by the microscopic examination of blood smear (7).

57

The automated system CELL DYN 4000 (Illinois - USA) presented a good correlation with the microscopic examination of leucocytes differential counting (14). Some studies has been reported the association between the flags for blast cells and the presence of these

cells in the microscopic examination. A high number of false positives was observed in the

flags of automated systems. A careful microscopic examination of the blood smear increases

the sensibility of these findings (10, 11).

Ferrero et al. (1997) investigated the association between the results obtained by ABX Cobas Veja (Montpellier - France), Couter STKS (Fullerton, California - USA) and the microscopic examination of blood film, and a good association between the parameters was

observed, except eosinophiles and monocytes. A high value of false positive flags for blasts

was reported (15).

A study investigated platelets counting using CELL DYN 4000 (Illinois - USA) reported 60 cases of thrombocytopenia. However, 17% of these results were false. The

microscopic examination of platelets must be done to prevent errors during the investigation

of thrombocytopenia (12).

The automated systems has been more used in the clinical laboratories around the

world. The aim of this study was to establish a protocol for the direct liberation of results

obtained by ABX Pentra 60 (Montpellier - France) without the microscopic examination of blood film. We also investigated the real necessity of qualified professionals at the

hematology field.

58

Materials and Methods

We studied 1000 blood samples (aleatoric) from adults collected during July and December of 2004. The samples of inpatients and outpatients were kindly given away by

UNILAB - Laboratrios Unidos de Pesquisas Clnicas Ltda, Porto Alegre, RS, Brazil. These

blood samples were analyzed in ABX Pentra 60 (Montpellier - France) which is an automated system manufactured by Horiba ABX that analyses samples through the principle

of measurement Double Hydrodynamics Sequential System (DHSS) and Multi-Distribution Sample System (MDSS) which matches cytochemistry, impedance and flux cytometry. DHSS is a technology owned by ABX that makes possible to measure the volume and

content of a cell in a single cell flow. MDSS ensures a perfect blend and homogenization

between samples and reagents with just one small quantity of samples. This equipment provides 26 parameters of analysis with a complete differential in five parts, including atypical

lymphocytes and large immature cells (16).

The microscopic examination of blood smears were evaluated by the author. All

samples were investigated, including the samples that presented flags during the automated

analysis. On the first 100 samples the blind reading (accomplished with no access to the numerical data of automation) was compared to the reading made by other two professionals.

The peripheral blood samples were previously collected by an experienced

professional. The collected of blood samples was realized according standard technique. It

was used alcohol 70%, tourniquets and safety equipment in order to disinfect the site. The

anticoagulant used for the service was EDTA to prevent some alterations (17).

After the collection, the samples were sent to the Hematology Department of UNILAB

59

to be processed. Firstly, the samples were put inside of an agitator, then they were

processed on the electronic blood cell counter ABX Pentra 60 (Montpellier - France) and simultaneously numbered with their respective blades. Glass blades (24 x 76 mm) clean and degreased were used for a good blood distension. A drop of the blood sample was put in the

blade with a capillary tube, leaving the distension under an angle of 25 to 40 with a fast

movement.

Those blades were dyed according to the pattern of the UNILAB by the dye Pantipo

Rpido that uses essential components of Romanowsky's (18) dye, a basic component (cationic) methylene blue, which gives a blue color to the nucleic acids (DNA and RNA) and to nucleoproteins, granules of basophiles and slightly to the granules of neutrophiles, besides

an acid dye (anionic) like eosin which gives an orange color to hemoglobin and slightly to the granules of eosinophiles.

The smears were provided to the author for microscopic analysis without his

acknowledgement about the results of automation (blind microscopy). The microscopic examination was performed through an Olympus equipment with oculars of 10x and 40x

and an immersion objective of 100x. The author followed a rigorous criterion of reading observing the 3 cell series, making numerical counting and observing possible morphological

changes.

The manual microscopic examination started by the red blood cells with the analysis

of the dying and possible morphological alterations. Later, the white blood cells were

analyzed. The total counting of leucocytes was made through a manual counter evaluating

100 cells. Following, the morphology analysis of the white cells was accomplished with more

attention to atypical neutrophiles, leucocytes and monocytes. Finally, the general counting of

the platelets and their quality was evaluated. The fonio reading was used to compare the

results of the equipment with microscopy. This method is based on a counting of

60

erythrocytes and platelets in fields. It is made an average of the quantity of erythrocytes and

platelets by field and calculated a rule of three with the total values of erythrocytes.

A comparative study between normal blood counts and the main Flags of the

automatic analyzer ABX Pentra 60 and the optical microscopy was performed.

Among the main flags are: RBC - red blood cells: macrocytosis (VCM > 100), microcytosis (VCM < 80) and hypochromy (HCM < 27); WBC - White blood cells:

lymphocytosis (> 4500 L), lymphopenia (8000 L), neutropenia

(1000 L), eosinophilia (>800 L), immature cells, leukocytosis

(>11000 L) and atypical lymphocytes; and PLQ - platelets: thrombocytosis (> 500000 L),

thrombocytopenia (< 100000 L), macroplatelets and platelets aggregate.

The statistical analysis was performed with the SPSS program, version 8.0, through

an agreement measurement between two measures called Kappa coefficient. This method

will offer a value between zero and 1, so that as closer it is of 1 the agreement between the

automation results and microscopy will be higher 0,05 was considered significant.

Table I: Values of concordance (Kappa).

Kappa value Concordance

Negative - 0 Without 0,01 0,2 Poor 0,21 0,4 Weak 0,41 0,6 Reasonable 0,61 0,8 Good 0,81 0,92 Very good 0,93 1,00 Excellent

Adapted from Dawson 2001 (19).

61

The samples used in this study deriving from the laboratory routine and do not

characterize any addition to behaviors, treatments or questionings close to the patients. So, it

is not perceived the necessity of their consent. This research was approved by the Ethics

Committee of the Hospital de Clnicas de Porto Alegre.

Results

The correlation between the results obtained by the author in the optical microscopy

and by the other two observers was satisfactory, and do not have any significant

disagreement between them (table II).

Table II: Correlation between the three clinical analysts with the respective values of agreement.

Variables Kappa 1 vs 2 Kappa 1 vs 3 Kappa 2 vs 3 RBC 0,852 0,740 0,651

Macrocytosis ** ** ** Microcytosis 0,852 0,740 0,651 Hypochromy ** ** **

WBC 0,890 0,865 0,796 Lymphocytosis 0,740 1,000 0,740 Lymphopenia 0,968 0,967 0,935 Neutrocytosis 0,964 0,962 0,926 Neutropenia 0,898 0,951 0,841 Monocytosis 0,880 0,842 0,769 Eosinophilia 1,000 0,795 0,795 LIC/RM 0,942 1,000 0,942 Leukocytosis 1,000 0,957 0,957 Atypical lymphocytes 1,000 1,000 1,000

PLQ 0,795 0,559 0,481

Thrombocytosis ** ** - 0,15 Thrombocytopenia 1,000 1,000 1,000 Macroplatelets 1,000 0,662 0,662

** The values were analyzed by agreement test and there was no discrepancy between them.

62

The frequency of normal and abnormal results obtained by the analysis in ABX Pentra

60 were 59,9% and 40,1%, respectively.

The abnormal findings in the red blood counting (RBC) occurred in 4,9% of those samples, the microcytosis being the most frequent (65,3%), followed by the macrocytosis (32,6%) and hypochromy (8,1%)*. At the white blood counting (WBC) the automated system determined abnormalities in 37,6% of the samples, and the lymphopenia was the most

frequent finding (table III).

The platelet counting was abnormal in 4,8% of the samples with thrombocytosis in

54,1%, thrombocytopenia in 33,3% and macroplatelets were seen in 10,4% of the platelet

alterations. The equipment ABX Pentra 60 (Montpellier - France) revealed 15 cases of platelet aggregates.

The optical microscopy of red blood cells showed abnormalities in 39,9% of the

smears, and 60,1% were normal. At the red blood count (RBC) occurred alterations in 4,7% of the samples, being the microcytosis the most frequent alteration (70,2%), followed by macrocytosis (29,7%) and hypochromy (10,6%)*. *In some samples it was observed more than one alteration, as it was expected. At the white blood count (WBC) the equipment determined abnormalities in 36,9% of the samples, being the lymphopenia the most frequent

finding (table III).

63

Table III. Alterations of WBC in the automated and manual methods.

WBC Alterations Automatic Method % * Manual Method %* Lymphocytosis 9,04% 10,84%

Lymphopenia 50,53% 51,49%

Leukocytosis 31.38% 32.79%

Neutrocytosis 48,13% 50,40%

Neutropenia 27,92% 27,10%

Monocytosis 40,95% 37,39%

Eosinophilia 12,50% 12,73%

Immature Cells (LIC) 18,08% 16.80% Atypical Lymphocytes 8,24% 7,58%

The optical microscopy of platelets was abnormal in 4,7% of the smears with

thrombocytosis in 53,1%, thrombocytopenia in 34,0% and macroplatelets were seen in

14,8% of the platelet alterations*.

The statistical analysis comparing the results of red, white and platelet series

obtained by the automation method and microscopy is represented in the table IV.

64

Table IV: Correlation between the results obtained by ABX Pentra 60 and by the optical

microscopy. Kappa values were expressed.

Variables Kappa

ABX Pentra 60 x Microscopy

Kappa

RBC 0,912 Very good

Macrocytosis 0,932 Excellent

Microcytosis 0,920 Very good

Hypochromy 0,888 Very good

WBC 0,947 Excellent

Lymphocytosis 0,832 Very good

Lymphopenia 0,948 Excellent

Neutrocytosis 0,943 Excellent

Neutropenia 0,951 Excellent

Monocytosis 0,856 Very good

Eosinophilia 0,933 Excellent

LIC/RM 0,885 Very good

Leukocytosis 0,948 Excellent

Atypical Lymphocytes 0,878 Very good

PLQ 0,635 Good

Thrombocytosis 0,698 Good

Thrombocytopenia 0,619 Good

Macroplatelets 0,665 Good

* Some samples presented more than one alteration.

65

Discussion

In this study we evaluated the performance of the automated system ABX Pentra 60

and compared these results with the results obtained by microscopic examination. This allow

us to test the protocols for direct liberation of results without the microscopic exam, and we

can to establish the necessity of professionals for the hematology department.

In this study excellent values of agreement were found for the counting of

eosinophiles, neutrophiles and lymphocytes, corroborating Grimaldi and Scopacasa studies

in 2000 (14), who showed an excellent correlation to another equipment.

We also found good results with a good value of agreement for the pathologic alarm

of the immature cells (LIC/RM) different of the one found by Hoedemarkers and collaborators in 1999 (10), with an equipment Cell Dyn 4000 (Illinois - USA), and Ferrero in 1997 (15), with ABX Cobas Veja (Montpellier - France), and Couter STKS (Fullerton, California - USA). These researchers observed an erroneous indication for the presence of blasts.

A false low counting of platelets (pseudothrombocytopenia) may occur in blood samples collected with EDTA. This reduction on the counting is consequent to the

agglutination of platelets or, more rarely, to the formation of platelet roses around the

neutrophiles, a phenomenon referred to as platelet satellitism (13). Some authors have been proposing that self-antibodies existent in the plasma recognize and attach, at the presence of

EDTA, to an epitope of glycoprotein IIb (GPIIb), an integrant to the complex GPIIb/IIIa of the platelet surface promoting platelets aggregates (20-22). The agglutination of platelets may result at the formation of aggregates of similar size to the leucocytes, and the automated

counter is unable to distinguish such aggregates, recognizing them as leucocytes and

providing a falsely elevated counting or a pseudoleukocytosis (23). This fact was not observed in this study.

66

The awareness about the clinical data of patient presents high importance to prevent

the liberation of incorrect results. The careful assessment of the blood smear is vital for the

characterization of pseudothrombocytopenia cases, since through it will be evident the

presence of platelet aggregates that, in general, are more frequent at the end of the blood

smear tail. The critical observation of histogram may also suggest a condition of

pseudothrombocytopenia (24). The diagnostic may be confirmed through the platelets counting at sodium citrate at 3,8% immediately after the collection (25).

At the present study it was observed 15 cases of flags of platelet aggregates on the

automated system. Only 3 of those cases were also followed by thrombocytopenia flags.

When analyzed microscopically, the platelet aggregates in smears were proved in 100% of

those cases, corroborating the works of Dusse in 2004 (24), Cohen in 2000 (12), and Van Der Meer in 2002 (25), who observed pseudothrombocytopenia in their studies. Cohen, in 2000 (12), still emphasizes that a good microscopic inspection may prevent the mistake of a diagnostic of pseudothrombocytopenia.

The other 12 cases of platelet aggregates found by the automation may be up to the

configuration of the equipment's sensibility for this parameter (16), as platelet aggregates were not found in those cases.

The reports with no alteration issued by the automation equipment do not have a

careful microscopic inspection and are automatically liberated in the majority of clinical laboratories. The intervention of a qualified professional only happens when the equipment

inform some pathologic alarms (Flags), then the observation of the blood smear becomes mandatory, so that the laboratories are able to guarantee quality and reliance in their final

report. Usually the laboratories associated to hospitals that have a elevated volume of tests

in their routine must have a special care, since many blood tests are likely to be associated

to any alteration. Nevertheless, some laboratories analyze a large volume of blood tests

67

daily and need many professionals to review all this process, being economically unfeasible,

so, with a protocol of direct liberation of normal results of blood counting the laboratories will

have more agility with the service and, from the managerial point of view, a reduction at the

fixed costs with professionals of this area.

ABX Pentra 60 showed to be satisfactory for the routine of the clinical laboratory

because it is easy handling and safely indicates the main Flags. The statistical analysis of

the 1000 blood samples showed an excellent correlation between the pathological alarms of

the equipment ABX Pentra 60 and microscopy, with a good correlation to the platelets.

From the managerial point of view we can establish a protocol for direct liberation of

blood tests, thus reducing the fixed costs with dyes, blades, capillary tubes, among others.

We suggest the direct liberation without reviewing the smear in the cases of normal values

for all parameters. We will make revision of the smear whenever we have results from the

equipment with the following Flags: platelet aggregates, immature cells, thrombocytosis,

thrombocytopenia and leukocytosis. We should revise samples either when they come from

hospitals, or the patient have an historical of hematological sickness, or when the results

surpass the value stipulated by the department for a better final report.

The Laboratory UNILAB has a monthly routine of 3.000 blood cells counting, and

approximately 14% of them needed be revised according the criterion listed above.

Approximately 14 blood smears needed be revised by microscopic examination every day.

Approximately 100 blood smears should be revised by microscopic examination every day

without the automated system for blood cell counting. Considering that a qualified

professional must evaluate approximately 100 blood smears by day, this condition could to

reduce 86% of worked hours and to propitiate a reduction in the number of professionals.

68

Aknowledgement

The authors thank Alan Birk for his important collaboration at the statistical

analysis. We also thank Celito Luiz Diel, Rafael Failace and Alzira do Carmo Aquino

for their colaboration.

69

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