apostila de parasitologia clínica

Apostila Parasitologia Clínica 2009

1

SUMÁRIO

Introdução ................................................................................... 2

Método da gota espessa.............................................................. 3

Exame direto a fresco ................................................................. 4

Técnica de Hoffmann .................................................................. 4

Técnica de Faust ......................................................................... 5

Técnica da hematoxilina férrica .................................................. 6

Técnica de Willis ..........................................................................8

Técnica de Kato ........................................................................... 9

Exame parasitológico de fezes (rotina do LAC-USP) .................. 10

Técnica de Stoll .......................................................................... 12

Técnica de Ritchie ..................................................................... 13

Técnica de Rugai ........................................................................ 14

Técnica de coloração de Kynion ................................................ 15

Técnica do Swab (VASPAR) ........................................................ 19

Bibliografia recomendada para estudo ...................................... 20


2

INTRODUÇÃO

A Parasitologia Clínica na prática, consiste no aprendizado de técnicas

mais utilizadas no diagnóstico das principais parasitoses intestinais e

sanguíneas, preparando o aluno para atuar em saúde pública, educação e

pesquisa.

Sejam bem vindos !

Professoras: LUCIA MARIA BRAGAZZA e SORAYA EL KHATIB


3

MÉTODO DA GOTA ESPESSA

1. Usar luvas durante todas as etapas do procedimento.

2. Colocar em Lâmina de microscopia três a quatro gotas de sangue fresco,

colhidas por punção venosa ou da polpa digital.

3. Com a ponta de outra lâmina e com movimentos circulares, contínuos,

reunir as gotas, criando uma área de aproximadamente 2 cm de diâmetro.

Continuar com movimentos circulares, do centro para a periferia, durante

30 segundos para evitar a formação de fibrina, a qual poderá obscurecer

as preparações coradas.

4. Terminar os movimentos circulares no centro do círculo de sangue; por

meio desse procedimento o esfregaço apresenta a borda fina e o centro

espesso.

5. Deixar secar à temperatura ambiente e, após, mergulhar a preparação

em água corrente ou em solução salina a 0,85%, para que se produza a

hemólise. Secar à temperatura ambiente.


4

EXAME DIRETO A FRESCO DE SUSPENSÃO DE FEZES

1. Suspender por meio de um palito, pequena porção de fezes em gota salina previamente colocada sobre uma lâmina.

2. Examinar ao microscópio

TÉCNICA DE HOFFMANN

1. Colocar aproximadamente 2 g de fezes num copo descartável. 2. Acrescentar aproximadamente 20 ml de água morna aos poucos. 3. Homogeneizar as fezes totalmente com o auxílio de um palito. 4. Transferir para um cálice afunilado coando em filtro para fezes. 5. Acrescentar água da torneira até encher o cálice. 6. Deixar em repouso até a sedimentação (2 a 24 horas). 7. Com o auxílio de uma pipeta Pasteur recolher o sedimento, gotejar

sobre uma lâmina e adicionar uma gota de lugol, homogeneizar o preparado com uma lamínula e cobrir com a própria lamínula.

8. Examinar ao microscópio.


5

TÉCNICA DE FAUST

1. Colocar aproximadamente 2 g de fezes num copo descartável. 2. Acrescentar aproximadamente 20 ml de água morna aos poucos. 3. Homogeneizar totalmente as fezes com o auxílio de uma espátula. 4. Coar a suspensão de fezes em filtro próprio para fezes ou gaze. 5. Recolher o filtrado em tubo de centrífuga e centrifugar a 2500 rpm

durante 01 minuto. 6. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em água 7. Centrifugar a 2500 rpm por 1 minuto e desprezar o sobrenadante, 8. Se necessário repetir a lavagem até que o sobrenadante fique claro. 9. Ressuspender o sedimento com sol. de sulfato de zinco (d= 1.180)

completando o volume do tubo até 1 cm da boca do mesmo. 10. Centrifugar a 2500 rpm por 01 minuto. 11. Retirar a película da superfície delicadamente com o auxílio de uma

alça dobrada em anel. 12. Colocar as gotas obtidas com a alça de anel para uma lâmina com lugol 13. Cobrir com uma lamínula 14. Examinar ao microscópio


6

TÉCNICA DE HEMATOXILINA FÉRRICA ( segundo Cláudio Santos Ferreira)

1. Fazer o esfregaço bem fino em lâmina misturando fezes com uma

pequena gota de soro (usar de preferência muco e fezes líquidas para

a pesquisa de trofozoítos).

2. Fixador de Bouin - 1 a 2 minutos.

3. Lavar em álcool.

4. Lavar em água corrente - 2 minutos.

5. Mordente (alúmen férrico a 2%) - 5 minutos.

6. Hematoxilina - ± 5 minutos.

Controlar a coloração, observando o esfregaço até atingir a cor azul

cinzenta.

7. Água corrente - 1 minuto.

8. Diferenciador (alúmen férrico a 2%) se necessário.

9. Água corrente.

10. Montar em Bálsamo do Canadá.


7

Sol. de Alúmen Férrico.

Mordente Alúmen de ferro puro.....................................................2.0 g.

(Sulfato de amônio e ferro III)

Água destilada..............................................................100 ml.

Diferenciador Alúmen de ferro puro.....................................................0.5 g.

Água destilada...............................................................100 ml.

Triturar em almofariz e dissolver a frio.

A sol. se conserva por períodos curtos, por isso deve-se preparar

pequenas quantidades de cada vez.

Guardar em frasco âmbar.

Solução de Hematoxilina Cristais puros de hematoxilina...............................................0.5 g.

Álcool a 95%...........................................................................10 ml.

Água destilada q.s.p. .............................................................100ml.

Deixar em recipiente de boca larga, tampado com gaze durante

alguns dias ( no mínimo 2 dias).

Completar até o volume original.

Acrescentar 0.02 g. de ác. cítrico puro.

TÉCNICA DE WILLIS


8

• Colocar aproximadamente 2 g de fezes num copo descartável.

• Acrescentar aproximadamente 20 ml de água morna aos poucos.

• Homogeneizar totalmente as fezes com o auxílio de um palito.

• Transferir para um cálice afunilado coando em filtro próprio para fezes.

• Transferir para um tubo de centrífuga e centrifugar a 2500 rpm por 02 minutos.

• Desprezar o sobrenadante

• Ressuspender o sedimento em sol. saturada de NaCl, completando o volume do tubo com esta solução até formar um menisco.

• Colocar uma lâmina sobre a boca do tubo.

• Deixar em repouso durante 15 a 45 minutos (não ultrapassar os 45 minutos, pois os ovos começam a descer).

• Retirar a lâmina virando bruscamente.

• Examinar ao microscópio.


9

TÉCNICA DE KATO (modificado por KATZ e cols.)

• Preparar uma sol. de verde de malaquita (esse produto tem a finalidade de conservar e clarificar as fezes a serem examinadas ) usando as seguinte fórmula:

glicerina............................................100 ml

água dest. ........................................100 ml

verde de malaquita a 3%..................1 ml

• Cortar papel celofane semi-permeável (molhável) em pedaços de 24 mm por 30 mm e deixá-los mergulhados na sol. de verde de malaquita por 24 horas.

• Colocar sobre um pedaço de papel higiênico uma porção de fezes a ser examinada.

• Comprimir a parte superior com um pedaço de tela metálica. Nessa malha só passam ovos de helmintos e detritos menores do que eles.

• Retirar as fezes que passaram para a parte superior da tela e transferí-las com o auxílio de uma espátula, para um cartão retangular, contendo no seu centro um orifício de 6 mm de diâmetro ( as fezes são colocadas nesse orifício).

• Após encher completamente o orifício, retirar o cartão cuidadosamente deixando as fezes sobre a lâmina de vidro.

• Cobrir as fezes com a lamínula de papel celofane, comprimindo-a após tê-la invertido contra uma folha de papel absorvente.

• Aguardar 1 a 2 horas e examinar ao microscópio (todos os campos)

• O número de ovos encontrados no esfregaço fecal, multiplicado por 23 corresponderá ao número de ovos por grama de fezes.


10

EXAME PARASITOLÓGICO DE FEZES (ROTINA do LAC -USP)

Técnicas de Hoffmann, Ritchie, Faust

1. Enumerar o material 2. Colocar aproximadamente 5 g de fezes no copo descartável 3. Acrescentar aproximadamente 50 ml de água morna aos poucos 4. Homogeneizar totalmente as fezes com o auxílio de uma espátula 5. Transferir para um cálice afunilado coando em filtro próprio para

fezes 6. Acrescentar água de torneira até 2/3 do cálice 7. Transferir para 2 tubos de centrífuga quantidade suficiente do

filtrado para atingir aproximadamente 1 cm abaixo da borda do tubo. Um dos tubos será utilizado para execução da técnica de Faust (1) e o outro tubo será utilizado para a execução da técnica de Ritchie (2)

8. Acrescentar água de torneira no cálice até atingir o volume inicial ( 2/3 do cálice), a fim de executar a técnica de Hoffmann

9. Deixar em repouso até a sedimentação - de 2 a 24 horas 10. Com o auxílio de uma pipeta tipo Pasteur, recolher o sedimento e

gotejar sobre uma lâmina e adicionar uma gota de lugol, homogeneizar o preparado com uma lamínula e cobrir com a mesma

11. Examinar ao microscópio

( 1 )

1. Tarar o tubo e centrifugar a 2500 rpm durante 1 minuto 2. Decantar o sobrenadante e agitar até que o sedimento se

desprenda do fundo do tubo. 3. Lavar o sedimento com água até que o sobrenadante fique claro. 4. Ressuspender o sedimento com sol. de sulfato de zinco (d= 1.180)

completando o volume até 1 cm da boca do tubo e centrifugar a 2500 rpm por 01 minuto.

5. Retirar a película da superfície delicadamente com o auxílio de uma alça dobrada em anel.

6. Passar a gota do anel para uma lâmina com lugol


11

7. Cobrir com uma lamínula 8. Examinar ao microscópio

( 2)

1. Tarar o tubo e centrifugar a 2500 rpm durante 2 minutos 2. Decantar e agitar até que o sedimento se desprenda do fundo 3. Adicionar ao sedimento 5 ml de formol a 10% 4. Deixar em repouso por no mínimo 5 minutos 5. Adicionar 2 ml de éter 6. Tapar o tubo e agitar vigorosamente 7. Tarar os tubos e centrifugar a 2500 rpm durante 2 minutos 8. Decantar e agitar para desprender o sedimento do fundo do tubo 9. Adicionar 2 gotas de lugol e agitar novamente

Preparar uma lâmina do sedimento e examinar


12

TÉCNICA DE STOLL

É uma técnica quantitativa , na qual as fezes são ressuspensas em NaOH

0,1N que tem a finalidade de desagregar e clarificar o material. A

suspensão é feita em um frasco tipo Erlenmeyer , cujo gargalo traz duas

marcas, uma indicando 56 cm e a outra 60 cm .

TÉCNICA:

1. Encher o frasco até a marca 56 com NaOH 0,1N. 2. Colocar fezes até o nível atingir a marca 60. 3. Introduzir no frasco cerca de 10 pérolas de vidro, tampar com rolha

de borracha e em seguida agitar vigorosamente, para se obter uma suspensão homogênea.

4. Retirar 0,15 ml da suspensão e colocar em uma lâmina. Cobrir com uma lamínula e examinar ao microscópio , sob o aumento de 100 vezes.

5. Contar o número de ovos em toda a preparacão. 6. O número de ovos contados multiplicado por 100, dá o número de

ovos por grama de fezes.


13

TÉCNICA DE RITCHIE

7. Colocar aproximadamente 2 g de fezes num copo descartável. 8. Acrescentar aproximadamente 20 ml de água morna aos poucos. 9. Homogeneizar totalmente as fezes com o auxílio de um palito. 10. Transferir para um cálice afunilado coando em filtro para fezes. 11. Transferir para um tubo de centrífuga e centrifugar a 2.500 rpm

durante 2 min. 12. Decantar e agitar até que o sedimento se desprenda do fundo do

tubo. 13. Acrescentar 5 ml de formol a 10%. 14. Acrescentar 2 ml de éter. 15. Tapar o tubo e agitar vigorosamente. 16. Centrifugar novamente a 2.500 rpm durante 2 min. 17. Decantar e agitar até que o sedimento se desprenda do fundo do

tubo. 18. Adicionar 2 gotas de lugol e agitar novamente. 19. Preparar uma lâmina do sedimento e examinar ao microscópio.


14

TÉCNICA DE RUGAI

1. Remover a tampa do recipiente contendo as fezes e envolver em pedaço de gaze dupla (dobrada em duas partes) repuxando as bordas para trás.

2. Embocar os recipientes no interior de um cálice cônico, fixando-o por pressão contra as paredes, em posição levemente inclinada.

3. Colocar água morna pelas paredes do cálice aproveitando a abertura restante da posição inclinada do recipiente metálico. O líquido deve alcançar toda a extensão da abertura do recipiente. Evitar a formação de bolhas de ar.

4. Deixar em repouso por 90 min. 5. Sem retirar o recipiente, introduzir uma pipeta até o fundo do

cálice. Retirar o sedimento e colocar em uma lâmina ou vidro relógio.

6. Examinar ao microscópio.


15

TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE KYNION PARA PESQUISA DE

CRYPTOSPORIDIUM PARVUM E ISOSPORA BELLI

1a fase

Material utilizado

-Solução de formalina tamponada a 10%, pH 7.2 em PBS

-Gaze ou coador de nylon

-Copo descartável e cálice

Descrição

- Homogeneizar ± 1 g. de fezes em 4 ml. de solução de formalina

tamponada

-Filtrar em gaze ou coador de nylon

-Transferir o material filtrado para os cálices e manter em geladeira por 24

horas, no mínimo


16

2a fase

Material utilizado

-Centrífuga

-Tubos de centrífuga

-Tampas de borracha

-Éter sulfúrico

Descrição

- Colocar no tubo de centrífuga 4 ml do material contido nos cálices e

adicionar 2 ml de éter sulfúrico

-Agitar o tubo ( tampado) vagarosamente

-Centrifugar por 8 minutos a 1500 rpm

-Desprezar o sobrenadante e limpar os detritos superficiais com um

bastonete

-Fazer o esfregaço com o sedimento

Coloração

-Deixar secar o esfregaço

-Fixar com metanol por 5 minutos

-Cobrir o esfregaço com sol. de fucsina carbólica de Kynioun por 30

minutos à temperatura ambiente


17

-Lavar com água

-Lavar com álcool ácido por 2 minutos. Caso o esfregaço tenha ficado

muito espesso e a coloração vermelha não tenha sido removida, repetir o

procedimento

-Lavar com água

-Cobrir toda a lâmina com azul de metileno ou verde de malaquita por 1 a

2 minutos, lavar com água e deixar secar

Reagentes

Formalina

Formol....................................................................................10 ml

PBS pH 7.2 q.s.p. ..................................................................100ml

Fucsina carbólica de Kynioun

Fucsina básica.....................................................................4 g.

Cristais de fenol ou ác. fênico.............................................8 g.

Álcool 95%...........................................................................20 ml

Água dest. q.s.p. .................................................................100 ml

Álcool- Ácido

Ácido sulfúrico conc............................................................5 ml

Álcool 70% q.s.p. ...............................................................100 ml


18

Verde de malaquita

Verde de malaquita ............................................................3 g.

Água dest. ..........................................................................100 ml

Azul de metileno

Azul de metileno..................................................................1 g.

Água dest. ..........................................................................100 ml


19

MÉTODO DO SWAB DE VASELINA E PARAFINA (VASPAR)

1. Mergulhar o swab de algodão em mistura de quatro partes de

vaselina e uma parte de parafina (4:1).

2. Colocar o swab de algodão revestido com uma camada de vaselina-

parafina em tubo de ensaio fechado com uma bucha de algodão.

Armazenar no refrigerador .

3. Esfregar sutilmente o swab na superfície perianal e introduzir

pequena porção no orifício anal.

4. Repor o swab no tubo.

5. Encher 1/3 do tubo com xilol ou com quantidade suficiente para

cobrir o swab. Deixar em repouso por 5 minutos.

6. Remover o swab e centrifugar (500 x g/1min)

7. Com a pipeta capilar, colher o sobrenadante. Transferir várias gotas

para uma lâmina de microscopia. Não é necessário cobrir a

preparação com lamínula. Para evitar a expansão do material em

uma grande área, colocar as gotas no centro de um anel desenhado

com lápis de cera e examinar imediatamente. O anel pode ser

dissolvido com xilol.

Observação: Este exame deve ser realizado pela manhã, antes do

paciente defecar ou banhar-se.


20

BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA PARA ESTUDO

DE CARLI, G. A. Parasitologia Clínica. Seleção de métodos e técnicas de

laboratório para o diagnóstico das parasitoses humanas. Ed. Atheneu,

2001.

HENRY, J.B. Diagnósticos clínicos e tratamento por métodos laboratoriais.

São Paulo: Manole, 2007.

MELO, A. L., LINARDI, P.M., VITOR, R.W.A. Parasitologia Humana. 11ª

Edição. Ed. Atheneu, 2005.

Pranchas para o Diagnóstico de Parasitas Intestinais. Organização Mundial

de Saúde. Ed. Livraria Santos, 2005.

apostila de parasitologia clínica

Documents