Apostila

Bioqumica dos Sistemas Cardiovascular e Respiratrio

Professores: Russolina Zingali Robson Monteiro

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SUMRIO

UNIDADE 1. Metabolismo do Miocrdio ........................................... UNIDADE 2. Sistema Hemosttico .................................................... UNIDADE 3. Regulao do Processo Hemosttico ......................... UNIDADE 4. Testes de Hemostasia ................................................... UNIDADE 5. Hemcias e Grupos Sanguneos .................................. UNIDADE 6. Metabolismo da Hemcia .............................................. UNIDADE 7. Hemoglobina e Mioglobina ........................................... REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................... ANEXOS I. Anemia e ndices Hematimtricos .................................................. II. Aula Prtica 1 Testes de Hemostasia ........................................ III. Aula Prtica 2 ndices Hematimtricos e Determinao de Grupo Sanguneo ................................................................................

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UNIDADE 1

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1. METABOLISMO DO MIOCRDIO1.1. INTRODUO O corao necessita de energia diariamente para poder exercer a sua funo de bombear o sangue por todo o corpo humano e, assim, perfundir os tecidos. Para que isso ocorra em harmonia, necessrio que haja uma oferta contnua de oxignio e substratos energticos, o que obtido atravs da circulao coronariana. A utilizao de cada substrato pelo corao definida tanto pela concentrao arterial de cada um deles, quanto pela demanda energtica do miocrdio em determinado momento. 1.2. COMBUSTVEIS DO CORAO HUMANO As principais fontes de energia do corao so carboidratos e cidos graxos, os quais so utilizados em maior proporo nos estados ps-prandial e de jejum, respectivamente. Em jejum, ou no perodo entre as refeies, o nvel de cidos graxos livres no sangue alto, e estes so preferencialmente utilizados para o metabolismo oxidativo (Figura 1), tornando-se ento a principal fonte de energia. Quando os cidos graxos so oxidados, a oxidao da glicose inibida, e a mesma altamente convertida a glicognio. Este fenmeno conhecido como o efeito econmico da oxidao do cido graxo. Inversamente, quando os nveis de glicose e insulina circulantes esto elevados, os nveis de cidos graxos circulantes so suprimidos; logo, o corao diminui a captao dos mesmos e, com isso, a inibio da gliclise pelos cidos graxos removida, e a oxidao da glicose aumentada. Alm disso, o prprio metabolismo da glicose suprime diretamente a oxidao de cidos graxos (Figura 2). Refeies ricas em gorduras levam a um aumento acentuado de triglicerdeos no sangue durante a lipemia ps-prandial. Nestes casos, a enzima lipase lipoprotica converte o triglicerdeo a cidos graxos, que ento entra nas vias de oxidao dos mesmos. Nestas circunstncias excepcionais, os triglicerdeos circulantes tornam-se o principal combustvel do miocrdio. Durante exerccios fsicos intensos, o nvel de lactato sanguneo eleva-se e este se torna o principal combustvel do corao, enquanto a oxidao da glicose e a captao de cidos graxos passam a contribuir para a obteno de apenas 15-20% da energia necessria ao corao durante o exerccio. Os corpos cetnicos contribuem significativamente para o metabolismo energtico do corao somente em estado de jejum ou em cetose diabtica severa, pois, assim como os cidos graxos e o lactato, sua utilizao dependente de sua concentrao. Finalmente, na isquemia, vale ressaltar que o padro de captao de substratos modifica-se de uma predominncia da utilizao de lipdeos para a de carboidratos.

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Figura 1. Metabolismo Oxidativo dos cidos Graxos. Quando o nvel sanguneo de cidos graxos livres (FFA) alto, estes so utilizados como a principal fonte de energia do corao. Alm disso, enquanto os cidos graxos so oxidados, a oxidao da glicose encontra-se reduzida, e a mesma altamente convertida a glicognio. GS = glicognio sintase; PFK = fosfofrutoquinase; PDC = complexo piruvato desidrogenase.

Figura 2. Controle da Insulina sobre a Absoro da Glicose pelo Corao. Quando os nveis de glicose e insulina circulantes esto elevados, o corao diminui a absoro dos cidos graxos, e a oxidao da glicose aumentada.

6 1.2.1. Ciclo Glicose-cido Graxo O ciclo glicose-cido graxo, primeiramente descrito por Randle e colaboradores (1963), baseado na variao dos papis relativos da glicose e do cido graxo como principais fontes de energia entre os estados abastecidos e em jejum (Figura 3). A produo cclica (liga/desliga) de cido graxo pelo tecido adiposo o evento bsico no ciclo. Durante o jejum, o tecido adiposo quebrado para liberar cidos graxos, inibindo o metabolismo da glicose pelo corao. Aps as refeies, a presena de glicose estimula a produo de insulina e a primeira torna-se o principal combustvel. A contribuio de determinado combustvel para o metabolismo oxidativo do corao varia no decorrer do dia de acordo com seus nveis circulantes, assim como com o tipo de alimento ingerido e com a prtica de exerccio fsico.

Figura 3. Metabolismo Cardaco da Glicose e dos cidos Graxos. Os micitos cardacos transportam a glicose para o seu interior atravs dos transportadores especficos GLUT 1 e GLUT 4. A glicose metabolizada na via glicoltica e produz piruvato, que pode ser ento oxidado na mitocndria a acetil CoA pela enzima piruvato desidrogenase (PDH). A acetil CoA entra no ciclo do cido ctrico e gera equivalentes redutores para a produo de ATP na cadeia transportadora de eltrons. J os cidos graxos entram nos micitos por difuso passiva ou mediada por translocases especficas. Estes so ento esterificados pela acil CoA sintase e subsequentemente transportados mitocndria pela via da carnitina acil transferase 1 (CAT-1 ou CPT-1, no esquema), onde so oxidados e geram acetil CoA.

7 1.2.2. Metabolismo Oxidativo da Glicose A captao da glicose pelas clulas cardacas controlada pelos transportadores de glicose GLUT 4 e GLUT 1 (Figura 2). Como a concentrao de glicose no meio extracelular maior do que no intracelular, este transporte no requer energia. A absoro da glicose aumenta sempre que os transportadores so estimulados, como durante o trabalho cardaco aumentado, no perodo psprandial, ou em situaes de hipxia ou isquemia, condies estas que aumentam tambm a gliclise. Por outro lado, a absoro da glicose reduzida pelos fatores que inibem a gliclise, como um baixo trabalho cardaco, o jejum, ou em casos de diabetes mellitus severa. Nas ltimas duas condies, o nvel de cidos graxos no sangue encontra-se elevado. No perodo ps-prandial com consumo de carboidratos, os nveis circulatrios de glicose elevam-se e a liberao de insulina, um hormnio circulante, estimulada. Esta aumenta o nmero dos transportadores de glicose GLUT 4 e GLUT 1 no sarcolema (Figura 2), translocando-os de stios internos no disponveis para stios externos. Logo, a insulina estimula a taxa de reciclagem desses transportadores entre stios internos e externos. A insulina se liga a receptores especficos, os quais consistem de uma sub-unidade externa e uma sub-unidade interna. A ligao da insulina na sub-unidade leva a uma autofosforilao da sub-unidade , a qual amplifica fortemente o efeito da insulina e promove a ativao de tirosina cinases, desencadeando vias de sinalizao celulares que iro culminar, por exemplo, em um aumento da atividade de enzimas como a glicognio sintase e a piruvato desidrogenase. Em diversas doenas, tais como a diabete tardia, falha cardaca congestiva e alguns tipos de hipertenso, o transporte de glicose encontra-se prejudicado mesmo com nveis de insulina aparentemente normais ou at elevados. Estes so casos de resistncia insulina. 1.2.3. Via Glicoltica A gliclise a via metablica que converte a glicose a piruvato (Figura 4a). Durante o metabolismo oxidativo normal, a glicose gera piruvato, que ento oxidado no ciclo do cido ctrico (ou Ciclo de Krebs). Ao entrar na clula cardaca, a glicose rapidamente convertida pela enzima unidirecional hexoquinase a glicose 6-fosfato. Esta ento dirigida para a sntese de glicognio ou para a gliclise. Na gliclise, a glicose-6-fosfato convertida a frutose 1,6-bisfosfato pela fosfofrutoquinase (PFK), uma das enzimas que regulam o fluxo desta via. Quando sua atividade aumentada, como em hipxia, a converso da glicose 6-fosfato a frutose 1,6-bisfosfato, via frutose 6-fosfato, ocorre em uma taxa aumentada (Figura 4a). glicose + ATP glicose 6-fosfatohexoquinase

glicose 6-fosfato + ADP

frutose 6-fosfato

8PFK

frutose 6-fosfato + ATP

frutose 1,6-bisfosfato + ADP

Depois disso, cada frutose 1,6-bisfosfato convertida a duas molculas de trioses fosfato (Figura 4a). Nas etapas seguintes, duas molculas de piruvato e quatro de ATP so formadas independentemente da presena de oxignio, alm de 2 (NADH + H+) (Figura 4a). frutose 1,6-difosfato + 2 Pi + 4 ADP + 2 NAD+ NADH + + 2 H + + 2 H 2O 2 x piruvato + 4 ATP + 2

Logo, no balano geral, uma molcula de glicose gera duas de ATP, duas de piruvato, duas de H2O, e dois (NADH + H+).

a.

b.

LDH

PDH

Figura 4. Metabolismo Aerbio e Anaerbio da Glicose. a) Via glicoltica: a via metablica da converso da glicose a piruvato. b) Destinos do piruvato dependendo das condies de oxignio: anaerbia formao de lactato; aerbia descarboxilao oxidativa. LDH = lactato desidrogenase; PDH = piruvato desidrogenase.

9 Cabe ressaltar que existe um controle intracelular coordenado da gliclise, de tal modo que a absoro e fosforilao da glicose, a atividade da PFK e a da piruvato desidrogenase podem aumentar ou diminuir simultaneamente em resposta a um trabalho aumentado do corao, assim como a outros estmulos. Esses so, portanto, pontos-chave no controle da gliclise. 1.2.4. Metabolismo Aerbico dos cidos Graxos (AGs) O metabolismo miocrdico dos AGs comea em funo de seus nveis circulantes. Ou seja, quanto maior o seu nvel, maior ser a relao molar AG/albumina, e maior ser a captao dos AGs pelo miocardio. Uma vez captados, os AGs passam por uma srie de mudanas at a formao de molculas de acetil CoA. O primeiro passo desta via a ativao dos AGs intracelulares pela coenzima A (CoA) para formar derivados de acil CoA. A membrana mitocondrial no permevel a essas molculas, que necessitam, portanto, serem transformadas e transportadas para o interior da mitocndria. Inicialmente, as molculas de acil CoA combinam-se com a carnitina, formando acil carnitina, que transportada pelo sistema carreador de carnitina para o espao mitocondrial interno. Depois disso, as longas cadeias de acil CoA, j livres de carnitina, sofrem -oxidao e progressivamente so formadas molculas de acetil CoA, as quais so oxidadas no ciclo do cido ctrico e finalmente levam gerao de ATP. Qualquer AG intracelular no oxidado pode ser estocado como triglicrides ou transformado em lipdeos estruturais por alteraes no grau de saturao. Os triglicrides (ou triacilgliceris) teciduais podem ser fontes de cidos graxos quando os nveis destes esto baixos na circulao (Figura 5). Sumrio das etapas do metabolismo dos AGs: 1. AG intracelular reage com CoA e forma acil CoA extramitocondrial: AG + CoA + ATPAcil CoA sintetase

acil CoA + AMP + PPi

2. Acil CoA extramitocondrial reage com a carnitina e forma acil cartinina, reao essa catalisada pela enzima carnitina acil transferase 1 (CAT-1); 3. A enzima carnitina acil translocase transloca a acil carnitina extramitocondrial para o espao intramitocondrial; 4. A enzima carnitina acil transferase 2 (CAT-2) permite acil carnitina intramitocondrial reagir com a CoA, e ocorre a liberao de acil CoA intramitocondrial e carnitina. Esta ltima exportada de volta ao citoplasma; 5. A acil CoA intramitocondrial sofre -oxidao e forma unidades de dois carbonos de acetil CoA, que entram no ciclo do cido ctrico; 6. Quando os nveis de captao de AGs so bem elevados, ocorre mais formao de acetil CoA do que o ciclo do cido ctrico capaz de consumir. Nestes casos, o excesso de acetil CoA pode tambm reagir com carnitina intramitocondrial, formando acetil carnitina, que transportada ao espao extramitocondrial pela enzima carnitina-acetil translocase, onde ocorre formao de acetil CoA citoplasmtico. Este pode ento sofre transformao a malonil CoA, que prov um feedback inibitrio.

10 O malonil CoA produzido sempre que elevados nveis de acetil CoA citosslico esto presentes devido ao alto metabolismo de AGs, ou s altas taxas de oxidao da glicose. 1.2.5. -Oxidao A -oxidao converte a longa cadeia de acil CoA em fragmentos de dois carbonos de acetil CoA. A oxidao do AG continuamente remove uma molcula de acetil CoA da terminao carboxi da cadeia. Durante o esforo cardaco aumentado, a mitocndria torna-se mais oxidada. Os nveis intramitocondriais de NADH2 e FADH2 diminuem, e ocorre um aumento na taxa de oxidao dos cidos graxos. Por outro lado, na anaerobiose, os nveis de NADH2 e FADH2 aumentam, como resultado de uma reduo da taxa de -oxidao devido ao diminudo transporte de eltrons.

Figura 5. Descrio detalhada da absoro e degradao dos cidos graxos pela mitocndria. Os nmeros correspondem s enzimas acil CoA sintase (1), carnitina acil transferase 1 (2), carnitina acil translocase (3), carnitina acil transferase 2 (4) e 3-hidroxiacil-CoA desidrogenase (5). Fp = flavoprotena, NAD+ = nicotinamida adenina dinucleotdeo oxidada, NADH = nicotinamida adenina dinucleotdeo reduzida.

11 Um resumo do metabolismo energtico das clulas cardacas est representado na Figura 6.

Figura 6. Representao esquemtica da absoro e metabolismo dos substratos nas clulas musculares cardacas. FAT, fatty acid translocase; FABP, sarcoplasmic fatty acid-binding protein; NAD, nicotinamide adenine dinucleotide; NADH, reduced niconamide adenine dinucleotide.

1.2.6. Piruvato e Lactato O piruvato formado a partir do lactato absorvido pelo corao e pela degradao da glicose, e situa-se na interseco da gliclise e do metabolismo oxidativo no ciclo do cido ctrico. No corao anaerbico, o piruvato forma lactato; no aerbico, sofre descarboxilao oxidativa e entra no ciclo do cido ctrico. Esta reao ocorre pela atividade do complexo enzimtico da piruvato desidrogenase (PDH) (Figura 4b), encontrado na membrana interna da mitocndria. Os produtos desta reao de mltiplas etapas incluem a acetil Coa e NADH2. A primeira entra diretamente no ciclo de Krebs e totalmente oxidada a CO2 e H2O, e a segunda forma ATP pela fosforilao oxidativa. A piruvato desidrogenase encontrada tanto na forma ativa como na inativa. Normalmente, encontra-se na forma inativa, mas pode ser ativada pelo aumento do esforo cardaco, pelas catecolaminas ou pelas altas taxas de gliclise do estado ps-prandial. Por outro lado, a enzima inibida pela formao

12 de NADH2 na isquemia ou na hipxia, ou pela oxidao dos cidos graxos. A inibio desta enzima o evento-chave na inibio da gliclise durante a oxidao dos cidos graxos. O lactato absorvido pelo corao aerbico e produzido durante a anaerobiose; ento, a sua liberao no seio coronrio pode ser usada como um sinal de isquemia do miocrdio. A contribuio do lactato para as necessidades de energia de um miocrdio bem oxigenado pode aumentar a at 60% quando o seu nvel em circulao encontra-se elevado, como por exemplo durante e logo aps exerccio fsico. Durante infuso de lactato, a contribuio do mesmo pode subir a at 90%. O lactato um combustvel muito menos importante quando seu nvel est baixo, ou quando os nveis dos cidos graxos esto elevados. A absoro do lactato pelo corao depende de um sistema de transporte especfico, pois o sarcolema no livremente permevel ao mesmo. Uma vez absorvido, o lactato convertido a piruvato pela lactato desidrogenase (LDH), sendo que esta reao reversvel: lactato + NAD+LDH

piruvato + NADH + H+

Existem cinco isoformas de LDH, nomeadas de acordo com suas migraes eletroforticas. Cada enzima composta de quatro subunidades do tipo H ou M. A isoforma cardaca constituda predominantemente de subunidade H, e conhecida como LDH-1. Pode-se estimar o tamanho de um infarto do miocrdio dosando-se a taxa de aparecimento e desaparecimento de LDH-1 no sangue perifrico, com picos entre 35-43 horas aps o aparecimento dos sintomas. 1.2.7. Corpos Cetnicos Os corpos cetnicos (CC) so formados no fgado em decorrncia do metabolismo excessivo de cidos graxos atravs da -oxidao. Esse processo, como j mencionado anteriormente, consiste na degradao dos cidos graxos nas mitocndrias atravs da liberao progressiva de fragmentos de dois carbonos, na forma de acetil Coenzima A (acetil CoA). Durante um jejum prolongado, quando a glicemia encontra-se muito baixa, os nveis de cidos graxos elevados, os nveis de insulina baixos e os de glucagon altos, h estmulo para a gliconeognese, que ocorre principalmente no fgado, e desvia o oxaloacetato do ciclo do cido ctrico. A gliconeognese aumentada necessria porque alguns rgos nobres, como o crebro, utilizam principalmente a glicose como fonte energtica. Desta forma, ocorre o acmulo de acetil CoA pelo metabolismo excessivo de cidos graxos, e diminuio da via do cido ctrico devido ao desvio do oxaloacetato para a gliconeognese. Com esse acmulo, ocorre aumento na produo de corpos cetnicos pelo fgado que se formam pela unio de duas molculas de acetil CoA. Inicialmente, formado acetoacetato, que transportado pelo sangue do fgado para diversos rgos que podem utiliz-lo como fonte energtica. O acetoacetato ainda convertido a -

13 hidroxibutirato ou acetona. Esses trs compostos so denominados corpos cetnicos (Figura 7).

Figura 7. Sntese dos Corpos Cetnicos. Duas molculas de acetil CoA se juntam e formam o acetoacetato, que pode se transformar em -hidroxibutirato ou acetona. Corpos cetnicos: acetoacetato, -hidroxibutirato e acetona.

Portanto, quando grande parte da energia do organismo provm do metabolismo das gorduras, como na inanio, nas dietas ricas em gorduras e no diabetes no tratado, aumenta a produo de corpos cetnicos. A utilizao desses compostos pelas clulas cardacas mediada pela enzima tiolase, que realiza a reao inversa e converte corpos cetnicos em duas molculas de acetil CoA. Como no miocrdio no ocorre gliconeognese e, nessas clulas, o oxalacetato no desviado do ciclo do cido ctrico, o acetil CoA formado segue nesta via, gerando energia para o corao. Nos diabticos descompensados, mesmo que a glicemia esteja elevada, a glicose no consegue ser absorvida pelas clulas insulino-dependentes, uma vez que o estmulo para a exposio dos transportadores GLUT 1 e GLUT 4 dado pela insulina no encontra-se ativo, por falta de ou resistncia a esse hormnio. Logo, observa-se uma intensa produo heptica de corpos cetnicos nesses pacientes, assim como uma grande utilizao desses substratos como fonte de energia pelos micitos cardacos, mesmo em situaes ps-prandiais. Vale ressaltar que o acmulo de corpos cetnicos na corrente sangunea (cetose), observado na diabetes no tratada, pode levar a um quadro de acidose metablica severa (cetoacidose) nesses indivduos.

14 1.3. PRINCIPAIS RESERVAS DE ENERGIA O corao possui reservas de energia que so poupadas para momentos de carncia energtica, como por exemplo, durante a isquemia. A isquemia a interrupo do fluxo sangneo para determinado rgo, diferente da hipxia, que a interrupo apenas da chegada de oxignio, podendo ou no haver fluxo sangneo. Durante uma isquemia, portanto, o corao fica privado tanto dos substratos energticos, como cidos graxos, glicose, lactato e corpos cetnicos, quanto de hormnios como glucagon e adrenalina. Para continuar funcionando, ento, os micitos cardacos utilizam suas principais reservas energticas: creatina-fosfato e glicognio. 1.3.1. Creatina-Fosfato O miocrdio utiliza as reservas de creatina fosfato, principalmente, para a manuteno da integridade da membrana plasmtica (mantm os canais dependentes de ATP). A creatina fosfato transfere fosfato ao ADP, formando creatina e restaurando os nveis de ATP, cuja produo est muito reduzida durante a isquemia. Essa reao catalisada pela enzima creatina fosfoquinase cardaca (CPK-MB). Essa mesma enzima tambm se localiza prximo membrana mitocondrial, e, nessa regio, quando as ofertas de oxignio e ATP so normalizadas, a CPK-MB restaura os nveis de creatina fosfato atravs da reao inversa. Assim, a creatina fosfato uma fonte energtica de curtssima durao. 1.3.2. Glicognio O glicognio um polissacardeo constitudo de vrias molculas de glicose, que forma grandes grnulos no citoplasma da clula cardaca. As molculas de glicognio esto em constante estado de turnover, como resultado das taxas variveis de sntese e degradao das mesmas. As vias de sntese e degradao do glicognio so realizadas por dois sistemas de enzimas diferentes. A sntese ocorre em altas taxas nos perodos ps-prandiais sob influncia da insulina, que aumenta a absoro da glicose e estimula a atividade da enzima glicognio sintase (Figura 1). A sntese do glicognio parece tambm acontecer aps intenso esforo cardaco ou aps isquemia, quando o glicognio depletado, sugerindo que a prpria diminuio dos nveis de glicognio capaz de estimular sua produo. No estado de jejum, embora haja falta de insulina, a sntese do glicognio ainda pode ocorrer, mesmo que em menor taxa, porque a glicognio sintase estimulada por altos nveis miocrdicos de glicose 6-fosfato, que resultam do bloqueio da via glicoltica. A energia requerida para a sntese do glicognio derivada de um composto fosfato de alta energia, uridina trifosfato (UTP), que formado a partir do ATP. J os dois principais mecanismos que levam glicogenlise so: (1) ativao da glicognio fosforilase pela adenosina monofosfato cclica (cAMP); ou

15 (2) na isquemia, por uma diminuio nos nveis de fosfato de alta energia. Um aumento em cAMP promove uma cascata de eventos que no final converte a enzima fosforilase b inativa fosforilase a altamente ativa:estmulo de catecolaminas -receptor adenilato ciclase cAMP * * ativao de protena quinase ativao da fosforilase b quinase * * mudana da fosforilase b fosforilase a degradao do glicognio

A glicognio fosforilase cataliza a reao em que uma ligao glicosdica, reunindo dois resduos de glicose no glicognio, sofre o ataque por fosfato inorgnico (Pi), removendo o resduo terminal no-redutor de glicose como glicose 1-fosfato. A fosforilase age repetitivamente nas extremidades noredutoras das ramificaes do glicognio, controlando assim o incio da glicogenlise durante hipxia ou isquemia. A continuao da degradao pode ocorrer apenas depois da ao de uma enzima de desramificao, que cataliza as reaes sucessivas que removem as ramificaes.

Funo do Glicognio Cardaco O glicognio cardaco uma fonte potencial de energia miocrdica, produzindo trs molculas de ATP durante a gliclise e a quantidade padro de ATP atravs do ciclo do cido ctrico em condies aerbicas. O glicognio tem o papel estabelecido como fonte de energia durante hipxia ou isquemia miocrdica. Alm dessas condies de curta durao, o turnover do glicognio pode contribuir substancialmente para a gliclise aerbica em um corao em trabalho normal, e pode ser oxidado preferencialmente glicose externa, especialmente logo depois de um estmulo -adrenrgico aumentado. Como o glicognio est situado nas proximidades do retculo sarcoplasmtico, seu turnover pode fornecer ATP no local para a bomba de captao de Ca2+. 1.4. DOENA CARDACA DA ESTOCAGEM DE GLICOGNIO A degradao do glicognio pode ocorrer em lisossomos das clulas cardacas atravs de uma outra via, dependente de -1,4 glicosidase. Quando esta enzima inativa, ocorre um acmulo muito grande de glicognio que pode levar a uma condio de glicogenlise cardiomeglica ou doena de Pompe (Figura 8). As membranas lisossomais se rompem devido ao acmulo de glicognio, com risco de destruio do msculo cardaco. A glicogenlise citoplasmtica, dependente de fosforilase e da enzima desramificadora, ocorrem normalmente.

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Figura 8. Eletromicrografia de Tecido Cardaco de Paciente com Doena de Pompe. (aumento de 6.500 X) A clula superior consiste de muitos elementos contrcteis intactos, com as terminaes e a lateral da fibra esfiapadas, e glicognio ligado membrana (seta descontnua). O citoplasma da clula inferior foi totalmente substitudo pelo glicognio (seta contnua). Verifica-se que os elementos contrteis ou mitocndrias no foram mantidos, e as membranas lisossomais rompidas flutuam livremente no glicognio.

1.5. REPERFUSO O corao irrigado pelas artrias coronarianas que, normalmente, adaptam-se ao aumento de demanda energtica. Caso isso no acontea, pode ocorrer hipxia por reduo do fluxo sanguneo no corao, causando leses reversveis ou irreversveis, dependendo do tempo de hipxia. Se as leses forem irreversveis, mesmo aps a reperfuso, no h restaurao das estruturas celulares, gerando reas de necrose. Por outro lado, quando as leses so reversveis, a velocidade de reperfuso deve ser definida pelo tempo de hipxia sofrido. Quanto maior o tempo de hipxia, menor deve ser a velocidade de reperfuso, pois a rpida restaurao do fluxo sangneo aps um longo perodo de hipxia gera aumento paradoxal da leso. Em situaes fisiolgicas, o metabolismo das bases nitrogenadas leva a formao de pequena quantidade de hipoxantina, que atravs da enzima xantina oxidase, na presena de O2, leva a formao de xantina e perxido de hidrognio (H2O2), que so rapidamente degradados. A isquemia, ao longo do tempo, leva ao esgotamento de fontes energticas como cidos graxos, glicose, fosfocreatina e glicognio, e ao acmulo de metablitos do ATP, como ADP, AMP, adenosina e inosina (Figura 9). Como o ATP nessas ocasies no pode ser regenerado, as ligaes fosfato de menor energia (ADP e AMP) tendem a ser utilizadas como fonte energtica para a tentativa de manuteno da maquinaria celular, gerando, portanto, o acmulo dessas substncias. O aumento da concentrao desses metablitos estimula a

17 formao de hipoxantina a partir de adenosina e inosina, atravs de reaes catalisadas por enzimas presentes no citoplasma das clulas cardacas. Quando o fluxo sangneo restabelecido, atravs do uso de trombolticos, por exemplo, o oxignio que chega ao miocrdio ativa a enzima xantina oxidase. Essa enzima utiliza a hipoxantina como substrato para gerar xantina e H2O2, que se acumula. Essa mesma enzima ainda pode utilizar a xantina como substrato para gerar cido rico. J o perxido de hidrognio formado pode dissociar-se em dois radicais livres hidroxila (OH). Essas espcies reativas peroxidam lipdios (os lipdios peroxidados tornam-se instveis e reativos, iniciando uma reao autocataltica em cadeia), reagem com protenas da membrana celular (aumentam a sua degradao) e provocam danos ao DNA (ruptura dos seus filamentos), agravando as alteraes em reas com leses ainda reversveis. O miocrdio possui mecanismos protetores antioxidativos contra esses radicais livres, mas como estes radicais esto sendo formados em alta velocidade, h discrepncia entre a sntese dos mecanismos protetores e dos radicais livres.

O2Gliclise Anaerbia Ciclo do cido Ctrico

Cadeia Respiratria

NADH FADH2

Lactato

Acidose Ltica

ADP/AMP Adenosina/Inosina

Reperfuso

Estoque de Glicognio

O2HipoxantinaXantina Oxidase

Xantina H2O2

cido ricoXantina Oxidase

Peroxidao de Lipdeos

HO

-

Modificao Oxidativa de Protenas

Danos ao DNA

Figura 9. Efeito da Reperfuso sobre o Metabolismo de Produtos de Degradao da Adenosina. Durante a hipxia, o metabolismo de adenosina e inosina leva ao acmulo de hipoxantina. A reperfuso, aumento repentino de O2, leva a uma ativao da enzima xantina oxidase, que transforma a hipoxantina em xantina e liberao de H2O2. A xantina posteriormente transformada em cido rico. O acmulo de espcies reativas de O2 leva a danos nos tecidos.

18 Quando a reperfuso ocorre gradualmente, apesar de haver muito substrato (hipoxantina) para a enzima xantina oxidase, o estmulo lento do oxignio permite que haja sincronia entre a produo de radicais livres e mecanismos antioxidantes de defesa celular. Durante a perfuso normal do miocrdio, com aporte de oxignio e nutrientes, a enzima xantina oxidase tambm est ativa. No entanto, nessas ocasies, os nveis de metablitos de ATP no esto elevados, pois o ATP est sendo sempre renovado. Portanto, no h formao em excesso de hipoxantina, o substrato da xantina oxidase. Assim, a formao de radicais livres no significante, pois os mecanismos celulares de proteo a esses radicais conseguem dar conta da pequena quantidade produzida. 1.6. MARCADORES BIOQUMICOS DE ISQUEMIA MIOCRDICA O dano celular provoca a ruptura da membrana plasmtica, com conseqente extravasamento do contedo intracelular para o interstcio. Atravs da drenagem venosa, essas substncias caem na corrente sangnea, permitindo que se estime ocorrncia de infarto atravs das suas dosagens. Os principais marcadores bioqumicos utilizados so as isoformas cardacas das troponinas T e I, mioglobina, CK-MB, e a enzima LDH-1. A troponina I o marcador mais especfico, mas demora um pouco para ter sua concentrao sangnea elevada; no entanto, seus nveis mantm-se altos entre 7 a 10 dias aps o episdio de infarto. A mioglobina o primeiro marcador a apresentar seus nveis elevados, mas apesar de ser muito sensvel, pouco especfica, pois sua concentrao aumenta aps qualquer injria muscular, no s do miocrdio. A CK-MB, uma isoforma cardaca da creatina fosfoquinase, e a LDH-1, isoforma cardaca da lactato desidrogenase, tambm apresentam alteraes mais tardias na corrente sangnea, mas as suas dosagens so realizadas de rotina, pois apresentam baixo custo e resultado satisfatrio. Todas essas enzimas devem ser dosadas periodicamente, e seus resultados anotados em um grfico, formando uma curva enzimtica e permitindo, assim, a confirmao do diagnstico, a monitorao da leso e a estimativa do tamanho do infarto do miocrdio.

Autor(es):Catarina A. Miyamoto Eduarda P. Redenschi Luize Gonalves Lima Russolina Zingali

19

UNIDADE 2

20

2. SISTEMA HEMOSTTICO

2.1. PRINCPIOS GERAIS Hemostasia o processo fisiolgico responsvel pela manuteno da fluidez do sangue e pela conteno da perda de sangue aps algum dano vascular, evitando perturbaes no fluxo sanguneo, alm de estar envolvido no incio do processo de reparo tecidual. O sistema hemosttico contribui ainda para o sistema de defesa, uma vez que previne ataques de microorganismos por formar uma rede de plaquetas e fibrina, que dissolvida mais tarde com o restabelecimento do fluxo sangneo normal. Simultaneamente hemostase, inicia-se um processo um pouco mais lento de formao de um novo tecido e revascularizao. Mas quais so os agentes participantes do processo de hemostasia? De maneira geral, podemos citar: Plaquetas; Parede vascular (especialmente endotlio e subendotlio); Fatores de coagulao e seus inibidores; Protenas plasmticas (fator de von willebrand, outras protenas de adeso, imunoglobulinas); ons Ca2+; Substncias orgnicas de baixo peso molecular (fosfolipdeos, prostaglandinas, etc); Citocinas e hormnios.

As interaes desses agentes podem ser estimuladas principalmente aps uma leso vascular, mas tambm em condies patolgicas como doenas autoimunes, aterosclerose ou cncer.

21 Mas por que, em condies fisiolgicas, essas interaes no ocorrem o tempo todo, se grande parte dos fatores envolvidos encontra-se circulante ou presente nos vasos sanguneos? A resposta que os fatores de coagulao, em sua maioria consistindo de protenas plasmticas, circulam na forma de zimognios, isto , pr-enzimas que requerem processamento por protelise para que se tornem ativas. Alm disso, a camada interna dos vasos, formada pelas clulas endoteliais, possui um papel preponderantemente anti-hemosttico. As clulas endoteliais so capazes de: Separar fisicamente o sangue do subendotlio (que a camada que possui substncias pro-hemostticas); Sintetizar e liberar prostaglandina do tipo PGI2 (prostaciclina) e xido ntrico, substncias que reduzem a resposta plaquetria a estmulos ativadores da hemostasia primria; Alm disso, possuem em sua membrana externa, em contato com o sangue, duas substncia anti-hemostticas: a protena trombomodulina e o glicosaminoglicano heparan sulfato (que ser discutido futuramente).

A figura abaixo demonstra como est o endotlio na hora em que a leso ocorre, ou seja, o endotlio intacto e, portanto, inibidor da hemostasia. Alm disso, o esquema direita demonstra o endotlio lesionado e sua ao trombognica.

Figura 10. Aes Endoteliais Opostas (Antirombtica Vs. Pr-Trombtica) em Diferentes Situaes. Repouso ( esquerda); ou frente uma leso ( direita).

Para o melhor entendimento do processo hemosttico, este dividido em fases: Hemostasia primria consiste na formao de tampo ou agregado plaquetrio; Hemostasia secundria ou coagulao consiste na formao de uma rede de fibrina (cogulo) encarregada de estabilizar a agregao plaquetria.

22 Aps a hemostasia secundria, ocorre a dissoluo do cogulo de fibrina. A essa fase denominamos fibrinlise. Cada captulo dessa unidade destinado a elucidar cada uma dessas fases, que esto esquematizadas com suas respectivas duraes na figura abaixo:

LESO

HEMOSTASIA PRIMRIA (1-5 min) Vasoconstrico (3-10 seg) Adeso plaquetria (segundos) Agregao plaquetria (minutos)

HEMOSTASIA SECUNDRIA (3-15 min) Ativao dos fatores de coagulao Formao de fibrina (minutos)

FIBRINLISE Ativao da fibrinlise (minutos) Lise do cogulo (horas)

Figura 11. Resumo das Fases do Processo Hemosttico.

23 2.2. HEMOSTASIA PRIMRIA Hemostase primria consiste em uma srie de eventos, os quais incluem vasoconstrico e adeso, ativao e agregao plaquetrias, como apresentado na figura abaixo.

Figura 12. Participao das Plaquetas no Processo de Hemostasia durante a Formao do Tampo. A) Processo de injria com exposio de agonistas plaquetrios; B) Adeso das plaquetas ao subendotlio; C) Mudana de forma da plaqueta com secreo de grnulos; D) Ligao plaqueta-plaqueta; E) Depsito de fibrina sobre o tampo plaquetrio.

2.2.1. Vasoconstrico Eficiente forma de prevenir perdas sanguneas, em especial na microcirculao. um processo mediado por uma interao do sistema nervoso autnomo, clulas musculares e diversos mediadores como serotonina, adrenalina e noradrenalina. Para modular a vasoconstrico e impedir que essa seja extrema e cause isquemia, a prostaciclina I2 e a liberao de xido ntrico pelo endotlio possuem ao vasodilatadora. A vasoconstrico extremamente rpida e eficiente para conter pequenos sangramentos. Para sangramentos maiores, so recrutadas as plaquetas. 2.2.2. Plaquetas: Sua Estrutura e Funes As plaquetas constituem o grupo celular mais importante da hemostasia. So fragmentos de clulas com formato discoidal, sintetizados na medula ssea, e representam uma forma especializada e madura dos megacaricitos. Sua

24 sntese estimulada pelo hormnio trombopoietina, que encontrado em baixas concentraes no plasma. O citoesqueleto da plaqueta contribui significativamente para a manuteno da sua forma discide e para a sua alterao de forma, que ocorre durante a fase de ativao plaquetria. Metabolicamente, as plaquetas perderam a capacidade de sintetizar protenas. Sua energia gerada essencialmente pela degradao da glicose e fosforilao oxidativa. Em geral, as plaquetas tornam-se ativadas e, portanto, pr-hemostticas, ao serem estimuladas por diferentes fatores. Por sua vez, as plaquetas ativadas secretam diversas citocinas, fatores de crescimento e outras protenas por meio de grnulos. A plaqueta contm dois sistemas internos de membrana: Sistema canalicular aberto, que formado por mltiplas invaginaes, semelhantes a uma esponja, que so visualizadas na superfcie da plaqueta. Durante a ativao plaquetria, a plaqueta secreta seus grnulos atravs desses canais. O sistema canalicular tambm fornece pseudpodes que so emitidos com a mudana de forma que a plaqueta sofre aps sua ativao. Sistema tubular denso, que constitudo por restos de reticuloendoplasmtico. Este sistema membranoso, que no se comunica com o exterior, serve como um local de depsito de clcio intracelular.

A forma como as plaquetas atuam na hemostase discutida abaixo e, didaticamente, dividimos essa participao plaquetria nas trs fases a seguir:

Adeso Plaquetria Essa etapa se inicia quando a plaqueta entra em contato com uma superfcie no fisiolgica, gerada por uma leso do endotlio. Tal leso faz com que o colgeno subendotelial seja exposto s plaquetas circulantes. A adeso inicia-se com a interao entre o colgeno e as plaquetas, que ocorre pela ligao direta do receptor plaquetrio glicoprotena Ia/IIa (GPIa/IIa) s fibrilas de colgeno. Outro receptor presente na superfcie das plaquetas, a glicoprotena Ib/IX/V (GP Ib/IX/V), tambm participa da interao plaqueta-colgeno, porm de maneira indireta. Este receptor se liga a uma protena plasmtica denominada fator de von WIllebrand (FwV), a qual, por sua vez, est ligada ao colgeno. O FvW age, portanto, produzindo uma espcie de gancho entre a plaqueta (mais especificamente o receptor plaquetrio GP Ib/IX/V) e o colgeno subendotelial. Cabe ressaltar que este ltimo exemplo de interao (GP Ib/IX/V-FvWcolgeno) determinante para a estabilizao da adeso plaquetria inicial ao espao subendotelial, especialmente sob alta fora de fluxo da corrente sangunea, permitindo a continuidade do processo de hemostasia primria. Assim, ambas as deficincias genticas de FvW (Doena de von Willebrand) ou

25 do seu receptor GPIb/IX/V (Sndrome de Bernard-Soulier) resultam em adeso plaquetria defeituosa e distrbios hemorrgicos, como demonstrado na figura abaixo.

Figura 13. Doenas Relacionadas Hemostasia Primria.

Fator de von Willebrand O FvW sintetizado nos megacaricitos e nas clulas endoteliais, e armazenado, respectivamente, em grnulos e em organelas especficas, denominadas corpos de Weibel-Palade. O FvW uma protena de alto peso molecular que forma multmeros extensos, sendo encontrado tanto no plasma (associado ao fator VIII) como em plaquetas, e, ainda, na regio subendotelial. Sua concentrao plasmtica aproximadamente 30% menor em indivduos do grupo sanguneo O. Este fator apresenta stios de ligao especfica aos receptores plaquetrios GPIb/IX/V, ao fator VIII, ao colgeno, e protena botrocetina, derivada de veneno de cobra. A funo de carregar o fator VIII de extrema importncia. A concentrao plasmtica do FvW de 50 nmol/L excedendo em quase 50 vezes a de FVIII (1 nmol/L). Ambas as protenas possuem grande afinidade uma pela outra e, portanto, praticamente todo o FVIII encontra-se ligado ao FvW. Este estabiliza e protege o FVIII da inativao proteoltica, transportandoo at o local da leso e aumentando, assim, sua concentrao local. Depois da ativao do FVIII, este se desliga do FvW, podendo ser inativado pela protena C.

26 Ativao Plaquetria Uma vez aderida, atravs da interao plaqueta-subendotlio eficientemente estabilizada pelo FvW, a plaqueta sofre um estmulo de ativao pela prpria ligao ao colgeno, alm da ao de outras substncias ativadoras os agonistas plaquetrios. O colgeno, a trombina, o ADP e a adrenalina, entre outros, so exemplos de agentes responsveis pelo processo de ativao plaquetria. Na tabela abaixo, esto os principais agonistas e seus respectivos receptores plaquetrios:

Agonista ADP Colgeno Epinefrina PAF -trombina Tromboxana A2

Receptor P2Y1 P2Y12 GP IV GP VI Receptor de Epinefrina Receptor de PAF GP Ib PAR 1 PAR 4 Receptor de tromboxana A2

Tipo de receptor Acoplados Protena G Canal de clcio Tirosina fosfatase Acoplado Protena G Acoplado Protena G Acoplados Protena G Acoplado Protena G

A ativao plaquetria induz vrios eventos, dentre os principais: Secreo dos grnulos e grnulos densos; Mudana de forma da clula o formato original da clula (discide) alterado para um formato esfrico com emisso de pseudpodes; Aumento nos nveis intracelulares de clcio; Alterao da composio lipdica da membrana externa; Exposio da GP IIb/IIIa.

Secreo de grnulos A ativao plaquetria iniciada pela ligao dos agonistas supracitados aos receptores da superfcie plaquetria, seguida pelo desencadeamento de uma cascata de fosforilao de protenas intracelulares que culmina, entre outras coisas, na liberao dos grnulos plaquetrios, os quais podem ser de trs tipos: grnulos densos, contendo clcio, serotonina, epinefrina e ADP; grnulos alfa, contendo FvW, fibronectina, trombomodulina, fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF) e uma enzima inativadora da heparina (fator plaquetrio 4);

27 lisossomas com endoglicosidases e heparinases.

Em especial, as liberaes de tromboxano A2 (TXA2) um derivado do cido araquidnico e ADP so de extrema importncia, por serem capazes de ativar ainda mais plaquetas, desencadeando finalmente a agregao plaquetria.

Mudana de forma da clula e aumento nos nveis intracelulares de clcio Os agonistas plaquetrios se ligam a seus receptores e estimulam a fosfolipase C, uma enzima que hidrolisa o fosfatidilinositol (PIP2) em dois componentes: o inositol trifosfato (IP3) e o diacilglicerol (DAG). O IP3 induz a liberao de clcio no citoplasma, proveniente do sistema tubular denso, alm de fosforilar a miosina, uma protena contrtil do citoesqueleto plaquetrio. Como resultado, a plaqueta muda a sua forma e torna-se capaz de degranular (liberar os seus grnulos, como explicado anteriormente). Com o aumento de clcio, a assimetria da membrana presena de fosfatidilserina exclusivamente na camada interna das clulas alterada, devido a mudanas na atividade das seguintes enzimas: Aminofosfolipdeo translocase ATP-dependente (ou flipase) transporta especificamente os lipdeos fosfatidilserina e fosfatidiletanolamina da camada externa para a camada interna da membrana da clula. Ativada em baixos nveis de clcio e inativa em altos nveis de clcio intracelular. Flopase ATP-dependente transporta inespecificamente fosfolipdeos da camada interna para a camada externa da membrana. Ao lenta. Escramblase transporta inespecificamente fosfolipdeos da camada interna para a externa e vice-versa. Ao rpida. Inativa em baixos nveis de clcio e ativa em altos nveis de clcio intracelular.

Alm disso, a alta concentrao de clcio tambm ativa as chamadas fosfolipases A2, que liberam cido araquidnico a partir de fosfolipdeos de membrana, como a fosfatidilcolina para a produo de tromboxano A2, um potente ativador de plaquetas. O cido araquidnico sofre a ao da enzima ciclooxigenase, produzindo compostos como PGG2 e PGH2. A partir destes, a enzima tromboxano sintetase produz tromboxano A2 (TXA2), o qual, por sua vez, age na prpria plaqueta, estimulando fosfolipases de membrana um mecanismo de retroalimentao positiva. Alterao da composio lipdica da membrana externa O aumento nos nveis de fosfatidilserina na membrana externa da plaqueta ativada fundamental para a montagem de alguns complexos da coagulao

28 sangunea, como demonstrado abaixo e melhor aprofundado no captulo de coagulao sangunea.

Figura 14. Perda de Assimetria Fosfolipdica da Membrana Plasmtica na Presena de Clcio. Efeito regulatrio do clcio sobre a atividade de enzimas transportadoras de fosfolipdios e exemplo do papel da exposio de fosfatidilserina na montagem do complexo pr-coagulante protrombinase.

DAG O DAG, produzido na via ativada por fosfolipase C, estimula ainda a protena quinase C (PKC), que fosforila a miosina e conduz as plaquetas profunda mudana na forma plaquetria.

Agregao Plaquetria A agregao plaquetria estritamente dependente da ativao plaquetria, especialmente devido induo da maior exposio da GP IIb/IIIa, presente na membrana da plaqueta, ao seu ligante fibrinognio (decorrente de mudanas conformacionais dessa glicoprotena), e secreo de ativadores plaquetrios contidos nos grnulos. Este fenmeno de agregao consiste em uma interao fsica entre as plaquetas, mediada pela protena plasmtica fibrinognio, que possui uma seqncia especfica de aminocidos que reconhecida pela GP IIb/IIIa. O resultado final desta fase a formao do agregado plaquetrio, capaz de impedir o sangramento at que a hemostase secundria (coagulao) esteja concluda.

29 2.2.3. Distrbios na Hemostasia Primria Quando h deficincia em algum dos fatores envolvidos na hemostasia, h um prejuzo em todo o processo descrito, que o que caracteriza os distrbios hemostticos. Os distrbios hemostticos congnitos mais importantes esto descritos na tabela abaixo. Alm dos congnitos, tambm h distrbios adquiridos, como pelo uso excessivo de antiinflamatrios, de cido acetilsalislico, anti-histamnicos ou de psicotrpicos. H tambm distrbios numricos, de alterao na produo de plaquetas, como a aplasia medular, leucemia e produo reduzida por deficincia de folato ou vitamina B12, ou de destruio excessiva: coagulao intravascular disseminada (CID), envenenamento botrpico e esplenomegalia.

Distrbio

Freqncia ocorrncia Relativamente comum

da

Descrio

Gravidade do sangramento

Doena de von Willebrand

Fator de von Willebrand defeituoso ou ausente, a protena que mantm as plaquetas unidas parede vascular lesada, ou deficincia do fator VIII da coagulao

Leve a moderado na maioria dos casos. Pode ser severo nas pessoas que apresentam nveis muito baixos do fator de von Willebrand

Doena da reserva de armazenamento Sndromes de Chdiak-Higashi e de HermanskyPudiak Disfuno do tromboxano A2

Relativamente incomum

Grnulos das plaquetas defeituosos que impedem a aglomerao das plaquetas

Leve

Raras

Formas especiais de doena do fundo de armazenamento

Varivel

Muito rara

Resposta plaquetria comprometida aos estmulos de aglomerao

Leve

Trombastenia de glazman

Rara

Ausncia de GP IIb/IIIa na superfcie da plaqueta que so necessrias para a aglomerao plaquetria

Varivel

Sndrome de Bernard-Soulier

Rara

Ausncia de protenas na superfcie da plaqueta e plaquetas anormalmente grandes que no aderem s paredes vasculares lesadas

Varivel

30 2.2.4. Importante Observao Farmacolgica O cido acetilsalislico, comercialmente conhecido como aspririna, capaz de interferir no processo de hemostasia primria. A aspirina, que inativa a enzima ciclooxigenase, evita a sntese de PGH2 plaquetrio e, consequentemente, de tromboxano A2, o que dificulta uma eficiente ativao plaquetria. Alm disso, discute-se seu efeito limitador sobre a capacidade do colgeno de ativar as plaquetas, uma vez que o colgeno , por si s, indutor fraco da ativao plaquetria, mas se torna um indutor poderoso na presena de PGH2. Dessa forma, percebemos que a aspirina possui um papel antitrombtico, ou seja, de inibir a hemostase, mas que no ocorre to intensamente em indivduos normais pela compensao da ativao plaquetria por outros agonistas, tais como a trombina. Por outro lado, no endotlio, a aspirina tambm atuar inibindo a ciclooxigenase endotelial. Esta produz PGG2 que passa a PGH2, o qual, no endotlio, se converte em PGI2 um inibidor da hemostasia primria. Logo, no endotlio, a aspirina agiria como um agente pr-hemosttico. Mas porque ser que a sua ao predominante continua sendo antitrombtica? Porque apesar de a aspirina agir na mesma enzima, tanto na plaqueta quanto no endotlio, este ltimo possui a capacidade de sintetizar novas protenas e, dessa forma, rapidamente repe seus nveis de ciclooxigenase. J nas plaquetas, a sntese protica no ocorre, e a enzima no reposta, inibindo, portanto, a produo de PGH2 e consequentemente de tromboxano A2, o que dificulta a ativao plaquetria. O esquema abaixo busca resumir toda essa produo dos derivados do cido araquidnico.

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CIDO ARACDNICOInibida por

ciclooxigenase PGG2

aspirina

Tromboxana sintetase (nas plaquetas) PGH2 TROMBOXANA A2

Prostaciclina sintetase (no endotlio)

PGI2

Assim, concluem-se os conceitos relacionados hemostasia primria, cujos pontos mais importantes so: As fases desse processo; A participao das plaquetas e de seus receptores; A ao da aspirina.

A partir de agora, passaremos prxima etapa, hemostasia secundria, mas tendo em mente que a hemostasia primria no uma fase separada da secundria. Os processos de ativao ocorrem todos juntos, somente com diferena temporal para os efeitos apresentados que fazem com que sejam agrupados em fases. Na verdade, essa diviso meramente didtica, e essas fases interligam-se, estimulam-se e inibem-se, como ser explicado a seguir.

32 2.3. HEMOSTASIA SECUNDRIA: COAGULAO SANGNEA A coagulao sangnea constitui a segunda etapa do processo hemosttico. Apesar da diviso didtica e conceitual desta fase, como veremos mais adiante, esta etapa est naturalmente relacionada hemostase primria. O sangue contm diversas protenas plasmticas, dentre as quais os fatores de coagulao, que esto envolvidos em uma seqncia rigorosamente controlada de reaes de ativao, as quais resultam, em ltima instncia, na formao de trombina e, subsequentemente, fibrina. Esta srie de eventos leva ativao parcial dos fatores de coagulao, que circulam em um estado precursor inativo chamado de zimognio (zimo= enzima, gnio= que d origem). O processo de ativao primariamente uma seqncia de clivagens proteolticas em locais especficos tambm conhecida como protelise limitada , um mecanismo muito comum a vrios outros sistemas do organismo, tais como o sistema complemento, sistema de regulao da presso sangunea via angiotensina/renina ou sistema de cininas, ativao de metaloproteases de matriz, etc. A enzima, nesta constelao, um fator de coagulao ativado, e o substrato (em muitos casos tambm ligados a superfcie), um zimognio de um fator de coagulao diferente que se torna ativado depois de uma parte da molcula ter sido clivada (o peptdio de ativao). Em alguns casos, vrias clivagens proteolticas podem ser requeridas, porm nem sempre o peptdeo de ativao liberado, e isto se deve ao fato de o mesmo estar ligado molcula residual via pontes dissulfeto ou por ligao no covalente. No caso dos fatores homlogos VIII e V, vrias clivagens proteolticas ocorrem, mas as cadeias de protenas individuais finais ainda formam uma molcula ligadora de clcio relativamente estvel (ver figura 15 para stio de clivagem nos fatores de coagulao). A clivagem das ligaes do peptdio de ativao induz mudanas conformacionais considerveis que expem o stio ativo da enzima recm gerado, geralmente escondido dentro da pr-enzima. Na maioria dos casos, os passos de ativao proteoltica so mais ou menos restritos a superfcie, porque muitos dos fatores de coagulao ou de seus precursores tm locais de ligao especfica a fosfolipdios, ons metlicos, receptores especficos ou co-fatores localizados na superfcie de diferentes tipos de clulas. Todos os fatores de coagulao com atividade proteoltica pertencem classe de serino-proteases (que contm o resduo de aminocido serina no stio cataltico), as quais compartilham significativa seqncia de homologia. Em certas doenas, uma ativao inespecfica de fatores de coagulao pode ser mediada por uma variedade de outras proteases de microorganismos, liberadas por clulas tumorais, leuccitos ativados ou tecidos danificados. Um caso especial so as proteases de animais venenosos, tais como certas espcies de serpentes que contm poderosos ativadores da coagulao (e inibidores) nos seus venenos, e podem induzir mudanas macias associadas hemostase, com severas complicaes tromboemblicas ou hemorrgicas.

33 2.3.1. Fatores da Coagulao Os fatores de coagulao representam uma famlia de protenas plasmticas altamente glicosiladas. A maioria deles (exceto Fator II protrombina e Fator I fibrinognio) encontrada em concentraes muito baixas. exceo do fator tecidual (TF) que est ligado membrana de clulas do subendotlio, todos os fatores da coagulao so protenas plasmticas que requerem uma etapa de ativao proteoltica. A pr-calicrena e o cininognio de alto peso molecular HMWK , e tambm o Fator XII esto envolvidos na ento chamada fase de contato da coagulao sangunea ou via extrnseca, que parece ser de mnima importncia para a hemostase fisiolgica.

Fator Fibrinognio *Protrombina Fator V *Fator VII Fator VIII *Fator IX *Fator X Fator XI Fator XIII Fator XII Pr-calicrena HMWK

Peso Molecular (Da) 330.000 72.000 300.000 50.000 300.000 56.000 56.000 160.000 320.000 76.000 82.000 108.000

Concentrao Plasmtica (g/mL) 3.000 100 10 0,5 0,1 5 10 5 30 30 40 100

Concentrao Necessria para Hemostase (% concentrao normal) 30 40 10-15 5-10 10-40 10-40 10-15 20-30 1-5 0 0 0

*Fatores dependentes de vitamina K Alguns dos fatores da coagulao so dependentes de vitamina K, isto , uma srie de reaes enzimticas que resultam na modificao (gamacarboxilao) de cadeias laterais de cido glutmico presentes no chamado domnio-Gla dessas protenas dependem de vitamina K. Gla o acrnimo para cido gama-carboxiglutmico (do ingls gamma-carboxyglutamic acid). Resduos Gla- so requeridos para ligao de ons clcio, co-fatores pivs da maioria das reaes da cascata de coagulao. Entretanto, a ligao do clcio no est restrita a apenas o cido gama-carboxiglutmico. importante observar que mais de um resduo de cido glutmico modificado por esta reao, somente no domnio Gla. Antagonistas da vitamina K (coumadim / Warfarin, phenprocoumon / Marcumar / Falithrom, acenocoumarol / Sintrom) so drogas que so ministradas para profilaxia e tratamento de doena tromboemblica. Sua funo inibio de gama-carboxilao, o que leva a formao de fatores de coagulao em parte inativos. Estes anticoagulantes orais inibem o sistema de reciclagem

34 (reduo) enzimtica de uma forma oxidada e inativa de vitamina K (vitamina K epxido) que gerada nas reaes de gama carboxilao.

Figura 15. Representao Esquemtica da Seqncia de Alguns Fatores da Coagulao.

35

Figura 16. Formao do Domnio Gla. A reao de gama carboxilao dos fatores da coagulao ocorre no fgado, e pode ser bloqueada por antagonistas da vitamina K como a varfarina. Em (A) est representada a reao de gama carboxilao em resduos de cido glutmico, catalisada pela enzima gama-glutamil carboxilase. Esta converte uma forma reduzida de vitamina K em vitamina K epxido (oxidada), que por sua vez reciclada a sua forma reduzida pela enzima vitamina K epxido redutase (em B), a qual alvo de inibio pela varfarina e outros cumarnicos relacionados.

2.3.2. Vias de Ativao da Coagulao Sangunea A ativao do sistema de coagulao pode ser separada em duas vias: a via extrnseca ou via do fator VII, cuja ativao se d pelo fator tecidual; e a ativao por contato com superfcies no-fisiolgicas, tambm chamada de ativao intrnseca ou via de contato, onde h participao das protenas prcalicrena (PK) e cininognio de alto peso molecular (HMWK), e dos fatores XII, XI e IX (FXII, FXI, FIX). Estas duas vias no esto diretamente separadas; elas interagem em diversas etapas. As duas vias se encontram no fator X. Etapas restantes so comuns a ambas as vias. Por razes prticas, uma vez que os dois principais ensaios de coagulao (TAP e PTTa) separaram estas vias, comum trat-las individualmente.

Via Extrnseca A ativao fisiolgica da coagulao sangunea mediada quase exclusivamente por meio da via do fator tecidual. Fator tecidual (TF) uma protena de membrana que usualmente no encontrada em quantidade suficiente na superfcie do endotlio, clulas brancas do sangue ou no plasma. Entretanto, o subendotlio constitutivamente rico em TF, o qual tambm tem sido localizado em quase todos os tecidos. Placas aterosclerticas e moncitos estimulados com lipopolissacardeos (endotoxina LPS) ou a citocina prinflamatria interleucina 1 (IL-1) tambm podem gerar TF.

36 ou estmulos de ativao celular, ou sintetizado de novo por leuccitos/clulas sanguneas, respectivamente. Os indutores fisiolgicos da biossntese do fator tecidual so diversas citocinas, tais como IL-1, fator de necrose tumoral (TNF), trombina, protena C 5a (do sistema complemento), a anaflatoxina gerada do complemento C5, e provavelmente vrios outros. O fator tecidual consiste de um domnio intracelular, uma poro transmembrana e um domnio extracelular, que homlogo ao de receptores de citocinas. Aps injria vascular, TF exposto no subendotlio, e o contato do fator tecidual com o fator VIIa leva formao de um complexo ativo, chamado de complexo tenase extrnseco, o qual pode ativar o fator X, ainda mais eficientemente na presena de fosfolipdios (PL) e ons clcio. De acordo com outros resultados, concentraes muito baixas de fator VIIa parecem estar sempre presentes no sangue (meia vida 2,5 h) e so responsveis pela ativao inicial de tal complexo nos locais onde h TF exposto. O sistema, simplificadamente, pode ser ilustrado como uma srie de etapas subseqentes: TF/FVIIa + FX (+ Ca2+ + PL) FXa FXa + FII (protrombina) FIIa (Trombina) FIIa + Fibrinognio Fibrina Na realidade, entretanto, o sistema muito mais complexo. Um elemento muito importante da hemostase o envolvimento de reaes de feedback positivo, caracterizadas pela participao de um produto da reao em sua prpria formao, levando a uma amplificao macia. Na hemostase, o feedback positivo provido pela ativao de uma prenzima pelo produto de sua reao, a enzima resultante, (p.ex., a ativao de FVII pelo prprio FVIIa na presena de TF e ons clcio), e pela ativao de cofatores que aceleram as reaes enzimticas. As reaes de feedback positivo esto envolvidas em muitas etapas na cascata de coagulao. Na via extrnseca, provavelmente o feedback mais importante alcanado depois que o fator V ativado pelos primeiros traos de trombina. Junto com Ca++ e PL, FVa acelera a ativao de protrombina pelo FXa significativamente, enquanto a forma no ativada no efetiva. O complexo FXa, FVa, PL e clcio (complexo protrombinase) muito mais efetivo na gerao de trombina que o FXa sozinho, e parcialmente protegido contra inibio por inibidores tais como a antitrombina. A contribuio do FVIII, FIX e FXI para a formao de trombina Pacientes com deficincias de FVIII ou FIX (hemoflicos A e B, respectivamente) so muito mais comuns que pacientes com uma deficincia em um dos fatores extrnsecos tpicos. Isso ilustra que a deficincia completa ou muito severa de FVII, FX, FV e protrombina provavelmente letal. Mas uma grave deficincia de FVIII e IX tambm associada com hemorragia macia, especialmente no tecido conjuntivo das articulaes. No caso de deficincia de FXI (hemofilia C), a tendncia ao sangramento relativamente fraca em alguns

37 pacientes. Outros sofrem de uma ditese hemorrgica severa, similar queles das clssicas hemofilias A e B. Os achados clnicos provam que todos os fatores devem estar envolvidos na ativao da coagulao. O FVIII circulante est ligado ao FvW e ativado pela trombina:

Figura 17. Esquema de Ativao do FVIII pela trombina.

O envolvimento de FVIII, FIX e FXI na formao de trombina foi reinvestigado atravs dos ltimos anos e isso levou a uma descrio revisada da coagulao sangunea, na qual a ento chamada via intrnseca no representa mais um papel importante a respeito da formao de trombina fisiolgica. J h um longo perodo, sabia-se que, na presena de baixas concentraes de TF, no apenas fator X, mas tambm fator IX era ativado por FVIIa. Sob essas condies, a taxa de formao de trombina tornou-se tambm dependente deste FIXa e de FVIIIa (co-fator do FIXa, juntos formam o complexo tenase intrnseco, na presena de Ca++ e PL). Usando um ensaio imune para o peptdio de ativao do fator IX, que liberado por ativao, foi demonstrado que FVIIa in vivo de longe o ativador mais relevante de FIX. Sob as condies do ensaio de tempo de protrombina (TAP), entretanto, no qual um grande excesso de TF usado, a ativao da coagulao independente dos fatores IX e VIII. Mais recentemente, descobriu-se que a

38 trombina capaz de ativar tambm o FXI, ativador conhecido do FIX. Essa etapa provavelmente dependente da presena de superfcies negativas ou compostas. De acordo com dados mais recentes, FXI ativado quando altos nveis de trombina so gerados, que um processo em andamento at mesmo quando fibrina j est formada. Isto explica por que a deficincia do FXI no detectada em ensaios de coagulao para a via extrnseca, nos quais a taxa para formao de fibrina (usualmente os primeiros filamentos de fibrina detectados) determinvel.

A Fase de Contato da Coagulao Sangunea e a Via Intrnseca A interao do sangue com superfcies artificiais, especialmente superfcies que so negativamente carregadas tais como vidro ou plsticos (em dispositivos mdicos), aciona uma complexa interao de vrias protenas que requerem uma superfcie negativamente carregada para uma mudana conformacional que as ativa. Superfcies biolgicas negativamente carregadas tambm podem ser representadas por certos componentes de membrana, tal como sulfatdeos. Eles so expostos ao sangue em casos de injrias. Este processo chamado de fase de contato da coagulao sangunea. A fase de contato tambm caracterizada por reaes de feedback positivo. Na presena de cininognio de alto peso molecular (HMWK ou HK), prcalicrena ativada pelo FXIIa a calicrena, que por sua vez ativa mais FXII e assim por diante. O FXIIa, por sua vez, pode tambm ativar FXI a FXIa. O nico fator envolvido que parece ser um fator fisiolgico de coagulao o FXI. Uma deficincia desta protena (hemofilia C) pode levar a problemas hemorrgicos leves e, s vezes, at mesmo severos, enquanto que a deficincia de FXII e HMWK ou pr-calicrena no determinam quadros hemorrgicos. O FXIa ativa FIX a FIXa. Todas as etapas subseqentes requerem ons clcio e so fosfolipdeos dependentes. FIXa livre ativa FX, mas esta reao no muito efetiva. To logo alguma trombina formada, entretanto, FIXa forma um complexo com FVIIIa (que ativado pela trombina). Junto com PL (na superfcie de plaquetas) e ons clcio, este complexo (tenase intrnseco) ativa FX com eficcia muito maior. A via intrnseca, especialmente a fase de contato, parece ser um tanto menos importante que a via extrnseca. Existe crescente consenso de que o gatilho fisiolgico tpico da coagulao, em sade e doena, o fator tecidual. Cabe ressaltar, entretanto, que a ativao por contato desempenha um papel importante quando o sangue exposto a superfcies no biolgicas, tal como durante cirurgia de by-pass cardiopulmonar, na qual a inibio da ativao por contato rotineiramente realizada com aprotinina, um inibidor de protease polivalente. Aparentemente, o benefcio teraputico alcanado com aprotinina, entretanto, preferencialmente a inibio da fibrinlise induzida pela ativao por contato (discutido em mais detalhes na parte de fibrinlise).

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Figura 18. Resumo das Vias Extrnseca e Intrnseca da Coagulao. Observe a ligao comum entre ambas as vias no nvel de ativao do fator IX. PL=fosfolipdios; HMWK=cininognio de alto peso molecular.

40 Um Modelo Recente na Coagulao Sangunea Fisiolgica Resultados mais recentes proveram evidncias para um modelo baseado em superfcies celulares hemostticas que enfatiza a importncia de receptores celulares especficos para as protenas da coagulao. J h algum tempo foi reconhecido que plaquetas fornecem fatores que apiam a ativao de protrombina, uma vez que FXa ligado superfcie da plaqueta pode levar gerao de trombina. De acordo com este novo modelo, a coagulao no ocorre simplesmente como uma cascata, mas em trs estgios sobrepostos: Fase 1: Iniciao Ocorre na superfcie de uma clula que expe fator tecidual, p.ex. em clulas subendoteliais ou moncitos ativados. A formao do complexo tenase extrnseco (TF/FVIIa) resulta na formao de FXa e FIXa, e na gerao de pequenas quantidades de trombina. Essa fase de iniciao facilmente desligada pelo inibidor da via do fator tecidual (TFPI), como veremos mais adiante. Fase 2: Amplificao A trombina formada na fase inicial essencial para ativao das plaquetas e dos co-fatores das enzimas FXa e FIXa, respectivamente FV e FVIII, de modo a permitir uma amplificao da gerao de trombina em larga escala. Dessa forma, o FXa, agora constituinte do complexo protrombinase, est protegido da inibio por antitrombina. Fase 3: Propagao Grandes quantidades de trombina so geradas na superfcie da plaqueta ativada, onde a exposio de fosfolipdios aninicos, especialmente fosfatidilserina, essencial para a montagem dos complexos tenase intrnseco (FIXa/FVIIIa/FX) e protrombinase (FXa/FVa/protrombina). Nveis mais elevados de trombina levam tambm ativao de FXI, que est disponvel no plasma, mas tambm liberado de plaquetas (atravs dos grnulos alfa). A superfcie da plaqueta ativada protege ainda o FXIa de inibio por inibidores plasmticos. FXIa pode induzir a formao de trombina de forma explosiva, por ativao mais eficiente de FIX na superfcie da plaqueta ativada. Obviamente, uma formao adicional macia de trombina atravs dessa via ocorre quando a fibrina j estiver formada.

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Figura 19. Reaes da Coagulao Dependentes de Superfcies de Membrana. Representao esquemtica dos principais complexos enzimticos da coagulao, onde cada serino-protease est associada ao seu co-fator protico e substrato apropriados, em uma superfcie de membrana expondo Fator Tecidual (no caso do complexo tenase extrnseco) ou fosfatidilserina, representada em azul (no caso dos complexos tenase intrnseco e protrombinase).

Formao de Polmero de Fibrina Solvel e Fibrina Estabilizada A fase final da cascata de coagulao leva formao de fibrina insolvel por converso da protena solvel no plasma, o fibrinognio, pela trombina em uma srie de reaes proteolticas. Fibrinognio uma grande protena plasmtica multimrica que formada de duas cadeias alfa, beta, gama. As cadeias de protenas individuais do fibrinognio so conectadas por diversas ligaes dissulfeto. A molcula forma uma estrutura nodular que pode ser depois segmentada em um domnio-E central e dois domnios-D (Figura 20).

Figura 20. Desenho Esquemtico aa Clivagem de Fibrinognio pela Trombina. Este esquema mostra os fibrinopeptdios A (FPA) e B (FPB), expostos no domnio-E central, sendo cortados pela trombina. O produto da reao chamado des-AB-fibrina, monmeros de fibrina, ou, depois da formao de oligmeros, fibrina solvel.

42 A liberao de fibrinopeptdios FPA e FPB (um processo gradual levando primeiro a des-A-fibrina e um tanto depois a des-AB-fibrina) gera mudanas significativas na estrutura geral da molcula e induz polimerizao. Aps certo tamanho molecular ter sido atingido, a solubilidade da fibrina reduzida significativamente. Isso leva formao de um polmero insolvel, que forma uma rede de cadeias ramificadas, o cogulo. A trombina permanece ligada ao cogulo e ainda ativa. Em adio trombina, existem diversas enzimas de cobras venenosas que tambm podem gerar fibrina (Reptilase, uma protease semelhante trombina proveniente de Bothrops atrox, Ancrod e vrias outras). Algumas enzimas de cobras venenosas cortam apenas FPA ou FPB. Defibrinao teraputica com enzimas de cobras venenosas parecem ser benficas no acidente vascular cerebral (AVC) e outras doenas tromboemblicas arteriais. Em contraste com a trombina, batroxobin e enzimas de cobras venenosas altamente purificadas similares no so inibidas por antitrombina ou inibidores de ao rpida similar, e no ativam plaquetas ou FV, FVIII, FXI ou FXIII. Portanto, estas enzimas so ferramentas valiosas na investigao da formao de fibrina e retrao do cogulo. Fator XIII A formao de des-A-fibrina por trombina leva quase simultnea ativao de outro fator da coagulao, FXIII, em uma reao dependente de clcio. FXIIIa age como uma transglutaminase e faz uma ligao cruzada entre as molculas de fibrina. De acordo com dados recentes, o substrato de FXIIIa j a des-Afibrina. FXIIIa tambm promove a ligao cruzada entre diversas outras protenas e o cogulo de fibrina. Dentre estas protenas, esto a alfa2-antiplasmina, inibidor central do sistema de fibrinlise, e o inibidor da fibrinlise ativado por trombina (TAFI). Esses inibidores previnem o cogulo de ser dissolvido precocemente.

Figura 21. Converso de Fibrinognio em Fibrina (1) e Estabilizao do Cogulo de Fibrina pelo Fator XIIIa (2).

43 A ligao cruzada mediada pelo FXIIIa a formao de uma ligao isopeptdeo entre cadeias laterais de lisina e glutamina especficas no substrato. Essa reao libera uma molcula de amnia/ligao cruzada (Figura 22).

Figura 22. Ligao Cruzada Isopeptdeo Catalisada pelo Fator XIIIa.

A fibrina forma uma rede tridimensional. In vivo, um cogulo de fibrina contm clulas aprisionadas tais como plaquetas, eritrcitos e clulas brancas do sangue. Devido baixa atividade fibrinoltica inicial, o cogulo relativamente estvel por algum tempo. Desde de que o cogulo ainda tenha trombina ativa, pedaos dissolvidos do cogulo (embolia) podem transportar um material altamente trombognico para outros segmentos de vasos sanguneos, que podem ento ser o incio de um novo evento tromboemblico (p.ex., um infarto do miocrdio ou um AVC). A fixao direta de filamentos de fibrina a diferentes clulas tais como plaquetas, fibroblastos, clulas do msculo liso e a protenas adesivas garante que a rea afetada esteja mecanicamente (impacto do fluxo) e quimicamente (impacto de enzimas fibrinolticas ou proteases de leuccitos) bem protegida. Isto limita a perda de sangue no caso da injria de um vaso, protege contra invaso por agentes infecciosos em feridas abertas, e previne os filamentos de fibrina e clulas aprisionadas de formar mbolos, que podem ocluir vasos sanguneos em outras reas. 2.3.3. Deficincia dos Fatores da Coagulao

44 Deficincias Hereditrias As deficincias congnitas da maioria dos fatores da coagulao so relativamente raras. Deficincias leves de fatores da coagulao (usualmente abaixo de 30% da atividade normal ou at mesmo mais baixo), no levam a ditese hemorrgica espontnea. Entretanto, a combinao com um fator de risco diferente, tal como trombocitopenia, uso de AAS (cido acetilsaliclico) e outros, pode ser perigoso, especialmente quando requerida uma cirurgia. Portanto, uma anamnese cuidadosa obrigatria, e testes de coagulao que investiguem a funo das vias de coagulao devem sempre ser efetuados, incluindo uma investigao da funo plaquetria, que provavelmente mais importante que o sistema plasmtico. As deficincias hereditrias que levam a ditese hemorrgica so mais conhecidas como hemofilias, e trs tipos diferentes so descritos: a Hemofilia A, conhecida tambm como hemofilia clssica e que se caracteriza pela ausncia do fator VIII da coagulao; a Hemofilia B, tambm conhecida como doena de Christmas, e que se caracteriza pela ausncia do fator IX; e a Hemofilia C, que determinada por gene autossmico dominante no relacionado com o sexo e caracteriza-se pela ausncia de fator XI.

Terapia Deficincias de fatores da coagulao so usualmente tratadas com fatores purificados e concentrados de plasma agregado de diferentes doadores, ou de origem recombinante, especialmente para a maioria das formas de hemofilia, as deficincias de FVIII (hemofilia A) e FIX (hemofilia B). Deficincias de alguns dos outros fatores da coagulao so usualmente tratadas com plasma fresco congelado (ou liofilisado) ou com PPSB, uma frao do plasma que rica em fatores da coagulao dependentes de vitamina K. PPSB tem sido utilizado cuidadosamente porque algumas marcas podem conter fatores da coagulao ativados tal como FIXa. Apenas para alguns subtipos de deficincia do fator de Von Willebrand, a peptdio hormnio desmopressina (que libera FvW de clulas endoteliais) pode ser usada como uma alternativa menos cara, mas muito efetiva. Terapia concentrada requer monitorao cuidadosa.

Inibidores Uma complicao perigosa da terapia concentrada o desenvolvimento de inibidores, autoanticorpos, que agem diretamente contra o respectivo fator da coagulao. O desenvolvimento de inibidores pode ter tambm causas genticas. No caso de deficincia do FVIII, a formao do inibidor afeta aproximadamente 1/3 dos pacientes. Inibidores podem tambm ser formados espontaneamente ou depois do parto. Alguns inibidores desaparecem espontaneamente, outros requerem tratamento com frmacos imunossupressores e/ou altas concentraes de fatores da coagulao que esto associados com altos custos. Ademais,

45 concentrados de FVIII de porcos e concentrados de fatores da coagulao ativados (FEIBA = atividade desviadora do inbidor do fator FVIII), e tambm FVIIa recombinante so usados.

Deficincia adquirida Deficincias adquiridas dos fatores da coagulao (e seus inibidores fisiolgicos) so achadas freqentemente em pacientes com doena heptica (a maioria dos fatores da coagulao so sintetizados no fgado), durante septicemia, no cncer, depois de trauma, queimaduras e vrias outras doenas ou alguns tratamentos especficos, tal como a terapia com L-asparginase no cncer. Uma situao muito perigosa o quadro clnico de coagulao intravascular disseminada (CID), tambm conhecido como coagulopatia de consumo. Essa doena ameaadora da vida no incomum em pacientes com doena heptica, cncer e especificamente durante septicemia. O quadro clnico caracterizado pela ocorrncia simultnea de sintomas de hemorragia severa e trombose, induzida por desequilbrio na hemostasia. O consumo de fatores da coagulao e da fibrinlise e seus inibidores, diminuio da contagem de plaquetas e fibrinognio, e a ocorrncia de marcadores de ativao do sistema hemosttico (p.ex., um aumento da fibrina solvel, produtos de degradao de fibrina e fibrinognio e outros marcadores) so tpicos.

Deficincia de fibrinognio e desfibrinogenemia Uma deficincia de fibrinognio pode levar a complicaes hemorrgicas. Em adio s deficincias, vrias formas mutantes so conhecidas. Usualmente elas mostram o quadro clnico de uma leve a moderada ditase hemorrgica. Algumas desfibrinogenemias, entretanto, mostram tambm uma tendncia em direo a freqncias aumentadas de doenas tromboemblicas, que podem estar associadas com aumento da fora do cogulo ou fibrinlise prejudicada (devido a uma funo co-fator prejudicada da respectiva fibrina na ativao catalisada por ativadores do plasminognio) do cogulo.

Deficincia do FXIII Uma deficincia de FXIII pode levar a uma prejudicada cicatrizao de feridas e problemas hemorrgicos severos. A deficincia congnita de FXIII muito rara, mas deficincias adquiridas so achadas em diversas situaes clnicas, nas quais o sistema de coagulao sistematicamente ativado, tal como durante a coagulopatia de consumo, septicemia, em certas doenas de tumores, em doena heptica, em doenas gastrointestinais inflamatrias e na prpura Henoch-Schoenlein. De acordo com os resultados de um estudo da European Thrombosis Research Organization, pacientes com nveis muito baixos de FXIII e pacientes com atividade 100/nL). A HIT tipo II, entretanto, pode ser extremamente sria. Ela se desenvolve de 4 a 14 dias depois da administrao de heparina e pode levar a uma diminuio macia da contagem de plaquetas (muitas vezes 6 s

O TAP est elevado nas coagulopatias extrnsecas ou comuns, geralmente quando a deficincia moderada ou grave (< 10% da atividade). As condies

71 que mais elevam este tempo so: uso de cumarnicos (warfarim), deficincia de vitamina K, insuficincia heptica, deficincia dos fatores da via extrnseca ou da via comum. 4.3.2. Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (PTTa) Este exame tambm denominado tempo de formao de tromboplastina do sangue ou tempo de cefalina, nesta prova se adiciona ao plasma citratado o reagente denominado de tromboplastina parcial ou cefalina, a qual eventualmente contm uma suspenso de caulim (partculas de vidro). A adio de cloreto de clcio inicia a coagulao pela via intrnseca. O PTTa para um plasma humano normal ativado por caulim de 32 s a 46 s. Como este teste realizado na ausncia de Fator Tecidual, o processo de coagulao obrigatoriamente iniciado pela via intrnseca, ou seja, pelo contato com as partculas de vidro, que garantem a superfcie negativa capazes de ativar os fatores XI e XII. Desse modo, se o teste for anormal, porque deve haver deficincia em um dos fatores plasmticos da via intrnseca. Clinicamente, o resultado do PTTa deve ser dado: Em segundos - normal em torno de 32 s a 46 s; Atividade normal; Relao entre o tempo do paciente e o tempo de controle.

O PTTa estar alargado nas coagulopatias da via intrnseca ou via comum, geralmente quando a deficincia leve, moderada ou grave ( 14,0g/dl Mulheres Hb > 12,0g/dl Grvidas e crianas pequenas Hb > 11g/dl Anemia Leve: Homens Hb de 11,5 a 13,9g/dl Mulheres Hb de 10,0 a 11,9g/dl Grvidas e crianas pequenas Hb de 9,5 a 10,9g/dl Anemia Moderada: Homens Hb de 9,0 a 11,4g/dl Mulheres Hb de 8,0 a 9,9g/dl Grvidas e crianas pequenas Hb de 7,6 a 9,4g/dl Anemia Grave: Homens Hb < 9,0g/dl Mulheres Hb 12anos: 80 a 98 fL. ALTERAO DE TAMANHO NORMOCITOSE MICROCITOSE MICROCITOSE DISCRETA MICROCITOSE ACENTUADA MACROCITOSE MACROCITOSE ACENTUADA ANISOCITOSE ADULTOS 80,0 98 >120 CRIANAS AT 3 ANOS 73,0 99 > 120 CRIANAS DE 4 A 14 ANOS 73,0 99 > 120

Presena de hemcias de volumes diferentes

Hemoglobina Corpuscular Mdia (HCM) ndice hematimtrico que corresponde mdia de hemoglobina por eritrcito ou seja, a quantidade, em peso, de hemoglobina contida em cada clula. Pode estar elevado na presena de macrocitose e diminudo na presena de hemcias microcticas. Onde, Hb = hemoglobina (g/L) e Hm = nmero de hemcias x 1012/L. O valor dado em picogramas (pg)= 10-12g. Valor de referncia para >12anos: 27 a 31 pg. Concentrao de Hemoglobina Corpuscular Mdia (CHCM) a avaliao da hemoglobina encontrada em 100 mL de hemcias, ou seja, a relao do peso da hemoglobina para o volume do eritrcito que a contm. Esse ndice permite a avaliao do grau de saturao de hemoglobina no eritrcito. A saturao da hemoglobina normal indica a presena de hemcias ditas normocrmicas. Quando diminuda, teremos hemcias denominadas hipocrmicas e, quando aumentadas, hemcias hipercrmicas. Onde, Hb = hemoglobina (g/dL) e Ht = hematcrito (dl/dl). A unidade de medica g/dl ou g%. Valor de referncia: 32 a 36 g%. Tendo em vista os conceitos expostos acima, podemos reescrever a classificao de anemias quanto morfologia vista no incio do captulo, relacionando-as com as etiologias associadas (ver tambm Quadro 3).

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Microctico-hipocrmicas: eritrcitos de pequeno tamanho (VCM baixo) e pouca concentrao de hemoglobina (CHCM baixa), no obrigatoriamente com baixo nmero de eritrcitos circulantes (eritrcitos normais ou diminudos); Normoctico-normocrmicas: tamanho dentro da mdia, concentrao e contedo de hemoglobina na mdia, normais, mas com pouco nmero de eritrcitos circulantes (VCM normal, CHCM normal e HCM normal e eritrcitos diminudos, respectivamente); Macroctica: glbulos grandes (VCM alto), com concentrao interna de hemoglobina normal (CHCM normal), mas com contedo interno (peso) de hemoglobina aumentado (HCM alta), tambm com baixo nmero de glbulos circulantes (eritrcitos diminudos).

Quadro 3. Classificao das Anemias segundo Tamanho do Eritrcito e Etiologias Associadas. MICROCTICA: Ferroprivas: Carncia alimentar Absoro inadequada Aumento na demanda Hemorragias No ferroprivas: Doenas crnicas Talassemia / Esferocitose Anemia Sideroblstica MACROCTICA Deficincia de viamina B12: Carncia alimentar Absoro deficiente Aumento na demanda Erros congnitos Deficincia de cido Flico: Carncia alimentar Absoro deficiente Aumento na demanda Drogas (AZT, quimioterapia, lcool) Outras: Sndrome Mielodisplsica Adiser congnita Eritroleucemia Hipotireoidismo Doena hepatica NORMOCTICA: Anemias nutricionais: deficincia simultnea de Fe+2 e vitamina B12 Anemias da insuficincia renal e da medula ssea Anemias hemolticas

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Autor(es): Ana Carolina Soares Matos de Menezes

Referncias Bibliogrficas: Modificado de: Oliveira, R. & Neto, A.: Anemias e Leucemias: conceitos bsicos e diagnsticos por tcnicas laboratoriais. 1a Edio-2004 Failace. R: HEMOGRAMA: manual de interpretao. 4a Edio-2003

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Anexo II. Aula Prtica 1 Testes de HemostasiaProvas de Hemostase e Coagulao Hemostase: o conjunto de fenmenos fisiolgicos capaz de atuar em um vaso para estancar uma hemorragia e reduzir a leso vascular. Para que isso ocorra, so acionados: a) o endotlio vascular e as plaquetas, levando formao de uma rolha plaquetria e parada do sangramento fenmeno chamado de Hemostase Primria; b) as protenas do plasma, atravs do mecanismo de Coagulao, levando formao de um cogulo de fibrina organizado que evita a retomada da hemorragia fenmeno chamado de Hemostase Secundria. Em seguida, ocorre o processo de reparao tecidual, concomitante ao mecanismo de Fibrinlise. Testes para Plaquetas e Vasos Sangneos 1. Tempo de Sangramento Mtodo de Duke: Princpio: a medida da durao de um sangramento quando se pratica com uma lanceta uma inciso cutnea, cuja profundidade no ultrapasse 4 mm. Material: Lanceta estril descartvel ou lanceta de Bensaude; lcool 70% ou lcool iodado; Algodo; Papel de filtro; Cronmetro. Mtodo: Fazer a assepsia do lbulo da orelha com lcool e deixar secar. Executar a inciso de 3 a 4 mm de profundidade com a lanceta estril. Deixar o sangue fluir naturalmente (sem fazer presso). Disparar o cronmetro junto com a inciso e par-lo quando o sangramento cessar. Absorver com papel de filtro a gota formada a cada 15 segundos, sem tocar a ferida diretamente para no perturbar a formao do tampo hemosttico. Interpretao: O valor normal de 1 a 4 minutos. Tempos prolongados podem ser observados em: Trombocitopenia, Trombastenia de Glanzmann, Trombocitopatias, Doena de von Willebrand, Parahemofilia, Afibrinogenemia Congnita e Sndrome Fibrinoltica. Resultados normais so encontrados nas Hemofilias.

2. Prova do Lao ou Prova de Fragilidade Capilar Prova de Rampel-Leede: Princpio: A fragilidade capilar testada pelo aumento da presso intracapilar por obstruo do fluxo venoso, aplicando-se um torniquete de borracha (garrote) ou manguito do esfigmomanmetro no brao do paciente.

141 O nmero de petquias formadas mostra a fragilidade capilar. O impedimento de formao petequial em indivduos depende da resistncia da parede capilar e tambm ocorre em funo do nmero e funcionalidade das plaquetas. Material: Torniquete de borracha (garrote) ou esfigmomanmetro; Cronmetro. Mtodo: Verificar previamente se existem petquias no brao do paciente. Colocar o garrote no brao de forma que seja feita certa presso. Se for utilizado o esfigmomanmetro, aferir a presso e mant-la entre a mxima e a mnima (presso arterial mdia, dada pela mdia aritmtica das presses sistlica e diastlica) durante 5 minutos. No fim, contar o nmero de petquias que aparecem. Interpretao: Considerar a prova positiva quando houver formao de mais de seis petquias por rea circular de 5 cm de dimetro (ou 20-25 cm2). O aumento da fragilidade capilar pode ser observado na Trombocitopenia, Trombastenia de Glanzmann, Trombocitopatias, Doena de von Willebrand, Prpura Henoch-Schonlein, Disproteinemias, Prpura Senil, Diabetes Mellitus, Hipertenso, Artrite Reumatide e Escorbuto. O teste de difcil interpretao e tende a ser de ajuda limitada, particularmente na mulher, porque ela desenvolve petquias mais facilmente.

Testes de Coagulao 1. Tempo de Ativao de Protrombina (T.A.P.) Mtodo de Quick: Princpio: Este teste avalia a VIA EXTRNSECA da coagulao. A protrombina transformada em trombina na presena de tromboplastina. O teste consiste na adio ao plasma de uma mistura de tromboplastina tecidual e clcio, de modo que o tempo de coagulao depender dos fatores I, II, X, V, e VII contidos no plasma. Material: Tubos de ensaio (10 x 75 mm); Pipetas de escoamento total; Banho-Maria a 37C; Cronmetro. Reagente: Plasma citratado na proporo adequada; Suspenso de tromboplastina + Cloreto de Clcio 0.02 M (segundo Quick). Mtodo: Em um tubo de ensaio conservado em banho-maria a 37C, pipetar 0,1 mL de plasma, adicionar 0,2 mL de tromboplastina clcica, agitar a mistura e, simultaneamente, disparar o cronmetro para marcar o tempo de coagulao (inclinando o tubo vrias vezes).

142 Interpretao: O tempo de protrombina de um plasma normal humano de 11,5 a 12,5 s (segundo Quick), embora resultados com preparaes comerciais variem de 12 a 15 segundos. Tempo de protrombina prolongado indica deficincia de um ou mais fatores: II, X, V, e VII, ou presena de inibidores de coagulao.

2. Tempo de Tromboplastina Parcial Ativado ou Tempo de Cefalina (P.T.T.a.): Princpio: Esta uma prova que avalia a VIA INTRNSECA da coagulao. Adiciona-se ao plasma tromboplastina parcial ou cefalina (que ir substituir o fator plaquetrio 3), e uma suspenso de cido elgico (para ativar o fator XII), medindo-se assim a atividade do sistema intrnseco em condies padronizadas. Material: Tubos de Ensaio (10 x 75 mm); Banho-Maria a 37C; Cronmetro; Pipetas de escoamento total. Reagente: Plasma citratado; Soluo de CaCl2 0,02 M; Suspenso de cido elgico + Cefalina em soluo fisiolgica. Mtodo: Para um tubo de ensaio mantido a 37C, pipetar:

0,1 mL de Cefalina + 0,1mL de Plasma 0,1 mL de CaCl2 0,02 M

Misturar bem e deixar a 37C por 2 minutos. Agitar levemente. Acionar o cronmetro, colocar a 37C e deixar durante 30 segundos. A seguir observar a cada 5 segundos a coagulao do plasma.

Interpretao: O PTTa para um plasma humano normal ativado de 32 a 46 segundos. Tempos mais prolongados indicam deficincia de um ou mais fatores da via intrnseca da coagulao (fatores XII, XI, IX, VIII, fator de Fitzgerald e fator de Fletcher) e da via efetora (fatores X, V, II e I) de um modo global. Esta prova s no mede o fator VII e o fator plaquetrio 3 (FP3). til no controle pr-operatrio. Serve para demonstrar deficincia de um dos fatores anti-hemoflicos e serve tambm como controle da teraputica heparnica. Obs1: Esta prova deve ser efetuada sempre em paralelo com um plasma normal. Relao Paciente/Normal at 1/3 considerada normal. Obs2: Fator de Fitzgerald Cininognio de Alto Peso molecular (HMWK); Fator de Fletcher Pr-Calicrena.

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Anexo III. Aula Prtica 2 ndices Hematimtricos e Determinao de Grupo SanguneoValores Fundamentais da Srie Vermelha ndices Hematolgicos 1. Determinao da Velocidade de Hemossedimentao (VHS) Mtodo de Westergreen: Fundamento: No sangue colhido com anticoagulante, as hemcias em suspenso no plasma tendem a sedimentar pela ao da gravidade. A velocidade de hemossedimentao expressa como a distncia (em milmetros) da queda das hemcias na unidade de tempo (usualmente uma hora). Concentraes elevadas de alfa-2 globulinas, gama-globulinas e fibrinognio provocam aumento da velocidade porque facilitam a formao de aglomerados de hemcias (rouleaux). Esta prova est aumentada nos processos inflamatrios agudos e crnicos: artrite reumatide, enfermidade do aparelho genital feminino, processos neoplsicos, etc. Tem utilidade no acompanhamento de uma enfermidade e no como valor diagnstico. Na gravidez, aps o 3 ms, o VHS encontra-se aumentado. Material: - Material de colheita de sangue; - Anticoagulante: soluo de Citrato de Sdio a 3,8% (p/v); - Pipeta de Westergreen, graduada de 0 a 200 mm e dimetro interno de 2,5 mm; - Suporte apropriado. Tcnica: - Colher sangue venoso com anticoagulante Citrato de Sdio a 3,8% na proporo de uma parte de Citrato para quatro partes de sangue total; - Homogeneizar e encher a pipeta de Westergreen at a marca zero; - Colocar a pipeta no suporte adequado, de modo que permanea na posio vertical, e marcar o tempo; - Proceder a leitura em milmetros aps a 1 hora.

Valores Normais Homens Mulheres Crianas 3 a 5 mm/1 hora 4 a 7 mm/1 hora 4 a 7 mm/1 hora

144 2. Determinao do Hematcrito (Ht) ou Volume Globular (VG): Fundamento: O Hematcrito definido como o volume ocupado pelos eritrcitos em um dado volume de sangue e usualmente expresso em volume (mL) de eritrcitos por mL de sangue ou volume (Litro) de eritrcitos por litro de sangue. Material: - Tubo de Wintrobe; - Seringa munida de agulha longa; - Frascos para colheita de sangue, contendo anticoagulante. Tcnica: - Colher o sangue cuidadosamente para evitar hemlise; - Verter para o vidro contendo o anticoagulante; - Homogeneizar o sangue e encher o tubo de Wintrobe com seringa munida de agulha longa; - Centrifugar a 3000 rpm em uma centrfuga clnica de 15 cm de raio durante 30 minutos (1500 x g); - Proceder a leitura do Hematcrito, desprezando a parte correspondente aos glbulos brancos e plaquetas. Nota: O valor do Hematcrito depende do nmero, da forma e do tamanho das hemcias circulantes. Pode-se empregar tambm o Microhematcrito, que fornece resultados mais rpidos (de 3 a 4 minutos) e utiliza menor quantidade de sangue obtido por puno digital. Tem maiores aplicaes em Pediatria e Medicina de Urgncia. Valores Normais Homens 40 a 54% ou 0,40 a 0,54 L/L Mulheres 36 a 47% ou 0,36 a 0,47 L/L Obs: Os recm-nascidos tm valores mais elevados que se reduzem na , 1 infncia at atingirem os valores da idade adulta. Interpretao: - Valores elevados so encontrados na Poliglobulia genuna (Policitemia Vera), onde h um aumento patolgico do nmero de eritrcitos, e nas Poliglobulias Falsas, onde h hemoconcentrao causada por diminuio do volume plasmtico por perdas aquosas importantes (desidrataes, choque e queimaduras). - Valores diminudos so encontrados nas anemias, que tm diminuio do nmero de eritrcitos, e em condies associadas a Hidremia (descompensao cardaca, gravidez e administrao excessiva de fluidos).

145 3. Dosagem da Hemoglobina no sangue integral pelo Mtodo da Cianometemoglobina [Van Kampen, E.J. and Zijlstra, W.G. Clin Clin Acta 6:538 (1961)]: Fundamento: Baseia-se na oxidao da Hemoglobina Metemoglobina pelo Ferricianeto de Potssio e subsequente reao com o Cianeto de Potssio originando Cianometemoglobina, derivado estvel que tem o mximo de absoro em 546 nm (filtro verde). Material: - Soluo de Drabkin; - Padro de Cianometemoglobina correspondendo a concentraes de 14 g/dL de Hb; - Pipeta automtica de 20 L; - Espec