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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica
APLICAÇÃO DA MICROEXTRAÇÃO EM FASE LÍQUIDA (HF-LPME) EM
DIFERENTES MATRIZES BIOLÓGICAS NA ÁREA TOXICOLÓGICA
Caio Caleiras Ferri
Trabalho de Conclusão do Curso de
Farmácia-Bioquímica da Faculdade
de Ciências Farmacêuticas da
Universidade de São Paulo.
Orientador(a): Marcelo Filonzi dos
Santos
São Paulo
2017
0
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS --------------------------------------------------------------------- 1
RESUMO ---------------------------------------------------------------------------------------------- 2
1. INTRODUÇÃO --------------------------------------------------------------------------------- 4
2. OBJETIVO(S) ---------------------------------------------------------------------------------- 8
3. MATERIAIS E MÉTODOS ------------------------------------------------------------------ 9
3.1. MATERIAIS ---------------------------------------------------------------------------------- 9
3.2. ESTRATÉGIAS DE PESQUISA -------------------------------------------------------------- 9
3.3. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO ------------------------------------------------ 11
3.3.1. Tipos de Estudos ---------------------------------------------------------------- 11
3.3.2. Tipos de Parâmetros ------------------------------------------------------------ 12
3.3.3. Tipos de Análise e Quantificação -------------------------------------------- 12
3.4. COLETA E ANÁLISE DOS DADOS -------------------------------------------------------- 12
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO --------------------------------------------------------- 13
5. CONCLUSÃO -------------------------------------------------------------------------------- 22
6. BIBLIOGRAFIA ------------------------------------------------------------------------------ 23
7. ANEXOS --------------------------------------------------------------------------------------- 28
1
LISTA DE ABREVIATURAS
GC Cromatografia Gasosa (Gas Chromatography)
LC-MS Cromatografia Líquida Associada a Espectrometria de Massas
(Liquid Chromatography-mass Spectrometry)
HPLC Cromatografia líquida de Alta Eficiência (High Performance Liquid Chromatography)
DAD Detecção por Arranjo de Fotodiodos (Diode Array Detection)
RSD Desvio Padrão Relativo (Relative Standard Deviation)
FL Detecção por Fluorescência (Fluorescence Detection)
ECD Detecção por Captura de Elétrons (Electron Capture Detector)
PDA Detector por Arranjo de Fotodiodos (Photodiode Array Detector)
CE Eletroforese Capilar (Capillary Electrophoresis)
CZE-AD Eletroforese Capilar de Zona associada a Detecção Amperométrica
(Capillary Zone Electrophoresis With Amperometric Detection)
ET-AAS Espectrometria de Absorção Atômica Eletrotérmica
(Electrothermal Atomic Absorption Spectrometry)
MS Espectrometria de Massas (Mass Spectrometry)
ICP-MS Espectrometria de Massas com Fonte de Plasma
(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometric)
LLE Extração em Fase Líquida (Liquid-phase Extraction)
SPE Extração em Fase Sólida (Solid-phase Extraction)
PALME Extração em Membrana Artificial Líquida Paralela
(Parallel Artificial Liquid Membrane Extraction)
MMLLE Extração Líquido-líquido em Membrana Microporosa
(Microporous Membrane Liquid-liquid Extraction)
ESI Ionização por Eletrospray (Electrospray Ionization)
LOQ Limite de Quantificação (Limit of Quantification)
DLLME Microextração Dispersiva Líquido-líquido (Dispersive Liquid–liquid Microextraction)
LPME Microextração em Fase Líquida (Liquid-phase Microextraction)
SPME Microextração em Fase Sólida (Solid-phase Microextraction)
2
RESUMO FERRI, C.F. Aplicação da microextração em fase líquida (HF-LPME) em diferentes matrizes biológicas na área toxicológica. 2017. Trabalho de Conclusão de Curso de Farmácia-Bioquímica – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017. Palavras-chave: HF-LPME; HOLLOW-FIBER LIQUID-PHASE MICROEXTRACTION; TOXICOLOGY; HUMAN SAMPLES. INTRODUÇÃO: Na toxicologia há grande interesse quanto à identificação e
quantificação de diversos tipos de substâncias que possam trazer risco à saúde.
Por esse motivo, indústrias farmacêuticas, laboratórios clínicos e toxicológicos
bem como laboratórios de pesquisa acadêmica constantemente desenvolvem e
aprimoram métodos bioanalíticos. Estes métodos devem ser aplicados aos mais
diversos tecidos humanos, tais como sangue, plasma, urina, entre outros. Apesar
de ser um procedimento básico, a extração de analitos em amostras tem extrema
importância e pode incluir processos de pré-tratamento, limpeza, enriquecimento
do analito e derivatização. Seu maior objetivo é de isolar e concentrar os analitos
de interesse em uma matriz mantendo a compatibilidade com os instrumentos
onde serão feitas as análises. A extração do analito da matriz é uma importante
etapa para diversos métodos aplicados à toxicologia clínica e forense. Matrizes
com graus de complexidade e características diferentes, tais como sangue, urina,
conteúdo gástrico, outros fluidos biológicos ou amostras de tecidos devem ser
processadas antes da análise, porque as diferentes características de cada matriz
podem interferir na quantificação dos analitos, causando o chamado efeito matriz.
Dentre as principais e mais recentes técnicas de extração, encontra-se a HF-
LPME. A técnica combina o conceito de extrações com membranas (SLM e
MMLLE) com o uso reduzido da razão solvente orgânico/ fase aquosa. Isso
porque consiste numa membrana capilar porosa e hidrofóbica cujos poros são
impregnados com solvente orgânico para extração enquanto seu interior é
preenchido com a fase aceptora. A aplicação da fibra oca (hollow fiber – “HF”)
revolucionou a microextração, por permitir a miniaturização da preparação de
3
amostras. Adicionalmente, a técnica demonstrou ser mais simples, rápida e com
menor custo em relação a outras técnicas baseadas na utilização de membranas
Os métodos desenvolvidos com ela demonstrou maior eficácia de extração, se
comparado com os outros métodos de LPME, por permitir o aumento de
transferência de massa, através de vigorosa agitação. Compatível com diversos
sistemas cromatográficos, tem mostrado maior sensibilidade para análise de
fármacos, maior rapidez de execução, menor custo e menor consumo de solvente
orgânico. A identificação das diferentes matrizes humanas em que a HF-LPME foi
aplicada com sucesso permite a análise crítica do sucesso da técnica e
identificação de possíveis campos para novas aplicações. OBJETIVO: Realizar
uma revisão bibliográfica acerca da aplicação da metodologia analítica
“microextração em fase líquida com fibra oca” (HF-LPME) em diferentes matrizes
biológicas, com finalidade toxicológica. MATERIAIS E MÉTODOS: Para a
pesquisa, foi utilizada a ferramenta de busca de dados científicos PUBMED, que
permite acesso à base científica MEDLINE. As buscas na ferramenta foram
limitadas a publicações até 31/12/2016, em língua inglesa. Foram utilizadas as
seguintes palavras para a pesquisa: “hollow-fiber liquid-phase microextraction" e
“human”. As publicações selecionadas foram então avaliadas quanto à relevância
dos dados apresentados, avaliando-se principalmente a técnica de extração, os
analitos pesquisados, a matriz humana estuda e os parâmetros analíticos para
avaliação da metodologia como desvio padrão relativo, limite de detecção e
recuperação. RESULTADOS: Foram selecionados 21 trabalhos sobre HF-LPME
aplicada à toxicologia dentro da toxicologia. Os trabalhos abordaram as seguintes
matrizes humanas: cabelo, urina, sangue, plasma e soro. CONCLUSÃO: O
trabalho demonstrou importantes aplicações da técnica de extração HF-LPME em
diferentes matrizes biológicas descritos na literatura disponível, dentro do campo
da toxicologia. Foi evidenciado que a técnica é compatível com grande diversidade
de amostras biológicas como sangue total, plasma, soro, urina e cabelo, com
aplicação tanto para a monitoração toxicológica clínica quanto para finalidades
forenses.
4
1. INTRODUÇÃO
Os danos ao meio ambiente têm aumentado a preocupação mundial sobre seu
impacto e riscos gerados à saúde humana. A determinação de poluentes na
atmosfera, água, solo e tecidos humanos é vista como fundamental para a
avaliação dos níveis da concentração destas substâncias tóxicas e determinação
do impacto das contaminações. Diversos tipos de contaminantes como
praguicidas, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, bifenilas policloradas, aminas
aromáticas, benzeno, tolueno, etilbenzeno e também medicamentos como
anticoncepcionais hormonais, são identificados em diferentes matrizes. Tais
compostos geram grande preocupação devido à sua toxicidade humana,
carcinogenicidade e efeitos endócrinos. Por esse motivo, indústrias farmacêuticas,
laboratórios clínicos e toxicológicos bem como laboratórios de pesquisa
acadêmica constantemente desenvolvem e aprimoram métodos bioanalíticos.
Estes métodos devem ser aplicados aos mais diversos tecidos humanos, tais
como sangue, plasma, urina, entre outros 1.
A extração de analitos em amostras tem extrema importância e pode incluir
processos de pré-tratamento, limpeza, enriquecimento do analito e derivatização.
Seu maior objetivo é de isolar e concentrar os analitos de interesse em uma matriz
mantendo a compatibilidade com os instrumentos onde serão feitas as análises2.
Existem, contudo, desafios relacionados ao desenvolvimento de procedimentos
para a preparação de amostras que sejam simples, de baixo custo e capazes de
serem realizados em escala miniaturizada. Além disso, o desenvolvimento de
métodos de preparação de amostras capazes de serem aplicados a compostos
com grande gama de propriedades físico químicas, mantendo ainda a
especificidade é altamente desejado1.
Uma das técnicas mais clássicas para extração de analitos é a extração líquido-
líquido (liquid – liquid extraction - “LLE”). Existem, porém, importantes
desvantagens relacionadas à sua aplicação como procedimentos longos e
entediantes, custos elevados de aquisição devido à necessidade de pureza dos
5
reagentes, toxicidade para o profissional envolvido nas manipulações dos
solventes e o risco ao meio ambiente. Além disso, muitos reagentes estão
submetidos às legislação e necessitam de autorização dos órgãos reguladores
vinculados à polícia. Com o objetivo de mitigar parte desses problemas, foi
desenvolvida a microextração em fase líquida (liquid-phase microextraction -
“LPME”). A LPME pode ser apresentada como uma versão simples e
miniaturizada da LLE, utilizando microlitros de solventes orgânicos nos
procedimentos extrativos. Ela pode ser facilmente inserida na rotina laboratorial
com custos reduzidos para aquisição de materiais necessários para sua prática
como microponteiras, soluções ácidas e básicas, agitadores magnéticos1.
A preparação de amostras utilizando técnicas com membranas para a
microextração (membrane based liquid-phase microextraction – MLPME) tem se
tornado comum em relação a outras técnicas mais difundidas, tais como a
extração em fase sólida (solid-phase extration –“SPE”), microextração em fase
sólida (solid-phase microextration –“SPME”) ou a tradicional extração líquido-
líquido (liquid-liquid extraction - “LLE”). O interesse em técnicas baseadas na
MLPME é evidenciado pelo crescente número de revisões tratando do assunto.
Estas revisões podem ser divididas em três categorias: 1) Aplicação de técnicas
da MPLME em instrumentos analíticos; 2) Avanços recentes da técnica e 3)
Aplicação a determinados grupos de compostos, em bioánalises ou análises
ambientais 3.
Dentro da MPLME, a aplicação da fibra oca (hollow fiber – “HF”) revolucionou a
microextração, por permitir a miniaturização da preparação de amostras.
Adicionalmente, a técnica demonstrou ser mais simples, rápida e com menor custo
em relação a outras técnicas baseadas na utilização de membranas. A
microextração fibras ocas foi associada ao termo LPME (liquid-phase
microextraction) para diferenciar a técnica de outras LPME que não utilizam
membranas (e.g. single-drop – “SDME” e dispersive liquid-liquid microextraction -
“DLLME”) se tornando assim a HF-LPME 3.
6
Divulgado pela primeira vez por Pedersen-Bjergaard e Rasmussen, a HF-LPME
combina o conceito de extrações com membranas (SLM e MMLLE) com o uso
reduzido da razão solvente orgânico/ fase aquosa. Isso porque a HF-LPME
consiste numa membrana capilar porosa e hidrofóbica cujos poros são
impregnados com solvente orgânico para extração enquanto seu interior é
preenchido com a fase aceptora, não existindo, portanto, contato direto da fase
aceptora com a matriz4 5 6.
A preparação básica da HF-LPME pode ser executada em modo de duas ou três
fases. No primeiro modo, o analito de interesse é extraído de amostra aquosa para
um solvente orgânico, imiscível e pouco volátil, presente tanto nos poros quanto
no lúmen da fibra. Já no sistema de três fases o analito de interesse é extraído de
amostra aquosa para uma solução aceptora aquosa presente no lúmen da fibra,
através de solvente orgânico presente nos poros da fibra. A representação
esquemática dos dois sistemas pode ser visto na figura 01 5 7.
A fibra oca utilizada na LPME pode ser descrita como um tubo flexível e oco,
construído com um polímero, de forma que suas paredes apresentam poros. É
mais comumente utilizada na conformação em forma de “U”, onde as
extremidades da fibra permanecem fora da matriz a ser analisada, de forma que a
matriz não entre diretamente em contato com o lúmen da fibra. Um solvente
orgânico de baixa polaridade deve ser impregnado aos poros desta membrana por
meio da fibra durante alguns segundos. O lúmen da fibra é preenchido com a
solução aceptora, podendo esta ser um solvente orgânico ou uma solução aquosa
ácida ou alcalina (figura 01) 7.
Sendo um novo modo de LPME a HF-LPME ganhou adeptos devido ao seu baixo
custo, efetividade, baixo impacto ambiental e facilidade de descarte da fibra oca
utilizada. O método demonstrou maior eficácia de extração, se comparado com os
outros métodos de LPME, por permitir o aumento de transferência de massa,
através de vigorosa agitação 8.
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técnica de extração a ser utilizada bem como da metodologia de detecção. Essa
preparação visa também concentrar os compostos em estudo para uma
mensuração confiável4.
A determinação de diversos analitos em diferentes concentrações e matrizes pode
ser alcançada por meio da aplicação das técnicas de preparação de amostra e
extração como a HF-LPME. Não obstante, ainda se faz necessária a otimização
de diferentes fatores para garantir a obtenção de bons resultados. As vantagens
apresentadas pela HF-LPME em relação às outras técnicas aqui descritas são
diversas e compensam o esforço aplicado à sua otimização. Em primeiro lugar, a
HF-LPME é compatível com diversos sistemas cromatográficos, tendo sido
extensivamente aplicada em combinação com HPLC, LC-MS, LC-MS/MS, GC,
GC-MS e GC-MS/MS 8. Além disso, os métodos de HF-LPME têm mostrado maior
sensibilidade para análise de fármacos em comparação à SPE e SPME. Em
comparação à LLE e SPE se mostrou mais rápida, consumindo menos solvente
orgânico, demonstrando ser vantajosa para diferentes analitos em diferentes
matrizes 8.
Foi realizada no presente trabalho uma revisão da literatura científica relacionada
ao uso da HF-LPME como técnica para análise de diversos compostos em
matrizes biológicas humanas, com aplicação em toxicologia.
2. OBJETIVO(S)
Realizar uma revisão bibliográfica acerca da aplicação da metodologia analítica
“microextração em fase líquida com fibra oca” (HF-LPME) em diferentes matrizes
biológicas, com finalidade toxicológica.
9
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Este trabalho de revisão da literatura foi desenvolvido com base nos protocolos
para a elaboração de revisões sistemáticas. Apesar de este estudo se tratar de
uma revisão narrativa, o autor preocupou-se em seguir preceitos estabelecidos por
organizações de pesquisa internacionais especializadas em revisões sistemáticas
com o objetivo de padronização da metodologia a fim de que fosse explícita e
passível de reprodução 10. Para tanto, foram utilizados os guias, manuais e
handbooks do “Joanna Briggs Institute”12, “Division of the National Toxicology
Program - Office of Health Assessment and Translation (OHAT)”11, “PRISMA”13 e
“The Cochrane Collaboration”14.
3.1. Materiais Para o desenvolvimento deste trabalho foram utilizados os softwares Microsoft
Word 2010, Microsoft Excell 2010 para o gerenciamento dos dados, Mendeley
Desktop 2008-2016 versão 1.17.9 para gerenciamento das publicações e citações.
As bases de dados para a pesquisa foram acessadas, através do portal CAPES,
remotamente (VPN) através do software “Cisco Anyconnect Secure Mobility Client”
versão 3.1.14018, pela rede da Universidade de São Paulo, através do login e
senha do aluno.
3.2. Estratégias de pesquisa Apesar de se apresentar como uma revisão narrativa, o estudo foi desenvolvido
seguindo algumas das recomendações especificadas em cada um dos guias e
manuais para revisão sistemática da literatura a fim de garantir o máximo de
clareza do objetivo, com critérios de elegibilidade dos estudos pré-definidos,
metodologia explícita e reprodutível, pesquisa sistemática para identificação do
máximo número possível de estudos que se encaixassem nos critérios de
inclusão, exclusão, avaliação da validade dos dados encontrados e apresentação
sistemática e sintética dos achados 14.
10
Para a pesquisa, foi utilizada a ferramenta de busca de dados científicos
PUBMED, que permite acesso à base científica MEDLINE bem como diversas
revistas de life science e livros online. As buscas na ferramenta foram limitadas a
publicações até 31/12/2016. Apenas estudos na língua inglesa foram incluídos.
Foram utilizadas as seguintes palavras para a pesquisa: “hollow-fiber liquid-phase
microextraction" e “human”, de modo que se obtivesse o maior número de
resultados possível que fossem relacionados com o objetivo.
Os estudos foram selecionados em duas fases. Na primeira, foram aplicados os
critérios de inclusão e exclusão aos títulos e abstracts dos artigos obtidos da
pesquisa bibliográfica. Na segunda fase, os estudos pré-selecionados foram
acessados na íntegra, analisados e revisados manualmente. O processo de
seleção dos estudos é apresentado na figura 02.
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3.3.2. Tipos de Parâmetros Foram incluídos apenas artigos que abordassem o desenvolvimento e/ou
aplicação da metodologia analítica “hollow-fiber liquid-phase microextraction” ou
“HF-LPME” em tecidos humanos, com aplicação explícita em toxicologia. Artigos
que abordassem apenas outra metodologia analítica de extração, apenas
amostras que não fossem tecidos humanos e que não descrevessem aplicação
em toxicologia foram excluídos.
3.3.3. Tipos de Análise e Quantificação Todas as publicações desenvolvidas com as diversas metodologias de separação,
identificação e quantificação dos analitos estudados foram incluídas.
3.4. Coleta e Análise dos Dados
A coleta de dados foi realizada manualmente, pelo revisor, de cada um dos artigos
selecionados. As seguintes informações foram extraídas de cada publicação: a)
Autor, b) Ano de publicação, c) Origem, d) Técnica de extração, e) Analito (s), f)
Matriz, g) Técnica de determinação, h) Desvio padrão relativo, i) Limite de
detecção (LOD) e j) Recuperação.
Foi realizada uma narrativa para sintetizar os dados devido à heterogeneidade dos
resultados, parâmetros e metodologia de identificação e quantificação. O resumo
dos dados obtidos encontra-se relacionado no anexo 1. A relação dos artigos pré-
selecionados na primeira fase e excluídos na segunda fase encontram-se no
anexo 2.
13
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Através da estratégia de pesquisa, foram inicialmente identificados 121
publicações diretamente relacionadas com o objetivo do estudo. Posteriormente,
utilizando os critérios de inclusão e exclusão pré-estabelecidos, os 121 artigos
iniciais foram avaliados quanto ao título e abstract, resultando dessa pré-seleção
58 publicações.
Foram então obtidas as 58 publicações na íntegra, as quais foram integralmente
analisadas manualmente. Destas, 37 foram descartadas com base nos critérios de
inclusão e exclusão. Destes trabalhos excluídos, 3 tratavam de revisão da
literatura sobre técnicas analíticas; 1 encontrava-se em chinês; 1 estava
duplicada; 1 abordava aplicação em alimentos; 1 abordava aplicação em ratos; 5
descreviam técnicas diferentes da HF-LPME; 25 não abordaram explicitamente
aplicação em toxicologia.
Nos 21 trabalhos selecionados, foram abordadas aplicações da HF-LPME nas
seguintes matrizes humanas: cabelo, urina, sangue, plasma e soro. Entre eles, 3
artigos abordaram 2 matrizes cada (plasma e urina). Os quadros 01 e 02
resumem estes resultados.
Quadro 01: Número de artigos selecionados por tipo de matrizes estudadas.
Matriz Biológica Total de Artigos Porcentual de Artigos
Cabelo 3 13%
Plasma 7 29%
Sangue total 1 4%
Soro 1 4%
Urina 12 50%
Total Geral 24 100%
Os resultados relacionados na quadro 01 demonstram que cerca de 50% dos
trabalhos com HF-LPME em toxicologia, desenvolvidos em matrizes humanas,
foram em urina. A segunda matriz de maior interesse foi o plasma, representando
14
mais de 29% dos trabalhos. A terceira matriz de maior interesse foi cabelo,
correspondendo a 13% dos trabalhos.
A quadro 02 apresenta as matrizes abordadas por cada autor nos artigos
publicados. Três destes trabalhos abordaram as matrizes plasma e urina ao
mesmo tempo enquanto outro abordou urina e sangue na mesma publicação.
Quadro 02: Artigos selecionados: Referência do trabalho e matriz estudada
Citação do Trabalho Matriz Estudada
(Fernandez, André, & Cardeal, 2016)15 Urina
(Bairros, Lanaro, Almeida, & Yonamine, 2014)16 Urina
(Bairros et al., 2014)17 Urina
(Sun, Qu, & Du, 2014)18 Plasma
(Bartosz, Marcin, & Wojciech, 2014)19 Urina
(Moreno, García-Barrera, & Gómez-Ariza, 2013)20 Plasma
(Rezaei, Yamini, Moradi, & Daraei, 2013)21 Urina e Plasma
(Pantaleão, Paranhos, & Yonamine, 2012)22 Cabelo
(Menck et al., 2013)23 Sangue total
(Desoubries, Chapuis-Hugon, Bossée, & Pichon, 2012)24 Urina
(Hadjmohammadi & Ghambari, 2012)25 Plasma
(Lin, Yan, Kumar, Li, & Jen, 2011)26 Urina
(Fotouhi, Yamini, Molaei, & Seidi, 2011)27 Urina e Plasma
(Emídio, de Menezes Prata, de Santana, & Dórea, 2010)28 Cabelo
(Xiong, Chen, He, & Hu, 2010)29 Urina
(Xiao & Hu, 2010)30 Urina
(Yang, Chen, & Shi, 2010)31 Urina
(Jiang, Hu, Chen, & Xia, 2009)32 Cabelo
(Li et al., 2007)33 Plasma
(Xiao, Hu, Duan, He, & Zu, 2007)34 Soro
(Ghambarian, Yamini, & Esrafili, 2011)35 Urina e Plasma
A separação de um agente tóxico, em pureza e quantidade suficiente para que
seja possível sua caracterização e quantificação é um desafio dentro da
15
toxicologia analítica. Os métodos utilizados em laboratórios de química analítica
ou desenvolvidos em novas linhas de pesquisa devem ser avaliados e testados
para que possam garantir a produção de dados reais e adequados ao seu
objetivo, sendo, portanto necessária sua validação. A validação de um método
deve seguir uma série de testes experimentais padronizados visando à produção
de dados relativos à exatidão e precisão. Métodos qualitativos requerem
parâmetros como especificidade/seletividade, limite de detecção (LOD), precisão e
estabilidade. Os métodos quantitativos com limite de concentração pré-
estabelecido, exigem, além dos testes mencionados anteriormente, os parâmetros
adicionais de linearidade, exatidão e precisão36.
A especificidade de um método esta relacionada com extensão de interferência de
outras substâncias na identificação e quantificação de um analito de interesse.
Trata-se da medida da habilidade do método em identificar e quantificar analitos
na presença de outras substâncias.
O limite de detecção (limit of detection – “LOD”) garante a menor concentração de
analito identificada com certo grau de segurança. O LOD também pode ser
definido como a mais baixa concentração que pode ser distinguida do ruído
causado pelo meio de análise, com certo grau de confiança. Há diversos métodos
para estimar o LOD, sendo que todos dependem da análise de amostras de
“branco” e da análise da relação sinal-ruído. O requerimento mínimo para
avaliação do sinal-ruído são três análises. O LOD não se trata de um parâmetro
robusto e pode ser afetado por mudanças pequenas no sistema analítico (ex:
temperatura, pureza dos reagentes, efeitos de matriz, condições instrumentais)36.
A precisão está relacionada com o grau de concordância entre as medidas
individuais, ou seja, a reprodutibilidade da medida sob as mesmas condições do
método. Reflete a aleatoriedade dos erros que ocorrem em um método. Dois
conjuntos de condições comumente aceitas pelos quais a precisão normalmente é
avaliada são reprodutibilidade e repetitividade. A reprodutibilidade ocorre quando o
mesmo analista analisa amostras no mesmo dia com o mesmo instrumento ou
materiais, no mesmo laboratório. A reprodutibilidade é representada quando há
16
variação de qualquer uma destas condições. A precisão é medida como um
coeficiente da variação ou desvio padrão relativo (relative standard deviation –
“RSD”) de resultados analíticos obtidos de controles de qualidade preparados
independentemente. A precisão é concentração-dependente, normalmente sendo
aceitas taxas de 20% para concentrações mais baixas36.
Métodos são descritos como lineares quando há relação de proporcionalidade
direta entre a resposta ao método e a concentração do analito na matriz, dentro do
intervalo de concentrações do analito de interesse (intervalo de trabalho). O
intervalo de trabalho é definido pelo proposito do método e deve refletir apenas
parte de do intervalo de quantificação total. Normalmente um alto coeficiente de
correlação é utilizado para avaliar a linearidade36.
Para avaliação da precisão de um método, mensura-se a medida da diferença
entre a expectativa de um resultado de um teste e o valor de referência devido ao
erro sistemático do método. Normalmente expresso como uma porcentagem, é
calculada pela análise de 3 diferentes concentrações conhecidas (baixa, média e
alta), diferentes das concentrações utilizadas para a preparação da curva de
calibração .
A recuperação de um analito em uma analise esta relacionada com a resposta do
detector, obtida de uma quantidade de analito adicionado a uma matriz e extraído,
comparado à resposta do detector para a concentração verdadeira do padrão
analítico puro. Também pode ser entendido como o porcentual de fármaco,
metabólito ou padrão interno no espécime, que atinge o fim do procedimento.
Experimentos de recuperação devem ser realizados por comparação dos
resultados analíticos de amostras em três concentrações. A recuperação do
analito não deve exceder 100%, porém, a extensão da recuperação deve ser
consistente, apresentando resultado acima de 20% para todas as concentrações
testadas36.
As incertezas de um método são definidas como parâmetros associados ao
resultado de mensurações que caracterizam a dispersão de valores daquilo que
17
esta sendo mensurado. Também definida como intervalo de confiança ou
probabilidade, é calculada estimando-se os erros associados com diversos
estágios da analise como efeitos pré-analíticos, homogeneização, pesagem,
injeção. Para que um método seja validado, também deve ser demonstrada a
extensão da estabilidade dos analitos durante todo o procedimento analítico,
incluindo o armazenamento antes e depois das análises.
Métodos bioanalíticos com foco na determinação de drogas de abuso e
substâncias relacionadas geralmente são desenvolvidos em matrizes biológicas
humanas como fluidos (sangue, plasma, soro, urina, cabelo e saliva) e outros
tecidos (cabelo, fígado). Nos resultados encontrados, a técnica da HF-LPME com
finalidade toxicológica, foi aplicada a urina, sangue total, plasma, soro e cabelo.
Urina
Devido à facilidade de coleta, ser menos invasiva, apresentar maior volume de
material disponível , composição basicamente aquosa e por ser a principal via de
excreção de fármacos, a urina é uma das matrizes mais comumente utilizadas nos
estudos para desenvolvimento de metodologias analíticas para identificação e
quantificação de substâncias de interesse da toxicologia. Trata-se de uma matriz
com quantidade relativamente grande de sais e que contém compostos orgânicos
e inorgânicos, sendo a força iônica e pH parâmetros de grande variação nesta
matriz e que afetam significantemente a extração. Apesar de proporcionar
comumente menores valores de recuperação, apresenta grandes quantidades das
substâncias de interesse 4.
Fernandez e colaboradores15 desenvolveram um método, utilizando HF-LPME,
para determinação de bisfenol A (BPA) e ftalatos em urina. Com RDS de 11.7 a
19.7%, obtiveram LODs variando de 0.777 - 23.3 µg/L para os diferentes produtos
de biotransformação monitorados. Tais compostos são associados principalmente
como causa de infertilidade em mulheres, além de outras desordens fisiológicas.
No mesmo estudo, foram coletadas amostras de urina, de pacientes do Hospital
da UFMG, de mulheres com idades entre 18 e 45 anos. Como resultado,
18
encontrou-se grande quantidade dos produtos de biotransformação estudados nas
amostras analisadas. As médias das concentrações encontradas de cada analito
variaram entre 9.52 a 670 µg/L.
Plasma
Por apresentar concentrações de analito com relação direta à exposição dos
tecidos à substância de interesse, o plasma se mostra como a matriz biológica de
maior interesse para fins de monitorização terapêutica. Composto por
aproximadamente 8% de proteínas, entre elas, principalmente albumina e também
α1-glicoproteína ácida, lipoproteínas e imunoglobulinas, entre outras, possui
eletrólitos, lipídeos, hormônios e metabólitos. Tais características tornam esta
matriz complexa e aumenta a dificuldade de quantificação de substâncias nela
devido a todos os interferentes endógenos presentes bem como à ligação destes
a proteínas plasmáticas 4.
Para a análise de buprenorfina (BP), norbuprenorfina (NBP) (produto de
biotransformação) e naloxona (NX) em plasma, Sun e colaboradores 18
desenvolveram um método analítico combinando a HF-LPME com UHPLC-MS
como método para identificação e quantificação dos analitos. A buprenorfina é um
analgésico derivado alcaloide da morfina, tendo sido utilizado como droga de
abuso em substituição à heroína. Foram obtidos como resultados LOD= 0.050
ng/mL para buprenorphine e seu metabólito e LOD= 0.025 ng/mL para naloxona,
com RSD menor que 15% e recuperações entre 92.1% e 106.0%. O método foi
aplicado a amostras coletadas de voluntários sadios submetidos a tratamento com
buprenorfina e naloxona, com variação das concentrações administradas em dois
grupos: grupo A (4 mg, 3.2 mg de BP e 0.8 mg de NLX) e grupo B (16 mg, 12.8
mg de BP e 3.2 mg de NLX). Foram analisadas amostras coletadas após uma
hora da administração e os seguintes resultados foram obtidos: 6.4 ng/mL para
BP, 4.2 ng/mL para NBP e 0.6 ng/mL para NLX, demonstrando o sucesso da
aplicação do método.
19
Sangue total
Assim como o plasma, o sague é uma matriz bastante complexa por apresentar
toda a composição do plasma somada à presença de biopolímeros, como as
hemácias, que representam 45% de sua composição em volume. Muitos fármacos
e outras substâncias apresentam elevada interação com estes polímeros,
evidenciando a necessidade de análise desta matriz para avaliação da disposição
cinética de tais analitos. Comumente, as extrações em sangue utilizando-se as
técnicas de LPME não requer nenhum tratamento prévio, entretanto, o tempo para
atingir o equilíbrio no procedimento normalmente é maior em relação ao plasma
devido à maior viscosidade do sangue 4.
Almeida e colaboradores37 desenvolveram um método para análise de barbitúricos
em sangue total. Os barbitúricos são fármacos depressores do sistema nervoso
central que apesar de não serem comumente utilizados como droga de abuso,
apresentam estreita faixa terapêutica, risco de dependência e o risco de abuso
clínico, tornando-se objeto de preocupação em saúde publica. Foram obtidos
como resultados LOD= 0.5 µg/mL e RDS menor que 15% para todas as análises
de validação, sendo a recuperação variável entre 6 a 19% dentre os analitos
pesquisados. O método foi então aplicado a amostras de sangue obtidas de casos
reais envolvendo barbitúricos (3 casos). Foram coletadas amostras de sangue da
veia femoral e aorta de 3 cadáveres para análise de barbitúricos, com resultados
variando de 5.9 a 13.3 µg/mL de concentração do analito nos três casos. O
método se demonstrou rápido (5 min) capaz de detectar concentrações
subterapêuticas.
Cabelo
O uso de cabelo como matriz de análise apresenta algumas vantagens. Assim
como a urina, não são necessários procedimentos invasivos para a sua coleta.
Além disso, o cabelo apresenta o histórico de exposição de um indivíduo a um
toxicante ou fármaco. Estes motivos o tornam o numa matriz bastante interessante
para a análise de compostos de interesse toxicológico. Possui perfil apolar,
20
acumulando preferencialmente os compostos em sua forma original em oposição
aos seus produtos de biotransformação (mais polares). Essas características
tornam o cabelo na matriz ideal para análise de substâncias extensivamente
metabolizadas e não detectadas em outros tecidos 4.
Para a determinação de ecstasy e compostos análogos em cabelo, Pantaleão e
colaboradores22 desenvolveram um método para determinação de estimulantes
anfetamínicos, ecstasy e análogos em cabelo humano utilizando HF-LPME e CG-
MS. Estes compostos são utilizados como drogas de abuso e apresenta relevante
prevalência na população mundial: anfetamínicos - 0.3% a 1.3% e ecstasy e
análogos - 0.2% a 0.6% em pessoas com idades entre 15 e 64 anos (The United
Nations Office on Drugs and Crime (UNODC) – 2009). O método de análise se
mostrou simples e prático alcançando resultados para LOD entre 0.01 e 0.05
ng/mg, RSD menor que 15%, alcançando valores de recuperação de 40.5 a
89.6%.
Fluido oral
Neste trabalho de revisão não foram encontrados estudos com HF-LPME
abordando o fluido oral como matriz. Isso se deve-se ao fato da saliva ser uma
matriz ainda pouco explorada, para a análise de fármacos, apesar de sua coleta
ser pouco invasiva e de relativa facilidade. Apresenta-se como um material
relativamente viscoso e com conteúdo de lipídeos e proteínas pequeno quando
comparado a outros fluidos. Como desvantagem, também apresenta comumente a
presença de contaminantes diversos como creme dental, açúcar, resíduos de
alimentos, entre outros que prejudicam a extração 4.
Outro dado relevante é a técnica utilizada em cada um dos trabalhos para
detecção e quantificação dos analitos nas diferentes matrizes estudadas. No
quadro 03 estão relacionados o número e porcentual relativo de cada uma das
técnicas utilizadas para identificação e quantificação dos analitos estudados, para
cada tipo de matriz biológica pesquisada.
21
Quadro 03: Técnicas de identificação e quantificação por matrizes estudadas nos
artigos selecionados
Técnica de Análise Total de
Matrizes
Porcentagem de Matrizes
Biológicas
ETAAS 1 4%
GC-ECD 1 4%
GC-FID 1 4%
GC-FPD/GC-FID 1 4%
GC-ICP-MS 1 4%
GC–MS 5 21%
GC–MSMS 1 4%
HPLC-DAD 3 13%
HPLC-ET-AAS 2 8%
HPLC–ICP-MS 1 4%
HPLC-PDA 1 4%
HPLC-UV 3 13%
HPLC–UV 1 4%
LC–MS 1 4%
UHPLC–MS/MS 1 4%
Total Geral 24 100%
A cromatografia gasosa (CG) e a cromatografia líquida (HPLC) se mostram
dominantes em aplicabilidade a diferentes métodos e matrizes, sendo cada uma
utilizada em mais de 40% dos trabalhos avaliados.
22
5. CONCLUSÃO
Este trabalho demonstrou importantes aplicações da técnica de extração HF-
LPME em diferentes matrizes biológicas descritos na literatura, dentro do campo
da toxicologia. A HF-LPME demonstra ser extremamente atrativa frente a outras
técnicas devido a seu baixo custo, facilidade de execução, e rapidez. Alinhada
com o conceito de química verde, a utilização de solventes orgânicos é
praticamente eliminada com a aplicação desta técnica. Isto sendo porque a
quantidade de solvente necessária para impregnar os poros da fibra oca é
desprezível.
Foi evidenciado que a técnica é compatível com grande diversidade de amostras
biológicas como sangue total, plasma, soro, urina e cabelo, com aplicação tanto
para a monitoração toxicológica clínica quanto para finalidades forenses. A HF-
LPME apresenta ainda outras vantagens, tais como altas recuperações em
relação a outras metodologias, em analitos com diferentes características físico-
químicas, alta seletividade e ótimo clean-up em amostras complexas.
Quanto à metodologia de análise, a aplicação de HF-LPME é compatível com
diversos sistemas cromatográficos como HPLC, LC-MS, LC-MS, GC, GC-MS, GC-
MS/MS, GC-FID, entre outros. Entretanto, existem empecilhos que dificultam sua
automação. Isso porque a técnica demanda diversos processos manuais que
promovem perdas na eficiência da extração e possivelmente problemas
associados à reprodutibilidade.
Trabalhos futuros, poderão aumentar robustez HF-LPME, explorando a
automatização da técnica nas matrizes biológicas largamente estudadas. Além
disso, outras matrizes poderiam ser analisadas com a como fígado, leite, mecônio
e saliva. Dessa maneira será possível a eliminação de etapas de preparação de
amostras, que apresentam um alto custos e riscos ocupacionais.
23
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7. ANEXOS
Citação
Autor
Ano da Publicação
Origem
Técnica de
Extração
Analito (os)
Matriz
Técnica de
Determ
inação
RSD
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Recuperação
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- 8.
9%
ANEXO 1 - DADOS DA PESQUISA
Citação
Autor
Ano da Publicação
Origem
Técnica de
Extração
Analito (os)
Matriz
Técnica de
Determ
inação
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Recuperação
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95.
0%
Anexo 2 - Publicações Pré Selecionadas Não Incluída s
Autor
1Veronika Pila and others, ‘One-Step Extraction of Polar Drugs from Plasma by Parallel Artificial Liquid
Membrane Extraction’, 1043 (2017), 25–32.
2
Guanzhong Luo, Youxin Li, and James J. Bao, ‘Development and Application of a High-Throughput Sample
Cleanup Process Based on 96-Well Plate for Simultaneous Determination of 16 Steroids in Biological
Matrices Using Liquid Chromatography-Triple Quadrupole Mass Spectrometry’, Analytical and Bioanalytical
Chemistry , 408.4 (2016), 1137–49 <https://doi.org/10.1007/s00216-015-9213-1>.
3
Shao Jun Jing, Qing Lian Li, and Ye Jiang, ‘A New Simultaneous Derivatization and Microextration Method
for the Determination of Memantine Hydrochloride in Human Plasma’, Journal of Chromatography B:
Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences , 1008 (2016), 26–31
<https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2015.09.016>.
4
Behrooz Zargar, Hooshang Parham, and Amir Hatamie, ‘Hollow Fiber Liquid Based Microextraction of
Nalidixic Acid in Urine Samples Using Aliquat 336 as a Carrier Combined with High-Performance Liquid
Chromatography’, Journal of Chromatographic Science , 54.2 (2016), 257–63
<https://doi.org/10.1093/chromsci/bmv117>.
5
I. Jiménez-Díaz and others, ‘Analytical Methods for the Assessment of Endocrine Disrupting Chemical
Exposure during Human Fetal and Lactation Stages: A Review’, Analytica Chimica Acta , 892 (2015), 27–48
<https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.08.008>.
6
Maria José Nunes de Paiva and others, ‘New Method for the Determination of Bile Acids in Human Plasma
by Liquid-Phase Microextraction Using Liquid Chromatography-Ion-Trap-Time-of-Flight Mass Spectrometry’,
Journal of Chromatography A , 1388 (2015), 102–9 <https://doi.org/10.1016/j.chroma.2015.02.016>.
7
Mohammad Mahdi Moein and others, ‘Three-Phase Molecularly Imprinted Sol-Gel Based Hollow Fiber
Liquid-Phase Microextraction Combined with Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry for
Enrichment and Selective Determination of a Tentative Lung Cancer Biomarker’, Journal of
Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences , 995–996 (2015), 38–45
<https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2015.05.005>.
8
Qing-Lian Li and others, ‘Study of Enrichment Factors for Six β-Blockers in Aliphatic Alcohols by Hollow-Fiber
Liquid-Phase Microextraction’, Journal of Separation Science , 38.19 (2015), 3435–41
<https://doi.org/10.1002/jssc.201500487>.
9
Zaifa Pan and others, ‘Three-Phase Hollow-Fiber Microextraction Combined with Ion-Pair High-Performance
Liquid Chromatography for the Simultaneous Determination of Five Components of Compound ??-Ketoacid
Tablets in Human Urine’, Journal of Separation Science , 38.9 (2015), 1499–1506
<https://doi.org/10.1002/jssc.201401497>.
10
Hind Hadi, Ahmad Makahleh, and Bahruddin Saad, ‘Hollow Fiber Liquid-Phase Microextraction Combined
with High Performance Liquid Chromatography for the Determination of Traces Mitiglinide in Biological
Fluid’, Journal of Chromatography B , 895–896.1 (2012), 131–36
<https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2012.03.031>.
11
Mohammad Tajik and others, ‘Automated Hollow Fiber Microextraction Based on Two Immiscible Organic
Solvents for the Extraction of Two Hormonal Drugs’, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis ,
107 (2015), 24–31 <https://doi.org/10.1016/j.jpba.2014.12.028>.
Autor
12
Gazala Mohamed Ben-Hander, Ahmad Makahleh, Bahruddin Saad, Muhammad Idiris Saleh, and others,
‘Sequential Hollow-Fiber Liquid Phase Microextraction for the Determination of Rosiglitazone and
Metformin Hydrochloride (Anti-Diabetic Drugs) in Biological Fluids’, Talanta , 131 (2015), 590–96
<https://doi.org/10.1016/j.talanta.2014.08.037>.
13
Sharon Yong and others, ‘Determination of Total Thyroxine in Human Serum by Hollow Fiber Liquid-Phase
Microextraction and Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry’, Talanta , 126 (2014), 163–69
<https://doi.org/10.1016/j.talanta.2014.03.058>.
14Wang Xiaofei and others, ‘Hollow Fiber Liquid Phase Microextraction of Tramadol From Water and
Biological Samples’, Chinese Journal of Chromatography , 24.6 (2006), 641–44.
15Astrid Gjelstad and others, ‘Parallel Artificial Liquid Membrane Extraction : Micro-Scale Liquid – Liquid –
Liquid Extraction in the 96-Well Format’, 1377–85.
16
Fang Chen and others, ‘Sensitive Determination of Endogenous Hexanal and Heptanal in Urine by Hollow-
Fiber Liquid-Phase Microextraction prior to Capillary Electrophoresis with Amperometric Detection’,
Talanta , 119 (2014), 83–89 <https://doi.org/10.1016/j.talanta.2013.10.052>.
17
Xiaotian Liu and others, ‘High-Throughput Determination of Nicotine in Plasma by Ultrasonication Enhanced
Hollow Fiber Liquid-Phase Microextraction prior to Gas Chromatography’, Journal of Chromatographic
Science , 52.6 (2014), 553–58 <https://doi.org/10.1093/chromsci/bmt079>.
18
Gazala Mohamed Ben-Hander, Ahmad Makahleh, Bahruddin Saad, and Muhammad Idiris Saleh, ‘Hollow
Fiber Liquid Phase Microextraction with in Situ Derivatization for the Determination of Trace Amounts of
Metformin Hydrochloride (Anti-Diabetic Drug) in Biological Fluids’, Journal of Chromatography B: Analytical
Technologies in the Biomedical and Life Sciences , 941 (2013), 123–30
<https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2013.10.007>.
19
Miguel Ángel González-Curbelo and others, ‘Determination of Organophosphorus Pesticides and
Metabolites in Cereal-Based Baby Foods and Wheat Flour by Means of Ultrasound-Assisted Extraction and
Hollow-Fiber Liquid-Phase Microextraction prior to Gas Chromatography with Nitrogen Phosphorus
Detection’, Journal of Chromatography A , 1313 (2013), 166–74
<https://doi.org/10.1016/j.chroma.2013.05.081>.
20Pierina Sueli Bonato, ‘Hollow-Fiber Liquid-Phase Microextraction and Chiral LC – MS / MS Analysis of
Venlafaxine and Its Metabolites in Plasma’, 5 (2013), 721–30.
21
M. Villar Navarro and others, ‘Hollow Fiber Liquid-Phase Microextraction and Determination of
Nonsteroidal Anti-Inflammatories by Capillary Electrophoresis and Sulfonamides by HPLC in Human Urine’,
Biomedical Chromatography , 27.2 (2013), 246–53 <https://doi.org/10.1002/bmc.2783>.
22
Shufen Cui and others, ‘The Mass Transfer Dynamics of Hollow Fiber Liquid-Phase Microextraction and Its
Application for Rapid Analysis of Biological Samples’, Journal of Chromatography A , 1266 (2012), 10–16
<https://doi.org/10.1016/j.chroma.2012.10.024>.
23
A I Olives, V González-Ruiz, and M A Martín, ‘Isolation and Quantitative Methods for Analysis of Non-
Steroidal Anti-Inflammatory Drugs’, Anti-Inflammatory and Anti-Allergy Agents in Medicinal Chemistry , 11.1
(2012), 65–95 <https://doi.org/10.2174/187152312803476273>.
24
Hadi, Makahleh and Saad, ‘Hollow fiber liquid-phase microextraction combined with high performance
liquid chromatography for the determination of traces mitiglinide in biological fluid’ , Journal of
Chromatography B, <10.1016/j.jchromb.2012.03.031>
Autor
25
Homeira Ebrahimzadeh and others, ‘Simultaneous Determination of Chloropheniramine Maleate and
Dextromethorphan Hydrobromide in Plasma Sample by Hollow Fiber Liquid Phase Microextraction and High
Performance Liquid Chromatography with the Aid of Chemometrics’, Talanta , 94 (2012), 77–83
<https://doi.org/10.1016/j.talanta.2012.02.054>.
26
Mohammad Reza Hadjmohammadi, Mona Soltani, and Vahid sharifi, ‘Use of Hollow Fiber Liquid Phase
Microextraction and HPLC for Extraction and Determination of Apigenin in Human Urine after Consumption
of Satureja Sahendica Bornm.’, Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and
Life Sciences , 900 (2012), 85–88 <https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2012.05.022>.
27
W. W. Yang and others, ‘Hollow Fiber Liquid-Phase Microextraction for the Determination of Nimesulide in
Human Plasma and Its Application to a Pharmacokinetic Study’, Pharmazie , 66.8 (2011), 564–69
<https://doi.org/10.1691/ph.2011.1013>.
28
Abdulmumin A. Nuhu, Chanbasha Basheer, and Bahruddin Saad, ‘Liquid-Phase and Dispersive Liquid-Liquid
Microextraction Techniques with Derivatization: Recent Applications in Bioanalysis’, Journal of
Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences , 879.17–18 (2011), 1180–88
<https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2011.02.009>.
29
Jun Zhou and others, ‘Application of Hollow Fiber Liquid Phase Microextraction Coupled with High-
Performance Liquid Chromatography for the Study of the Osthole Pharmacokinetics in Cerebral Ischemia
Hypoperfusion Rat Plasma’, Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and
Life Sciences , 879.23 (2011), 2304–10 <https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2011.06.022>.
30
Khaldun M. Al Azzam and others, ‘Hollow Fiber Liquid-Phase Microextraction for the Determination of Trace
Amounts of Rosiglitazone (Anti-Diabetic Drug) in Biological Fluids Using Capillary Electrophoresis and High
Performance Liquid Chromatographic Methods’, Journal of Chromatography A , 1217.23 (2010), 3654–59
<https://doi.org/10.1016/j.chroma.2010.03.055>.
31
Yang Yang, Juan Chen, and Yan Ping Shi, ‘Determination of Aconitine, Hypaconitine and Mesaconitine in
Urine Using Hollow Fiber Liquid-Phase Microextraction Combined with High-Performance Liquid
Chromatography’, Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life
Sciences , 878.28 (2010), 2811–16 <https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2010.08.032>.
32
Elham Tahmasebi, Yadollah Yamini, and Abolfazl Saleh, ‘Extraction of Trace Amounts of Pioglitazone as an
Anti-Diabetic Drug with Hollow Fiber Liquid Phase Microextraction and Determination by High-Performance
Liquid Chromatography-Ultraviolet Detection in Biological Fluids’, Journal of Chromatography B: Analytical
Technologies in the Biomedical and Life Sciences , 877.20–21 (2009), 1923–29
<https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2009.05.033>.
33
Kamlesh Shrivas and Hui-Fen Wu, ‘Single Drop Microextraction as a Concentrating Probe for Rapid
Screening of Low Molecular Weight Drugs from Human Urine in Atmospheric-Pressure Matrix-Assisted
Laser Desorption/ionization Mass Spectrometry’, Rapid Communications in Mass Spectrometry : RCM ,
21.24 (2007), 3103–3108 <https://doi.org/10.1002/rcm.3192>.
34
Tzu Feng Tsai and Maw Rong Lee, ‘Liquid-Phase Microextration Combined with Liquid Chromatography-
Electrospray Tandem Mass Spectrometry for Detecting Diuretics in Urine’, Talanta , 75.3 (2008), 658–65
<https://doi.org/10.1016/j.talanta.2007.11.058>.
Autor
35
Hamid Reza Sobhi, Yadollah Yamini, and Reza Haji Hosseini Baghdad Abadi, ‘Extraction and Determination
of Trace Amounts of Chlorpromazine in Biological Fluids Using Hollow Fiber Liquid Phase Microextraction
Followed by High-Performance Liquid Chromatography’, Journal of Pharmaceutical and Biomedical
Analysis , 45.5 (2007), 769–74 <https://doi.org/10.1016/j.jpba.2007.09.026>.
36Xiaofei and others, ‘Hollow Fiber Liquid Phase Microextraction of Tramadol From Water and Biological
Samples’, Chinese Journal of Chromatography,
