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Aplicação do planejamento experimental (DOE) no processo de desenvolvimento de fitoterápicos na Indústria

farmacêutica Julho/2015

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ISSN 2179-5568 – Revista Especialize On-line IPOG - Goiânia - 9ª Edição nº 010 Vol.01/2015 julho/2015

Aplicação do planejamento experimental (DOE) no processo de

desenvolvimento de fitoterápicos na Indústria farmacêutica

Thiala Soares Josino da Silva

MBA Gestão da Qualidade e Engenharia da Produção

Instituto de Pós-Graduação - IPOG

Fortaleza, Ceará, 11 de Agosto de 2014

Resumo

A aplicação do DOE na Indústria é fundamental para o desenvolvimento de novos produtos e

para o controle de processos. Um dos aspectos que deve ser observado para o conhecimento

das substâncias ativas de plantas consiste na preparação de extratos vegetais, cuja obtenção

pode ser feita através da realização de um planejamento fatorial. O trabalho objetivou

avaliar a técnica de extração no preparo do extrato hidroalcoólico de folhas de Spondias

mombin L., por meio da aplicação de estudos fatoriais, determinando, simultaneamente, a

influência da temperatura e da concentração etanólica, tendo como respostas o teor de

resíduo seco (RS) e o de fenóis totais (FT). O processo foi realizado seguindo um

planejamento fatorial completo 22 com dois fatores: A – temperatura, 60°C e 27ºC; B –

concentração etanólica, 70% e 30%. Os resultados foram analisados empregando-se o

programa Minitab. Para RS, a temperatura foi a variável mais importante, enquanto que

para FT, foi a concentração etanólica; para ambas as respostas os efeitos de interação entre

os fatores A e B não foram significativos; e a temperatura influenciou tanto o RS quanto o

teor de FT. Assim, sugere-se a combinação de 60ºC e 70% de etanol, para a otimização do

processo de extração.

Palavras-chave: Planejamento fatorial. Extração. Otimização de processo. Spondias mombin

L..

1. Introdução

A palavra “otimizar” significa fazer tão perfeito, efetivo ou funcional quanto possível

(SCHWARTZ, 1981). Variadas técnicas de planejamento experimental e análise estatística

dos dados são utilizadas na otimização de diversos sistemas (CLARKE & KEMPSON, 1997).

O planejamento fatorial é utilizado para se obter as melhores condições operacionais de um

sistema, realizando-se um número menor de experimentos quando comparado com o método

univariado (BRASIL et al, 2007; MONTGOMERY, 2004).

Para Montgomery (2004), um experimento planejado é um teste, ou série de testes, no

qual são feitas mudanças propositais nas variáveis de entrada de um processo, de modo a

podermos observar e identificar mudanças correspondentes na resposta de saída. Para Campos

(2003), o Planejamento de Experimentos (DOE - Design of Experiments) é constituído de um

conjunto de técnicas estatísticas que proporcionam um método estruturado para planejar,

executar e analisar experimentos.



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O planejamento fatorial tem como vantagem evitar dificuldades provenientes da

possibilidade de que variáveis interajam entre si, proporcionando um meio em que os fatores

envolvidos na reação ou no processo possam ser avaliados simultaneamente e a importância

relativa de cada um destes possa ser determinada (ARMSTRONG & JAMES, 1996), devendo

a escolha do fator ser pré-determinada pelo experimentador (BOLTON, 1990).

A introdução da metodologia do planejamento experimental nos estágios iniciais do

ciclo de desenvolvimento de um produto é, em geral, a chave para o sucesso do projeto, seu

uso eficaz pode levar a produtos mais fáceis de serem fabricados, com maior confiabilidade e

que têm desempenho de campo acentuado (MONTGOMERY, 2004).

A aplicação dos Planejamentos Experimentais na Indústria é fundamental para o

desenvolvimento de novos produtos e para o controle de processos. Nesta área é comum

aparecer problemas em que se precisam estudar várias propriedades ao mesmo tempo e estas,

por sua vez, são afetadas por um grande número de fatores experimentais. É papel de técnicas

de planejamento de experimentos, auxiliar na fabricação de produtos com melhores

características, na diminuição do seu tempo de desenvolvimento, aumentar a produtividade de

processos e minimizar a sensibilidade a fatores externos (NETO et al., 2001).

Qualquer processo farmacêutico que tenha, no mínimo, dois parâmetros, como

temperatura e velocidade, os quais possam ter um valor mínimo e máximo atribuído e uma

resposta igualmente mensurável, com limites de especificação determinados, é passível de ser

estudado mediante o uso do DOE (DA SILVA, 2007).

Diversos são os autores que estão aplicando o planejamento de experimentos na área

farmacêutica como ferramenta no desenvolvimento de novos processos ou produtos e no

aprimoramento de processos ou produtos já existentes. Podemos destacar alguns como

exemplo:

- Uso do planejamento experimental para otimizar os fatores do processo de

granulação em leito fluidizado em escala semi-industrial (RAMBALI, 2001).

- Avaliação e otimização simultânea das características de peletes, utilizando um

planejamento fatorial 33 (PATERAKIS, 2002).

- Planejamento fatorial, caracterização físico-química e atividade de nanopartículas de

ciprofloxacina-PLGA (DILLEN, 2004).

- Aplicação da metodologia de planejamento de experimentos no desenvolvimento e

otimização de método de liberação de fármacos (KINCL, 2005).

- Aplicação do planejamento experimental estatístico para estudar as variáveis que

influenciam o processo de revestimento na formulação de lipossomas de lidocaína (Gonzalez-

RODRIGUES, 2007).

- Planejamento de processo aplicado na otimização da produção de pós por

compressão direta por meio de um processo de fabricação contínua (GONNISSEN, 2008).

- Entender o efeito do tamanho de partícula da lactose sobre as propriedades de

formulações PSI utilizando o planejamento experimental (GUENETTE, 2009).

- Desenvolvimento Tecnológico de Soluções Extrativas Hidroetanólicas das Flores de

Calendula officinalis L. empregando Planejamento Fatorial (SOUZA et al., 2010).



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- Otimização das condições de extração de senosídeos por soluções hidroetanólicas

das folhas de Senna alexandrina MILL empregando planejamento fatorial (SEVERO et al.,

2013)

As plantas medicinais são potenciais fontes de moléculas bioativas com mecanismos

de ação inovadores e estruturas diferenciadas, características que tem impulsionado pesquisas

visando desenvolvimento de medicamentos fitoterápicos pela indústria farmacêutica

(ELISABETSKY, 2004).

A Associação Brasileira das Empresas do Setor Fitoterápico, Suplemento Alimentar e

de Promoção da Saúde (ABIFISA) relata que segundo a Organização Mundial de Saúde,

aproximadamente 80% da população mundial utiliza-se de algum medicamento derivado de

plantas medicinais. Pesquisas também demonstram que 91,9% da população brasileira já fez

uso desses produtos, sendo que 46% cultivam em casa alguma espécie de planta medicinal.

Atualmente, estima-se que o mercado brasileiro de fitoterápicos movimente cerca de R$ 1

bilhão por ano (ABIFISA, 2011).

O uso de fitoterápicos na medicina humana quer seja como prática tradicional,

complementar ou alternativa à alopatia, vem sendo estimulado legalmente no Brasil

principalmente após 2006 através do reconhecimento dos benefícios garantidos pelo uso

seguro, eficaz, qualificado e racional e com a aprovação da Política Nacional de Plantas

medicinais e fitoterápicos (BRASIL; 2006). Esse estímulo é fundamentado nas vantagens

largamente atribuídas aos fitoterápicos como custos reduzidos e valorização das tradições

populares, bem como a comprovação, através dos avanços das pesquisas, dos efeitos

sinérgicos decorrentes dos vários constituintes químicos presentes em uma espécie vegetal e

da associação de mecanismos por constituintes agindo em alvos moleculares diferentes,

contribuindo na eficácia terapêutica (YUNES; CALIXTO, 2001; LAPA et al., 2004;

ELISABETSKY, 2004; SIXEL; PECINALLI, 2005).

Um dos aspectos que deve ser observado para o conhecimento das substâncias ativas

de plantas consiste na preparação de extratos vegetais, a fim de isolar seus constituintes

químicos ativos (CECHINEL & YUNES, 1998). Um dos métodos que pode ser considerado

adequado para a análise químico-farmacológica é a preparação de extratos hidroetanólicos

50% por maceração. Este extrato é análogo às tinturas realizadas na cultura popular, onde se

misturam as partes ativas das plantas com bebidas alcoólicas (CECHINEL & YUNES, 1998).

A obtenção de uma solução extrativa padronizada requer o conhecimento de suas

propriedades tecnológicas e/ou físico-químicas, e dos fatores que as influenciam, criando

condições para avaliar a manutenção e a reprodutibilidade de sua qualidade. Desta maneira, é

necessário detectar e estudar os efeitos de tais fatores, os quais podem ser estimados através

da realização de um planejamento fatorial. A realização de uma análise fatorial com objetivo

de otimizar formulações farmacêuticas emprega modelos estatísticos que permitem assegurar

o resultado, diminuindo a possibilidade de erros aleatórios (MONTGOMERY, 1991;

DAVIES, 1993; MORGAN, 1995).

Conhecida popularmente como cajazeira (LORENZI, 2000), a Spondias mombin L. é

uma árvore (Figura 1) de porte elevado, frutífera, com casca do tronco muito rugosa, onde

destacam-se pedaços grossos de súber, conhecidos pelo nome de caracas. As folhas, são

compostas, decíduas, alternadas, imparipinadas, com 20 – 45 cm de comprimento. O fruto é



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uma drupa de cor amarelo-alaranjada, de sabor ácido, ovóide e oblongo com 3,2 a 4,0 cm de

comprimento e 2,5 cm de largura. As flores pequenas, fragantes, esbranquiçadas, podem ser

femininas, masculinas e bissexuais, dispostas em panícula com 15 a 30 cm de comprimento

(MORTON, 1987; MATOS, 1998). No Brasil, as cajazeiras são encontradas isoladas ou

agrupadas, notadamente em regiões da Amazônia e da Mata Atlântica e nas zonas mais

úmidas dos Estados do Nordeste, principalmente na faixa litorânea e nas serras, e de forma

espontânea e subespontânea, em matas, campos de pastagens e pomares domésticos (SOUZA

et al, 2000).

Todas as partes da planta S. mombin têm sido utilizadas pela medicina tradicional. O

decocto das frutas é bebido como um diurético e febrífugo. A goma é utilizada como

expectorante e para expelir vermes (RODRIGUES & HASSE, 2000). O suco das folhas

trituradas e o pó de seca folhas são usadas como cataplasmas em feridas e em inflamações. O

decocto do caule e das folhas é usado como emético, antidiarréico e no tratamento de

disenteria, hemorróidas, gonorréia e leucorréia (AKUBUE, et al., 1983). O chá das flores e

das folhas é feito para aliviar estomatites, uretrite, cistite e inflamação da garganta

(VILLEGAS et al., 1997). O extrato das folhas é indicado como antiviral, agindo sobre o

vírus da herpes labial, da angina herpética e contra o vírus Cockisquii, responsável pelos

surtos periódicos de aftas dolorosas especialmente em crianças (HARRI E MATOS, 2008).

A atividade de S. mombin sobre o vírus Coxsakii B2 e Herpes Simples 1, responsáveis

pelas crises de aftas dolorosas e pela herpes labial, respectivamente, foi determinada e

atribuída à presença de quatro substâncias da planta, sendo dois taninos: geraniina e

galoilgeraniina, compostos polifenólicos, (Figura 2) (CORTHOUT et al., 1991), e dois ésteres

do ácido caféico (CORTHOUT et al., 1992).

O trabalho objetivou avaliar a técnica de extração, na preparação do extrato

hidroalcoólico de folhas de cajazeira (S. mombin). Apresentando como vantagem a extração

da máxima quantidade de princípio ativo com o mínimo de recursos e tempo, a maximização

dos resultados foi obtida por meio da aplicação de estudos fatoriais, determinando,

simultaneamente, a influência da temperatura e da concentração etanólica e tendo como forma

de avaliação o teor de resíduo seco (RS) e o de fenóis totais (FT).

Figura 1 – Cajazeira (Spondias mombin L.). A. Árvore; B. Flores; C. Frutos; D. Sementes

Fonte: Spondias mombin - Ação anti-herpes e anti-virótica

(http://www.padetec.ufc.br/novapagina/vendas/cajazeira/cajazeira.php. Acesso em: 19 dez. 2013)

A B C D

http://www.padetec.ufc.br/novapagina/vendas/cajazeira/cajazeira.php



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Figura 2 - Taninos elágicos isolados de folhas e caule de S. mombin. 1. Geraniina; 2. Galoilgeraniina

Fonte: CORTHOUT et al., 1991

2. Materiais e métodos

2.1. Material vegetal

Foram utilizadas folhas secas de Spondias mombin L. pulverizadas fornecidas pelo

Parque de Desenvolvimento tecnológico da Universidade Federal do Ceará.

2.2. Preparo do extrato

As extrações foram feitas usando as folhas pulverizadas de S. mombin por 4 horas. A

concentração droga/solvente utilizada foi 10g das folhas pulverizadas para 100mL de solução

hidroalcoólica. Duas temperaturas de extração foram usadas 27 ± 2°C e 60 ± 5°C, e duas

concentrações etanólicas: 30% e 70 % (v/v).

2.3. Planejamento fatorial para otimização da extração das folhas de S. mombin

O processo extrativo foi realizado de acordo com a Tabela 1, a qual apresenta a matriz

de planejamento para um planejamento fatorial completo 22 com dois fatores. Os fatores e os

níveis estudados foram: A – temperatura nos níveis 60°C e 27ºC (respectivamente 1 e -1); B –

concentração etanólica nos níveis 70% e 30% (respectivamente 1 e -1). Como parâmetros de

análise foram utilizados a determinação do resíduo seco (RS) e o teor de fenóis totais (FT). Os

resultados foram analisados estatisticamente empregando-se o programa Minitab. As

determinações foram realizadas com 3 repetições, totalizando 12 ensaios.

Ensaio Temperatura (ºC) Concentração etanólica (%)

1 27 30



6


2 60 30

3 27 70

4 60 70

Tabela 1- Matriz de planejamento fatorial 22 para estudar a influência da temperatura e da concentração etanólica

no processo extrativo de folhas de S. mombin

Fonte: Dados produzidos pelo o autor (2014)

Nos planejamentos de dois níveis costuma-se identificar os níveis superior e inferior

com os sinais (+) e (-), respectivamente (NETO, 2003). Usando essa notação, observasse que

os ensaios 2 e 4 na Tabela 1 correspondem ao nível (+) da temperatura, enquanto os ensaios 1

e 3 correspondem ao nível (-). No caso da graduação alcoólica, os ensaios 1 e 2 correspondem

ao nível (-), enquanto os ensaios 3 e 4 correspondem ao nível (+). Assim, a matriz de

planejamento fatorial 22, na forma codificada, para estudar a influência da temperatura e da

graduação alcoólica no processo extrativo é expressa como na “Tabela 2”.

Ensaio Temperatura (ºC) Concentração etanólica (%)

1 - -

2 + -

3 - +

4 + + Tabela 2- Matriz codificada de planejamento fatorial 22 para estudar a influência da temperatura e da

concentração etanólica no processo extrativo de folhas de S. mombin


2.4. Determinação do teor de resíduo seco

Foram transferidos 10mL de extrato para placa de Petri, os quais foram evaporados até

secura em banho de temperatura e posteriormente dessecados em estufa a 105ºC, por 3 horas.

Após dessecar, a amostra foi esfriada em dessecador e pesadas. O resíduo seco foi calculado

em porcentagem sobre o volume inicial (10mL).

2.5. Determinação do teor de fenóis totais

A dosagem de fenóis totais deu-se com o emprego do reagente de Folin-Ciocalteau.

Este é composto por dois ácidos, o fosfotunguístico e o fosfomolibídico, cujo tungstênio e

molibdênio apresentam estado de oxidação 6+. Na presença de agentes redutores, como os

compostos fenólicos, a média do estado de oxidação desses íons encontra-se entre 5 e 6,

formando os chamados tungstênio e molibdênio de coloração azul cuja intensidade é medida

por espectrofotometria. Alíquotas (100µL) das soluções amostra (extrato hidroetanólico de S.

mombin) e padrão de trabalho (ácido gálico) foram transferidas para balão volumétrico de

10mL onde foram adicionados 0,5mL do reagente de Folin-Ciocalteau 1N e 4mL de água

ultra-pura. Após alcalinizar o meio (1,25mL de Na2CO3 a 20%), o volume foi completado

com água ultra-pura. Decorrido 40min, à temperatura ambiente e ao abrigo da luz, realizou-se

leitura espectrofotométrica (715nm).

3. Resultados e discussão



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Este trabalho teve como objetivo encontrar, realizando planejamento e análises

estatísticas de experimentos, as melhores condições operacionais do processo de extração por

solução hidroetanólica de folhas de Spondias mombin L.

Segundo Massart et al (1988) os fatores podem ser divididos em duas categorias,

quantitativos e qualitativos. Portanto, para o presente estudo a concentração etanólica e a

temperatura são fatores quantitativos, uma vez que são valores numéricos e expressam a

quantidade deste fator.

Para fazer um planejamento fatorial completo realizam-se experimentos em todas as

possíveis combinações de níveis dos fatores e cada um desses experimentos, em que o sistema

em estudo é submetido a um conjunto de níveis definido é um ensaio experimental (NETO,

2003). Tal fato pode ser verificado ao analisar a matriz de planejamento apresentada na

“Tabela 1” deste artigo. A análise do teor dos principais componentes biologicamente ativos em matérias-

primas de origem vegetal ou de fitoterápicos é uma etapa essencial para a segurança e eficácia

de sua utilização na elaboração de produtos farmacêuticos (WILLIAMSON, 2001), portanto

uma das respostas analisadas foi o teor de fenóis totais, tendo também o teor de sólidos totais

extraídos (resíduo seco) como segundo parâmetro de resposta.

Os resultados observados nos ensaios realizados em todas as quatro possíveis

combinações dos níveis escolhidos são apresentados na “Tabela 3”. Os experimentos foram

realizados em triplicata, resultando em 12 ao total, com o intuito de se estimar o erro

experimental de uma resposta individual.

A Figura 3a, 3b e 3c mostra, respectivamente, o gráfico de Pareto dos efeitos

padronizados em p = 0,05, os efeitos principais para a resposta RS e a interação entre os

fatores A (temperatura) e B (concentração etanólica). No gráfico de Pareto, os efeitos para a

resposta RS que se localizam à direita da linha tracejada (p=0,05) foram significativos. No

gráfico dos efeitos principais, pode-se observar o aumento da resposta com a variação dos

fatores e no gráfico das interações é possível observar se há interação dos fatores e qual a

melhor resposta a partir da variação dos dois fatores.

Analisando-se os gráficos da figura 3, pode-se dizer que a temperatura (fator A)

utilizada na preparação dos extratos foi a variável mais importante do processo global da

extração para a resposta RS, que a concentração etanólica (fator B) também contribuiu de

forma significativa, porém em menor grau, para a otimização do processo. Além disso, as

figuras demonstram que o melhor sistema extrativo para a resposta RS é aquele que emprega

a temperatura de 60ºC com concentração etanólica de 70% e que não há interação entre os

fatores.

A Figura 4a, 4b e 4c mostra, respectivamente, o gráfico de Pareto dos efeitos

padronizados em p = 0,05, os efeitos principais para a resposta FT e a interação entre os

fatores A (temperatura) e B (concentração etanólica). No gráfico de Pareto, os efeitos para a

resposta FT que se localizam à direita da linha tracejada (p=0,05) foram significativos. No

gráfico dos efeitos principais, pode-se observar o aumento da resposta com a variação dos

fatores e no gráfico das interações é possível observar se há interação dos fatores e qual a

melhor resposta a partir da variação dos dois fatores.

Experimentos A B RS (mg) FT (mg/mL)



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1 - + 23,5 16,80

2 + - 28,3 17,42

3 - + 35,7 23,61

4 + - 28,2 17,97

5 + + 30,0 22,21

6 + + 32,5 22,76

7 - - 22,8 12,11

8 - + 25,4 19,16

9 - + 21,6 16,88

10 - - 23,2 14,88

11 + - 27,9 14,80

12 - - 22,2 13,35

Níveis

Fatores -1 1

A: Temperatura 27ºC 60ºC

B: Concentração etanólica 30% 70%

Tabela 3 - Resultado experimental do planejamento fatorial completo 22




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Figura 3: a- Gráfico de Pareto para os efeitos padronizados em p= 0,05 para RS; b- Efeitos principais para RS; c-

Interação entre os fatores A (temperatura) e B (concentração etanólica) para RS

Fonte: Dados produzidos pelo autor (2014)



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Figura 4: a- Gráfico de Pareto para os efeitos padronizados em p= 0,05 para FT; b- Efeitos principais para FT; c-

Interação entre os fatores A (temperatura) e B (concentração etanólica) para FT


Analisando-se os gráficos da figura 4, pode-se dizer que a concentração etanólica

(fator B) utilizada na preparação dos extratos foi a variável mais importante do processo

global da extração para a resposta FT e que a temperatura (fator A) também contribuiu de

forma significativa, mesmo que em menor grau, para a otimização do processo. Além disso,

as figuras demonstram que o melhor sistema extrativo para a resposta FT é aquele que

emprega a temperatura de 60ºC com concentração etanólica de 70% e que não há interação

entre os fatores.

Os resultados referentes a concentração etanólica estão de acordo com outros autores

que sugerem que solventes com alta polaridade, como a água, e solventes com polaridade

muito baixas, ou apolares, como hexano ou diclorometano, não são bons extratores (LIU et

al., 2000). A água, considerada o solvente universal, em combinação com outros solventes

orgânicos contribui para criar um meio moderadamente polar, o que favorece a extração de

polifenóis (LAPORNIK et al., 2005; LIYANA-PATHIRANA; SHAHIDI, 2005).

Entre os fatores principais, a passagem do nível inferior (27ºC) para o nível superior

(60ºC) na temperatura utilizada no processo extrativo, proporcionou um aumento tanto no

resíduo seco (RS) quanto no teor de fenóis totais (FT). Assim, o aumento da temperatura

usada no processo extrativo influencia positivamente no RS e no teor de FT.



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Outra forma de se observar as condições de extração e seus efeitos, é a partir dos

gráficos de contorno das figuras 5a e 5b e dos gráficos de superfície das figuras 6a e 6b. Nos

gráficos de contorno, é possível ver quais as combinações adequadas dos níveis dos fatores

para obtenção de determinadas faixas tanto de RS quanto de FT, esta análise torna-se útil

quando há necessidade de avaliações rápidas e sem precisão. Nos gráficos de superfície,

percebe-se a influência mais predominante de cada fator em cada resposta, para RS a

influência é maior para temperatura, enquanto que para FT, é maior em relação a

concentração etanólica; também é possível notar qual a melhor condição de operação para

cada resposta.

Figura 5: Gráficos de contorno: a- RS vs concentração etanólica e temperatura; b- FT vs concentração etanólica e

temperatura


Figura 6: Gráficos de superfície: a- RS vs concentração etanólica e temperatura; b- FT vs concentração etanólica

e temperatura


4. Conclusão

O planejamento fatorial aplicado na otimização do processo extrativo indicou a

combinação das seguintes condições de operação para a otimização do processo de extração

da Spondias mombin: temperatura de 60ºC e concentração etanólica de 70% na solução



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extrativa. Dessa forma, recomenda-se o planejamento fatorial previamente aos estudos em que

se pretende desenvolver soluções extrativas.

Os resultados experimentais obtidos podem ser extrapolados e aplicados à indústria,

favorecendo a extração deste princípio ativo em larga escala

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