Karina MeloTalita Fernanda

Belém-PA2012

Universidade Federal do ParáMestrado em Genética e Biologia Molecular

RNA seq

Uma abordagem desenvolvida para transcriptoma usando tecnologias de

sequenciamento “next generation”

Medição dos níveis de transcritos

Determinar a estrutura funcional

dos genes

Permite

O termo RNA-seq tem sido usado para representar o transciptoma revelado por sequenciamento de cDNA por NGS (sequenciadorres de segunda geração);

Permite a quantificação dos níveis de expressão gênica, mesmo em transcritos que possuem níveis mais baixos de expressão devido a sua alta sensibilidade;

Útil para descobrir novas transcrições, identificação de mutaçoes, indels, splicing alternativos;

RNA seq

MetodologiaRNA seq

Fonte: Snyder et al, 2009.

Sequenciamento:

Ilumina IG.

Applied Biosystems SOLiD.

Roche 454 Life Science systems

Biosystems HeliScope™ Single Molecule Sequencer.

Pacific Biosystems PACBIO RS.

RNA seq

Tabela 1: Principais características técnicas das plataformas 454 GS-FLX, ILLUMINA E SOLID

Fonte: Adaptado de: Metzker 2010; Carvalho & Silva 2010.

Após o sequenciamento os resultados são alinhados num genoma de referência ou montados de novo.

RNA seq

Genoma de referência

Montados de novo

“Ab initio”

Preferencialmente o método “Ab initio”;

Quando não se possui genoma de referência pode ser utilizado na montagem o genoma de um organismo filogenéticamente próximo;

Combinando as duas estratégias: mesmo que se possua o genoma de referência, é recomendado alinhar novamente usando o alinhamento gerado “de novo”;

Método “de novo” é mais efetivo quando utilizado em genomas de procariontes; pois esta abordagem está mais suscetível a erros de sequenciamento, gera transcritos mais fragmentados, além de um volume de dados computacionais muito maior.

Quantificação do nível de expressão gênica

Análise dos dados apóso Sequenciamento:

Fonte: Marthin & Whang 2011

Aplicação RNAseq.RNA seq

Ambiente Normal

Estresse térmico

Estresse osmótico

CDS 1 CDS 2

CDS 1 CDS 2

CDS 1 CDS 2

Vantagens.

- Permite detectar transcritos mesmo sem a presença de um genoma de referência;

- Pode detectar variações nas sequencias genômicas;

- Possuem pouco ruído de fundo, podendo ser mapeado sem ambiguidade em regiões distintas do genoma;

- Requer uma quantidade muito menor de amostras de RNA;

- Já revelou várias regiões de transcrição e isoformas de splicing novas de genes conhecidos;

- Capaz de rastrear com acurácia as mudanças na expressão gênica durante diferentes estágios da diferenciação de células e do desenvolvimento de alguns organismos.

RNA seq

Fonte: Wang et al. 2009

Desvantagens.

- Moléculas de RNA necessitam ser fragmentadas para que possam se adequar às tecnologias de sequenciamento de nova geração, podendo em cada processo de fragmentação influenciar no resultado produzido;

- Por usar sequenciamento de larga escala, enfrenta desafios durante o armazenamento, recuperação e processamento das grandes quantidades de dados gerados;

- Permite maior cobertura e por isso requer mais sequenciamento que, por sua vez, aumenta o custo;

- Para sua validação é exigido o uso de triplicatas para cada experimento;

- Sujeito a erros de sequenciamento devido ao grande volume de dados gerados, sendo necessário dedicar maior tempo na análise pós-montagem para resolvê-los

RNA seq

Perspectivas

Embora o RNA-seq ainda seja um método pouco utilizado devido a seu recente desenvolvimento, ele possui muitas vantagens em relação a outros métodos, como o microarray podendo vir a substitui-lo;

Os próximos desafios a esta metodologia é ser amplamente utilizada em genomas mais complexos para identificar níveis de expressão de transcritos raros;

O uso de novas tecnologias (sequenciamento pair-end e strand specif) podem vir a facilitar esta meta permitindo uma maior cobertura genômica com o uso de sequencias longas (reads);

RNA seq

Ampla utilização em mais organismos, como plantas poliplóides, comunidades de microorganismos (metatranscriptômica);

Avanços nos sistemas computacionais e nos próprios computadores, permitindo um maior rapidez na análise dos dados;

Futuro da “montagem” transcriptômica: “Não será necessário montar” (Martin & Wang 2009).

RNA seq

Aplicações no estudo de doenças genéticas.RNA seq

Aplicações no estudo de doenças genéticas.

- Detecta alterações na molécula de RNA em células cancerosas;

- Permite identificar níveis de expressão e de novos transcritos;

- Identifica mecanismos de splicing alternativo e fusões gênicas;

- Detecta mutações, entre elas rearranjos cromossômicos, que levam a transcritos quiméricos;

RNA seq

Obrigada!!