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Número da Publicação

US8609724 B2

Tipo de Publicação

Concessão

Número do PEDIDO

US 11 / 911,299

Número de PCT (Tratado de Cooperação em Matéria de Patentes)

PCT / CA2006 / 000548

Data de Publicação

17 dez. 2013

Dados de depósito 11 abr. 2006

Dados da Prioridade

11 abr. 2005

Tambem Como publicado

CA2604625A1 , CA2604625C ,US20090118370 , WO2006108276A1

Inventores Evangelos Michelakis , Stephen Archer

Cessionário originais

Evangelos Michelakis , Stephen Archer

Exportar citação BiBTeX , EndNote , RefMan

Citações de patente (12), Citações de Nao patente (35),Classificações (4), Eventos Legais (3)

Links Externos:  USPTO , Cessão do USPTO , Espacenet

Método de tratamento de cancro utilizando dicloroacetato US 8609724 B2RESUMO

A invenção relaciona-se com a utilização de dicloroacetato e equivalentes químicos dos mesmos para o tratamento de cancro através da indução de apoptose ou reverter a resistência a apoptose numa célula de um modo preferido, a dosagem é de 10-100 mg / kg Preferivelmente, o dicloroacetato de sódio é usado. O dicloroacetato pode opcionalmente ser

administrada em combinação com um agente pró-apoptóticos e / ou um agente quimioterapêutico De um modo preferido, os cancros são tratados não pequenas do cancro do pulmão de células, glioblastoma e carcinoma da mama.

IMAGENS (7)

 

 

 

 

 

 

 

REIVINDICAÇÕES (20)

Nós reivindicamos:1. Um método para tratamento de um cancro associado com mitocôndrias hiperpolarizado compreendendo:selecção de um paciente tendo um cancro, compreendendo a mitocôndria hiperpolarizado e / ou uma elevada para survivina Kv1.5 proporção de proteína relativamente a um controlo normal; e

a administração ao referido paciente em necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de dicloroacetato (DCA) ou de um ácido ou de um seu sal.

2. O método de reivindicação 1 em que o dicloroacetato de ácido ou ou um seu sal é um sal de ácido dicloroacético.

3. O método de reivindicação 2 em que o dicloroacetato ou ácido ou sal da mesma está dicloroacetato de sódio.

4. O método de reivindicação 1 em que o cancro compreendendo mitocôndrias hiperpolarizados e / ou uma elevada para survivina Kv1.5 razão de proteínas em relação a um controlo normal é seleccionado de entre o grupo que consiste de cancro do pulmão de células, glioblastoma e carcinoma da mama não-pequenas.

5. O método de reivindicação 1 em que o dicloroacetato de ácido ou ou um seu sal é administrado na forma de uma composição farmacêutica compreendendo dicloroacetato ou ácido ou um seu sal e um transportador farmaceuticamente aceitável.

6. O método de reivindicação 1 em que o dicloroacetato de ácido ou ou um seu sal é administrado por via oral.

7. O método de reivindicação 6 em que 10-100 mg / kg de DCA ou ácido ou um seu sal é administrado por dia.

8. O método de reivindicação 6 em que 10-100 mg / kg de DCA ou ácido ou um seu sal é administrado duas vezes por dia.

9. O método de reivindicação 8 em que a dose é de 25-50 mg / kg.

10. O método de reivindicação 7 em que a dose é de 25-50 mg / kg.

11. O método de reivindicação 1 em que o dicloroacetato de ácido ou ou um seu sal é administrado em combinação com outro agente pró-apoptóticos e / ou o agente quimioterapêutico, e / ou outra terapia de cancro.

12. O método de reivindicação 1 em que a administração de uma quantidade eficaz de dicloroacetato de ácido ou um seu sal ou induz a apoptose e / ou a inversão da resistência a apoptose numa célula de cancro do paciente.

13. O método de reivindicação 1 em que a administração de uma quantidade eficaz de dicloroacetato de ácido ou um seu sal ou inibe a proliferação de células cancerígenas do paciente.

14. O método de reivindicação 1 em que a administração de uma quantidade eficaz de dicloroacetato de ácido ou de sal ou diminui mesmo nível de survivina em uma célula de cancro do paciente.

15. O método de reivindicação 1 em que a administração de uma quantidade eficaz de dicloroacetato de ácido ou um seu sal ou aumenta o nível de proteína Kv1.5 em uma célula de cancro do paciente.

16. O método de reivindicação 1 em que a administração de uma quantidade eficaz de dicloroacetato de ácido ou um seu sal ou aumenta o nível de factor indutor de apoptose (FIA), em uma célula de cancro do paciente.

17. O método de reivindicação 1em que a administração de uma quantidade eficaz de dicloroacetato de ácido ou um seu sal ou aumenta o nível de H 2 O 2 em uma célula de cancro do paciente.

18. O método de reivindicação 1, Em que as células cancerosas, mas não as células normais ou não-cancerosas, do paciente são afectados pela administração de dicloroacetato de ácido ou ou um seu sal.

19. O método de reivindicação 1, Em que o dicloroacetato de ácido ou um seu sal ou tem a fórmula CH (Cl 2 ) -COO-X, em que X é seleccionado a partir do grupo constituído por Na + , K + , CH 3 e OH.

20. O método de reivindicação 1, Em que o dicloroacetato de ácido ou um seu sal ou tem a fórmula CH (Cl 2 ) -COO - K + .

DESCRIÇÃO

REIVINDICAÇÃO DE BENEFÍCIO DA DATA DE DEPÓSITO

O presente pedido reivindica o benefício da data de apresentação do pedido de patente PCT N ° de Série PCT / CA2006 / 000548, (apresentado em 11 de abril de 2006) (publicado como WO 06/108276) e US Ser. N ° 60 / 669.884 (depositado em 11 de abril, 2005), cujos conteúdos são aqui incorporados por referência na sua totalidade para todos os fins.

CAMPO DE INVENÇÃO

A invenção relaciona-se com a utilização de dicloroacetato e equivalentes químicos óbvios dos mesmos no tratamento do cancro. utilizações relacionadas e métodos de diagnóstico e de rastreio também estão incluídos em um aspecto da presente invenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A maioria dos cancros são caracterizados por uma resistência à apoptose que os torna propenso a proliferação e resistente à maioria das terapias do cancro. A maioria dos tratamentos contra o cancro disponíveis objectivo de induzir apoptose mas são altamente tóxicos. Existem duas categorias principais de apoptose: o mediada pelo receptor e a apoptose dependente de mitocôndrias. -Mitocôndrias dependentes apoptose não está muito bem estudada e só recentemente a mitocôndria foi visto como nada mais do que uma organela que produz energia. Como tal, existe uma necessidade para uma terapia do cancro que pode superar a resistência a apoptose em células cancerosas.

SUMARIO DA INVENÇÃO

Uma célula pode tornar-se resistentes à apoptose numa variedade de maneiras um dos quais está a alterar o seu metabolismo e que têm mitocôndrias hiperpolarizados. Uma vez que a apoptose é iniciada pela despolarização das mitocôndrias, o mais hyperpolarized uma mitocôndria é, quanto mais é do limiar de despolarização e a mais resistente é à iniciação de apoptose.

Numa concretização, os presentes inventores descobriram surpreendentemente que se pode modular a função mitocondrial para o tratamento do cancro. Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um método para a indução de apoptose no cancro. Numa outra forma de realização, os inventores fornecem um método para a indução de apoptose no cancro mas não as células normais.Numa outra forma de realização, a invenção proporciona um método para inverter a resistência a apoptose em células de cancro, tais como células cancerosas com mitocôndrias hiperpolarizados. Numa forma de realização, o método compreende a administração às células cancerosas, de uma concretização que tem células ou suspeito de ter mitocôndrias hiperpolarizado, uma quantidade eficaz de dicloroacetato ou os seus sais ou equivalentes químicos óbvios dos mesmos.

Numa forma de realização, o dicloroacetato ou equivalente químico óbvio deste é administrado em combinação com outro agente pró-apoptóticos e / ou o agente quimioterapêutico, e / ou outra terapia de cancro.

Numa forma de realização, a invenção proporciona um método para induzir a apoptose e / ou reversão da resistência a apoptose numa célula de cancro, compreendendo administrar à célula uma quantidade eficaz de dicloroacetato ou seu equivalente químico óbvio. Numa outra forma de realização, a invenção proporciona um método para inibir a proliferação de células

cancerosas, que compreende administrar às células uma quantidade eficaz de dicloroacetato ou seu equivalente químico óbvio. Numa outra forma de realização, a invenção proporciona um método para diminuir a survivina em uma célula de cancro, compreendendo administrar à célula uma quantidade eficaz de dicloroacetato ou seu equivalente químico óbvio. Numa outra forma de realização, a invenção proporciona um método de aumentar a proteína Kv1.5 em uma célula de cancro, compreendendo administrar à célula uma quantidade eficaz de dicloroacetato ou seu equivalente químico óbvio. Numa outra forma de realização, a invenção proporciona um método para aumentar FIA em uma célula de cancro, compreendendo administrar à célula uma quantidade eficaz de dicloroacetato ou seu equivalente químico óbvio. Numa outra forma de realização, a invenção proporciona um método de aumentar a H 2 O 2 em uma célula de cancro, compreendendo administrar à célula uma quantidade eficaz de dicloroacetato ou seu equivalente químico óbvio. Numa outra forma de realização, os métodos da invenção afecta as células cancerígenas, mas as células normais ou não cancerosas não são afectadas pelo tratamento com dicloroacetato ou seu equivalente químico óbvio.

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona um método para tratamento de um cancro. Numa outra forma de realização, a invenção proporciona um método de tratamento de um cancro associado com mitocôndrias hiperpolarizados. Numa outra forma de realização, a invenção proporciona um método de tratamento de cancro por restabelecimento do potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) (essencialmente despolarizante a mitocôndria de células de cancro hiperpolarizado). Esta terapia metabólica molecular é realizada por meio da administração a um paciente em necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de dicloroacetato ou seu equivalente químico óbvio. Numa outra forma de realização, a invenção proporciona uma utilização de dicloroacetato ou seu equivalente químico óbvio no tratamento de cancro.

Numa forma de realização, o dicloroacetato é um sal de ácido dicloroacético. Numa outra forma de realização, o ácido dicloroacético é um sal de sódio de ácido dicloroacético.

Numa forma de realização, o cancro a ser tratado usando o equivalente químico óbvio dos mesmos ou DCA é seleccionado a partir do grupo que consiste em: cancro do pulmão de células não pequenas, glioblastoma e carcinoma da mama.

Numa outra forma de realização, o dicloroacetato, ou seu equivalente químico óbvio, é administrado na forma de uma composição farmacêutica compreendendo dicloroacetato ou seu equivalente químico óbvio e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em ainda outra forma de realização da invenção proporciona a utilização de ácido dicloroacético ou dicloroacetato ou seu equivalente químico óbvio na preparação de uma composição farmacêutica ou medicamento para o tratamento de cancro, tal como um cancro associado com mitocôndrias hiperpolarizados. Em ainda outra forma de realização, o dicloroacetato, ou seu equivalente químico óbvio, é administrado por via oral.

Em ainda outra forma de realização, o dicloroacetato é administrado numa formulação à base de água. Numa forma de realização a formulação à base de água de DCA compreende 0,0075

g de DCA / L para 7,5 g de DCA / l). Numa outra forma de realização o produto químico óbvio dicloroacetato ou equivalente deste é administrado a uma dose diária total de ~25-50 mg / kg bid de dicloroacetato. Noutra concretização, a dose é de 10-100 mg / kg administrados duas vezes por dia é administrado ao paciente. Numa forma de realização, a dose é de 25-50 mg bid.

Noutra concretização, a invenção constitui um método para determinar se um cancro está associada com as mitocôndrias hiperpolarizados, o que seria de prever a sua resposta terapêutica para dicloroacetato ou equivalentes químicos óbvios dos mesmos ou compostos semelhantes. Em uma forma de realização tal método compreende a administração de uma quantidade eficaz de dicloroacetato, ou seu equivalente químico com uma amostra de tecido de cancro de um paciente e medição da sua sensibilidade a apoptose e potencial de membrana mitocondrial utilizando microscopia confocal ou citometria de fluxo. Este teste de diagnóstico iria determinar se o paciente individual poderia beneficiar de dicloroacetato ou outras terapias que provocam a apoptose através de um mecanismo semelhante.

Outros objectos, características e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada que se segue. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indicando formas de realização preferidas da invenção são dadas a título apenas de ilustração, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e âmbito da invenção se tornarão evidentes para os peritos na técnica a partir desta descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A invenção será agora descrita em relação aos desenhos nos quais:

FIG. 1mostra que despolariza dicloroacetato mitocôndrias, liberta-citocromo c e FIA das mitocôndrias e aumenta a H 2 O 2a produção.

As FIGS. 1A, B e C são imagens confocal de câncer e células normais coradas com corantes para potencial de membrana mitocondrial ou anticorpos para citocromo c e apoptose factor indutor (FIA) como explicado no Exemplo 1.

FIG. 1Dmostra os resultados de um ensaio que mede a produção de peróxido de hidrogénio (H 2 O 2 ) em células cancerosas tratadas com dicloroacetato, como explicado no Exemplo 1.

FIG. 2mostra que dicloroacetato aumenta K + actual e repolariza células cancerosas, sem afectar as células normais.

As FIGS. 2A e B mostram dados remendo de aperto de cancro e as células normais em resposta a dicloroacetato e uma variedade de inibidores, como explicado no Exemplo 2.

FIG. 2C mostra os resultados de quantitativa reacção em cadeia de polimerase transcriptase inversa (qRT-PCR) e imunotransferência, estudar a expressão de Kv1.5 em células cancerosas tratadas com dicloroacetato, como explicado no Exemplo 2.

FIG. 3 mostra que DCA aumenta a expressão de Kv1.5 através do factor de transcrição de Ca ++ / calcineurina dependente de NFAT.

FIG. 3A são imagens confocais de células cancerosas carregadas com o corante sensível ao cálcio Fluo-3 e os dados médios para os níveis de cálcio, tal como explicado no Exemplo 3.

FIG. 3B são imagens confocais de células cancerígenas tratadas com anticorpos contra Kv1.5 e NFAT, como explicado no Exemplo 3.

FIG. 4 dicloroacetato mostra que aumenta a apoptose e diminui a proliferação de células cancerosas in vitro.

FIG. 4A são imagens confocais de células de cancro ensaiadas para Anexina, TUNEL, PCNA, BrdU e survivina, tal como explicado no Exemplo 4.

FIG. 4B são imunomanchas em células cancerosas para a expressão e a actividade da caspase 3 e 9, tal como explicado no Exemplo 4.

FIG. 5 dicloroacetato mostra que previne e reverte o crescimento do tumor in vivo em ratos e uma correlação semelhante entre a apoptose os canais de K + e grau de malignidade em cancros humanos.

FIG. 5A são imagens representativas de tumores explantados e as imagens de ressonância magnética a partir de tumores in vivo, assim como um lote de tamanho do tumor ao longo do tempo em resposta a dicloroacetato, como explicado no Exemplo 5.

FIG. 5B são imagens confocal de tumores coradas para TUNEL e PCNA, bem como dados médios, como explicado no Exemplo 5.

FIG. 5C são imagens confocais de tumores coradas com survivina e Kv1.5, bem como uma imunotransferência para survivina e Kv1.5, como explicado no Exemplo 5.

FIG. 5D ilustra as médias dos dados de análise de qRT-PCR para survivina e Kv1.5, traçados ao longo de pontuação histológica grau, a partir de cancro de não pequenas células do pulmão das amostras de 30 pacientes, tal como explicado no Exemplo 5.

FIG. 6 é mecanismo proposto um desenho esquemático do dicloroacetato ilustrando de ação.

FIG. 7 é um mapa de calor de genes modificados por dicloroacetato em células cancerosas, utilizando uma micromatriz Affymetrix gene, tal como explicado na parte inferior da secção de resultados e discussão.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

"Dicloroacetato (DCA) ou seu equivalente químico óbvio" significa ácido dicloroacetato ou seu sal ou outro análogo, derivado de dicloroacetato que tem o mesmo efeito terapêutico desejado no tratamento de cancro.

Por exemplo, sais de ácido dicloroacético são bem conhecidas e comercialmente disponíveis. Geralmente, tais sais de ácido dicloroacético terão a seguinte fórmula:

Os sais específicos incluem aqueles formados por os iões metálicos de metais alcalino-terrosos e alcalinos tais como sódio, potássio, cálcio, e magnésio, amónio e de amónio substituído em que o substituinte é um grupo mono- ou di-alquilo inferior radical de 1-4 átomos de carbono e diammonium etileno. Os sais farmaceuticamente aceitáveis, com citotoxicidade celular mínimo, tais como os de sódio, são os preferidos.

sais farmacêuticos específicos úteis na presente invenção incluem dicloroacetato de sódio, dicloroacetato de potássio, de amónio e dicloroacetato de diisopropilo. As formas dicloroacetato de sódio e de base livre são altamente preferido.Geralmente, o sal de base livre e as formas de dicloroacetato são particularmente preferidos para uso na presente invenção devido à sua pronta disponibilidade e preço económico. Numa forma de realização, os sais do ácido dicloroacético pode ser utilizado a uma concentração entre cerca de 0,5 mM a cerca de 100 mM, de preferência cerca de 50 mM. De preferência tais compostos são utilizados a uma concentração de, em concentrações de 0,1-10 mM, mais preferivelmente pelo menos cerca de 0,5 mM (concentração estimada de droga no tumor com base em estudos de cultura de células).

"Administrar à célula", tal como aqui utilizado, significa qualquer modo em que uma substância é administrada à célula (in vivo ou in vitro) e tem um efeito sobre a referida célula, tais métodos são conhecidos dos peritos na arte. A título de exemplo, in vitro, que pode ser administrada ao meio celular, ou meio de cultura celular. In vivo, a título de exemplo, pode ser administrada através de formas conhecidas de administração farmacêutica.

Um "paciente com necessidade do mesmo", tal como aqui utilizado é um paciente que possui ou se suspeita de ter um cancro, tal como cancro do pulmão, glioblastoma, ou cancro da mama, a qual é caracterizada pela resistência a apoptose e / ou mitocôndrias hiperpolarizados. Preferivelmente, o referido paciente é um mamífero, e em uma forma de realização de um humano. Reconhece-se que por causa da dificuldade na obtenção de tecido humano para permitir a medição directa de mitocôndrias hiperpolarizados que se pode medir a

survivina (como um substituto de mitocôndrias apoptose dependente) e ARNm de Kv1.5. Como mostrado emFIG. 5este índice de survivina / Kv1.5 é elevada em todas as linhas celulares tumorais testadas e em uma coorte de 30 pacientes com cancro do pulmão de células não-pequenas. Além disso DCA inverteu este índice in vitro e in vivo. Por conseguinte, numa forma de realização da invenção, este índice pode ser utilizado clinicamente para seleccionar os pacientes com maior probabilidade de beneficiar de terapia DCA. No entanto, o método da invenção não é necessariamente restringida a tais pacientes como os ensaios clínicos que utilizam terapia DCA pode ser usado para identificar os pacientes que podem beneficiar da terapia nos quais o índice é desconhecida, disponível ou baixo.

Como tal, numa forma de realização, a invenção proporciona um método para determinar se uma célula, ou doente, compreendendo células suspeitas de serem células de cancro podem beneficiar de tratamento dicloroacetato ou seu equivalente químico óbvio.

Numa forma de realização, a invenção proporciona um método para a identificação de células ou a um paciente que pode beneficiar do tratamento com dicloroacetato ou seu equivalente químico óbvio para induzir ou reverter a resistência à apoptose e / ou para o tratamento do cancro, compreendendo:

(I) obtenção de uma amostra de células, amostra de tecido ou amostra compreende células cancerosas ou de células suspeitas de serem cancerosas;

(Ii) administrar ao referido dicloroacetato de amostra ou seu equivalente químico óbvio;

(Iii) determinar se a referida apoptose é induzida e / ou resistência a apoptose é invertida na referida amostra,

em que, quando a referida apoptose é induzida e / ou resistência a apoptose é invertida na referida amostra, isto é indicativo de que as células e / ou o paciente de onde se obteve a amostra pode beneficiar de tratamento dicloroacetato ou seu equivalente químico óbvio.

Numa forma de realização, o método de determinar se a referida apoptose é induzida e / ou anulada ou se um paciente ou de células podem beneficiar de tratamento dicloroacetato ou equivalente químico óbvio é através da monitorização do índice de amostras survivina / Kv1.5. Isto pode ser monitorizado em relação a um controlo externo ou interno. Por exemplo, numa forma de realização, o índice é comparado com um nível pré-determinado ou intervalo que é conhecida a beneficiar do tratamento, e / ou o índice é obtido a partir da amostra antes do tratamento e se for reduzido ou invertida, em seguida, o célula ou doente pode beneficiar de tratamento.

Os dicloroacetato e químicos óbvios equivalentes do invento podem ser formulados em composições farmacêuticas para administração a seres humanos numa forma biologicamente compatível, adequada para administração in vivo. Por "forma biologicamente compatível

adequada para administração in vivo" entenda-se uma forma da substância a ser administrado em que quaisquer efeitos tóxicos são ultrapassados pelos efeitos terapêuticos.

A administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz das composições farmacêuticas ou DCA ou equivalentes químicos óbvios dos mesmos da presente invenção é definida como uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários para atingir o resultado desejado. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente activa de uma substância podem variar de acordo com factores tais como o estado de doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade de dicloroacetato ou óbvio seu equivalente químico ou formulação, compreendendo a desencadear uma resposta desejada no indivíduo. O regime de dosagem pode ser ajustado para proporcionar a resposta terapêutica óptima.Por exemplo, várias doses divididas podem ser administradas diariamente ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica.

Por conseguinte, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica para o tratamento de um paciente em necessidade do mesmo, tal como um humano, compreendendo dicloroacetato ou seu equivalente químico óbvio do invento e um veículo farmaceuticamente aceitável, diluentes ou excipientes.

O termo "tratamento de um ser humano", como aqui utilizado, significa a administração da composição farmacêutica da presente invenção a um ser humano para prevenir, aliviar ou curar um cancro.

As composições aqui descritas podem ser preparadas por métodos conhecidos per si para a preparação de composições farmaceuticamente aceitáveis que podem ser administradas a indivíduos, de tal modo que uma quantidade eficaz da substância activa é combinada numa mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Numa forma de realização, as composições farmacêuticas podem ser usadas em métodos para o tratamento de seres humanos. A dosagem e o tipo de dicloroacetato do invento a ser administrada vai depender de uma variedade de factores, que podem ser prontamente monitorizados em sujeitos humanos. Tais factores incluem o tipo e gravidade da doença.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a métodos para o tratamento terapêutico de seres humanos usando as composições dicloroacetato ou equivalentes químicos óbvios dos mesmos.

Numa outra forma de realização da invenção, o dichloracetate ou seu equivalente químico óbvio podem ser administrados em combinação com outros agentes pró-apoptóticos ou quimioterapêuticos. "Em combinação com" tal como utilizado neste contexto, significa que os agentes podem ser administrados ao mesmo tempo ou em momentos diferentes, mas em um regime de tratamento de combinação, tal como regimes de combinação conhecidos dos peritos na arte. Numa forma de realização, os agentes podem ser formulados em uma única ou diferentes composições farmacêuticas.

ainda Entende-se que as composições terapêuticas do presente invento pode ser utilizado em conjunto com transportadores ou excipiente farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção são preparadas convencionalmente, compreendendo substâncias que são utilizadas habitualmente em produtos farmacêuticos, [por exemplo, Remington 's Pharmaceutical Sciences (Alfonso R. Gennaro ed. 18th edition, 1990), Pharmaceutical Sciences do Remington (Ciências Remington' s Pharmaceutical, Mack Publishing Company, Easton, Pa., EUA, 1985) ou de Remington as Ciências e Practice of Pharmacy, 21ª Edição (Universidade de Ciências da Filadélfia, 2005) ou Handbook of Pharmaceutical Additives (compilado por Michael e Irene Ash, Gower Publishing Limited, Aldershot, Inglaterra ( 1995))], incluindo excipientes, veículos, adjuvantes e tampões. As composições podem ser administradas, por exemplo, oralmente, parentericamente, entericamente, por via intramuscular, por via subcutânea, por via intravenosa ou outras vias úteis para atingir um efeito. Por exemplo, numa forma de realização, a substância activa pode ser administrada de uma forma conveniente tal como por injecção (subcutânea, intravenosa, intramuscular, etc), administração oral ou por inalação.Dependendo da via de administração, a substância activa pode ser revestido num material para proteger o composto da acção de enzimas, ácidos e outras condições naturais que possam inactivar o composto. Os excipientes convencionais incluem substâncias veículo orgânicas ou inorgânicas f armaceuticamente aceitáveis adequadas para aplicação parentérica, entérica, oral e outras vias de administração que não reagem prejudicialmente com os agentes. Para aplicação parentérica, são particularmente adequadas soluções estéreis injectáveis, de preferência soluções oleosas ou aquosas, bem como suspensões, emulsões ou implantes, incluindo supositórios. As ampolas são dosagens unitárias convenientes. As preparações farmacêuticas podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com estabilizadores, agentes molhantes, emulsionantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões ou outras substâncias que não reagem prejudicialmente com os compostos activos. Numa forma de realização, as composições farmacêuticas da invenção são composições que podem ser administradas por via oral.

A invenção será agora descrita pelos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLOS Métodos

Cultura de células:

O pulmão de não pequenas células A549 linha celular de cancro, a linha celular de glioblastoma MO59K, e a linha de células de carcinoma mamário, células MCF 7, foram adquiridos a partir de ATCC (VA EUA). células epiteliais das vias aéreas pequenas normais (NSAEC) foram adquiridas da Cambrex Bio-ciência. A549 foram mantidas em meio F12K, glioblastoma em DMEM / F12 (Gibco / Invitrogen ON Canada), células MCF-7 em DMEM (Sigma-Aldrich, ON Canadá) e NSAEC no meio basal pequena célula epitelial das vias aéreas especiais fornecidos pela empresa. Todos os meios foram suplementados com FBS a 10% (Sigma-Aldrich) e 5% PSF (Gibco) como antibiótico.

Tumorigenicidade Ensaios em ratos nus.

As células de linhas de células A549 foram colhidas e ressuspensas em PBS. A suspensão de células (3.106 células por injecção), foi injectado SC na parte de trás (abaixo do nível escápula) de ratos pelados atímicos. Os ratos foram aleatoriamente divididos em 3 grupos: controlo (receberam apenas as células no dia 0), do grupo DCA prevenção (DCA + células no dia 0) e DCA de inversão (células no dia 0 + DCA duas semanas após a injecção). O DCA 0,075 g / L foi adicionado à água potável e os ratos tiveram livre acesso à água. A esta dose o DCA solução é incolor e inodoro. Os ratos foram observados semanalmente para o aparecimento visual de tumores em locais de injecção, e os tamanhos do tumor foram medidos todas as semanas em 3 grupos durante um mês. No final do mês, os ratos foram mortos, e os tumores foram excisados e fixados para a apoptose e a proliferação medições. Alguns tumores foram fotografadas em ratos anestesiados com um sistema SIEMENS 1.5T MRI, utilizando sequências padrão, permitindo a reconstrução 3D e cálculo do volume do tumor in vivo.

immunoblotting:

Anticorpos para K + canais foram adquiridos a Alomone (Jerusalém, Israel). As células ou tumor foram recolhidas e imunotransferência foi realizada em amostras reunidas a partir de 4-t 25 pratos ou 4 ratos em cada um dos 2 grupos (25 ug de proteína em amostras reunidas / via), como descrito anteriormente. Os filmes foram digitalizadas e quantificadas utilizando 1D Software de Análise de Imagem (Kodak, Rochester, NY). A expressão foi normalizada para ambos Ponceau-S e o sinal de actina do músculo liso para corrigir diferenças de carga.

qRT-PCR:

As amostras foram adicionadas a uma placa de micropoços com sondas TaqMan e reagentes de RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, Calif.). qRT-PCR foi realizada com um detector de ABI Prism 7700 Sequence (Applied Biosystems) e os iniciadores para Kv1.5 humano, survivina, 18s e 2 microglobulina beta tal como descrito.

electrofisiologia:

Electrofisiologia de célula total foi realizada em células em cultura. As células foram de tensão fixada em um potencial de realização de -70 mV. As correntes foram evocadas por impulsos de teste de 200 ms de -70 a +70 mV filtrada a 1 kHz e amostradas a 2-4 kHz.

A microscopia confocal:

A visualização foi realizada utilizando um microscópio confocal Zeiss LSM 510, tal como descrito. Apoptag kit de detecção de apoptose (TUNEL mancha, Serologicals, Norcross, Ga.) E anticorpo do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) (Dako, Carpinteria, Calif.) Foram utilizados conforme as instruções do fabricante em ambas as células de formaldeído fixa e cortes de tecido embebidos em parafina após recuperação antigênica. A coloração nuclear foi feita utilizando 4 ', 6'-diamidino-2-fenilindole dicloridrato (DAPI, a 300 nm; Molecular Probes) em tecido fixo ou células como anteriormente descrito kit Apoalert Anexina V (Clontech, Palo Alto,

Calif.), citocromo c anticorpo (Pharmingen, San Diego, Calif.), o factor indutor de apoptose (Santa Cruz Calif. EUA) NFAT e Kv1.5 (Sigma) e MitoTracker vermelho (500 nM, Molecular Probes) foram utilizados tal como descrito pelas instruções da empresa. potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) foi estudado em cultura de células cancerosas vivas, utilizando perclorato de metil-éster de tetrametilrodamina (TMRM) (20 nmol / L) durante 30 minutos (37 ° C) e Hoechst (1,0 umol / L) 10 para coloração nuclear minutos (Molecular Probes, Canadá).

H 2 O 2 medições.

As células cancerosas foram propagadas em lâminas de poços múltiplos LabTek (Nalgene / Nunc, VWR, ON Canada) até à confluência. As monocamadas foram pré-incubadas com 500 uM DCA (Sigma-Aldrich), na presença ou ausência de 5 uM rotenona (Sigma-Aldrich) durante uma hora. Produção de H 2 O 2 foi medida por Amplex Red (Molecular Probes, Eugene Oreg.) Seguindo as recomendações do fabricante durante um período de uma hora na presença da droga (s) relevante. A fluorescência foi medida a 590 nm com excitação a 530 nm e H 2 O 2 níveis determinados por referência a uma curva padrão. Cada ensaio foi realizado quatro vezes.

DNA Microarrays:

O ARN total a partir de A549 e MO59K tratada (500 uM durante 48 horas DCA) e células não tratadas foram extraídos utilizando Qiagen RNeasy Kit (Ontario, Canadá). Diferenças na expressão de genes entre A549 controle, MO59K e DCA-A549, células DCA-MO59K foi avaliada usando set U133A chip de DNA humano (Affymetrix, Califórnia, EUA). A análise foi realizada utilizando software Affymetrix. Alterações na expressão de genes foram considerados significativos se a expressão foi alterada por ≧ 1,75 vezes. intenção especial foi feita em genes que estavam mudança nos A549 e MO59K.Em seguida, foi realizada uma análise de caminho (GO análise).

estatísticas:

Os valores são expressos como a média ± SEM. diferenças inter-grupos foram avaliados por Kruskal Wallis ou ANOVA conforme o caso, com análise post hoc utilizando o teste exato de Fisher (Statview 4.02, SAS Institute, Cary, NC).

exemplo 1 DCA despolariza mitocôndrias, Lançamentos citocromo-c e FIA da mitocôndria e aumenta a H 2 O 2 Produção (FIG. 1 )

A: 48H de DCA (500 uM) despolarizada significativamente a mitocôndria em A549, MO59K, células MCF-7 de cancro, mas não teve nenhum efeito sobre as células epiteliais normais (EC).

B: No painel superior, citocromo-c em verde é co-localizada com a coloração vermelha MitoTracker no controle, enquanto que após 48H DCA citocromo-c vazou a mitocôndria e está localizada no citosol.

C: No controle (painel superior) AIF em vermelho não é localizada no núcleo, ao passo que após 48H DCA FIA está localizada principalmente no núcleo.

D: DCA aumenta H 2 O 2 a produção de uma forma rotenona e dependente da dose.

exemplo 2 DCA Aumenta K + atuais e Câncer repolariza células sem afetar as células normais (FIG. 2 )

A: 48H DCA (500 uM) K + aumenta a densidade de corrente em todas as linhas de células cancerosas (A549, MO59K e MCF-7), mas não afectam as células normais, tais como as células epiteliais normais. No lado direito, os traços originais que representam a corrente de K + em ambos controlo (células não tratadas) e células tratadas DCA. Aumento de K + densidade de corrente foi devido principalmente a um aumento na corrente Kv, como mostrado pela corrente 4-AP-sensível na legenda. O aumento da K + densidade de corrente resulta numa diminuição significativa na capacitância de membrana, (o que sugere uma diminuição do volume celular) e repolarização do potencial de membrana em repouso. B: O mecanismo pelo qual DCA aumenta a corrente de K + foi avaliada pelas células cancerosas agudamente expostos a DCA ( 10 min, a 500 uM). Os efeitos de DCA na corrente de K + foram bloqueados por 4-AP e bloqueado por ambos catalase e rotenona (50 uM). TTFA, um bloqueador específico de II complexo não impediu os efeitos da DCA. C: células tratadas DCA (48 horas) tinha aumentado proteína Kv1.5 e mRNA, sugerindo que a DCA é capaz de aumentar a expressão do canal Kv.

exemplo 3 DCA Aumenta Kv1.5 Via Ca ++ / calcineurina dependente de Factor de Transcrição NFAT (Fig. 3 )

A: concentração de cálcio citosólico livre foi medida utilizando Fluo-3. As células de controlo teve mais cálcio do que ambos DCA e H 2 O 2 células tratadas. Aguda DCA diminuição da concentração de cálcio por meio de um 4-AP e rotenona via sensível confirmando os dados electrofisiologia. B: imagem confocal de células A549 mostrou que NFAT (verde) é activado como está localizada principalmente no núcleo da maioria das células não tratadas. Interessantemente, estas células tinham um nível muito baixo de expressão de Kv1.5 (vermelho). Ambos DCA e H 2 O 2 bloqueou a activação de NFAT, como mostrado pela sua localização para fora do núcleo no citoplasma, e tinham uma expressão aumentada Kv1.5.

exemplo 4 DCA Aumenta apoptose e diminui a proliferação de células cancerosas in vitro (Fig. 4 )

A: DCA aumenta significativamente a apoptose como um maior número de células são tratadas DCA anexina V positiva e positiva de TUNEL. DCA também diminui significativamente a proliferação quanto menos células tratadas DCA foram positivas para PCNA, BrDU ou survivina.

B: Aumento da apoptose é também mostrado pela activação induzida por DCA tanto de caspase 3 e 9, tal como imunoblots revelar uma banda activo para ambas as caspases.

exemplo 5 Impede DCA e inverte crescimento tumoral in vivo (Fig. 5 )

Um: A injecção de células A549 no flanco de ratos nus induziu o desenvolvimento do tumor no prazo de uma semana. DCA ratos tratados tanto na prevenção como protocolos de reversão tinham tumores menores. O tamanho dos tumores foram avaliados pelo compasso de calibre, como mostrado na figura, em peso, e usando ressonância magnética in vivo. B: ratos tratados tinham tumores DCA com um aumento da apoptose, como mostrado por TUNEL. Curiosamente foi observada uma correlação negativa significativa entre% TUNEL e ambos o tamanho do tumor e peso. C: Como nos experimentos in vitro, DCA aumento da expressão Kv1.5 e diminuição da expressão survivin in vivo.Representante imunohistoquímica confocal é mostrado à esquerda e imunotransferência à direita. As 2 pistas à esquerda são a partir de ratos não tratados, enquanto as pistas direito 2 são de ratos tratados DCA. D: cancros do pulmão de células não-pequenas Humanos mostram uma correlação positiva entre o grau histológico eo índice survivin / Kv1.5 (quanto maior o grau do tumor mais agressivo do tumor). resultados e Discussão

A549 humana (câncer de pulmão de não pequenas células), MO59K (glioblastoma) e MCF-7 (cancro da mama) as células cancerosas têm mitocôndrias hyperpolarized; Tratamento DCA induz Δψm despolarização, liberação mitocondrial de ambos FIA e citocromo C e aumenta mitocondrial H 2 O 2 de produção (FIG. 1). TMRM (tetrametilrodamina metil-éster) é um corante de carga positiva que se acumula nas mitocôndrias negativamente carregados de um modo potencial-dependente membrana mitocondrial, ou seja, a mais o sinal vermelho de TMRM o mais hyperpolarized as mitocôndrias. Todos os tipos de células cancerígenas têm de fluorescência mais vermelho, isto é, eram mais hiperpolarizado do que as células epiteliais normais (CE) na parte inferior. mitocôndrias hyperpolarized refletem um estado de resistência à apoptose, uma vez que é a despolarização mitocondrial que inicia a apoptose. DCA despolariza mitocôndrias em todos os tipos de células cancerígenas. DCA não alteram o potencial de membrana mitocondrial em células epiteliais de pulmão humanos normais (FIG. 1). Curiosamente, DCA trouxe o potencial de membrana mitocondrial para o nível das células epiteliais normais. Em conjunto, estes resultados provavelmente explicar a falta relativa de toxicidade de DCA em tecido normal e devem conferir uma vasta janela terapêutica para esta estratégia de tratamento do cancro. A despolarização mitocondrial foi associada com a libertação a partir das mitocôndrias de ambos os indutores de apoptose, citocromo-c e factor de indução de apoptose (AIF). Citocromo c vazamentos para a mitocôndria e ativa caspases, os efetores de apoptose. FIA é translocado para o núcleo onde se inicia a apoptose independente de caspases. DCA tratamento de todos os A549, células MCF-7 e MO59K provoca fugas de citocromo C para o citoplasma, e a translocação de FIA para o núcleo, como demonstrado pela imunocoloração múltipla e imagem confocal emFIG. 1B. As células foram coradas verde com um anticorpo monoclonal para o citocromo C e vermelho com MitoTracker vermelho, um

marcador mitocondrial. A coloração verde no controle foi confinada a áreas discretas (mitocôndrias), enquanto nas células tratadas com DCA-lo difusamente manchas no citoplasma. As células foram manchado de vermelho com anticorpo FIA e azul para DAPI um marcador nuclear. A coloração com vermelho de controlo foi confinado no citosol ao passo que nas células tratadas com DCA que manchas no núcleo. Uma abertura do poro de transição mitocondrial (MTP) é necessária para ambos citocromo C e a libertação FIA e isto está associado com a despolarização mitocondrial em apoptose dependente de mitocôndrias.

Um estímulo importante do MTP-sensível redox é um aumento na produção de espécies de oxigénio activadas (AOS) produzidos na cadeia de transporte de electrões das mitocôndrias. AOS produção é aumentada como o despolarizar mitocondrial. Devido à presença de MnSOD na mitocôndria, superóxido é dismutadas a H 2 O 2 , um radical que é relativamente estável e pode vazar no citoplasma e a membrana de plasma, onde ele pode afectar mecanismo redox-sensíveis, incluindo a abertura de K + canais.

A exposição a DCA (50, 500 e 5000 ^ M) durante 4 horas aumentou H 2 O 2 a produção em células A549 de forma dependente da dose. O efeito de DCA foi totalmente inibida por rotenona, um inibidor do complexo I, sugerindo que a maior parte de radicais livres utilizado para produzir H 2 O 2 foi produzida no complexo I (FIG. 1C).

Crônica Tratamento DCA Aumenta Kv Densidade de Corrente e hiperpolariza a membrana plasmática (FIG. 2).

Como ilustrado na FIG. 2A, Kv1.5 tem sido implicada no mecanismo de apoptose, pelo menos em células de músculo liso de artéria pulmonar. Aumento tanto expressão Kv1.5 e densidade de corrente era responsável da diminuição [K +] i que conduz a um encolhimento das células e uma diminuição na inibição tónico que K + exerce sobre as caspases, promovendo assim a apoptose. Nas células de cancro dos presentes exemplos, houve um aumento significativo em K + de corrente nas células tratadas DCA, em comparação com as células não tratadas cancerosas. A maior parte do aumento de K + de corrente nas células tratadas DCA é 4-aminopiridina sensíveis (isto é, corrente Kv).

A Ativação DCA-Induzida de canais Kv é devido ao aumento do H 2 O 2 Produção (FIG. 2C).

A fim de determinar o mecanismo do aumento na corrente Kv, farmacologia experiências foram realizadas sobre o efeito agudo da DCA em células cancerosas. DCA (500 uM) superfused sobre células A549 durante 5 a 10 minutos também causou um aumento de K + corrente, semelhante à causada pela exposição crónica à DCA. O efeito de DCA em K + de corrente foi bloqueada por ambos catalase e rotenona (10 uM), mas não por TTFA (50? M, um inibidor do complexo II da cadeia de transporte de electrões), o que sugere que o H 2 O 2 derivada de complexo I, mas não complexo II, era responsável pela activação corrente kV (como foi totalmente bloqueada por 4-AP).

DCA regula positivamente a expressão Kv1.5 Via a [Ca ++] Caminho i-NFAT (FIG. 3).

Além da activação de canais Kv aguda existentes, DCA pode aumentar o exterior K + corrente por regulação positiva da expressão da proteína de Kv1.5. Na verdade, a regulação negativa de Kv1.5 pode ser uma característica das células cancerosas, contribuindo para a resistência à apoptose de células cancerosas. Tanto o ARNm e proteína de níveis de canais Kv1.5 foram aumentados em DCA células tratadas, em comparação com os controlos de acordo com os dados de electrofisiologia (FIG. 2C). O NFAT fator de transcrição é regulada pelo cálcio intracelular e calcineurina. Aumento do intracelular de Ca ++ activa a calcineurina, que de-fosforila NFAT, permitindo a sua translocação para o núcleo, onde se diminui a expressão de Kv1.5. Uma vez que o DCA hyperpolarized a membrana plasmalemmal, é muito provável que o fluxo de Ca ++ por meio de tensão fechado Ca ++ canais irá diminuir. As células foram estudadas utilizando microscopia confocal e Fluo-3. DCA células tratadas tiveram uma diminuição significativa da [C ++] em comparação com as células não tratadas (FIG. 3A). A diminuição da [Ca ++] induzida por DCA foi bloqueado por ambos 4-AP e rotenona, reforçando a hipótese de que complexos produziu-I H 2 O 2 canais Kv ativados e, portanto, repolarizada o potencial de membrana. Além disso, exógeno H 2 O 2 imita o efeito de DCA e diminui a Ca ++ intracelular níveis (FIG. 3A). Como esperado, nas células cancerosas não tratadas, NFAT estava localizada no núcleo enquanto que em ambos DCA e H 2 O 2 células tratadas NFAT estava localizada no citossol (FIG. 3B). Curiosamente, quando as células tinham uma localização nuclear de NFAT que expressa muito pouco Kv1.5, estudada por co-coloração com um anticorpo para a NFAT e Kv1.5 e coloração com DAPI para imagiologia do núcleo (FIG. 3B).

Os dados mostraram que despolariza DCA mitocôndrias e provoca a libertação de mediadores pró-apoptóticos. Além disso, o aumento na corrente kV (de forma aguda por meio da produção de H 2 O 2 e cronicamente através do aumento na expressão mediada por NFAT Kv1.5) potenciaria a apoptose ainda mais distalmente na via, através da diminuição da inibição de caspases induzida + K . Assim, com um mecanismo de "duplo golpe", DCA seria um poderoso indutor de apoptose e reverter ambas as causas da resistência potencial de apoptose, ou seja, hiperpolarização mitocondrial e inibição Kv. A apoptose foi então medida com um certo número de ensaios. As células da apoptose de resistência seria realmente aqueles que proliferam a mais. Por conseguinte, mediante a eliminação destas células, DCA provavelmente diminuir índices de proliferação celular nas células cancerosas; Por esta razão também foi medida índices de proliferação celular.

A apoptose DCA-induzido é mitocôndrias-Dependente, e ocorre no início (FIG. 4).

tratamento DCA (500 uM) de células A549 provoca indução precoce da apoptose como evidenciado pela coloração de anexina V, que cora fosfatidilserina expressa cedo na superfície de células apoptóticas (FIG. 4A). As células não-tratadas apresentaram quase nenhuma apoptose (medida pelo TUNEL) e proliferação celular significativa (medida pelo PCNA, BrDu e contando DAPI) (FIG. 4A). Em contraste, células tratadas com DCA mostrou um aumento significativo na apoptose e uma diminuição na proliferação celular (FIG. 4A). Encolhido, núcleos picnóticos, uma característica de atraso de apoptose, foram observadas nas células apoptóticas. Tanto a actividade da caspase-3 e 9 foi assim melhorada em células tratadas DCA (FIG. 4B). Além disso, o tratamento DCA diminuiu a expressão de survivina, um inibidor de

proteína de apoptose que é selectivamente expresso no cancro (FIG. 4A). Survivina expressão é considerado um índice de prognóstico pobre em um grande número de tipos de cancro.

Desde DCA diminui a proliferação e aumenta a apoptose sem afectar as células normais, seria benéfica para o tratamento de cancro in vivo.

DCA blocos de tumor crescimento em ratos nus (FIG. 5)

Ratos nus foram injectados com 3,10 6 células A549. Os ratos desenvolveram tumores no prazo de uma semana. 20 animais foram divididos em 3 grupos: controles não receberam DCA, ratos DCA-de prevenção receberam DCA logo após injeção de células durante 5 semanas, e os ratos DCA-reversão recebeu DCA 2 semanas após a injeção de células para mais de 3 semanas. Os ratos de controle desenvolver rapidamente tumor com um crescimento do tumor constante e exponencial (FIG. 5A). Ambos os grupos tratados com DCA apresentaram uma redução significativa no tamanho do tumor, medido pelo peso do tumor na altura de sacrifício do rato, e o diâmetro máximo do tumor medido semanalmente em ratos vivos utilizando compassos de calibre, bem como utilizando ressonância magnética em ratos vivos (FIG. 5A). A diminuição do crescimento do tumor no grupo tratado com DCA foi associada com um aumento da apoptose (TUNEL) e uma diminuição na proliferação (PCNA e survivina) (FIG. 5B), Confirmando os resultados obtidos in vitro. De facto, houve uma correlação negativa entre a apoptose e o tamanho do tumor (a mais elevada a apoptose quanto menor o tamanho), sugerindo que a indução de apoptose é de facto o mecanismo pelo qual o tamanho do tumor foi diminuído (FIG. 5B). Além disso, foi regulado para cima e Kv1.5 survivina foi regulada negativamente nos ratos tratados (FIG. 5C), Confirmando de novo os dados in vitro.

Dado que a survivina representa regulação da apoptose mitocôndrias-dependentes, por meio do mecanismo que foi descrito acima, a despolarização em mitocôndrias pode eventualmente causar uma regulação para cima de Kv1.5. Assim survivina e Kv1.5 pode ser regulada em paralelo e em conjunto, servem como um índice de resistência à apoptose em tumores. A fim de validar esta hipótese e aumentar a relevância clínica dos dados obtidos com animais, tecidos de 30 pacientes com câncer de pulmão de não pequenas células foram analisados a partir dos arquivos do Departamento de Patologia da Universidade de Alberta. Uma vez que todos os tecidos foram arquivados, estudos funcionais (isto é, medida de potencial de membrana mitocondrial) não pôde ser executada, mas survivina e Kv1.5 expressão poderia ser medido. O índice da relação survivina / Kv1.5 correlacionada positivamente com a agressividade do tumor (isto é, quanto maior for o índice, maior será o grau histológico tumoral conforme avaliado por patologistas cegos) (FIG. 5D). A idade e o sexo dos pacientes eram similares entre os 3 graus histológicos padronizados. Estes resultados validam a importância do trabalho dos animais e, pela primeira vez vincular a apoptose dependente da mitocôndria com a expressão de canais Kv, sob uma abrangente resistência células cancerosas mecanismo de oferta a apoptose.

Efeitos da DCA são restritas a mitocondriais Pathways (As FIGS. 6 e 7)

DCA é um inibidor protótipo da enzima piruvato cinase desidrogenase mitocondrial e, assim, DCA activa piruvato desidrogenase e promove a oxidação da glicose. Consequentemente, DCA aumenta a entrega de NADH no complexo da cadeia de transporte de elétrons. Isso resulta em um aumento na produção AOS dentro do complexo I mitocondrial e a despolarização das mitocôndrias, iniciando a apoptose, tal como descrito no mecanismo proposto de acçãoFIG. 6. A fim de confirmar que os efeitos de DCA não são específicos, mas são, de facto metabólica e regulam vias de apoptose, um chip de genes e análise GO de células tratadas e não-tratadas foi realizada. Nós usamos uma estratégia de "subtração" para revelar alterações relevantes na expressão do gene do tumor que eram unicamente devido a DCA. Estudar tanto a linha A549 e glioblastoma células (ou seja, um tumor muito diferente do que o cancro do pulmão, epiteliais contra células da glia) e incidindo sobre as mudanças que ocorreram em um padrão semelhante em resposta à terapêutica DCA revelou mudanças na expressão genética devido a DCA, em vez de alterações genéticas específicas do tumor idiossincráticas.

Os genes que foram modificados por DCA em paralelo em A549 (pulmão) e MO59K (glioblastoma) estão listados e os seus níveis de expressão foram representados num mapa de calor (FIG. 7). células LC = cancro do pulmão controlar, as células cancerosas LD = pulmão tratados com DCA, GC = células de glioblastoma controles, DG = células de glioblastoma tratados com DCA. A maioria destes genes foram relacionados com a mitocôndria e complexo I e curiosamente, entre todos os canais de potássio dependentes da voltagem única Kv1.5 foi significativamente regulados positivamente. Esta análise gene chip apoia ainda mais o modelo descrito emFIG. 6.

CONCLUSÃO

O presente estudo conclui que DCA é um tratamento atraente para o cancro, como o cancro humano. A presente invenção mostra a interação de canais Kv membrana mitocôndrias e apoptose.

Numa forma de realização, não sendo ligado a um mecanismo em particular, os efeitos positivos da DCA pode potencialmente ser explicada pelo facto de hiperpolarização mitocondrial e a regulação negativa dos canais de K + contribui para o estado de resistência à apoptose que caracteriza o cancro. Numa forma de realização, o DCA aumenta a entrega de NADH na ETC complexo I mitocondrial, resultando num aumento na produção de H 2 O 2 e a despolarização mitocondrial.A despolarização mitocondrial inicia a apoptose, causando uma fuga de mediadores pró-apoptóticas no citoplasma. Ao mesmo tempo, o H2O2 pode activar os canais plasmalemmal kV e pode activar os factores de transcrição sensíveis a redox no núcleo (nossos resultados preliminares sugerem activação de NFAT) e também regular a expressão Kv1.5. Há forte evidência de que mostra que DCA única despolariza mitocôndrias, que são anormalmente hiperpolarizado. O DCA não alterar o potencial de membrana mitocondrial e a corrente de K + em vascular normal e células epiteliais. Isto proporciona a base para a selectividade da DCA, ou seja DCA não afectará células não-cancerosas, uma característica altamente desejável de todas as terapias do cancro candidato. DCA por si só a prevenção blocos do tumor, mas invertendo o estado de resistência à apoptose, DCA iria tornar os

tumores mais sensíveis às quimioterapias pró-apoptóticos, diminuir as doses e as toxicidades necessários. Moduladores metabólicos pode ser uma nova classe de fármacos anti-cancerígenos oralmente disponíveis. A presente invenção ilustra pela primeira vez, que o direccionamento de um eixo canal mitocôndrias-K + é proposto e mostrado ser eficaz em cancro.

Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência ao que presentemente são considerados os exemplos preferidos, deve ser entendido que o invento não está limitado aos exemplos revelados. Pelo contrário, a invenção destina-se a abranger várias modificações e arranjos equivalentes incluídos dentro do espírito e âmbito das reivindicações anexas.

Todas as publicações, patentes e pedidos de patente são aqui incorporados por referência na sua totalidade para a mesma extensão como se cada aplicação de publicação, patente ou patente individuais foi específica e individualmente indicado para ser incorporado por referência na sua totalidade.

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* CITADA cabelo examinador

CLASSIFICAÇÕES

Classificação Nos Estados Unidos 514/557Classificação internacional A61K31 / 19Classificação cooperativa G01N33 / 5011 , G01N2510 / 00

EVENTOS LEGAIS

Dados Código Evento Descrição

6 dez. 2010 COMO Tarefa

Nome do proprietário: os governadores dos Universidade de Alberta, CANADATexto livre formato: CESSÃO DE CEDENTES interesse; CEDENTES: Michelakis, Evangelos; Archer, Estevão; ASSINATURA DATAS PARA FROM20070418 20.081.126; REEL / Armação: 025452/0033

28 maio 2013

COMO Tarefa Nome do proprietário: Archer, STEPHEN, CANADATexto livre formato: CESSÃO DE CEDENTES interesse; CEDENTE: os governadores dos Universidade de Alberta; REEL / Armação: 030493/0397Data efectiva: 20080911

Dados Código Evento Descrição

Data efectiva: 20080911Texto livre formato: CESSÃO DE CEDENTES interesse; CEDENTE: os governadores dos Universidade de Alberta; REEL / Armação: 030493/0397Nome do proprietário: Michelakis, EVANGELOS, CANADA

6 fev. 2014 COMO Tarefa

Nome do proprietário: QUEEN S universidade em Kingston, CanadáData efectiva: 20131219Texto livre formato: CESSÃO DE CEDENTES interesse; CEDENTE: Michelakis, EVANGELOS; REEL / Armação: 032159/0316Nome do proprietário: QUEEN S universidade em Kingston, CanadáData efectiva: 20131128Texto livre formato: CESSÃO DE CEDENTES interesse; CEDENTE: Archer, STEPHEN; REEL / Armação: 032159/0134

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