Trabalho realizado pelos acadêmicos de Medicina da UFBA Adriana Campos, Nivaldo Cardozo Filho, Sabrina Oliveira e Silvana Asfora, sob

orientação dos Professores Roberto Meyer, Ivana Nascimento, Robert Schaer, Cláudia Brodskyn, Songelí Freire e Denise Lemaire, do Laboratório de

Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA. Atualizado em setembro de 2003

Aula 12

Nesta aula serão abordados a imunoquimioluminescência,a imunofluorometria, além de um resumo dos principais

aspectos do radioimunoensaio.

-Exames feitos por quimioluminescência são basicamente

automatizados.

-Quantificam Ag ou Ac presentes no soro. São muito usados

para a dosagem de hormônios, marcadores tumorais e diversas

outras proteínas séricas.

-Vários soros podem ser testados e diferentes moléculas po-

dem ser quantificadas de uma só vez.

-A técnica se baseia na ligação Ag – Ac. Como no ELISA, um

dos dois reagentes é conjugado com uma substância que quan-

do ativada, emite luz visível. Então, a luz emitida é proporcio-

nal à concentração do reagente pesquisado.

-Os tipos mais utilizados são: competição e sanduíche.

Fase sólida em que uma microesfera de poliestireno é revestida com Ac monoclonal contra o Ag específico

Adição de soro do paciente

Quimioluminescência (como exemplo, um tipo sanduíche)

O conjunto é incubado com agitação intermitente

Lavagem para retirada de Ag não fixado:

Adição de Ac monoclonal, anti-Ag pesquisado, conjugado à enzima .

Lavagem para retirada de Ac conjugado à enzima, não fixado

O conjunto é incubado

Adição de substrato da enzima

O substrato quimioluminescente sofre hidrólise na presença da enzima, produzindo substâncias instáveis que culminam com emissão de luz

Incubação

O exemplo acima é o que acontece com o substrato luminescente AMPPD.Alternativamente a substância luminescente pode ser desestabilizada por uma súbita mudança do pH e da concentração do meio (éster de acridina)ou ainda um elemento, como por exemplo o rutênio, dissociado do Ag ou do Ac por uma descarga elétrica no final da reação, culminando com a emis-são de luz. A imunoluminescência pode atingir uma sensibilidade de 10 -15 a10-16g.

Os imunoensaios de quimioluminescência são realizados emaparelhos automatizados, onde todo o processo é guiado por computadores. São apresentados abaixo quatro desses equipa-mentos, usados no Laboratório de Imunologia do ICS-UFBA:

“Elecsys 1010”da “Roche” “Access”, da “Sanofi-Winthrop”

“Immulite”, da “DPC” “ACS 180”, da “Ciba-Corning”

-Este método é muito utilizado para dosagens de proteínas

séricas, hormônios, marcadores tumorais, anticorpos

específicos para alérgenos etc.

-O teste é basicamente automatizado.

-O resultado baseia-se na fluorescência emitida, mensurada

pelo fluorômetro.

-A fluorescência emitida é intensa, porém pouco duradoura.

-Utiliza-se Ac ou Ag conjugado com um fluorocromo.

- Fluorocromos como fluoresceína e rodamina podem ser

utilizados, entretanto lantanídeos como o európio são os mais

usados.

-Os tipos mais utilizados são: competição e sanduíche.

- Pode detectar 10-12 a 10-16 g.

+ +

Fase Sólida contendo Ac monoclonal contra Ag

Ag++

Padrão, controle e amostra

-Eu

Ac monoclonal marcado com Eu, contra um outro epítopo do Ag

-Eu

Incubação

++

Solução de amplificação: dissocia os ions európio do Ac marcado na solução, e com eles forma estruturas fluorescentes

++-Eu

Eu

Fluorimetriaexemplo: sanduíche, usando

o európio

Os ensaios do tipo apresentadoa seguir, se baseiam na poten-

cialização da emissão de luz vi-sível, a partir da dissociação

de lantanídeos.

Como referido anteriormente, as técnicas imunofluorimétricassão realizadas quase sempre em equipamentos automatizados.A seguir é apresentado o fluorômetro pertencente ao Laboratóriode Imunologia do ICS – UFBA.

Sistema automático de imunoensaios, por fluorimetria, marca “Wallac”, modelo “Autodelfia”.

Um resumo sobre radioimunoensaio

Uma outra técnica para imunodosagem e imunodiagnóstico é oradioimunoensaio (RIA). Esta técnica foi a primeira a ser desen-volvida para dosagem de hormônios e outras substâncias pre-sentes em pequenas concentrações em fluidos biológicos e tem como base a ligação Ag – Ac.Apesar de ainda usada, está sendo substituída pela imuno-fluorimetria, ELISA e imunoluminescência, tendo em vista queenvolve material radioativo. O princípio e as modalidades sãoos mesmos dos outros ensaios acima mencionados – a diferençaestá na substância indicadora de reação, que neste caso é umisótopo radioativo e em geral se utiliza o 125I.Trata-se de um ensaio de grande reprodutibilidade, especificida-de e sensibilidade (em torno de 10-12g), entretanto, tem comodesvatagens a manipulação de isótopo radioativo (125I é emis-sor de radiação gama), a validade curta do referido reagente ra-dioativo (o 125I tem meia vida de 58 dias) e a demora da execu-ção do teste, já que a leitura final de cada amostra deve levar 1 minuto (“counts per minute”).