“estudo comparativo do emprego de...selantes de fibrina são utilizados em uma vasta gama de...

MATEUS VIDIGAL DE CASTRO

“ESTUDO COMPARATIVO DO EMPREGO DE

SELANTE DE FIBRINA COMERCIAL E

DERIVADO DO VENENO DE CASCAVEL

PARA REIMPLANTE DE RAÍZES VENTRAIS

MEDULARES APÓS AVULSÃO”

Campinas, 2015.

À minha amada irmã Viviane.

“Para tudo há uma ocasião, e um tempo para

cada propósito debaixo do céu”

Eclesiastes 3:1 (NVI).

AGRADECIMENTOS

Primeiramente à Deus, pelo Dom da vida, e por estar vivendo o aqui e o agora.

À todos os animais que perderam suas vidas em prol da minha pesquisa.

Ao Prof. Dr. Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira, orientador e incentivador no projeto de

mestrado, pela confiança e oportunidades de crescimento profissional e pessoal a mim

concedida. Obrigado também pelas discussões frutíferas e idéias inovadoras, que

frequentemente são colocadas em prática de forma extraordinária.

À Roberta Barbizan, que muito me ajudou na iniciação científica e com certeza contribuiu

muito para a minha formação como pesquisador;

À Juliana Nista, que muito me ajudou em experimentos;

À UNICAMP, por proporcionar o cenário e aos seus profissionais que contribuíram para

meu aprendizado; Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural do

Instituto de Biologia, sua coordenação e à secretária Líliam por toda a ajuda concedida; Aos

professores do programa, por todos os ensinamentos; Aos técnicos do departamento por

todo o auxílio;

Ao CEMIB, por conceder os animais utilizados nesse trabalho;

Ao CEVAP, por conceder o selante de fibrina utilizado em meu trabalho, pela comunhão de

idéias e pela grande colaboração com nosso laboratório.

À Fapesp, pelo apoio financeiro.

À minha família, em especial à minha mãe Josalba (In memoriam) e meu pai Carlos; Fonte

de prosperidade, paz e harmonia.

Obrigado a todos os companheiros de trabalho: Simone, Patrícia, Gabriela, Júlio, André,

Matheus, Rodrigo, Sergiy, Roya, Gustavo, Luciana, Aline, Bruna, Danielle, Elisa, Marta,

Greice, Melissa, Giuliano, Natália, Carol, Felipe, Giuliana; Pela dedicação e ajuda, carinho

e respeito, que sempre tive de cada um.

Obrigado a todos os amigos que me acompanharam por esses longos dois anos, sempre

me apoiando: Leo e Mari, Andressa, Rob, Patrique, Lúcia, Rafaela, Henrique e Marina,

Mayara, Kyl.

RESUMO

Lesões axonais na interface do sistema nervoso central (SNC) e periférico (SNP), como a

avulsão de raízes ventrais (ARV), induzem importantes processos degenerativos

retrógrados, podendo resultar em morte neuronal e consequente perda da função motora.

Nesse tipo de lesão ocorre a separação de raízes nervosas com a medula espinal,

interrompendo o contato entre um motoneurônio e as fibras musculares por ele inervadas.

Um tratamento promissor seria a utilização de selantes de fibrina, para reimplantar as raízes

ventrais nos seus respectivos sítios de avulsão e assim, promover a reconexão do

motoneuronio ao órgão alvo e consequentemente, o retorno funcional. Atualmente os

selantes de fibrina são utilizados em uma vasta gama de procedimentos cirúrgicos,

incluindo cirurgia cardiovascular, torácica, plástica e reconstrutiva, dentária e neurocirurgia.

No presente estudo foram utilizados dois tipos de selantes de fibrina para reconectar as

raízes ventrais no local exato da lesão. Um deles, produzido a partir do veneno de Crotalus

durissus terrificus e outro produzido comercialmente, a fim de investigar a eficácia de

ambos na regeneração nervosa e recuperação motora após avulsão de raízes ventrais

medulares. Para isso, ratos Lewis fêmeas, com 10 semanas de idade, foram submetidos à

avulsão de raízes ventrais medulares (L4-L6). Esses animais foram divididos em 3 grupos:

1) Avulsão de raízes motoras, sem reimplante; 2) Avulsão e reimplante das raízes motoras

com selante de fibrina derivado do veneno de Crotalus durissus terrificus na superfície

medular; 3) Avulsão e reimplante das raízes motoras com selante de fibrina comercial

(Tissucol). A intumescência lombar e o nervo isquiático foram dissecados e os espécimes

processados para a investigação da sobrevivência neuronal e contagem de axônios

mielínicos, bem como análise de parâmetros histomorfométricos. A imunoistoquímica foi

empregada para avaliar a estabilidade sináptica, reatividade astroglial e reatividade

microglial, além da expressão de proteínas relacionadas ao processo regenerativo axonal.

Adicionalmente, a evolução da recuperação motora, foi investigada através do método

“walking track test” (CatWalk). Os resultados indicaram que o reimplante das raízes

avulsionadas com ambos selantes de fibrina melhoraram significativamente a recuperação

motora até 12 semanas pós-operatórias. Além disso, o número médio de axônios e a

sobrevivência neuronal foram igualmente aumentados nos grupos onde houve o reimplante.

Por fim, o reimplante promeveu preservacão parcial da cobertura sináptica e aumento da

expressão de proteínas relacionadas ao processo de regeneracão axonal. Por outro lado,

não houve diferenças na reatividade microglial e astrogliose reativa, na fase aguda pós-

lesão, entre os grupos experimentais. Em conjunto, nossos resultados sugerem que o

selante de fibrina derivado do veneno de Crotalus durissus terrificus, bem como o selante

de fibrina comercial (Tissucol), utilizados para o reimplante de raízes medulares são

similarmente eficientes, reimplantando as raízes avulsionadas de forma estável e

duradoura, gerando efeitos neuroprotetores e promovendo melhora motora.

ABSTRACT

Axonal injury in the interface of central nervous system (CNS) and peripheral (PNS) such

as ventral roots avulsion (VRA) induce major retrograde degenerative processes which may

cause neuronal death and loss of motor function. By this type of injury occurs the separation

of nerve roots with the spinal cord, interrupting the contact between a motor neuron and the

innervated muscle fibers. One promising treatment would be to use of fibrin sealants to

redeploy the ventral root in their respective sites of avulsion, thereby promote the

reconnection of motor neuron to the target organ, and therefore, return of functional.

Currently fibrin sealants are used in a wide range of surgical procedures, including

cardiovascular, thoracic, plastic and reconstructive, dental and neurosurgery. In the present

research, we used two types of fibrin sealants to reconnect the ventral roots in the exact

location of the injury. One of them, produced from the venom of Crotalus durissus

terrificus other commercially produced to investigate the efficacy of both sealants to the

nerve regeneration and motor recovery after avulsion of ventral spine roots. For this, Lewis

rats female, 10 weeks old, were underwent to avulsion of ventral spinal root (L4-L6). These

animals were divided in 3 groups: 1) avulsion of motor roots without reimplantation; 2)

avulsion and reimplantation of motor roots with fibrin sealant derived from venom of

Crotalus durissus terrificus on the spinal cord surface; 3) avulsion and reimplantation of

motor roots with commercial fibrin sealant (Tissucol). The lumbar enlargement and sciatic

nerve were dissected and samples processed for the investigation of neuronal survival and

counting of myelinated axons as well as for analysis of histomorfometric parameters.

Immunohistochemistry was used to evaluate synaptic stability, reactivity astroglial and

microglial, beyond the expression of proteins related to axonal regeneration process.

Additionally, the evolution of motor recovery was investigated using the "walking track test"

(Catwalk). The results indicated that reimplantation of avulsion roots with both fibrin sealants

significantly improved motor recovery up to 12 weeks postoperative. Moreover, the average

number of axons and neuronal survival was also increased in the groups that received the

reimplantation. Finally, reimplantation promoted partial preservation of synaptic coverage

and increased expression of proteins related to axonal regeneration process. Furthermore,

no differences in microglial reactivity and reactive astrogliosis in the acute phase after injury,

among the experimental groups. Taken together, our results suggest that the derived fibrin

sealant from venom of Crotalus durissus terrificus, as well as the commercial fibrin

sealant (Tissucol), used for the reimplantation of spinal cord roots are similarly efficient,

reimplanting the avulsion roots effectively, are neuroprotective and promoting the motor

improvement.

Lista de figuras

Figura 1. Esquema de hemi-medula espinal. A imagem representa um corte

transversal da medula espinal em nível lombar, mostrando a formação do nervo espinal.

Fonte: Koeppen and Stanton: Berne and Levy Physiology, 6th Edition. Modificado.

Figura 2. Eletromicrografia obtida na região do terço médio do nervo isquiático em

microscópio eletrônico de transmissão, evidenciando as seguintes estruturas: CS) – Célula

de Schwann, M) – Axônio mielínico, A) Axônio amielínico.

Figura 3. Fotomicrografia de corte transversal do nervo isquiático, evidenciando as

seguintes estruturas: (T) – Nervo tibial; (F) – Nervo fibular, (S) – Nervo sural. A seta indica

o perineuro.

Figura 4. Esquema da medula espinal submetida à avulsão de raizes motoras. A

imagem representa um corte transversal da medula espinal, indicando o sítio exato da

lesão. Fonte: Koeppen and Stanton: Berne and Levy Physiology, 6th Edition. Modificado.

Figura 5. Fotomicrografias obtidas na região dorsolateral da medula espinal em

microscópio de luz (contraste de fase em campo claro), evidenciando as raízes ventrais. A)

– Raiz ventral do lado contralateral a lesão, B) – Raiz ventral reimplantada - lado ipsilateral.

Figura 6. Sistema ''CatWalk'’ (Walking Track Test). (A) - Imagem do equipamento

com a câmera de alta resolução em destaque no interior do círculo. (B) - Plataforma onde

os ratos realizaram as caminhadas. (D) e (E) - Sistema em funcionamento. Destaque para

as impressões plantares. (F) e (G) - Tela do software enquanto o teste está ocorrendo.

Destaque para os gráficos 3D e os resultados estatísticos fornecidos pelo sistema ao final

do teste. Fonte: http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/catwalk

Figura 7. Fotomicrografia de corte transversal do nervo isquiático. Em (A), após a

montagem das micrografias na objetiva de 10X, foi realizada a medida da área do nervo.

Em (B), utilizou-se a objetiva de 100X para realizar a quantificação das fibras.

Figura 8. Imagem do nervo isquiático previamente editada (transformada em preto

e branco), em objetiva de 100x. Observar a ferramenta limiar usada (círculo à esquerda),

bem como os parâmetros morfométricos obtidos pelo programa referente ao axônio

selecionado (seta central): Perímetro da figura (Perímetro); Área correspondente à bainha

http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/catwalk

de mielina (Área); e Diâmetro mínimo da fibra mielínica (Height). O background e fibras que

não apareciam inteiras na imagem original foram apagadas.

Figura 9. Fotomicrografias obtidas na região dorsolateral da medula espinal coradas

com cresil violeta (Coloração de Nissl), representando a sobrevivência neuronal, 4 semanas

após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo

avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) -

Lado ipsilateral do grupo implante com selante comercial, (E) – Gráfico da razão percentual

ipsi e contralateral da sobrevivência dos motoneurônios medulares após a avulsão. Note-

se maior sobrevivência neuronal após a avulsão das raízes nervosas nos grupos onde

houve o reimplante, não havendo diferença entre os tratamentos (** = p<0.01; n=5 para

cada grupo).

Figura 10. Fotomicrografias obtidas na região dorsolateral da medula espinal

coradas com cresil violeta (Coloração de Nissl), representando a sobrevivência neuronal,

12 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral

do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo implante com selante fabricado pelo

CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo implante com selante comercial, (E) – Gráfico da

razão percentual ipsi e contralateral da sobrevivência dos motoneurônios medulares após

a avulsão. Note-se maior sobrevivência neuronal após a avulsão das raízes nervosas nos

grupos onde houve o reimplante, não havendo diferença entre os tratamentos (** = p<0.01;

n=5 para cada grupo).

Figura 11. Fotomicrografias de cortes transversais do nervo isquiático

representativas dos diferentes grupos experimentais, corados com Sudan Black, 4 semanas



Lado ipsilateral do grupo implante com selante comercial, (E) - Gráfico da quantificação do

número de fibras mielínicas (*** = p< 0,001; n=5 para cada grupo). Barra de escala = 10

µm.

Figura 12. Fotomicrografias de cortes transversais do nervo isquiático

representativas dos diferentes grupos experimentais, corados com Sudan Black, 12

semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do

grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo implante com selante fabricado pelo CEVAP,

(D) - Lado ipsilateral do grupo implante com selante comercial, (E) - Gráfico da quantificação

do número de fibras mielínicas (*** = p< 0,001; n=5 para cada grupo). Barra de escala = 10

µm.

Figura 13. Histograma de distribuição de frequência referente ao diâmetro mínimo

das fibras mielínicas dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 4


grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado pelo

CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante comercial.


das fibras mielínicas dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 12





dos axônios mielínicos dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 4





dos axônios mielínicos dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 12




Figura 17. Histograma de distribuição de frequência referente a espessura da

bainha de mielina das fibras mielínicas dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada

grupo), 4 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado

ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado

pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante comercial.

Figura 18. Histograma de distribuição de frequência referente a espessura da

bainha de mielina das fibras mielínicas dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada

grupo), 12 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado

ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado

pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante comercial.

Figura 19. Histograma de distribuição de frequência referente a razão “g” das fibras

mielínicas dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 4 semanas após a

lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C)

- Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado

ipsilateral do grupo reimplante com selante comercial.

Figura 20. Histograma de distribuição de frequência referente a razão “g” das fibras





Figura 21. Análise da porcentagem da espessura da bainha de mielina, bem como

a razão “g”, nos diferentes grupos experimentais, ao longo do tempo. (A) - Porcentagem de

fibras mielínicas com bainha de mielina superior a 2µm de espessura, 4 semanas após

lesão. (B) - Porcentagem de fibras mielínicas com bainha de mielina superior a 2µm de

espessura, 12 semanas após lesão. (C) - Porcentagem de fibras mielínicas na faixa de 0,7-

0,9 de razão “g”, 4 semanas após lesão. (D) - Porcentagem de fibras mielínicas na faixa de

0,7-0,9 de razão “g”, 12 semanas após lesão.

Figura 22. Relação da razão “g” com o diâmetro mínimo do axônio, dos diferentes

grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 4 semanas após a lesão. (A) - Lado

contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral

do grupo implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo

implante com selante comercial.

Figura 23. Relação da razão “g” com o diâmetro mínimo do axônio, dos diferentes

grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 12 semanas após a lesão. (A) - Lado



implante com selante comercial.

Figura 24. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lâmina IX do corno

ventral da medula espinal marcada com anti-sinaptofisina, 4 semanas após a lesão. (A) -

Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado

ipsilateral do grupo implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do

grupo implante com selante comercial, (E) – O gráfico indica a diferença da razão

ipsi/contralateral da média da densidade integrada de pixels. Note-se grande redução na

expressão de sinaptofisina, resultado de pequena cobertura sináptica nestes neurônios,

após a avulsão das raízes nervosas (** = p<0.01; n=5 para cada grupo). Barra de escala =

50µm.

Figura 25. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lâmina IX do corno

ventral da medula espinal marcada com anti-GFAP, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado



implante com selante comercial, (E) – O gráfico indica a diferença da razão ipsi/contralateral

da média da densidade integrada de pixels. Note-se nos lados ipsilaterais, a forte presença

astrogliose reativa circunjacente aos motoneurônios, após a avulsão das raízes nervosas,

não havendo diferença entre grupos experimentais (n=5 para cada grupo). Barra de escala

= 100µm.

Figura 26. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lamina IX do corno

ventral da medula espinal marcada com anti-Iba-1, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado




da média da densidade integrada de pixels. Note-se nos lados ipsilaterais, a forte presença

de microglia reativa próxima aos motoneurônios, após a avulsão das raízes nervosas, não

havendo diferença entre grupos experimentais (n=5 para cada grupo). Barra de escala =

100µm.

Figura 27. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica de cortes longitudinais do

nervo isquiático marcado com anti-neurofilamento, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado




da média da densidade integrada de pixels. Não houve diferença entre grupos

experimentais (n=5 para cada grupo). Barra de escala = 100µm.


nervo isquiatico marcado com anti-S100, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral

do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo

implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo implante com

selante comercial, (E) – O gráfico indica a diferença da razão ipsi/contralateral da média da

densidade integrada de pixels. Note-se nos lados ipsilaterais, uma intensa marcação das

células de Schwann, após a avulsão das raízes nervosas (* = p<0.5; ** = p<0.01; n=5 para

cada grupo). Barra de escala = 100µm.


nervo isquiatico marcado com anti-p75NTR, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado




da média da densidade integrada de pixels. Note-se nos lados ipsilaterais, uma intensa

marcação de pan receptores para neurotrofinas, após a avulsão das raízes nervosas

(p<0.01; n=5 para cada grupo). Barra de escala = 100µm.

Figura 30. Análise da função motora dos animais com doze semanas após a lesão.

Observar a recuperação motora dos animais que, após sofrerem avulsão das raízes

ventrais, tiveram o reimplante das mesmas realizado com os selantes de fibrina. A) Gráfico

construído com a razão ipsi/contralateral referente aos valores do índice funcional do fibular

aferido até 12 semanas pós-operatórias (n=7; **=p<0.01). B) Gráfico construído com a

razão ipsi/contralateral referente aos valores da área da pegada aferida até 12 semanas

pós-operatórias (n=7; *= p<0.5). C) Gráfico construído com a razão ipsi/contralateral

referente aos valores do tempo da pegada aferida até 12 semanas pós-operatórias (n=7;

**=p<0.01).

Lista de tabelas

Tabela 1. Grupos experimentais e tempos de sobrevida após a avulsão das raízes

ventrais e técnicas utilizadas em cada grupo, bem como o objetivo de estudo de cada uma

delas.

Tabela 2. Anticorpos primários usados no ensaio de imunoistoquímica. Cada

anticorpo é seguido pelo fornecedor, animal hospedeiro, código do produto e concentração

utilizada.

Tabela 3. Valores médios do diâmetro mínimo das fibras mielínicas, diâmetro

mínimo do axônio, espessura da bainha de mielina e razão "g" nos diferentes grupos

experimentais, 4 semanas pós lesão. Os valores são apresentados como média ± erro

padrão.

Tabela 4. Valores médios do diâmetro mínimo das fibras mielínicas, diâmetro

mínimo do axônio, espessura da bainha de mielina e razão "g" nos diferentes grupos


padrão.

Lista de abreviaturas

ARV – Avulsão de raiz ventral

BDNF - Fator neurotrófico derivado do cérebro

BSA - Albumina de soro bovino

CEMIB - Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica

CEUA – Comissão de ética no uso de animais

CS – Célula de Schwann

DA - Diâmetro mínimo dos axônios mielínicos

DF - Diâmetro mínimo das fibras mielínicas

EBM - Espessura da bainha de mielina

GFAP - Proteína fibrilar ácida glial

IBA-1 – Proteína adaptadora de ligacao de cálcio ionizado

NGF - Fator de crescimento do nervo

PB – Tampão fosfato

PFI - Índice funcional do nervo fibular

PL - Comprimento da pata

RZG - Razão "g"

SFB - Soro fetal bovino

SN - Sistema nervoso

SNC - Sistema nervoso central

SNP - Sistema nervoso periférico

TS - Largura da pata

Sumário

1. Introdução ...................................................................................................................................... 23

1.1 - MEDULA E NERVOS ESPINAIS................................................................................................. 24

1.2 - AVULSAO E RESPOSTA À LESÃO ............................................................................................. 27

1.3 - REIMPLANTE DE RAÍZES MEDULARES .................................................................................... 29

1.4 - SELANTES DE FIBRINA ............................................................................................................ 30

2. Justificativa ..................................................................................................................................... 34

3. Objetivos ........................................................................................................................................ 37

3.1 - OBJETIVOS GERAIS ................................................................................................................. 38

3.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS......................................................................................................... 38

4. Material e Métodos........................................................................................................................ 39

4.1 - GRUPOS EXPERIMENTAIS ....................................................................................................... 40

4.2 - OBTENÇÃO DO SELANTE DE FIBRINA DERIVADO DO VENENO DE CROTALUS DURISSUS

TERRIFICUS ..................................................................................................................................... 41

4.3 – OBTENÇÃO DO SELANTE DE FIBRINA COMERCIAL ................................................................ 42

4.4 - AVULSÃO DAS RAÍZES MOTORAS ........................................................................................... 42

4.5 - REIMPLANTE DAS RAÍZES MOTORAS ..................................................................................... 42

4.6 - AVALIAÇÃO MOTORA DA RECUPERAÇÃO FUNCIONAL ......................................................... 43

4.7 - SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS ...................................................................................................... 46

4.8 - ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA DO NERVO ISQUIÁTICO ..................................................... 46

4.9 – IMUNOISTOQUIMICA ............................................................................................................ 49

4.10 - SOBREVIVÊNCIA NEURONAL ................................................................................................ 51

4.11 - ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS ............................................................................. 51

5. Resultados ...................................................................................................................................... 52

5.1 - EFEITO NEUROPROTETOR DOS SELANTES DE FIBRINA - SOBREVIVÊNCIA NEURONAL ......... 53

5.2 - ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA DO NERVO ISQUIÁTICO - REGENERAÇÃO AXONAL ........... 57

5.2.1 – CONTAGEM DO NÚMERO DE AXÔNIOS MIELÍNICOS ..................................................... 57

5.2.2 – DIÂMETRO MÍNIMO DAS FIBRAS MIELÍNICAS (DF) ........................................................ 61

5.2.3 – DIÂMETRO MÍNIMO DOS AXÔNIOS MIELÍNICOS (DA) ................................................... 63

5.2.4 – ESPESSURA DA BAINHA DE MIELINA (EBM) ................................................................... 65

5.2.5 – RAZÃO “g” (RZG) ............................................................................................................ 67

5.2.6 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS POR MEIO DE DOTPLOT – RZG X DIÂMETRO MÍNIMO

DO AXÔNIO ................................................................................................................................ 70

5.3 - REDUÇÃO DO PROCESSO DE ELIMINAÇÃO SINÁPTICA, AVALIADA ATRAVÉS DA EXPRESSÃO

DE SINAPTOFISINA ......................................................................................................................... 73

5.4 - REATIVIDADE GLIAL ................................................................................................................ 75

5.5 - EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RELACIONADAS AO PROCESSO REGENERATIVO AXONAL ......... 79

5.6 - AVALIAÇÃO MOTORA DA RECUPERAÇÃO FUNCIONAL ......................................................... 85

6. Discussão ........................................................................................................................................ 88

6.1 - REIMPLANTE E SOBREVIVÊNCIA NEURONAL ......................................................................... 89

6.2 - REIMPLANTE E A PLASTICIDADE SINÁPTICA .......................................................................... 90

6.3 - REIMPLANTE E REATIVIDADE GLIAL E PROCESSO REGENERATIVO AXONAL ......................... 90

6.4 - REIMPLANTE E REGENERAÇÃO NERVOSA E RECUPERAÇÃO FUNCIONAL ............................. 92

7. Conclusões ..................................................................................................................................... 95

8. Referências ..................................................................................................................................... 97

9. Anexo ........................................................................................................................................... 107

23

1. Introdução

24

1.1 - MEDULA E NERVOS ESPINAIS

O sistema nervoso (SN) é uma extensa e complicada organização de estruturas

pelas quais as reações internas do indivíduo são correlacionadas e integradas e pelo qual

são controlados seus ajustamentos ao meio ambiente. O SN é anatomicamente dividido em

Sistema Nervoso Central (SNC), que se localiza dentro do esqueleto axial (cavidade

craniana e canal vertebral) e pelo Sistema Nervoso Periférico (SNP), que se localiza fora

do esqueleto axial. O SNC é composto pelo encéfalo e pela medula espinal, enquanto o

SNP é composto por nervos, gânglios e terminações nervosas (Machado, 2000).

A medula espinal situa-se no interior do canal vertebral, apresentando forma

aproximadamente cilíndrica, sendo ligeiramente achatada no sentido ânteroposterior. Seu

calibre não é uniforme, pois apresenta algumas dilatações. O tecido nervoso presente na

medula espinal é morfologicamente dividido em substância branca e substância cinzenta.

A substância branca é formada por fibras nervosas, em sua maioria mielínica, agrupadas

em funículos. Por outro lado, a substância cinzenta localiza-se internamente à branca e

apresenta a forma de um ‘‘H’’, onde estão situados os corpos de neurônios. Levando-se em

consideração a organização dos neurônios na substância cinzenta medular, em 1952,

Rexed propôs a divisão da mesma em dez lâminas. A lâmina IX contém os núcleos motores,

que possuem diferentes dimensões de acordo com o segmento medular, caracterizando o

aparecimento das intumescências cervical e lombar, responsáveis pela inervação dos

membros inferiores e superiores, respectivamente, ao longo da medula espinal (Rexed,

1952).

Nos sulcos lateral anterior e posterior da medula, emergem filamentos radiculares,

que se unem para formar, respectivamente, as raízes ventrais e dorsais que, unidas, darão

origem a cada nervo espinal. A raiz ventral é formada por axônios que se originam em

motoneurônios situados nas colunas anterior e lateral da medula, enquanto a raiz dorsal é

formada por axônios que se originam em neurônios situados nos gânglios sensitivos da raiz

dorsal, que se apresenta como uma porção dilatada da própria raiz. Da união da raiz dorsal

sensitiva, com a raiz ventral motora, forma-se o tronco do nervo espinal, que funcionalmente

é misto. (Machado, 2000). (Figura 1).

Os nervos periféricos apresentam axônios mielínicos e amielínicos, dependendo de

suas relações com as células de Schwann (CS) (Figura 2). Em um axônio mielínico, que

em geral possui um diâmetro maior que 1µm, as CS, dispostas sequencialmente formam,

25

ao seu redor, uma estrutura tubular denominada bainha de mielina. As CS vizinhas estão

separadas umas das outras por intervalos destituídos de mielina e parcialmente cobertos

por digitações laterais do seu citoplasma. Estes espaços são denominados nodos de

Ranvier (Landon e Hall, 1976; Peters et al., 1976). Entretanto, nos axônios amielínicos, uma

CS, através de projeções citoplasmáticas, envolve total ou parcialmente entre 5 a 25

axônios, não havendo a formação da bainha de mielina. Dessa forma, os axônios

amielínicos encontram-se individualmente alocados no interior de sulcos ou canais

formados pelas expansões do citoplasma das CS (Peters et al., 1976).

Figura 1. Esquema de hemi-medula espinal. A imagem representa um corte transversal da

medula espinal, mostrando a formação do nervo espinal. Fonte: Koeppen and Stanton:

Berne and Levy Physiology, 6th Edition. Modificado.

O tecido de sustentação dos nervos é constituído por uma camada fibrosa mais

externa de tecido conjuntivo denso, o epineuro. Geralmente, os fascículos caminham de

forma relativamente organizada dentro do nervo, revestidos por bainha de várias camadas

de células achatadas, justapostas, compondo o perineuro. As células de bainha perineural

unem-se por junções oclusivas, constituindo uma barreia à passagem de muitas

macromoléculas e importante mecanismo de defesa contra agentes agressivos. Dentro da

bainha perineural encontram-se os axônios, cada um envolvido pela bainha de mielina, com

sua lâmina basal e um envoltório conjuntivo constituído principalmente por fibras reticulares

sintetizadas pelas células de Schwann, chamado endoneuro.

26

Figura 2. Eletromicrografia de transmissão obtida no terço médio do nervo isquiático,

evidenciando as seguintes estruturas: CS) – Célula de Schwann, M) – Axônio mielínico, A)

Axônios amielínicos.

O nervo isquiático do rato é formado pelos segmentos medulares L4, L5 e L6. Esses

segmentos também contribuem para formacão de outros nervos do plexo lombosacral. No

nível do trocânter maior do fêmur apresenta-se unifascicular e 5-7 milímetros distalmente,

o nervo divide-se em duas porções (porção tibial e porção fibular) e posteriormente, em

quatro fascículos. A porção tibial dá origem ao nervo tibial e ao nervo sural, enquanto a

porção fibular dá origem ao nervo fibular e ao ramo cutâneo. Em seu trajeto descedente,

perfura os músculos isquiotibiais, localizando-se lateralmente na face posterior da coxa, e

os dois maiores nervos, tibial e fibular, inervam as regiões dorsal e ventral da perna

(Schmalbruch, 1986).

Em um estudo prévio sobre a composição de fibras nervosas do nervo isquiático de

ratos, conduzido por Schmalbruch em 1986, verificou-se que este nervo apresenta cerca

de 7.800 fibras mielínicas, das quais 4.500 compõem o nervo tibial (1000 são motoras),

1.900 o nervo fibular (600 são motoras), 1.100 o nervo sural, e 400 o ramo cutâneo. Deste

total, apenas 1.600 axônios são motores, aproximadamente 20% do total de axônios

mielínicos presentes no nervo.

27

Figura 3. Fotomicrografia de corte transversal do nervo isquiático, evidenciando as

seguintes estruturas: (T) – Nervo tibial; (F) – Nervo fibular, (S) – Nervo sural. A seta indica

o perineuro.

1.2 - AVULSAO E RESPOSTA À LESÃO

Lesões próximas da interface entre o Sistema Nervoso Central (SNC) e periférico

(SNP) desencadeiam uma extensa degeneração de motoneurônios medulares (Novikov et

al., 1995; Kishino et al., 1997; Oliveira e Langone, 2000), acarretando permanente perda

das respectivas funções motoras. Os neurônios motores afetados apresentam,

adicionalmente, no período agudo pós-lesão, perda significativa de sinapses (Kuno e

Llina´s, 1970; Purves, 1975; Takata e Nagahama, 1983; Delgado-Garcia et al., 1988),

dentre outras alterações no microambiente medular.

Experimentalmente, tal degeneração neuronal e alterações medulares podem ser

induzidas através da avulsão de raízes nervosas ventrais (motoras), a qual consiste na

abrupta separação dessas raízes da medula espinal, causando uma interrupção do contato

entre o motoneurônio e as fibras musculares alvo, com mínima interferência na integridade

do tecido próximo à raiz lesada e seu sistema vascular (Livesey e Fraher, 1992), sendo as

causas mais comuns da avulsão de raízes nervosas, em pacientes, acidentes de

motocicleta e em severa tração durante partos complicados, resultando em perdas motoras,

sensitivas e autônomas da extremidade afetada (Carlstedt, 2009).

28

Figura 4. Esquema da medula espinal submetida à avulsão de raizes motoras. A imagem

representa um corte transversal da medula espinal, indicando o sítio exato da lesão. Fonte:

Koeppen and Stanton: Berne and Levy Physiology, 6th Edition. Modificado.

Esse tipo de lesão resulta na retração de botões sinápticos da superfície da célula

axotomizada (Purves e Lichtman, 1978; Brannstrom e Kellerth, 1998) levando à perda de

80% das células nervosas lesadas até a segunda ou terceira semanas após o trauma

(Koliatsos et al., 1994). No caso de a reinervação do órgão alvo não ocorrer, tais alterações

sinápticas podem se tornar irreversíveis (Brannstrom e Kellerth, 1998). Para a função ser

restaurada, as células nervosas devem sobreviver à lesão e deve haver crescimento axonal

ao longo de sua trajetória, através das raízes nervosas.

Existe uma relação direta entre a transecção de raiz nervosa e alteração da função

neuronal (Yamaguchi et al., 1999). Após o trauma de raízes nervosas, mudanças axonais

indicativas de disfunção e degeneração se iniciam proximal e distalmente à lesão

(Kobayashi et al., 2004). A lesão da raiz nervosa pode resultar em isquemia e formação de

edema, extravasamento de fluidos intracelulares e desencadear, distalmente à lesão, a

degeneração Walleriana (Kobayashi et al., 2004).

Durante a degeneração Walleriana, ocorre a fragmentação da bainha de mielina dos

axônios lesados. Concomitantemente, ocorre o recrutamento dos macrófagos em direção

29

ao local da lesão, bem como a multiplicação das células de Schwann. Ambos os tipos

celulares atuam na fagocitose dos fragmentos de mielina e de neurofilamentos dos axônios

em degeneração (Sunderland, 1990), criando assim, um microambiente favorável ao

crescimento e orientação axonal em direção ao órgão alvo, fundamental ao sucesso do

processo regenerativo (Frisen, 1997). Adicionalmente, as células de Schwann são cruciais

para o processo de regeneração axonal, por realizarem a mielinização dos axônios em

brotamento e proverem um substrato rico para o crescimento dos novos axônios, pois

sintetizam vários fatores de crescimento, como o fator neurotrófico de crescimento do nervo

(NGF), o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), entre outros, fundamentais ao

desenvolvimento, manutenção e regeneração das células nervosas (Garbay et al., 2000).

Adicionalmente, induzem e orientam o crescimento axonal em direção ao órgão alvo

através da síntese de moléculas neurotróficas (Frisen, 1997).

Quanto mais tempo levar a reinervação do alvo, maior a chance de atrofia

permanente por denervação dos tecidos alvo, no caso o músculo estriado esquelético.

Portanto, a regeneração acelerada é crucial para a obtenção de resultados funcionais

satisfatórios.

1.3 - REIMPLANTE DE RAÍZES MEDULARES

A implantação cirúrgica das raízes ventrais lesadas se mostrou uma estratégia

eficaz e pode servir como um modelo de regeneração na interface do SNC/SNP, (Cullheim

et al., 1999), pela proximidade dessa lesão com o corpo celular dos motoneurônios. Em

humanos, esta técnica é atualmente considerada um tratamento relativamente promissor

para restaurar parcialmente funções motoras, bem como reduzir a ocorrência de dor

neuropática intratável. Para reimplantar a raiz e mantê-la em posição na medula, sutura-se

a raiz na pia-máter (Carlstedt, 2009). Entretanto, nem sempre a sutura direta é viável,

podendo ser utilizados selantes de fibrina como alternativa para reconectar a raiz no ponto

exato onde essa foi avulsionada. Outras formas de implante, alternativamente àquela

proposta no presente estudo, utilizam enxerto de outros nervos ou, ainda, fazendo-se uma

pequena abertura na medula (Pintér et al, 2010).

O reimplante de raízes ventrais tem caráter neuroprotetor, permitindo a

regeneração axonal, além de resultar em reinervação anatômica e funcional dos músculos

30

esqueléticos (Cullheim et al., 1989; Hoang et al., 2006; Chang e Havton, 2008),

possibilitando a passagem de fatores neurotroficos. Com a avulsão da raiz, a perda de

conexão do motoneurônio com seu alvo periférico gera uma interrupção de fornecimento,

aos motoneurônios, de fatores neurotróficos produzidos pelo alvo, que juntamente com o

trauma vascular levam a à excitoxidade, o que drasticamente reduz o número de

motoneurônios até cerca de 80% da população normal, dentro das primeiras duas semanas

após a lesão (Koliatsos et al, 1994).

Fatores neurotróficos são moléculas que tem têm um impacto profundo e

significativo em eventos de desenvolvimento, como a sobrevivência celular, diferenciação

e crescimento (Snider e Johnson, 1989; Chu e Wu, 2009). Proporcionar substâncias

neurotróficas aos pacientes com lesão de raízes nervosas pode ser uma opção para

resgatar neurônios da medula espinal, antes que a conectividade com a periferia seja

estabelecida. Fatores tróficos que podem melhorar o brotamento em motoneurônios

aumentam a probabilidade de um axônio se associar com células de Schwann na periferia.

Idealmente, os fatores que proporcionam efeitos quimiotáticos ou neurotróficos para os

axônios podem orientá-los em direção ao alvo (Chu e Wu, 2009). Adicionalmente, Vejsada

et al. (1995) demonstraram que, caso a conexão entre o corpo celular e o alvo não seja

restabelecida no animal adulto, os fatores neurotróficos não são capazes de manter a

sobrevivência de motoneurônios lesados por longos períodos.

1.4 - SELANTES DE FIBRINA

Os selantes de fibrina comerciais são produtos originários de proteínas do plasma

humano, formados por dois componentes principais: fibrinogênio e trombina, que, uma vez

combinados, formam uma matriz de fibrina bioativa com propriedades hemostática e de

adesão, mimetizando a via final da cascata de coagulação (Busuttil, 2003). Nesses

produtos, o fibrinogênio é clivado e convertido em polímeros de fibrina pela ação da

trombina. Alguns selantes são complementados com o fator XIII, o que pode aumentar a

resistência à tração, a estabilidade do coágulo e melhorar a hemostasia. O Fator XIII,

quando ativado pela trombina na presença de íons de cálcio, reage com os polímeros de

fibrina resultando um coágulo insolúvel. (Alving et al., 1995; Martinowitz e Spotnitz, 1997;

Radosevich et al., 1997). Este componente desempenha um papel bem estabelecido na

coagulação natural e estabilização do coágulo, sendo a enzima final ativada na cascata de

31

coagulação do sangue, facilitando assim, a formação de ligações cruzadas covalentes

dentro da rede de fibrina. Forma-se então uma malha, após a ativação pela trombina,

melhorando seu desempenho no uso clínico (Phillips et al., 2003). Alguns selantes

apresentam também inibidores da fibrinólise (aprotinina), os quais estão relacionadas com

a manutenção prolongada do coágulo no sítio (Tock et al., 1998; Albala et al., 2003).

Geralmente, a trombina utilizada na produção dos selantes de fibrina é de origem bovina

(Spotnitz, 2001) mas, atualmente, tem sido substituída pela trombina humana submetida à

inativação viral, para reduzir o risco de transmissão de doenças e ocorrência de reações

imunológicas.

Embora todos os selantes de fibrina contenham fibrinogênio e trombina,

qualitativamente e quantitativamente a exata composição varia, o que pode afetar a

velocidade da obtenção de hemostase e a formação de coágulos, alterando as

propriedades do coágulo de fibrina resultante, o que pode influenciar na sua utilização em

diversos procedimentos cirúrgicos (Albala, 2003). Selantes de fibrina com altas

concentrações de fibrinogênio tendem a produzir coágulos mais fortes e promovem, de

forma mais rápida, a formação de coágulos de trombina (Albala, 2003). Propriedades que

variam entre os diferentes selantes de fibrina, tais como a taxa de coagulação, a

viscosidade, a adesividade, a resistência do coágulo e a resistência à proteólise, são

importantes considerações para diferentes aplicações (Wozniak, 2003).

Atualmente, os selantes de fibrina são utilizados em uma vasta gama de

intervenções cirúrgicas, principalmente como agentes hemostáticos, indutores de processo

de cicatrização, selador de cavidades, estimulador do processo de reparação tecidual, além

de veículo de liberação lenta de drogas ou agentes de crescimento em sítios cirúrgicos.

Esses selantes têm sido utilizados em diferentes estudos experimentais para avaliação de

sua influência na reparação tecidual (Stechison, 1992; Toma et al., 1992; Tawes et al., 1994;

Sirieix et al., 1998; Jackson, 2001; Alabama, 2003; Chan e Boisjoly, 2004; Prabhu e

Spotnitz, 2005). Os selantes são utilizados em suas fórmulas originais ou como veículos de

introdução de outros elementos que possam interferir no processo cicatricial. Além disso,

há também resultados promissores para o remodelamento ósseo e cartilagíneo,

associando-se a cola de fibrina à condrócitos (Homminga et al., 1998 e Gille et al., 2005),

lascas ósseas (Sawamura et al., 1999) e células tronco (Baumgartiner et al., 2009 e Kang

et al., 2009).

32

Entre os diversos procedimentos cirúrgicos que os selantes de fibrina têm sido

utilizados destacam-se: cirurgia cardiovascular (Kim, 1988), cirurgia torácica, (Mouritzen,

1993) cirurgias vasculares (Kim, 1988), cirurgia abdominal (Athanasiadis, 1984) e

neurocirurgia (Gnjidic, 1994; Van Velthoven, 1991; Lee, 1991). Nesta última, a cola de

fibrina vem sendo utilizada há mais de 20 anos e não induz danos ao sistema nervoso (de

Vries, et al., 2002). O selante de fibrina tem boa tolerância e poucas reações adversas têm

sido relatadas (Alving et al., 1995; Dunn e Goa, 1999). Portanto, os selantes podem reduzir

complicações em cirurgias, como hemorragias e deiscência, reduzir os tempos de operação

e reduzir a necessidade de operações adicionais resultantes de pós-operatório, como

complicações hemorrágicas.

Interessantemente, o veneno de serpentes Crotalus durissus terrificus contém

uma fração trombina-like ou trombina-símile demonstrada por Nahas et al. (1964) e isolada

por Raw et al. (1986). A fração trombina-símile possui a habilidade de transformar o

fibrinogênio diretamente em fibrina, produzindo afibrinogenemia em pacientes picados por

estas serpentes, aumentando o tempo de coagulação sanguínea. Assim, envenenamentos

causados por serpentes deste gênero podem causar grandes desordens na coagulação

sanguínea. (Thomazini, et al., 1991; Pereira, et al., 1995). Nesse âmbito, pesquisadores do

CEVAP- Unesp/Botucatu, produziram um selante de fibrina derivado do veneno da

cascavel.

A possibilidade de se produzir uma cola de fibrina, cujo fator polimerizador é

derivado do veneno de serpente, abre uma importante opção para utilização clínica, no

reparo de nervos periféricos e de lesões medulares. Têm-se como vantagens à cola

disponível no mercado, a possibilidade de formulação personalizada à necessidade da

cirurgia, levando-se em conta o tempo de coagulação necessário, bem como se pode

controlar o tempo de degradação do selante. Adicionalmente, seu custo de produção é mais

baixo, visto que a tecnologia é totalmente nacional. A possibilidade de obtenção de

formulações com variadas características também abre a possibilidade da associação do

selante de fibrina nacional com diferentes células potencialmente benéficas para o processo

regenerativo do sistema nervoso.

Apesar da cirurgia de reimplantação das raízes avulsionadas serem realizadas,

mesmo que de forma limitada na prática médica, ainda há a necessidade de

aperfeiçoamento cirúrgico, do desenvolvimento de estratégias que resultem em diminuição

33

de morte neuronal pós-lesão e direcionamento dos neuritos para repovoar as raízes

reimplantadas (Cullheim et al., 1999).

Nesse contexto, o presente estudo propõe o implante, com selantes de fibrina, para

o tratamento da avulsão de raízes ventrais, em busca de uma possível alternativa para

resgatar os motoneurônios lesados, com vistas à recuperação da função motora e o retorno

funcional.

34

2. Justificativa

35

Um dos grandes desafios da medicina e da neurologia atualmente tem sido vencer

a falta de regeneração espontânea do Sistema Nervoso Central (SNC) após a perda de

células nervosas e/ou a interrupção de seus prolongamentos. Sendo assim, a

impossibilidade de reparo eficiente de lesões no SNC é um importante problema médico e

motivo de preocupação no que se refere à recuperação morfológica e funcional. Embora

possa haver recuperação parcial das manifestações comportamentais, as melhoras

funcionais observadas após as lesões, são decorrentes de fenômenos de plasticidade

sináptica e não de reparo estrutural. Além disso, essa recuperação geralmente se mostra

incompleta e imperfeita. Esse fato tem contribuído e motivado um grande número de

investigações científicas sobre as inúmeras variáveis envolvidas no processo de

regeneração nervosa. Nesse âmbito, modelos experimentais de lesões têm sido estudados a fim de

melhor compreender os mecanismos envolvidos na sobrevivência neuronal e na

plasticidade sináptica. A utilização de modelos bem estabelecidos permite testar o potencial

de diferentes tratamentos a fim de prevenir as alterações induzidas por tais lesões. Neste

contexto, a avulsão de raízes motoras tem se mostrado um modelo experimental

reprodutível de degeneração de neurônios motores em ratos, em que se observa a morte

de cerca de 80% dos motoneurônios duas semanas após a lesão (Koliatsos et al., 1994; Li

et al., 1998). Por outro lado, os motoneurônios que sobrevivem à avulsão têm potencial

regenerativo após o reimplante das raízes, direcionando os neuritos para seu alvo correto

(Cullheim, 1999), no qual ocorre reinervação parcial.

A grande maioria dos esforços atuais, tanto científicos quanto clínicos, têm se

concentrado no desenvolvimento e na aplicação de estratégias visando à amenização das

consequências do dano ao SNC e a ampliação do potencial regenerativo dos neurônios

lesados. Nesse aspecto, o reimplante das raízes avulsionadas com o selante de fibrina tem

sido proposto e avaliado.

A utilização do selante de fibrina comercial na prática clínica já é conhecida e

bastante discutida. Por outro lado, o selante de fibrina, derivado de veneno de serpente e

fibrinogênio animal, tem se tornado uma ferramenta útil na prática médica devido a seu

rápido, fácil e barato processo de produção. Tendo-se em vista que a tecnologia empregada

na produção do referido selante é totalmente nacional e que a sua formulação pode ser

adequada às necessidades cirúrgicas específicas da avulsão, acreditamos que haverá

maior preservação do microambiente medular. Por ser um produto biológico bioativo, não

36

causa reações adversas nos pacientes, não usa sangue humano em sua constituição, não

transmite doenças infecciosas, não representa riscos toxicológicos para utilização interna,

reduz o tempo cirúrgico e melhora o pós-operatório, é altamente adesivo e pode ser

utilizado como adjuvante em procedimentos de sutura convencional e liberação de

fármacos (Barros et al., 2009).

Acreditamos que os presentes resultados servirão de base para o uso dos selantes

de fibrina na aceleração da reparação nervosa em geral, indicando a viabilidade de futuro

emprego clínico desta abordagem terapêutica, preenchendo uma importante lacuna nos

procedimentos reparativos, após este tipo de lesão.

37

3. Objetivos

38

3.1 - OBJETIVOS GERAIS

Investigar a eficácia do selante de fibrina derivado do veneno de serpente Crotalus

durissus terrificus, em comparação com o selante comercial, para o reimplante das raízes

motoras avulsionadas em ratos LEW/HsdUnib.

3.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Avaliar a sobrevivência neuronal nos períodos agudo e crônico, após avulsão e reimplante

das raízes com os selantes comercial e o produzido pelo CEVAP;

- Avaliar o número e parâmetros morfométricos referentes as fibras mielinicas em

regeneração do nervo isquiático de ratos, após avulsão de raízes motoras e seu reimplante.

- Avaliar, por imunoistoquímica, a integridade dos circuitos sinápticos, reatividade astroglial

e reatividade microglial, além da expressão de proteínas relacionadas ao processo

regenerativo axonal: neurofilamentos (presentes no citoesqueleto dos axônios), p75NTR

(pan receptor para neurotrofinas) e S100 (marcador de células de Schwann), nos animais

submetidos à avulsão e reimplante;

- Analisar a recuperação funcional dos animais avulsionados e reimplantados, através do

walking track test (Catwalk), até 12 semanas pós-cirúrgicas.

39

4. Material e Métodos

40

4.1 - GRUPOS EXPERIMENTAIS

Para este estudo foram utilizadas fêmeas adultas de ratos LEW/HsdUnib com dez

semanas de idade e peso corporal de aproximadamente 200g, obtidos do Centro

Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB) da Universidade Estadual de

Campinas. Os experimentos foram conduzidos seguindo-se as normas de ética na

experimentação animal e foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais

(CEUA-Unicamp – protocolo 3064-1). Todos os animais tiveram suas raízes nervosas

ventrais (L4, L5 e L6), na região da intumescência lombar do lado direito, avulsionadas

(n=5, por grupo experimental) e analisados com 4 e 12 semanas após a cirurgia. O lado

não avulsionado de cada animal foi utilizado como controle interno para análise dos

resultados. Foram utilizados os seguintes grupos experimentais:

1. Avulsão de raízes ventrais, sem reimplante;

2. Avulsão e reimplante de raízes ventrais com selante de fibrina derivado do veneno de

Crotalus durissus terrificus, na superfície da medula espinal;

3. Avulsão e reimplante de raízes ventrais com selante de fibrina comercial na superfície da

medula espinal.

As técnicas utilizadas nesse trabalho, bem como os grupos experimentais e tempos

de sobrevida após a lesão são indicado na tabela 1.

41

Tabela 1: Grupos experimentais e tempos de sobrevida após a avulsão das raízes ventrais

e técnicas utilizadas em cada grupo, bem como o objetivo de estudo de cada uma delas.

Grupos

experimentais

Sobrevida

após a lesão Técnica utilizada Objetivo de estudo

Avulsão

Avulsão +

Reimplante (CEVAP)

Avulsão +

Reimplante

(Comercial)

4 semanas

Imunoistoquimica - Sinaptofisina;

GFAP e Iba-1; Neurofilamento, S100

e p75NTR

Integridade dos circuitos sinápticos;

reatividade glial; expressão de

proteínas relacionadas ao processo

regenerativo axonal

Coloração de Nissl Sobrevivência Neuronal

Contagem e morfometria de fibras

mielínicas do nervo isquiático por

microscopia de luz

Regeneração nervosa

12 semanas

Coloração de Nissl Sobrevivência Neuronal

Contagem e morfometria de fibras

mielínicas do nervo isquiático por

microscopia de luz

Regeneração nervosa

Walking Track Test (Catwalk)* Recuperação funcional após a lesão

* A técnica em questão se extendeu por 12 semanas, até o sacrifício dos animais, para avaliar a recuperação funcional após

lesão.

4.2 - OBTENÇÃO DO SELANTE DE FIBRINA DERIVADO DO VENENO DE CROTALUS

DURISSUS TERRIFICUS

O selante de fibrina derivado de veneno de serpente foi gentilmente cedido pelo

Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos da UNESP (CEVAP), cujos

componentes e fórmula de aplicação constam das suas patentes (Números do registro:

BR1020140114327 e BR1020140114360). No momento do uso os componentes foram

previamente descongelados, reconstituídos, misturados e aplicados de acordo com o

protocolo do presente projeto (Thomazini-Santos et al., 2001; Barros et al., 2010 e 2011;

Gasparotto et al. 2014; Ferreira Junior 2014).

42

4.3 – OBTENÇÃO DO SELANTE DE FIBRINA COMERCIAL

O selante de fibrina comercial utilizado foi o Tissucol, produzido pela Baxter AG

(Viena – Áustria), seguindo-se a orientação de uso conforme bula.

4.4 - AVULSÃO DAS RAÍZES MOTORAS

Os animais de todos os grupos experimentais foram anestesiados com uma

combinação de xilazina (Kensol, 10mg/Kg, Koning, Argentina) e quetamina (Vetaset,

50mg/Kg, Fort Dodge, USA), na proporção 1:1, aplicada por via intraperitoneal na dose de

0,10 ml/100g de peso corporal e tricotomizados na região média do dorso. Uma incisão

paramediana à coluna vertebral foi realizada na região torácica. A musculatura eretora da

coluna vertebral foi afastada para exposição das últimas vértebras torácicas e primeiras

lombares. Foi feita a laminectomia de aproximadamente três vértebras para que a

intumescência lombar fosse exposta. A dura-máter foi aberta através de incisão longitudinal

e, após dissecção do ligamento denticulado, a medula espinal foi cuidadosamente

movimentada até que as raízes ventrais associadas à intumescência lombar fossem

identificadas e avulsionadas. A avulsão foi realizada nas raízes lombares ventrais

referentes aos segmentos espinais L4, L5 e L6 do lado direito, com o auxílio de uma pinça

tipo relojoeiro (№4). Após os procedimentos cirúrgicos, a medula espinal foi recolocada na

posição original e a musculatura, a fáscia e a pele foram suturadas em camadas. Os

animais foram mantidos em biotério por um período de 4 a 12 semanas, dependendo do

experimento.

4.5 - REIMPLANTE DAS RAÍZES MOTORAS

Os animais dos grupos experimentais II e III, tiveram as raízes ventrais

reimplantadas na medula espinal nos seus respectivos sítios de avulsão com a utilização

de um dos selantes de fibrina (Figura 5).

43

BA

Figura 5. Fotomicrografias obtidas na região dorsolateral da medula espinal em

microscópio de luz (contraste de fase em campo claro), evidenciando as raízes ventrais. A)

– Raiz ventral do lado contralateral a lesão, B) – Raiz ventral reimplantada - lado ipsilateral.

Observar as diferenças morfológicas da raiz reimplantada em comparação a raiz intacta

contralateral.

4.6 - AVALIAÇÃO MOTORA DA RECUPERAÇÃO FUNCIONAL

Foram realizadas avaliações motoras, duas vezes por semana, em todos os animais

dos grupos experimentais, antes da avulsão, até a 12° semana pós avulsão, através do

“walking track test” (CatWalk) (Figura 6). Os animais foram colocados para andar ao longo

de uma passarela com um assoalho de vidro (100 cm comprimento x 15 cm largura x 0.6

cm espessura) localizado em uma sala escura, com uma luz vermelha ambiente.

Uma luz fluorescente verde entra na borda longa do assoalho e é totalmente refletida

internamente. A luz realça apenas as áreas nas quais as patas dos animais entram em

contato com a placa de vidro. Devido à tecnologia de pegadas iluminadas, as patas são

capturadas por uma câmera de vídeo de alta velocidade (Fujinon DF6HA-1B) que está

posicionada embaixo da passarela. A câmera de vídeo transforma cada cena em uma

imagem digital. As imagens digitais são transferidas para o computador através de uma

conexão Ethernet. O brilho de um pixel depende da quantidade de luz recebida de tal área

pela câmera. Assim, a tecnologia de pegadas iluminadas permite que sejam detectadas até

mesmo diferenças de pressão, como resultado de como o animal distribui o seu peso

corporal nas quatro patas. Esta câmera digital possui uma taxa de amostragem de 100

quadros por segundo. Já a combinação da luz verde na placa de vidro e a luz vermelha no

44

teto iluminado torna o contorno do corpo do animal visível quando ele atravessa a placa de

vidro.

As capturas fornecidas pela câmera foram digitalizadas pelo PCImage-SG quadro à

quadro (Matrix vision GmH, Oppenheimer, Alemanha). O programa CatWalk adquiriu,

armazenou e analisou os vídeos dos animais caminhando pelo corredor. As medições

foram feitas de acordo com diferentes parâmetros:

1- Áreas compreendidas pela pegadas e tempo desprendido pelas pegadas.

2- Índice de recuperação motora (Índice funcional do nervo fíbular). As medições foram

feitas de acordo com os seguintes parâmetros: a distância entre o primeiro e o quinto

dedo (toe spread, TS), a distância entre o terceiro dedo e o calcanhar (print length,

PL). Estes parâmetros foram utilizados para a medição das pegadas das patas

posterior direita (lesada) e posterior esquerda (normal) e os valores foram plotados

na seguinte fórmula descrita por Bain et al. (1982): (E= lado lesionado, N=lado

normal). Onde PFI = Índice funcional do nervo fíbular.

45

Figura 6. Sistema ''CatWalk'’ (Walking Track Test). (A) - Imagem do equipamento com a

câmera de alta resolução em destaque no interior do círculo. (B) - Plataforma onde os ratos

realizaram as caminhadas. (D) e (E) - Sistema em funcionamento. Destaque para as

impressões plantares. (F) e (G) - Tela do software enquanto o teste está ocorrendo.

Destaque para os gráficos 3D e os resultados estatísticos fornecidos pelo sistema ao final

do teste. Fonte: http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/catwalk

http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/catwalk

46

4.7 - SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS

Após os períodos de sobrevida pré-determinados, os animais foram sacrificados.

Todos foram anestesiados com uma combinação de xilazina (Kensol, 10mg/Kg, Koning,

Argentina) e quetamina (Vetaset, 50mg/Kg, Fort Dodge, USA), na proporção 1:1, aplicada

por via intraperitoneal na dose de 0,10 ml/100g de peso corporal. Em seguida foram

submetidos à toracotomia. O sistema vascular foi perfundido transcardiacamente com

tampão fosfato de sódio (Salina; pH 7,38) seguido de solução fixadora, a qual dependeu da

técnica de avaliação dos resultados. Assim, os espécimes destinados à quantificação e

morfometria das fibras mielínicas, presentes no nervo isquiático, foram fixados com

glutaraldeído (2%) e paraformaldeído (1%) em tampão fosfato de sódio, pH 7,38 (Fixador

Karnovsky). Já os espécimes destinados à quantificação de motoneurônios sobreviventes,

bem como imunoistoquimica, foram fixados com formaldeído 10% em tampão fosfato de

sódio, pH 7,38 (Fxador Formalina).

4.8 - ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA DO NERVO ISQUIÁTICO

Após a perfusão (Salina + Karnovsky), os nervos isquiáticos direito e esquerdo dos

animais de todos os grupos foram expostos e dissecados. O terço médio do nervo, na região

posterior da coxa, foi retirado e mantido na mesma solução fixadora por 24 horas a 4ºC. Os

fragmentos foram, então, lavados em salina tamponada e pós fixados por um período de 3

horas em solução de tetróxido de ósmio a 1%, diluído em tampão fosfato de sódio, pH 7,38.

Seguindo-se à pós-fixação, os fragmentos foram lavados em água destilada e desidratados

em série crescente de álcool e acetona, sendo incluídos em resina (Durcupan, Fluka). Os

blocos foram desbastados e secções semifinas (0,5μm) foram obtidas e analisadas após

coloração com Sudan black em microscopia de luz. Cada secção (n=5 por grupo) foi

digitalizada em microscópio óptico (NIKON DXM 1200i), sendo escolhida a objetiva de 10x

para a observação da totalidade do nervo (determinação da área do nervo). Em seguida,

imagens sequenciais foram digitalizadas na objetiva de 100x, em um total de 12 a 18 fotos

por nervo de cada animal, de modo que fosse atingida uma área superior à 30% da

totalidade do nervo. As análises quantitativas foram realizadas em um sistema analisador

de imagens, com o software Adobe Photoshop CS5 (Figura 7), sendo que o número total

de axônios em cada nervo foi calculado a partir da somatória do número de axônios obtidos

47

no total de campos descritos acima. Para isso, foi estabelecida uma proporção entre este

valor e a área total do nervo, obtida em objetiva de 10x.

Figura 7. Fotomicrografia de corte transversal do nervo isquiático. Em (A), após a

montagem das micrografias em aumento de 100X, foi realizada a medida da área do nervo.

Em (B), utilizou-se aumento de 1000X para realizar a quantificação das fibras.

Para análise morfométrica, dois campos amostrados em cada nervo (objetiva de

100x) foram empregados para obtenção das medidas da morfometria, que foi realizada

48

utilizando-se o programa Adobe Photoshop CS5. As imagens foram transformadas em

preto e branco e então foi aplicado aplicada a ferramenta “limiar”. O background que não

seria medido, bem como as fibras que não apareciam inteiras na figura foram apagadas

(Figura 8). Todos os axônios foram selecionados de uma só vez através da ferramenta de

seleção apropriada e as medidas foram feitas automaticamente pelo programa, após

calibração do mesmo. As medidas que o programa forneceu foram: área da bainha de

mielina, perímetro da fibra e largura e altura da fibra. O menor diâmetro (altura) medido de

cada fibra foi utilizado para a determinação do diâmetro da fibra, uma vez que valores

maiores poderiam refletir ser distorcidos pela inclinação do corte. O diâmetro do axônio

(DA) foi calculado a partir da área da bainha de mielina. A diferença entre o DF e o DA

dividido por 2 foi empregada para obtenção da espessura da bainha de mielina (EBM) e a

razão entre DA e DF, foi usada para calcular a razão "g" (RZG) (RZG = DA/DF).

Figura 8. Imagem do nervo isquiático previamente editada (transformada em preto e

branco), em objetiva de 100x. Observar a ferramenta limiar usada (círculo à esquerda), bem

como os parâmetros morfométricos obtidos pelo programa referente ao axônio selecionado

(seta central): Perímetro da figura (Perímetro); Área correspondente à bainha de mielina

(Área); e Diametro mínimo da fibra mielínica (Height). O background e fibras que não

apareciam inteiras na imagem original foram apagadas.

49

4.9 – IMUNOISTOQUÍMICA

Após a perfusão (Salina + Formalina), a intumescência lombar, conjuntamente com

as raízes reimplantadas (quando houve reimplante), bem como os nervos isquiáticos ipsi e

contralaterais à lesão, foram expostos, dissecados e pós-fixados por 12 horas à 4ºC, na

mesma solução fixadora. Em seguida, foram incluídos em Tissue-Tek (Miles Inc., USA) e

congelados à temperatura de -33°a -40°C. Secções transversais da medula espinhal e

raízes, bem como cortes longitudinais dos nervos, com 12μm de espessura, foram obtidos

em criostato (Micron HM25) e posteriormente armazenados a –20ºC até o momento da

utilização.

Para a realização da imunohistoquímica, as lâminas foram inicialmente

climatizadas, lavadas com PB 0,1M (tampão fosfato) (3 lavagens de 5 minutos) e

posteriormente tratadas com BSA (albumina de soro bovino) 3% no mesmo tampão por 45

minutos. Em seguida, as lâminas foram incubadas por 4 horas, com os anticorpos (anti-

sinaptofisina, anti-GFAP, anti-Iba1, anti-neurofilamento, anti-p75NTR e anti-s100), todos

em BSA 1% e Triton 0,2% diluídos em PB 0,1M, e mantidas em câmara úmida à

temperatura ambiente. Após lavagens com PB 0,1M (3 x 5 minutos), foram adicionados os

anticorpos CY3 (Jackson Lab., USA), de acordo com a espécie onde foi produzido o

anticorpo primário, na proporção de 1:250, diluído em BSA 1% e Triton 0,2% em PB 0,1M

por 45 minutos em câmara úmida à temperatura ambiente. As lâminas foram novamente

lavadas em PB 0,1M, montadas em glicerol/PB 0,1 M (3:1) sendo posteriormente

analisadas.

50

Tabela 2: Anticorpos primários usados no ensaio de imunoistoquímica. Cada anticorpo é

seguido pelo fornecedor, animal hospedeiro, código do produto e concentração utilizada.

Anticorpo Fornecedor Hospedeiro Código do produto Concentração

Sinaptofisina Millipore Camundongo MAB5258 1/1500

GFAP Abcam Coelho AB779 1/250

Iba-1 Wako Coelho 019-19741 1/2000

Neurofilamento Millipore Coelho Ab1989 1/2000

S-100 Dako Coelho Z0311 1/2000

p75NTR Santa Cruz Cabra Sc6188 1/200

CY3 (Anti-Camundongo)

– secundário. Jackson Burro 715-165-150 1/250

CY3 (Anti-Coelho) –

secundário. Jackson Burro 711-165-152 1/250

CY3 (Anti-Cabra) –

secundário. Jackson Burro 705-165-003 1/250

As lâminas imunomarcadas foram observadas em microscópio de fluorescência

(Nikon, eclipse TS 100) utilizando-se os filtros de rodamina (CY3). Foi capturada uma

imagem representativa de cada lado (ipsi e contralateral) por corte (total de 3 cortes por

animal experimental, obtidos ao longo dos segmentos lesados) da coluna ventral da medula

espinal e do nervo isquiático, utilizando-se uma câmera de alta sensibilidade (Nikon, DXM

1200F).

Para a quantificação, a densidade integrada de pixels, que representa a intensidade

da imunomarcação das proteínas, foi medida utilizando-se o software IMAGEJ (versão

1.33u, National Institutes of Health, USA). A proporção de densidade integrada de pixels foi

51

calculada para cada animal e então estabelecida à média das proporções para cada grupo

± erro padrão.

4.10 - SOBREVIVÊNCIA NEURONAL

Para contagem de motoneurônios foram utilizadas as secções transversais da

intumescência lombar coradas com cresil violeta (coloração de Nissl). Os motoneurônios

presentes no núcleo motor lateral do corno anterior no lado ipsilateral (lesado) e

contralateral (não lesado) foram contados em cortes alternados de cada espécime em

aproximadamente 20 secções, na área lesada da intumescência lombar, sendo o intervalo

entre elas de 240μm. Apenas as células com núcleo visível foram contadas.

Para corrigir eventuais contagens duplas de neurônios, devido ao fato da mesma

célula poder estar presente em duas secções, foi utilizada a fórmula de Abercrombie e

Johnson (1946): N=nt/(t+d). Onde N é o número corrigido de neurônios contados, n é o

número de células contadas, t é a espessura das secções (48μm) e d é o diâmetro médio

do neurônio. Como a diferença no tamanho afeta significativamente o número de células, o

valor de d foi calculado especificamente para cada grupo experimental (ipsilateral e

contralateral). Neste sentido, o diâmetro de motoneurônios para cada grupo foi mensurado

(Image Tool software, versão 3.00) e a média calculada.

4.11 - ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS

A partir dos resultados numéricos resultantes de todas as análises, foram calculados

a média, o desvio padrão e o erro padrão para cada grupo. Os dados de sobrevivência

neuronal, imunoistoquimica e quantificação de fibras mielínicas foram avaliados pelo

método de análise da variância – ANOVA de uma via. Enquanto os dados da análise

funcional (walking track test) foram avaliados pelo método da análise da variância – ANOVA

de duas vias. Nos dois casos foi realizado o pós-teste Bonferroni. Assumiu-se um nível de

significância igual a *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001.

52

5. Resultados

53

5.1 - EFEITO NEUROPROTETOR DOS SELANTES DE FIBRINA - SOBREVIVÊNCIA

NEURONAL

O efeito neuroprotetor da técnica de reimplante de raízes avulsionadas foi analisado

determinando-se a porcentagem de sobrevivência neuronal, sendo esta a taxa percentual

entre o número de motoneurônios presentes no núcleo motor lateral do corno anterior no

lado ipsilateral (lesado) e contralateral (não lesado), utilizando-se a fórmula descrita por

Abercrombie e Johnson (1946), afim de corrigir eventuais contagens duplas de neurônios.

Nas figuras 9 e 10, é possível observar qualitativamente os motoneurônios do grupo

dorsolateral da medula espinal (A-D), em animais que sofreram avulsão; com 4 e 12

semanas pós lesão, respectivamente. Em (E) está representada quantitativamente a razão

ipsi e contralateral de todos os grupos experimentais.

Após 4 semanas (Figura 9), foi possível observar efeito neuroprotetor nos animais

avulsionados dos grupos onde houve reimplante, refletindo significativamente numa menor

perda neuronal em relação ao grupo onde houve somente a avulsão das raízes, apesar de

existir degeneração neuronal decorrente da lesão. Calculou-se então a razão percentual,

obtendo-se os seguintes resultados: avulsão (36,43% ± 1,82%; média±EP), implante com

selante fabricado pelo CEVAP (69,02% ± 4,77%; média±EP) e implante com selante

comercial (68,17% ± 6,37%; média±EP). Dados apresentados como média

(ipsilateral/contralateral) da porcentagem de sobrevivência neuronal e erro padrão.

Esse padrão neuroprotetor se manteve após 12 semanas da lesão (Figura 10),

onde a sobrevivência neuronal dos grupos com reimplante foi estatisticamente maior

quando comparados ao grupo somente avulsão. Calculou-se então a razão percentual,

obtendo-se os seguintes resultados: avulsão (29,69% ± 2,91%; média±EP), implante com

selante fabricado pelo CEVAP (61,74% ± 4,67%; média±EP) e implante com selante

comercial (54,06% ± 5,72%; média±EP). Dados apresentados como média

(ipsilateral/contralateral) da porcentagem de sobrevivência neuronal e erro padrão.

55

Figura 9. Fotomicrografias obtidas na região dorsolateral da medula espinal coradas com

cresil violeta (Coloração de Nissl), representando a sobrevivência neuronal, 4 semanas




ipsi e contralateral da sobrevivência dos motoneurônios medulares após a avulsão. Nota-

se uma maior sobrevivência neuronal após a avulsão das raízes nervosas nos grupos onde

houve o reimplante, não havendo diferença entre os tratamentos (** = p<0,01; n=5 para

cada grupo).

57

Figura 10. Fotomicrografias obtidas na região dorsolateral da medula espinal coradas com

cresil violeta (Coloração de Nissl), representando a sobrevivência neuronal, 12 semanas




ipsi e contralateral da sobrevivência dos motoneurônios medulares após a avulsão. Nota-

se uma maior sobrevivência neuronal após a avulsão das raízes nervosas nos grupos onde

houve o reimplante, não havendo diferença entre os tratamentos (** = p<0,01; n=5 para

cada grupo).

5.2 - ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA DO NERVO ISQUIÁTICO - REGENERAÇÃO

AXONAL

5.2.1 – CONTAGEM DO NÚMERO DE AXÔNIOS MIELÍNICOS

Imagens de microscopia de luz de cortes transversais de nervos isquiáticos corados

com Sudan black, dos diferentes grupos experimentais, 4 e 12 semanas após a lesão, estão

representadas nas Figuras 11 e 12, respectivamente. A quantificação do número de

axônios mielínicos está representada pelos gráficos respectivos (Figura 11F e 12F).

Após 4 semanas (Figura 11), foi possível observar que o número de axônios

mielínicos foi significativamente menor nos grupos onde houve a lesão, quando comparado

ao grupo controle, não havendo diferença significativa entre os tratamentos e o grupo

somente avulsão (contralateral – 9232 ± 204; média±EP; implante com selante fabricado

pelo CEVAP - 6765 ± 365; média±EP; implante com selante comercial - 7238 ± 274;

média±EP; avulsão - 6238 ± 166; média±EP). Dados apresentados como média do número

de fibras mielínicas e erro padrão.

Entretanto, após 12 semanas (Figura 12), foi possível observar que o número de

axônios mielínicos foi significativamente maior nos grupos onde houve o reimplante, quando

comparado ao grupo somente avulsão, evidenciando uma intensa regeneração axonal, não

havendo diferença significativa entre os tratamentos (contralateral – 7746 ± 357; média±EP;

implante com selante fabricado pelo CEVAP - 7625 ± 244; média±EP; implante com selante

comercial - 7570 ± 142; média±EP; avulsão – 5573 ± 355; média±EP). Dados apresentados

como média do número de fibras mielínicas e erro padrão.

58

Figura 11. Fotomicrografias de cortes transversais do nervo isquiático representativas dos

diferentes grupos experimentais, corados com Sudan Black, 4 semanas após a lesão. (A) -

Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado


59

grupo implante com selante comercial, (E) - Gráfico da quantificação do número de fibras

mielínicas (*** = p< 0,001; n=5 para cada grupo). Barra de escala = 10 µm.

60

Figura 12. Fotomicrografias de cortes transversais do nervo isquiático representativas dos

diferentes grupos experimentais, corados com Sudan Black, 12 semanas após a lesão. (A)

61

- Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado


grupo implante com selante comercial, (E) - Gráfico da quantificação do número de fibras

mielínicas (*** = p< 0,001; n=5 para cada grupo). Barra de escala = 10 µm.

No estudo morfométrico dos nervos, foram considerados os seguintes parâmetros:

Diâmetro mínimo das fibras mielínicas (DF), o qual corresponde ao axônio e a sua bainha

de mielina; Diâmetro mínimo dos axônios mielínicos (DA), correspondendo somente ao

axônio; Espessura da bainha de mielina (EBM) e Razão "G" (RZG), a qual foi obtida a partir

do quociente DA/DF.

Nota-se que no modelo de lesão utilizado nesse trabalho, somente as fibras motoras

do nervo isquiático são lesadas. No entanto, no momento de fazer as análises

morfométricas não é possível diferenciar as fibras motoras das sensitivas, o que diminui a

diferença entre os grupos uma vez que todas as fibras sensitivas estão intactas. Portanto,

a distribuição de frequência foi essencial para análise dos resultados, uma vez que as

médias poderiam mascarar os resultados.

O estudo de distribuição de frequência dos parâmetros mencionados, são descritos

nas Figuras 13-23, enquanto as médias e respectivos erros-padrão de cada grupo foram

colocadas em anexo, ao final da tese. (Tabelas 3 e 4).

5.2.2 – DIÂMETRO MÍNIMO DAS FIBRAS MIELÍNICAS (DF)

Com 4 semanas após a lesão, podemos observar que os grupos com reimplante e

o grupo somente avulsão, apresentaram histograma de distribuição de frequência do

diâmetro mínimo das fibras mielínicas, divergente em relação ao grupo controle, em

decorrência da lesão, onde notamos uma diminuição da quantidade de fibras de maior

calibre nesses grupos experimentais.

Os nervos do grupo contralateral, apresentaram fibras mielínicas com diâmetros

mínimos variando entre 1µm e 16µm, distribuídas de forma bimodal. Já o grupo somente

avulsão possui uma predominância de fibras com menores dimensões, entre 1 e 13 μm.

Quanto ao grupo reimplante com selante de fibrina do CEVAP, as fibras mielínicas

apresentaram o diâmetro variando entre 2µm e 15µm. Por fim, no grupo reimplante com

selante comercial, o DF variou entre 2µm e 14µm.

62

Figura 13. Histograma de distribuição de frequência referente ao diâmetro mínimo das

fibras mielínicas dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 4 semanas


avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado pelo CEVAP, (D)

- Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante comercial.

No entanto, com 12 semanas após a lesão, podemos observar que o grupo somente

avulsão, ainda apresentou histograma de distribuição de frequência do diâmetro mínimo

das fibras mielínicas, distinta em relação ao grupo controle, em decorrência da lesão, onde

notamos uma predominância de fibras de menor calibre (provavelmente sensitivas – não

afetadas pela lesão) nesse grupo experimental.

Os nervos do grupo contralateral, apresentaram fibras mielínicas com diâmetros

mínimos variando entre 2µm e 16µm, distribuídas de forma bimodal. Quanto ao grupo

reimplante com selante de fibrina do CEVAP, as fibras mielínicas apresentaram o diâmetro

variando entre 2µm e 16µm. Já no grupo reimplante com selante comercial, o DF variou

entre 2µm e 14µm. Por fim, no grupo somente avulsão, as fibras mielínicas apresentaram

o diâmetro variando entre 2µm e 16µm.

63

Figura 14. Histograma de distribuição de frequência referente ao diâmetro mínimo das

fibras mielínicas dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 12 semanas




5.2.3 – DIÂMETRO MÍNIMO DOS AXÔNIOS MIELÍNICOS (DA)

Com 4 semanas após a lesão, podemos observar que o grupo somente avulsão,

bem como os grupos com reimplante, apresentaram histograma de distribuição de

frequência do diâmetro mínimo dos axônios mielínicos, divergente em relação ao grupo

controle, em decorrência da lesão. Notamos uma leve tendência com deslocamento para a

esquerda nesses histogramas, com predominância de axônios de menor calibre

(provavelmente sensitivos – não afetados pela lesão) nesses grupos experimentais.

64

Os nervos do grupo contralateral, apresentaram axônios mielínicos com diâmetros

mínimos variando entre 1µm e 14µm. Quanto ao grupo reimplante com selante de fibrina

do CEVAP, os axônios mielínicos apresentaram o diâmetro variando entre 1µm e 12µm. Já

no grupo reimplante com selante comercial, o DA variou entre 1µm e 11µm. Por fim, no

grupo somente avulsão, os axônios mielínicos apresentaram o diâmetro variando entre 1µm

e 14µm.

Figura 15. Histograma de distribuição de frequência referente ao diâmetro mínimo dos

axônios mielínicos dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 4 semanas




Entretanto, com 12 semanas após a lesão, podemos observar que o grupo somente

avulsão, bem como os grupos com reimplante, apresentaram histograma de distribuição de

65

frequência do diâmetro mínimo dos axônios mielinizados, divergente em relação ao grupo

controle, em decorrência da lesão. Notamos uma leve tendência com deslocamento para a

esquerda nesses histogramas, com predominância de axônios de menor calibre

(provavelmente sensitivos – não afetados pela lesão) nesses grupos experimentais.

Todos os grupos experimentais apresentaram axônios mielínicos com diâmetros

mínimos variando entre 1µm e 13µm.

Figura 16. Histograma de distribuição de frequência referente ao diâmetro mínimo dos

axônios mielínicos dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 12 semanas




5.2.4 – ESPESSURA DA BAINHA DE MIELINA (EBM)

Com 4 semanas após a lesão, os histogramas de distribuição de frequência da

espessura da bainha de mielina, revelaram que todos os grupos avulsionados, apresentam

66

semelhança entre si e se diferenciam do grupo controle. Esses histogramas mostram-se

desviados para a esquerda, com pico em torno de 1µm. A mudança no padrão do

histograma é bastante sugestiva, indicando perda de fibras de grande calibre, compatíveis

com axônios dos motoneurônios avulsionados.

Figura 17. Histograma de distribuição de frequência referente a espessura da bainha de

mielina das fibras mielínicas dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 4




Interessantemente, os histogramas de distribuição de frequência da espessura da

bainha de mielina, 12 semanas após a lesão, revelaram que o grupo somente avulsão

permanece diferente do controle, tendo seu histograma desviado para a esquerda, com

pico em torno de 1µm. No entanto, os grupos com reimplante tendem a se assemelhar ao

grupo controle, principalmente o grupo reimplante com selante de fibrina produzido pelo

CEVAP.

67

Figura 18. Histograma de distribuição de frequência referente a espessura da bainha de

mielina das fibras mielínicas dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo),

12 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral

do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado pelo


5.2.5 – RAZÃO “g” (RZG)

A RZG é um parâmetro morfométrico que expressa à regeneração funcional do

nervo (Smith e Koles, 1970) e corresponde ao quociente DA/DF.

Com 4 semanas após a lesão, os histogramas de distribuição de frequência da RZG,

revelaram que todos os grupos avulsionados têm seus histogramas desviados para a

direita, com pico em torno de 0,8. A mudança no padrão do histograma é bastante

sugestiva, indicando que há predominância de fibras com bainha de mielina delgada.

68

Figura 19. Histograma de distribuição de frequência referente a razão “G” das fibras





Entretanto, após 12 semanas de lesão, os histogramas de distribuição de frequência

da RZG, revelaram que todos os grupos avulsionados mantiveram seu padrão. Houve

aumento das frequências de RZG maiores que 0,8 indicando eventual brotamento

compensatório de fibras, no grupo somente avulsão, e um grande número de fibras em

regeneração axonal, nos grupos com reimplante.

69

Figura 20. Histograma de distribuição de frequência referente a RZG das fibras mielínicas

dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 12 semanas após a lesão. (A)

- Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado

ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do

grupo reimplante com selante comercial.

Por fim, nossos resultados mais relevantes são mostrados nos gráficos abaixo. De

modo geral, ao analisarmos a porcentagem de fibras mielínicas com bainha de mielina

superior a 2µm de espessura, bem como o conjunto das distribuições da RZG na faixa de

0,7-0,9 e compararmos com evolução da lesão (4 semanas X 12 semanas), observamos

que o grupo somente avulsão, mantém seu padrão histomorfométrico, onde há um aumento

acentuado da porcentagem de fibras mielínicas com bainha de mielina fina, em decorrência

da lesão.

Interessantemente, no grupo reimplante com selante produzido pelo CEVAP, 12

semanas após lesão, nota-se um aumento da porcentagem de fibras mielínicas com bainha

mais espessa, sugerindo uma possível regeneração axonal.

70

Figura 21. Análise da porcentagem da espessura da bainha de mielina, bem como a RZG,

nos diferentes grupos experimentais, ao longo do tempo. (A) - Porcentagem de fibras

mielínicas com bainha de mielina superior a 2µm de espessura, 4 semanas após lesão. (B)

- Porcentagem de fibras mielínicas com bainha de mielina superior a 2µm de espessura, 12

semanas após lesão. (C) - Porcentagem de fibras mielínicas na faixa de 0,7-0,9 de RZG, 4

semanas após lesão. (D) - Porcentagem de fibras mielínicas na faixa de 0,7-0,9 de RZG,

12 semanas após lesão.

5.2.6 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS POR MEIO DE DOTPLOT – RZG X

DIÂMETRO MÍNIMO DO AXÔNIO

A distribuição dos valores do diâmetro mínimo dos axônios no grupo contralateral obteve

um padrão heterogêneo. Nos grupos lesionados, os axônios apresentaram diâmetros

menores e foram pouco mielinizados (observar a razão “G”). Esses dados podem ser

71

melhor visualizados nas figuras 22 e 23, na qual foi representada a razão “G” relacionada

ao diâmetro mínimo do axônio.

Figura 22. Relação da razão “G” com o diâmetro mínimo do axônio, dos diferentes grupos

experimentais (n=5 para cada grupo), 4 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do

grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo


selante comercial.

72

Figura 23. Relação da razão “G” com o diâmetro mínimo do axônio, dos diferentes grupos

experimentais (n=5 para cada grupo), 12 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do



selante comercial.

73

5.3 - REDUÇÃO DO PROCESSO DE ELIMINAÇÃO SINÁPTICA, AVALIADA ATRAVÉS

DA EXPRESSÃO DE SINAPTOFISINA

Para avaliar as alterações na atividade sináptica, após avulsão das raízes ventrais,

foi feita análise imunoistoquímica da presença da proteína sinaptofisina, no núcleo motor

lateral da coluna anterior da medula espinal, 4 semanas após a lesão.

A imunomarcação revelou maior densidade sináptica no lado contralateral dos

animais avulsionados, em relação ao ipsilateral. Destaca-se a marcação adjacente à

superfície celular dos grandes motoneurônios que compõem o núcleo motor. Observou-se

uma intensa reatividade nessa área, a qual foi atribuída ao grande número de inputs aos

motoneurônios não lesados (contralaterais) em relação aos lesados. Em contraste ao lado

contralateral, a intensidade da expressão de sinaptofisina foi drasticamente reduzida na

superfície dos motoneurônios axotomizados dos animais sem implante, indicando uma

grande diminuição do número de terminais em aposição a estes neurônios. Porém,

observou-se significativa diferença na expressão de sinaptofisina entre os lados ipsilateral

dos grupos que tiveram a raiz avulsionada reimplantada, quando comparados aos grupos

avulsão (Figura 24). Foi feita uma avaliação quantitativa, onde se calculou a razão

percentual da densidade integrada de pixels entre os lados ipsi e contralateral de cada

grupo: (implante com selante fabricado pelo CEVAP – 66,98% ± 5,81%; média±EP;

implante com selante comercial – 72,02% ± 3,81; média±EP; avulsão – 41,53% ± 3,85%;

média±EP). Dados apresentados como média da razão ipsi/contralateral da densidade

integrada de pixels (intensidade da imunomarcação) e erro padrão.

75

Figura 24. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lamina IX do corno ventral da

medula espinal marcada com anti-sinaptofisina, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado




da média da densidade integrada de pixels. Note-se grande redução na expressão de

sinaptofisina, resultado de pequena cobertura sináptica nestes neurônios, após a avulsão

das raízes nervosas (** = p<0.01; n=5 para cada grupo). Barra de escala = 50µm.

5.4 - REATIVIDADE GLIAL

Para avaliação da reativiade glial após 4 semanas do reimplante, foram utilizados

anticorpos anti-GFAP, para análise da astrogliose reativa (Figura 25), bem como anti-Iba-

1, para análise da reatividade microglial (Figura 26). A imunomarcação revelou reatividade

basal para o lado contralateral de todos os grupos.

A marcação com GFAP demonstrou aumento significativo na atividade dos

astrócitos após a lesão, visto pela presença de astrogliose reativa e pelo incremento de

GFAP concentrada, particularmente, ao redor dos neurônios avulsionados (Figura 25). Foi

feita uma avaliação quantitativa, onde se calculou a razão percentual da densidade

integrada de pixels entre os lados ipsi e contralateral de cada grupo: (implante com selante

fabricado pelo CEVAP – 185,4% ± 31,27%; média±EP; implante com selante comercial –

199,7% ± 23,47%; média±EP; avulsão – 254,0% ± 21,59%; média±EP). Dados

apresentados como média da razão ipsi/contralateral da densidade integrada de pixels

(intensidade da imunomarcação) e erro padrão. A análise estatística não revelou diferenças

entre os grupos experimentais.

77


medula espinal marcada com anti-GFAP, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral




densidade integrada de pixels. Note-se nos lados ipsilaterais, a forte presença astrogliose

reativa circunjacente aos motoneurônios, após a avulsão das raízes nervosas, não havendo

diferença entre grupos experimentais (n=5 para cada grupo). Barra de escala = 100µm.

Paralelamente, a reatividade da microglia mostrou aumento da imunomarcação para

anti-Iba-1 no lado lesado, mostrando células microgliais reativas em íntimo contato com

motoneurônios avulsionados (Figura 26). Foi feita uma avaliação quantitativa, onde se

calculou a razão percentual da densidade integrada de pixels entre os lados ipsi e

contralateral de cada grupo: (implante com selante fabricado pelo CEVAP – 357,9% ±

65,0%; média±EP; implante com selante comercial – 302,9% ± 88,73%; média±EP; avulsão

– 481,7% ± 56,90%; média±EP). Dados apresentados como média da razão

ipsi/contralateral da densidade integrada de pixels (intensidade da imunomarcação) e erro

padrão. A análise estatística não revelou diferenças entre os grupos experimentais.

79


medula espinal marcada com anti-Iba-1, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral




densidade integrada de pixels. Note-se nos lados ipsilaterais, a forte presença de microglia

reativa próxima aos motoneurônios, após a avulsão das raízes nervosas, não havendo

diferença entre grupos experimentais (n=5 para cada grupo). Barra de escala = 100µm.

5.5 - EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RELACIONADAS AO PROCESSO REGENERATIVO

AXONAL

Para avaliação da expressão de proteínas relacionadas ao processo regenerativo

axonal, após 4 semanas da lesão, foram utilizados anticorpos anti-Neurofilamento

(presentes no citoesqueleto dos axônios), anti-p75NTR (pan receptor para neurotrofinas) e

anti-S100 (marcador de células de Schwann), nos animais submetidos à avulsão e

reimplante. A imunomarcação revelou reatividade basal para o lado contralateral de todos

os grupos.

A marcação anti-neurofilamento não demonstrou diferenças significativas na

expressão de neurofilamento presente no axônio, após a lesão, entre os grupos

experimentais (Figura 27). Foi feita uma avaliação quantitativa, onde se calculou a razão

percentual da densidade integrada de pixels entre os lados ipsi e contralateral de cada

grupo: (contralateral – 5125% ± 405,1%; média±EP; implante com selante fabricado pelo

CEVAP – 4287% ± 440,0%; média±EP; implante com selante comercial – 3608% ± 86,95%;

média±EP; avulsão – 4393% ± 403,4%; média±EP). Dados apresentados como média da

razão ipsi/contralateral da densidade integrada de pixels (intensidade da imunomarcação)

e erro padrão.

80

Figura 27. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica de cortes longitudinais do nervo

isquiático marcado com anti-neurofilamento, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado




81

da média da densidade integrada de pixels. Não houve diferença entre grupos

experimentais (n=5 para cada grupo). Barra de escala = 100µm.

Por outro lado, a marcação anti-S100 revelou um aumento da atividade das células

de Schwann após a lesão, em todos os grupos experimentais (Figura 28). Foi feita uma

avaliação quantitativa, onde se calculou a razão percentual da densidade integrada de

pixels entre os lados ipsi e contralateral de cada grupo: (contralateral – 3913% ± 443,2%;

média±EP; implante com selante fabricado pelo CEVAP – 6237% ± 754,8%; média±EP;

implante com selante comercial – 4579% ± 510,4%; média±EP; avulsão – 8882% ± 1362%;

média±EP). Dados apresentados como média da razão ipsi/contralateral da densidade

integrada de pixels (intensidade da imunomarcação) e erro padrão.

82


isquiatico marcado com anti-S100, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do




densidade integrada de pixels. Note-se nos lados ipsilaterais, uma intensa marcação das

83

células de Schwann, após a avulsão das raízes nervosas (* = p<0.5; ** = p<0.01; n=5 para


Por fim, a marcação anti- p75NTR, demonstrou um aumento de pan receptores para

neurotrofinas, em todos os grupos experimentais e significativamente no grupo reimplante

com selante commercial (Figura 29). Foi feita uma avaliação quantitativa, onde se calculou

a razão percentual da densidade integrada de pixels entre os lados ipsi e contralateral de

cada grupo: (contralateral – 464,5% ± 146,1%; média±EP; implante com selante fabricado

pelo CEVAP – 2286% ± 788,1%; média±EP; implante com selante comercial – 3266% ±

403,9%; média±EP; avulsão – 1509% ± 626,5%; média±EP). Dados apresentados como

média da razão ipsi/contralateral da densidade integrada de pixels (intensidade da

imunomarcação) e erro padrão.

84


isquiatico marcado com anti-p75NTR, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do


85



densidade integrada de pixels. Note-se nos lados ipsilaterais, uma intensa marcação de

pan receptores para neurotrofinas, após a avulsão das raízes nervosas (p<0,01; n=5 para


5.6 - AVALIAÇÃO MOTORA DA RECUPERAÇÃO FUNCIONAL

A avaliação motora da recuperação funcional dos grupos experimentais foi estudada

através do aparelho “walking track test” (CatWalk), até a 12° semana após a lesão.

A figura 30A demonstra os valores médios quanto ao índice funcional do fibular nos

diferentes grupos experimentais e momentos da avaliação funcional. Para calcular o índice

funcional do fibular, utilizamos dois parâmetros: a distância entre o primeiro e o quinto dedo,

bem como entre o terceiro dedo e o calcanhar. Na análise intergrupos verifica-se que, no

pré-operatório, todos os grupos apresentam função normal, porém, a partir da 1° semana

pós-operatório, esses valores diminuíram significativamente, indicando perda funcional em

ambos os grupos. No grupo no qual só ocorreu avulsão esses valores permaneceram

baixos e estáveis até a última semana de experimentação, não indicando nenhuma

melhora, quando comparado ao pré-operatório. Já no grupo onde houve o reimplante

utilizando os selantes de fibrina, os valores foram subindo gradativamente ao longo do

tempo, indicando uma melhora funcional. Após 12 semanas pós-lesão, os grupos onde

houve o reimplante, apresentaram médias significativamente mais altas (implante com

selante fabricado pelo CEVAP: -144.58 ± 24,38; média±EP e implante com selante

comercial: -134,74 ± 21,03; média±EP) quando comparado com o grupo somente avulsão

(-242,14 ± 12,42; média±EP), usando-se a fórmula descrita por Bain et al. (1989). Dados

apresentados como média (ipsilateral/contralateral) e erro padrão.

Por outro lado, também foi analisada a área compreendida pela pegadas, bem como

o tempo disposto por elas (Figuras 30B e 30C). Neste caso, foi feita a análise dos registros

das pegadas das patas normal (N) e experimental (E), observando-se também uma

evolução positiva dos grupos onde houve o reimplante quando comparado com o grupo

somente avulsão, durante os diferentes períodos de avaliação. Na comparação dos

registros das pegadas no período pré-operatório, pode-se observar que não houve

diferença significativa entre os grupos. Por outro lado, após 12 semanas, nota-se uma

86

diferença entre as pegadas neste diferente período de avaliação, mostrando significativo

grau de recuperação funcional nos grupos com reimplante. Nesse sentido, os grupos onde

as raízes foram reimplantadas mostraram suportar melhor o peso do corpo sobre a pata

lesada. Com relação a área das pegadas, obtivemos os seguintes resultados: (Somente

avulsão = 3,08 ± 2,14; média±EP; implante com selante fabricado pelo CEVAP – 30,71 ±

9,69; média±EP; implante com selante comercial - 30,62 ± 10,22; média±EP). Já em

relação ao tempo disposto ao apoio, obtivemos os seguintes resultados: (Somente avulsão

= 8,51 ± 4,56; média±EP; implante com selante fabricado pelo CEVAP – 51,32 ± 7,78;

média±EP; implante com selante comercial - 50,53 ± 9,03; média±EP). Dados

apresentados como média (ipsilateral/contralateral) e erro padrão.

Figura 30: Análise da função motora dos animais com doze semanas após a lesão.

Observar a recuperação motora dos animais que, após sofrerem avulsão das raízes

87

ventrais, tiveram o reimplante das mesmas realizado com os selantes de fibrina. A) Gráfico

construído com a razão ipsi/contralateral referente aos valores do índice funcional do fibular

aferido até 12 semanas pós-operatórias (n=7; **=p<0,01). B) Gráfico construído com a

razão ipsi/contralateral referente aos valores da área da pegada aferida até 12 semanas

pós-operatórias (n=7; *= p<0,5). C) Gráfico construído com a razão ipsi/contralateral

referente aos valores do tempo da pegada aferida até 12 semanas pós-operatórias (n=7;

**=p<0,01).

88

6. Discussão

89

6.1 - REIMPLANTE E SOBREVIVÊNCIA NEURONAL

A degeneração de motoneurônios medulares e alterações medulares podem ser

induzidas experimentalmente através da avulsão de raízes ventrais medulares (ARV), onde

ocorre uma abrupta separação dos filamentos radiculares, com a superfície da medula

espinal (Carlstedt, 2008 e 2009), levando os axônios motores, a serem axotomizados na

interface entre o SNC e SNP (Livesey e Fraher, 1992). Sabe-se que a ARV, desencadeia

morte de aproximadamente 80% dos motoneurônios durante as duas primeiras semanas

após a lesão, segundo Koliatsos et al. (1991) e Piehl et al. (1995 e 1998). Nesse aspecto,

nosso estudo permite concluir que o reimplante das raízes, utilizando os selantes de fibrina,

teve grande importância na neuroproteção.

Em nosso trabalho, após quatro semanas da lesão, obtivemos um menor índice de

morte neuronal nos grupos com reimplante, onde cerca de 70% dos motoneurônios

sobreviveram à lesão, evidenciando a significativa eficiência do reimplante no resgate

desses neurônios acometidos pela lesão. Nossos resultados mostraram que o reimplante

das raízes com os selantes de fibrina propostos, preservaram um número significativo de

motoneurônios quando comparado ao grupo somente avulsão, nos tempos de experimento

propostos (4 e 12 semanas). Ressaltamos que não houve diminuição significativa em

relação ao número de motoneurônios, quando se compara a 12ª semana com a 4ª semana,

indicando que ambos os efeitos neuroprotetores agudos se mantém ao longo do tempo,

refletindo na manutenção de elevada sobrevivência neuronal.

Interessantemente, ratos Wistar analisados 16 semanas após ARV demonstraram

sobrevivência de 27% dos motoneuronios no grupo avulsionado e de 53% no grupo que foi

realizado implante (Eggers et al., 2010). No entanto, esse autor demonstra que o implante

retarda, porém não previne completamente a neurodegeneração. Hallin e colaboradores

(1999) sugeriram que a sobrevivência de motoneurônios após reimplante ventral de C4-C5

em macacos foi devido aos fatores neurotróficos pela raiz implantada e pela persistente

abertura da barreira hemato-encefálica que permite substâncias tróficas nos motoneuronios

lesados (Risling et al., 1989; Sjögren et al., 1991; Frisén et al. 1993). Esse dado é

corroborado por Vejsada et al. (1995) que demonstraram que, caso a conexão entre o corpo

celular e o alvo não seja restabelecida em animal adulto, os fatores neurotróficos não são

capazes de manter a sobrevivência de motoneurônios lesados por longos períodos.

90

6.2 - REIMPLANTE E A PLASTICIDADE SINÁPTICA

A maioria dos motoneurônios injuriados axotomizados proximalmente reduzem o

tamanho dos ramos dendríticos (Linda et al., 1992; Chu e Wu, 2009) e conexão neurônios

vizinhos, por sinapses excitatórias (Linda et al., 2000; Chu e Wu, 2009). Essas mudanças

morfológicas deixam a célula em situação de pausa funcional, visando e reparo (Cullheim

et al., 2002; Chu e Wu, 2009).

Em nosso estudo,

A perda de inputs sinápticos no corpo neuronal acontece preferencialmente para os

inputs excitatórios, deixando as células sob influência inibitória durante o processo de

reparo. Esses eventos mostram uma mudança no metabolismo nos motoneurônios

injuriados, passando este do papel de elemento final para a atividade via motora para o

estado onde o principal objetivo é sobreviver e produzir novos axônios (Carlstedt, 2009).

Os motoneurônios que sofreram injúrias estão destinados à morte como resultado

do aumento de sensibilidade às influências excitatórias, assim, pode-se resgatar um

significativo número de motoneurônios através da redução de efeitos excitatórios (Mentis

et al., 1993; Greensmith e Vrbová, 1996). Em nosso caso, onde as fibras aferentes primárias

permanecem intactas, a recuperação de inputs inibitórios mostra-se essencial, para

minimizar os efeitos tóxicos do glutamato. Através dos resultados de sobrevivência obtidos,

somados à significativa preservação da imunomarcação anti-sinaptofisina, podemos

concluir que o reimplante com cola de fibrina é adequado para o reparo da ARV, mantendo

os circuitos medulares estabilizados e numa proporção inibição/excitação compatível com

a preservação dos neurônios em regeneração.

6.3 - REIMPLANTE E REATIVIDADE GLIAL E PROCESSO REGENERATIVO AXONAL

Na avulsão, ocorre degeneração de axônios motores, perda de sinapses,

deterioração de conexões locais segmentares, morte de células nervosas e reações em

células não neuronais, com a formação de cicatriz inibidora do crescimento axonal, a

chamada cicatriz glial (Carlstedt, 2008).

Um obstáculo provável para a regeneração advém do desenvolvimento da cicatriz

astroglial, que possui papel fundamental na falha dos axônios centrais regenerarem

91

eficientemente após a lesão. Isso difere do SNP, cujos axônios, dadas condições do

microambiente, regeneram com relativa facilidade (Kandel, 2000). No caso da avulsão de

raízes nervosas, o axônio deve regenerar inicialmente dentro do SNC, atravessando a

cicatriz glial formada na margem da medula até encontrar a saída do SNC através da raiz

ventral e então regenerar seu axônio rumo à reinervação do alvo através do SNP. Isso

contrasta com axônios periféricos que não encontram obstáculos à regeneração, desde que

a continuidade entre os cotos esteja preservada ou seja restaurada cirurgicamente

(neurorrafias associadas ou não a enxertos).

Adicionalmente, processos astrocitários no local da injúria também impedem a

regeneração (Fraher, 1998). Regeneração, sem intervenção externa, parece ocorrer em

certa medida, pelo menos em situações específicas. Um exemplo são os próprios axônios

dos motoneurônios medulares que, mesmo em pequena porcentagem conseguem

atravessar o funículo anterior, em direção à zona de transição (Fraher, 1998). Após a

transecção experimental no gato, alguns destes axônios se regeneraram através da cicatriz

glial, no SNC e repovoam raízes ventrais (Risling et al 1983, 1992, 1993; Carlstedt et al

1988; Fraher, 1998).

Dado que axônios motores têm que transpor uma longa distância para reinervar seu

alvo, a sobrevivência à longo prazo é essencial. Assim, manter o nível de fatores tróficos é

crucial para a sobrevivência do motoneurônio durante a regeneração. Fatores tróficos que

podem melhorar o brotamento em motoneurônios e aumentam a probabilidade de um

axônio se associar com células de Schwann na periferia. Idealmente, os fatores que

proporcionam efeitos quimiotáticos ou neurotróficos para os axônios podem orientá-los para

regenerar em direção ao alvo (Chu e Wu, 2009).

Adicionalmente aos fatores neurotróficos, um grupo de moléculas essenciais para o

crescimento de neuritos e, consequentemente para a sobrevivência dos motoneurônios

após uma lesão proximal, são os componentes da matriz extracelular. No nervo periférico,

tem sido atribuído à laminina um importante papel na aderência do cone de crescimento,

durante a elongação do axônio. Desta forma, a presença da laminina é um fator

preponderante para a capacidade regenerativa do neurônio. Interessantemente, ocorre

uma regulação positiva da produção de receptores para as lamininas (integrinas) no caso

da avulsão de raízes ventrais (Hammarberg et al., 2000).

92

6.4 - REIMPLANTE E REGENERAÇÃO NERVOSA E RECUPERAÇÃO FUNCIONAL

Além de concluirmos que o reimplante teve grande importância na neuroproteção,

também demonstramos que o reimplante utilizando os selantes de fibrina propostos,

também possibilitaram a regeneração axonal e, consequentemente, a recuperação

funcional, mostrando mais uma vez, a eficácia de tais selantes.

A análise com quatro semanas após o reparo das raízes avulsionadas, revelou que

em todos os grupos experimentais (exceto o grupo controle), houve diminuição acentuada

do número de axônios mielínicos, indicando morte neuronal retrógrada e degeneração

Walleriana acarretada pela lesão (Koliatsos et al., 1994). Entretanto, na análise com doze

semanas pós lesão, obtivemos um maior número de axônios mielínicos, nos grupos onde

houve o reimplante, quando comparado ao grupo somente avulsão. Os dados sugerem a

ocorrência de regeneração das fibras motoras, nos grupos experimentais onde houve o

reimplante, diferentemente do grupo somente avulsão, que apresentou um significativo

menor número de axônios mielínicos, decorrente da lesão, quando comparado aos demais

grupos. É importante ressaltar, nesse contexto, que os valores obtidos referentes ao

número de axônios mielínicos presentes no nervo isquiático, para o grupo controle, coincide

com a literatura (Schamalbruch, 1986).

Adicionalmente à contagem de axônios mielínicos, analisamos diferentes

parâmetros morfométricos; diâmetro das fibras nervosas (DFM), diâmetro dos axônios

(DAM), espessura da bainha de mielina (EBM) e a razão “g” (RZG).

Em relação ao DFM e DAM, nossos resultados indicaram que o grupo avulsão

apresentou fibras nervosas e axônios com menores dimensões, comparativamente àqueles

do grupo controle e implantado, representados na distribuição de frequência. Já em relação

ao grupo controle, os diâmetros médios das fibras nervosas e axônios, foram compatíveis

com a literatura (Schamalbruch, 1986). Foi importante analisar principalmente as fibras de

maiores dimensões, tendo-se em vista que nosso modelo de lesão, a avulsão ventral,

somente acomete os axônios motores (de grande calibre). Neste sentido, o grupo com

implante mostrou-se intermediário e o grupo somente avulsão apresentou o padrão mais

destoante em relação ao normal.

A EBM é um parâmetro relacionado à recuperação funcional do nervo, tendo sido

utilizada na avaliação da evolução do processo regenerativo axonal por diversos autores

93

(Levi e Bunge, 1994; Oliveira, 2000; Oliveira e Langone, 2000; Pierucci et al.,2008). A

espessura da bainha de mielina é uma indicação direta da recuperação funcional do nervo,

já que está relacionada com o nível de atividade fisiológica das células de Schwann. Por

outro lado, a RZG é um parâmetro que reflete a relação entre o diâmetro do axônio e o

diâmetro da fibra nervosa e está relacionado à condução do impulso nervoso, refletindo a

maturação das fibras regeneradas, sendo que os valores de normalidade, comumente

descritos estão na faixa 0,5-0,7. Razões abaixo de 0,5 indicam uma super mielinização do

axônio, enquanto razões acima de 0,7 indicam submielinização axonal. Essa razão é

utilizada como parâmetro morfométrico que expressa a relação da célula de Schwann e

axônio, bem como reflete uma maior ou menor distância entre os nós de Ranvier (Rushton,

1951; Smith e Koles, 1970; Waxman, 1980).

Nossos resultados indicaram uma distribuição desigual em relação a todos os

grupos, embora a média da EBM não tenha diferido significativamente entre os grupos. Isso

pode ser justificado pelo fato que a lesão feita (avulsão de raiz ventral), afeta somente as

fibras motoras, sendo que as fibras sensitivas estão intactas. Desse modo, a média poderia

mascarar o resultado (Schamalbruch, 1986). Em nosso trabalho, todos os grupos

apresentam, na média, a RZG dentro da normalidade (0,5-0,7). Sendo assim, os dados de

RZG obtidos para o grupo avulsão+implante, sugerem que a velocidade da condução

nervosa estaria próxima da normalidade. Embora haja diferenças entre o grupo implantado

ao se comparar com o controle, essas estão respectivamente menores do que o grupo que

somente sofreu avulsão.

Por fim, em nosso estudo, os grupos que utilizaram os selantes de fibrina,

apresentaram melhora significativa da função motora, ao longo das 12 semanas após a

lesão, além de um diferente padrão funcional intergrupos ao longo do tempo, pela avaliação

das áreas das pegadas, tempo de apoio das mesmas, além do cálculo do índice funcional

do nervo fibular. Esses dados foram obtidos através do “walking track test” (CatWalk).

A avaliação da área da pegada e do tempo disposto a ela, mostrou um diferente

padrão funcional intergrupos ao longo do tempo. No grupo somente avulsão, os valores

diminuíram e se mantiveram baixos, enquanto nos grupos onde houve reimplante, houve

um aumento significativo ao longo do tempo, indicando melhora.

A comparação entre os grupos apontou que os valores do índice funcional fibular,

no período pré-operatório, estiveram dentro dos padrões de normalidade, caracterizando a

94

funcionalidade normal. A partir da 1ª semana pós-lesão, houve queda desses valores,

tornando-se inferiores à -200, em ambos os grupos, caracterizando perda funcional total do

membro posterior ipsilateral à lesão. Em nosso trabalho, somente os grupos onde houve o

reimplante, apresentaram melhora significativa do índice funcional do nervo fibular, ao longo

das 12 semanas após a lesão.

Essas análises nos fornecem dados confiáveis sobre a recuperação funcional de

animais com alterações de motricidade (Dijkstra et al., 2000) e é um método não invasivo,

de baixo custo e quantitativo (Dijkstra et al., 2000; Varejão et al., 2001; Monte-Raso et al.,

2006).

A melhora motora observada nos animais é importante, pois a locomoção é

necessária para a restauração de unidades motoras, sensibilidade e córtex cerebral. Além

disso, mostra que a estratégia de reimplantação foi bem sucedida, promovendo condições

para o retorno funcional do músculo (Monte-raso, 2006).

Como achado fundamental de nosso estudo, destacamos a eficácia do selante de

fibrina do CEVAP, que demonstra sua qualidade e aplicabilidade médica, com todas as

vantagens que o mesmo apresenta. Dentre elas, ser um produto nacional, reflexo de

intensos anos de pesquisa, é fator de destaque, pois é um dos poucos exemplos bem

sucedidos de desenvolvimento de drogas brasileiras. Sua natureza não hemoderivada

também é relevante, pois facilita a obtenção de seu componentes, bem como afasta a

possibilidade de importantes contaminações virais.

Acreditamos fortemente que a técnica de reimplante de raízes medulares com o

selante de fibrina do CEVAP possa ser futuramente transferida para a clínica, o que será

de um ganho significativo para os pacientes portadores dessa lesão, otimizando a

recuperação funcional e minimizando eventos de dor neuropática e excitotoxicidade.

95

7. Conclusões

96

- Em conjunto, nossos resultados indicam que o selante de fibrina derivado do

veneno de Crotalus durissus terrificus, bem como o selante de fibrina comercial

(Tissucol), utilizados para o reimplante de raízes medulares são similarmente eficientes,

reimplantando as raízes avulsionadas de forma eficaz, sem deiscência, sendo

neuroprotetores e promovendo melhora motora.

Os resultados aqui apresentados sugerem que o implante das raízes ventrais com

os selantes de fibrina, resultaram em:

- Neuroproteção, observada pela sobrevivência neuronal.

- Regeneração axonal, observada pela quantificação de axônios.

- Melhor recuperação funcional

Como os selantes possuem características próprias, seu manuseio foi diferenciado.

O selante produzido nacionalmente, devido ao tempo de coagulação personalizado,

mostrou-se mais prático, sendo possível reconectar as raízes no ponto exato onde foram

avulsionadas, mais facilmente. O selante comercial, por não ter tempo de coagulação

personalizado, tem seu manuseio mais complicado.

Os presentes resultados podem ajudar na prática clínica, com uma técnica mais

eficiente para o reparo de lesões por avulsão de raízes nervosas. A utilização de ambos os

selantes trouxe resultados inéditos e promissores, contribuindo para o futuro emprego

clínico de ambos, nessa abordagem terapêutica.

97

8. Referências

98

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107

9. Anexo

108

Tabela 3: Valores médios do diâmetro mínimo das fibras mielÍnicas, diâmetro

mínimo do axônio, espessura da bainha de mielina e razão "G" nos diferentes grupos


padrão. Grupos DF (µm) DA (µm) EBM (µm) Razão “G”

Controle 6,62 ± 0,50 4,10 ± 0,53 1,26 ± 0,08 0,60 ± 0,03

Avulsão 6,31 ± 0,46 4,34 ± 0,52 0,98 ± 0,06 0,68 ± 0,03

Cevap 7,02 ± 0,28 5,12 ± 0,21 0,95 ± 0,11 0,71 ± 0,02

Comercial 6,54 ± 0,12 4,46 ± 0,14 1,04 ± 0,06 0,68 ± 0,02

Tabela 4: Valores médios do diâmetro mínimo das fibras mielÍnicas, diâmetro

mínimo do axônio, espessura da bainha de mielina e razão "G" nos diferentes grupos


padrão. Grupos DF (µm) DA (µm) EBM (µm) Razão “G”

Controle 7,67 ± 0,36 5,00 ± 0,43 1,33 ± 0,06 0,64 ± 0,03

Avulsão 7,81 ± 0,17 5,70 ± 0,17 1,05 ± 0,05 0,72 ± 0,01

Cevap 7,53 ± 0,32 5,15 ± 0,38 1,20 ± 0,05 0,68 ± 0,02

Comercial 6,95 ± 0,46 4,83 ± 0,50 1,06 ± 0,11 0,68 ± 0,04

“estudo comparativo do emprego de...selantes de fibrina são utilizados em uma vasta gama de...

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