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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E

PARASITÁRIOS

ANÁLISE DA EXPRESSÃO DOS GENES DAS CITOCINAS IL-2 E

TNF-α EM MODELO EXPERIMENTAL ANIMAL INFECTADO COM O

VÍRUS MAYARO (TOGAVIRIDAE: ALPHAVIRUS)

ALESSANDRA DA CONCEIÇÃO MIRANDA SANTOS

Belém-Pará

2013


ANÁLISE DA EXPRESSÃO DOS GENES DAS CITOCINAS IL-2 E

TNF-α EM MODELO EXPERIMENTAL ANIMAL INFECTADO COM O

VÍRUS MAYARO (TOGAVIRIDAE: ALPHAVIRUS)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal do Pará como requisito para

obtenção do grau de Mestre em Biologia de Agentes

Infecciosos e Parasitários.

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Ana Cecília Ribeiro Cruz.

Belém-Pará

2013


ANÁLISE DA EXPRESSÃO DO GENE DA IL-2 E TNF-α EM MODELO

EXPERIMENTAL ANIMAL INFECTADO COM O VÍRUS MAYARO

(TOGAVIRIDAE: ALPHAVIRUS).

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos

e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como

requisito para obtenção do grau de Mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Ana Cecília Ribeiro Cruz

Instituto Evandro Chagas

Banca Examinadora: Prof.ª Dr.ª Edna Cristina Santos Franco


Prof. Dr. José Antônio Picanço Diniz Júnior


Prof. Dr. Luiz Fernando Almeida Machado

Instituto de Ciências Biológicas – ICB/UFPA

Prof.ª Dr.ª Daniele Barbosa de Almeida Medeiros

(Suplente)


Aprovada em:___/___/___

Conceito:_____

Belém, 30 de Abril de 2013.

EPÍGRAFE

“Um homem nunca sabe aquilo de que é capaz até que o tenta fazer.”

(Charles Dickens).

DEDICATÓRIA

“Ao meu pai, tias-mães e irmã que fizeram dos meus sonhos sua luta;

ao meu marido e filho por todo amor, compreensão e incentivo; aos meus

amigos e familiares, pelo carinho e apoio constantes e a Deus porque sem

Ele nada seria possível".

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus pelo dom da vida, por seu infinito amor que me guia

em todos os momentos da minha vida e pela realização de mais sonho.

Ao meu Pai, Edilson da Silva Miranda, minha tia, Oscarina da Silva Miranda e a

minha irmã, Renata da Conceição Miranda, pelo apoio, confiança e paciência, elementos

fundamentais que me permitiram hoje está a onde estou. Obrigado por todo amor, carinho e

proteção que vocês me proporcionam.

Aos meus Tios e Tias, Primos e Primas, por todo apoio, palavra de incentivo e gestos

de compreensão que me deram. Obrigada pela família maravilhosa que vocês são.

Ao meu marido, José Alberto Baptista Santos Junior (Jota), pelo companheirismo,

paciência, compreensão, amor e carinho que me dedica. Obrigada por fazer parte da minha

vida e me permitir fazer parte da sua.

Ao meu filho Lucas, hoje com apenas sete meses, e dono de um amor que não cabe em

mim. Obrigada por existir em minha vida e dar a ela o sentido que só você pôde dar. Te amo

mais que tudo e para sempre, você foi sem dúvida a melhor coisa que me aconteceu durante

este curso!

À Professora Dr.ª Ana Cecília Ribeiro Cruz, pela orientação ao longo desses anos, que

me permitiram crescimento pessoal e profissional. Obrigada pela atenção, confiança,

paciência e dedicação para a realização desse trabalho.

À equipe do Laboratório de Biologia Molecular da Secção de Arbovirologia e Febres

hemorrágicas do Instituto Evandro Chagas: Cleiton e Maira, pela amizade e paciência com

que me ensinaram as técnicas de biologia molecular; José Wilson Jr, pelo apoio e trabalho na

inoculação dos isolados em camundongos e dissecação para extração dos órgãos dos animais;

Antônio Gregório Dias Jr; pela colaboração e sugestões no trabalho e execução das técnicas

de RT-qPCR; Samir Casseb, pelo companheirismo, incentivo e execução das técnicas de

biologia molecular; e Natália do Vale e Maria Natividade pela amizade e incentivo durante a

realização desse trabalho.

À Pesquisadora Eliana Pinto da Silva pela colaboração nos experimentos de titulação

em células Vero; A pesquisadora Milene Ferreira e ao pesquisador Basílio pelas inoculações

dos isolados em camundongos.

A todos os funcionários do biotério da Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas

(SAARB) do Instituto Evandro Chagas, pelo apoio no fornecimento e manutenção dos

animais de laboratório.

A todos os funcionários, contratados e estagiários da SAARB do Instituto Evandro

Chagas, pela amizade apoio e incentivo na realização deste trabalho.

Ao Instituto Evandro Chagas por permitir que este trabalho fosse desenvolvido em

seus laboratórios.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq), pela

concessão da bolsa de estudos.

A Universidade Federal do Pará, em especial ao Programa de Biologia de Agentes

Infecciosos e Parasitários, pela oportunidade de cursar o mestrado em Biologia de Agentes

Infecciosos e Parasitários.

Aos professores do curso de mestrado do programa de Biologia de Agentes

Infecciosos e Parasitários, pelos conhecimentos transmitidos.

À minha turma de mestrado, pela amizade ao longo dos vários meses de disciplinas.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS 8

RESUMO 9

ABSTRACT 10

1. INTRODUÇÃO 11

1.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE O ARBOVÍRUS 11

1.2. FAMÍLIA TOGAVIRIDAE 15

1.3. GÊNERO ALPHAVIRUS 16

1.4. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE O VÍRUS MAYARO 19

1.4.1. Modo de Transmissão 20

1.5. Breve Histórico e Epidemiologia 20

1.6. Manifestação Clinica 22

1.7. Patogenia e Resposta Imunológica 23

1.8. Diagnóstico, Tratamento e Prevenção 25

1.5. RELEVÂNCIA DO TRABALHO 27

1.6. OBJETIVOS 28

1.6.1. Objetivo Geral 28

1.6.2. Objetivos Específicos 28

2. MATERIAL E METODOS 29

2.1. AMOSTRAS VIRAIS 29

2.2. PREPARAÇÃO DO ESTOQUE VIRAL I 30

2.3. TITULAÇÃO VIRAL EM CELULA VERO 31

2.4. PREPARAÇÃO DO ESTOQUE VIRAL II 32

2.5. TITULAÇÃO VIRAL EM CAMUNDONGO 32

2.6. EXPERIMENTO 33

2.6.1. Critérios de Inclusão e Exclusão de Animais no Experimento 33

2.6.2. Dose Infectante 33

2.6.3. Colheita e Preparação do Material para Análise 33

2.7. TESTES VIROLÓGICOS 33

2.8. EXPRESSÃO DE RNA MENSAGEIRO PARA DETECÇÃO DE

CITOCINAS POR TRANSCRIÇÃO REVERSA E REAÇÃO EM CADEIA

MEDIADA PELA POLIMERASE EM TEMPO REAL (RT-qPCR)

USANDO SISTEMA SYBR GREEN 35

2.8.1. Análise da Expressão de mRNA de IL-2, TNF-α e GAPDH 35

2.9. ANÁLISE ESTATÍSTICA 36

3. RESULTADOS 37

3.1. CONFIRMAÇÃO DA INFECÇÃO POR MAYV 37

3.2. ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE mRNA DE IL-2, TNF-α E GAPDH 39

4. DISCUSSÃO 48

5. CONCLUSÕES 52

8. REFERENCIAS BIBLIOGÁFICAS 53

ANEXO 1 59

ANEXO 2 60

ANEXO 3 61

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Ciclo de manutenção dos Arbovírus em natureza -------------------------------- 11

Figura 2 - Esquema do genoma dos integrantes da família Togaviridae (Alphavirus) -- 16

Figura 3 - Esquema do genoma de RNA dos Alphavirus ----------------------------------- 18

Figura 4 – Localização do município de Santa Bárbara no Estado do Pará -------------- 29

Figura 5 - Produto de RT-PCR, em gel de agarose a 1,5% corado por SYBR® Safe,

de amostras de camundongos infectados via subcutânea com o MAYV, após 24 horas

de infecção -------------------------------------------------------------------------------------

37



de infecção ----------------------------------------------------------------------------------------- 37



de infecção ---------------------------------------------------------------------------------------- 38

Figura 8 – Curva de amplificação do experimento de RT-qPCR para determinação da

expressão de mRNA das citocinas IL-2, TNF-α e GAPDG (gene endógeno) em

camundongos infectados após 24horas com o MAYV pela via subcutânea nos

fragmentos de cérebro, fígado, rim e músculo esquelético --------------------------------- 40

Figura 9 - Curva padrão da RT-qPCR demonstrando a eficiencia da reação para o

gene GAPDH - ------------------------------------------------------------------------------------ 41


gene IL-2 -- ---------------------------------------------------------------------------------------- 41


gene TNF-α ---------------------------------------------------------------------------------------- 42

Figura 12 – Curva de dissociação com amplificação do gene endógeno (GAPDH) em


fragmentos de cérebro, fígado, rim e músculo esquelético -------------------------------- 43

Figura 13 – Curva de dissociação com amplificação do gene da citocina IL-2 em



Figura 14 – Curva de dissociação com amplificação do gene da citocina TNF-α em



Figura 15 – Diferença em porcentagem da expressão de gene da IL-2 nos órgãos e

tecido muscular infectados com o MAYV com 48 e 72 horas após infecção ------------ 45

Figura 16 – Diferença em porcentagem da expressão de gene da IL-2 nos órgãos e

tecido muscular infectados com o MAYV com 48 e 72 horas após infecção ------------ 46

RESUMO

O Mayaro vírus (MAYV) é um vírus considerado endêmico na Amazônia brasileira e

enzoótico na América do Sul onde é amplamente distribuído. Diversos surtos têm sido

descritos ao norte do Brasil e diagnosticado de forma endêmica no Estado do Para. O objetivo

deste trabalho foi analisar a expressão de RNA mensageiro das citocinas IL-2 e TNF-α em

camundongos (Mus musculus) recém-nascidos infectados experimentalmente via subcutânea

com o MAYV. A cepa selecionada foi proveniente de um caso humano de Febre do Mayaro

oriundo do surto ocorrido em fevereiro de 2008, no município de Santa Bárbara, no Estado do

Pará. O vírus foi inoculado na região dorsal dos camundongos com 0,02 mL de suspensão

viral a 10% contendo 10-9,5

DL50/0,02 mL da cepa. Após a infecção experimental, em

intervalos de 24, 48 e 72 horas, três camundongos infectados com a cepa e três camundongos

não infectados (controle negativo) foram anestesiados, eutanasiados e necropsiados, sendo os

fragmentos do cérebro, fígado, rim e músculos esqueléticos extraídos para a análise da

expressão de citocinas por RT-qPCR. Nas análises dos três primeiros dias após infecção,

todos os fragmentos em estudo (cérebro, fígado, rim e músculo esquelético) e em todos os

intervalos de tempo (24, 48 e 72 horas) foram confirmados por RT- PCR com infecção pelo

MAYV. A expressão de mRNA das citocinas IL-2 e TNF-α utilizando a técnica de RT-qPCR

não apresentou variação estatisticamente significativa nos órgãos e tecido muscular

selecionados no intervalo de tempo de 24 horas, no cérebro foi observada redução

significativa de expressão dos genes da IL-2 e TNF-α após 48 horas de infecção; no rim um

aumento de expressão do gene IL-2 após 48 e 72 horas de infecção, porém redução de

expressão do gene TNF-α no mesmo período; o fígado não apresentou variação de expressão

gênica em nenhum dos genes alvo em todos os intervalos de tempo, já o músculo esquelético,

teve aumento significativo de expressão dos genes da IL-2 e TNF-α, após 48 e 72 horas de

infecção, sugerindo que tais citocinas pró-inflamatórias podem ter um papel fundamental na

patogêneses das doença artralgênicas.

Palavra-Chave: Arbovírus; Expressão Gênica; Camundongo como animal de laboratório.

ABSTRACT

Mayaro virus (MAYV) is widely distributed and considered to be endemic in

Brazilian Amazon and enzootic in South America. On this regard, several outbreaks have

been reported in northern Brazil and diagnosed in the state of Pará. The aim of this study was

to analyze the expression of mRNA of IL-2 and TNF-α in newborn mice (Mus musculus) that

were via subcutaneous experimentally infected with MAYV. The strain was selected from a

human case of MAYV fever outbreak in Santa Barbara municipality, State of Pará, Brazil, in

February 2008. The virus was inoculated in the dorsal region of the mice with 0.02 ml of 10%

viral suspension containing 10 to 9.5 LD50/0.02 ml. After experimental inoculation, at

intervals of 24, 48 and 72 hours, three infected and three uninfected mice (negative control)

were anesthetized, sacrificed and necropsied and fragments from brain, liver, kidney, skeletal

muscles were extracted for analysis of cytokine expression by RT-qPCR. In the analyzes of

the first three days after infection, all fragments under study (brain, liver, kidney and skeletal

muscle) and at all time intervals were confirmed to be infected by RT-PCR. The mRNA

expression of IL-2 and TNF-α, using the technique of RT-qPCR, showed no statistically

significant change in those investigated organs within 24 hours post-infection. By the other

hand, it was observed a significant reduction of genes IL-2 and TNF-α at 48 hours after

infection in brain. In kidney extracts, there was an increase in expression of IL-2 after 48 and

72 hours post-infection, but reduced expression of TNF-α at the same period. Regarding liver,

it could not be observed any change in gene expression in any of the target genes at all time

intervals. And finally, skeletal muscle had a significant increase in gene expression of IL-2

and TNF-α after 48 and 72 hours post infection, suggesting that these pro-inflammatory

cytokines may play a key role in the pathogenesis arthrogenic of disease.

Keyword: Arboviruses; Gene Expression; Mouse as a laboratory animal.

11

1. INTRODUÇÃO

1.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE OS ARBOVÍRUS

O termo arbovírus refere-se a vírus transmitidos por artrópodes e deriva da expressão

inglesa “arthropod borne”, formado pela primeira sílaba de cada palavra acrescida da palavra

vírus. Constituem um grupo heterogêneo de vírus de acordo com suas propriedades físico-

químicas, porém com características epidemiológicas em comum. São considerados arbovírus

os vírus mantidos em natureza através da transmissão biológica entre hospedeiros vertebrados

suscetíveis por artrópodes hematófagos, principalmente mosquitos e carrapatos, ou por

transmissão transovariana e possivelmente venérea em artrópodes (Figura 1) (Levinson &

Jawetz, 2005; Azevedo et al., 2007; Vasconcelos et al., 2009).

Figura 1- Ciclo de manutenção dos Arbovírus em natureza.

Fonte: Adaptado de Azevedo et al., 2007.

A transmissão envolve uma complexa interação entre o vírus, o vetor artrópode e o

hospedeiro vertebrado, determinada por diversos fatores, como a habilidade do vetor de se

tornar infectado e de transmitir o vírus a um hospedeiro vertebrado, dependendo de fatores

genéticos, concentração viral no hospedeiro infectado, ambiente, temperatura e barreiras do

intestino, servindo como vetores de manutenção ou de disseminação, amplificando o vírus

com suas altas taxas de infecções e baixas taxas de transmissão, compensada por sua eclética

variedade alimentar de espécies de hospedeiros vertebrados. Já nos hospedeiros vertebrados, a

12

replicação deve ser suficiente para que os mesmos sirvam de fonte de infecção para os

hospedeiros invertebrados no momento do repasto sanguíneo, garantindo deste modo a

infecção dos vetores artrópodes. Além disso, o tamanho populacional dos vertebrados

suscetíveis é grande o suficiente para promover o contato com outros artrópodes, assim um

único hospedeiro serve como fonte de infecção para muitos artrópodes, tornando-os uma fonte

de amplificação viral em situações epidêmicas (Calisher, 1998; Vasconcelos et al., 2009).

Os vertebrados susceptíveis são infectados ao serem picados por insetos portadores de

arbovírus, os quais são capazes de se multiplicar e produzir viremia nos vertebrados, fase na

qual, novos vetores se infectam ao realizarem o repasto sanguíneo, tornando-se aptos a

infectarem novos hospedeiros vertebrados suscetíveis após um período de incubação

extrínseco, que representa o intervalo decorrido entre a ingestão do sangue e o momento em

que o mosquito é capaz de transmitir o vírus. Este período caracteriza-se pela replicação do

vírus nos tecidos do inseto, inclusive nas glândulas salivares, permanecendo o inseto

infectado por toda a sua existência (Azevedo et al., 2007; Vasconcelos et al., 2009).

Os arbovírus possuem ampla distribuição geográfica, abrangendo todos os continentes,

tanto em regiões tropicais quanto temperadas, com exceção da Antártida, porém com nítida

predominância nas regiões tropicais devido às condições climáticas e ecológicas favoráveis a

manutenção do ciclo viral, que comportam uma maior biodiversidade que favorece a

coexistência de grandes diversidades de vetores e hospedeiros vertebrados em toda época do

ano, diferentemente dos países de clima temperado, no qual o ciclo é interrompido durante a

estação do inverno reiniciando-se durante a primavera ou verão (Dégallier et al., 1990;

Figueiredo, 2007; Vasconcelos et al., 2009).

Atualmente, os arbovírus constituem o maior grupo conhecido de vírus, sendo

registrados 537 tipos diferentes de arbovírus segundo o “International Catalogue of

Arboviruses, Including Certain Other Viruses of Vertebrates”. No Brasil já foram

reconhecidos 210 tipos diferentes de arbovírus, dos quais, 197 foram isolados na Amazônia e

pelo menos 34 deles causam doenças em humanos de forma esporádica, endêmica e/ou

epidêmica, sendo freqüentemente associadas a surtos em seres humanos. As arboviroses

podem constituir importantes problemas de saúde pública e econômico-financeiro em todos os

continentes com exceção da Antártida. São conhecidas mais de 100 espécies de arbovírus por

causarem doenças no homem, 40 deles infectam animais domésticos e, pelo menos, vinte

causam epidemias. Entre os arbovírus conhecidos no Brasil, 37 têm sido incriminados como

causadores de doença humana, dentre estes, cinco destacam-se por estarem associados a

epidemias: Dengue virus, Febre amarela virus, Mayaro virus, Oropouche virus e Rocio.

13

Vírus. Apesar de ser baixo o número de arbovirus com potencial epidêmico, os impactos

sociais e econômicos dos surtos são importantes, os quais têm sido responsáveis por mais de

95% dos casos de arboviroses humanas no Brasil (Karabatson, 1985; Vasconcelos et al.,

1992; Travassos da Rosa et al., 1997; Gubler, 2004; Vasconcelos et al., 2009).

A classificação dos arbovírus pode ser feita de acordo com suas propriedades

antigênicas ou segundo suas características físico-químicas. De acordo com as propriedades

antigênicas, são classificados em grupos antigênicos segundo testes sorológicos como fixação

do complemento (FC), inibição de hemaglutinação (IH) e teste de neutralização (TN), assim

quando dois ou mais vírus apresentam cruzamento sorológico, passam a constituir um grupo

antigênico. Os três primeiros grupos caracterizados foram designados pelas letras: A, B e C, e

os demais receberam nomes do primeiro vírus isolado no respectivo grupo. Com base em suas

propriedades físico-químicas, os arbovírus estão distribuídos em cinco famílias: Bunyaviridae

(gênero Orthobunyavirus e Phebovirus), Flaviviridae (gênero Flavivirus), Reoviridae (gênero

Orbivirus), Rhabdoviridae (gênero Vesiculovirus e Lyssavirus) e Togaviridae (gênero

Alphavirus), ressaltando-se que nem todos os gêneros das citadas famílias são

necessariamente arbovírus. Em geral, recebem o nome conforme a doença que causam (ex.:

Febre amarela virus - FAV) ou de acordo com o lugar onde foram primeiramente isolados

(ex.: Encefalite St. Louis vírus - ESLV) (Casals, 1967; Karabatson, 1985; Vasconcelos et al.,

2009).

Todos arbovírus possuem genoma constituído por ácido ribonucléico (RNA), exceto o

vírus da peste suína africana que possui genoma de ácido dexoribonucléico (DNA). O RNA

dos arbovírus pode ser segmentado ou não e, apresentar-se com uma ou duas fitas

nucleotídicas. Os arbovírus com genomas não segmentados estão incluídos nas famílias

Flaviviridae, Rhabdoviridae e Togaviridae enquanto aqueles com genomas segmentados

incluem-se nas famílias Bunyaviridae e Reoviridae (Quadro 1) (Travassos da Rosa et al.,

1997; Vasconcelos et al., 2009).

A presença do envoltório lipoprotéico (envelope) nos vírus pertencentes às famílias

Rhabdoviridae, Bunyaviridae, Flaviviridae, e Togaviridadae determina a acentuada

sensibilidade aos solventes lipídicos (éter e clorofórmio), e a detergentes (desoxicolato de

sódio) dos membros destes grupos, enquanto que representantes da família Reoviridae, que

não apresentam este envoltório, são pouco sensíveis (ou resistentes) aos mesmos. Em geral, os

arbovírus são lábeis em pH ácido e estáveis em pH alcalino, podendo serem rapidamente

inativados à 56 ºC ou em temperaturas mais elevadas, porém são bem preservados quando

14

mantidos à temperatura de –70 ºC ou, se liofilizados e mantidos à temperatura de – 20 ºC

(Pinheiro et al., 1997; Vasconcelos et al., 2009).

Quadro 1 - Características gerais das famílias com arbovírus segundo algumas características

físíco-químicas.

Fonte: Adaptado de Levinson & Jawetz, 2005.

O quadro clinico das doenças causadas por arbovírus varia de branda até fatal em um

breve período de tempo, sendo a diversidade das manifestações clínicas uma peculiaridade

das arboviroses. Diferentes tipos de arbovírus podem determinar a mesma sintomatologia, ou

determinado tipo de arbovírus pode ocasionar respostas clinicas diferentes. Usualmente são

consideradas quatro formas clínicas principais de arboviroses: doença febril indiferenciada,

doença febril exantemática, febre hemorrágica e encefalites (Azevedo et al., 2007).

Apresentada praticamente por todos os arbovírus patogênicos ao humano, a doença

febril indiferenciada possui período de incubação variando de três a oito dias, entre sinais e

sintomas mais comuns temos febre, calafrios, cefaleia, mialgias, artralgia, tonturas, fotofobia,

dor epigástrica, dor retrorbitária, náuseas, vômitos, astenia, inapetência e congestão

conjuntival. Na doença febril exantemática, além de febre e das manifestações sistêmicas,

observa-se em 80% dos pacientes exantema maculopapular no tronco e membros inferiores e

superiores. A virose se apresenta em curso bifásico, primeiramente com um período febril que

perdura de um a três dias, e a segunda fase com reaparecimento da febre e surgimento do

exantema e artralgias que aparecem com grande intensidade podendo persistir por até quatro

meses. Tais características clinicas são reportadas nas infecções ocasionadas pelos Virus

Chikungunya (CHIKV), Mayaro (MAYV), Oropouche (OROV) e Dengue(DENV). A febre

hemorrágica, os arbovírus responsáveis por tais fenômenos em seres humanos pertencem as

famílias Togaviridae, Flaviviridae e Bunyaviridae, porém no Brasil o vírus da febre amarela e

15

da dengue são os únicos já registrados. As encefalites, a forma mais grave de apresentação

clínica das arboviroses em humanos, podendo levar à morte ou deixar sequelas graves nos

pacientes, são eles arbovírus das famílias Togaviridae, Flaviviridae e Bunyaviridae (Pinheiro

et al., 1997; Travassos da Rosa et al., 1997; Vasconcelos et al., 2009).

Praticamente todos os arbovírus são patogênicos para camundongos neonatos, adultos,

hamsters e cobaias. Porém, animais recém-nascidos são os mais vulneráveis, enquanto que os

animais jovens e adultos, de modo espontâneo ou dependendo do título do inóculo se

sobrepõe a natural resistência do adulto. Porém, quadros lesionais também se instalam de

modo semelhante aos vistos em animais imaturos. Dentre os achados histopatológicos,

destacam-se: lesões de células conjuntivas jovens ou pouco diferenciadas dos interstícios e de

membranas conjuntivas as quais são encontradas em vários órgãos e tecidos, como pulmão,

rim, cório de mucosas, derme, polpa dentária, miocárdio, músculos esqueléticos, pericôndrio e

periósteo; lesões no tecido muscular estriado, com alterações ocorrendo no interstício, onde

há dissociação das fibras musculares por edema intersticial, observam-se ainda detritos

celulares de células conjuntivas necrosadas; pode haver ainda envolvimento simultâneo de

músculo cardíaco e esquelético ou apenas miocardite ou miosite; além de tendinites (Dias,

1986).

1.2. FAMÍLIA TOGAVIRIDAE

A família Togaviridae compreende dois gêneros: os Alphavirus, que possuem 30

espécies de arbovírus do grupo A de acordo com a classificação sorológica (Tabela 1), e os

gêneros Rubivirus, cujo membro não pertencem aos arbovírus (Vasconcelos et al., 2009;

ICTV, 2012).

Estruturalmente, possui diâmetro de aproximadamente 65 a 70 nm e nucleocapsídeo

variando de 35 a 40 nm de diâmetro com simetria icosaédrica (T = 4), composto de doze

capsômeros pentaméricos e 30 hexaméricos para um total de 240 proteínas do capsídeo. Sua

superfície é circundada por envoltório lipoprotéico com dupla camada, onde se observa 80

trímeros de espículas, projeções que variam de 6,5 a 10 nm de comprimento e possuem os

heterodímeros E1 e E2 (Figura 2). Seu genoma é constituído de RNA de fita única, linear, de

polaridade positiva com aproximadamente 11700 nucleotídeos distribuídos por oito genes, os

quais codificam proteínas não estruturais (nsP1 à nsP4) que estão envolvidas na replicação

viral; proteínas estruturais do envoltório (glicoproteinas E1 e E2) e do capsídeo, além de

16

pequenos polipeptídios E3 e 6Ks (Casals & Whitman 1957; Azevedo et al., 2007;

Vasconcelos et al., 2009; Viral Zone, 2010; ICTV, 2012).

Figura 2 - Esquema do genoma dos integrantes da família Togaviridae

(Alphavirus). Fonte: Adaptado de Viralzone, 2010.

1.3. GÊNERO ALPHAVIRUS

Os membros do gênero Alphavirus podem causar uma grande variedade de doenças

em humanos e animais. São causas importantes de doenças encefálicas e artrogênica em seres

humanos , sendo considerados como umas das principais causas de doença debilitante por

artrite no mundo. A capacidade desse grupo de vírus de causar epidemias extensas de

poliartritre e artralgia, associada a sintomas crônicos, tornam a infecção por estes vírus, uma

doença de grande significado socioeconômico. Muitos vírus do Velho Mundo, incluindo o

Ross River (RRV), Barmah Forest, Mayaro, o'nyongnyong, Chikungunya e Sindbis virus

(SINV), apresentam como manifestação clinica a artralgia, enquanto que as encefalites são

causadas pelos vírus do Novo Mundo como Encefalite Eqüina do Oeste virus (WEEV),

Encefalite Eqüina do Leste virus (EEEV) e Encefalite Eqüina Venezuelana virus (VEEV)

(Powers et al., 2001; Herreroa et al., 2011).

Como um gênero, os Alphavirus são amplamente distribuídos por todo o mundo,

habitando todos os continentes, exceto na Antártida, sendo mantidos em ciclos naturais que

envolvem transmissão por um vector artrópode para hospedeiros vertebrados suscetíveis.

Porém, as distribuições geográficas de espécies individuais são prejudicadas devido as

condições ecológicas específicas e restrições de vetor e hospedeiro reservatório, já que as

interações vírus-hospedeiro podem ser altamente específicas, e, por vezes, apenas uma única

espécie de mosquito é utilizada como vector principal, como tem sido relatado para muitos

17

vírus complexos como o Encefalite Equina Venezuelana virus (EEV), limitando assim a

distribuição de muitos Alphavirus (Powers et al., 2001).

Tabela 1: Taxonomia dos vírus da família Togaviridae, gênero Alphavirus, segundo o

Comitê Internacional de Taxonomia Viral (ICTV, 2012).

Família Gênero Espécie

Togaviridae Alphavirus

Aura vírus

Barmah Forest virus

Bebaru virus

Cabassou virus

Chikungunya virus

Eastern equine encephalitis virus

Everglades virus

Fort Morgan virus

Getah vírus

Highlands J virus

Madariaga virus

Mayaro virus

Middelburg virus

Mosso das Pedras virus (78V3531)

Mucambo virus

Ndumu virus

O'nyong-nyong virus

Pixuna virus

Rio Negro virus

Ross River virus

Salmon pancreas disease virus

Semliki Forest virus

Sindbis vírus

Southern elephant seal virus

Tonate virus

Trocara virus

Una virus

Venezuelan equine encephalitis virus

Western equine encephalitis virus

Whataroa virus

18

Seu genoma é constituído de uma monopartícula linear de fita simples com 9,7 a 11,8

kb. Possuem polaridade positiva, sendo, portanto traduzidos a partir do RNA genômico que

serve tanto como genoma como RNA mensageiro. O genoma completo é traduzido em uma

poliproteína não estrutural, que é processada pelas proteases virais e do hospedeiro, e uma

poliproteína estrutural, expressa através de um mRNA subgenômico (Figura 3). Nos

Alphavirus, a poliproteína estrutural possui quatro proteínas: E3, que serve como sequencia de

sinais; E2, proteína transmembrana que transporta epítopos neutralizantes importantes para

neutralização dos anticorpos, além de responsável pela ligação ao receptor; 6K, importante na

montagem da partícula viral e no brotamento, aumentado a infectividade da partícula,

servindo também como peptídeo sinal para proteína E1, que tem a função de peptídeo de

fusão para entrada do vírus na célula hospedeira (Casals & Whitman, 1957; Griffin, 2007;

PiaLoux et al., 2007; Vasconcelos et al., 2009; ViralZone, 2010; ICTV, 2012).

Não Estrutural Estrutural

nsP1 nsP2 nsP3 nsP4 CP E3 E2 6K E1

Legenda: Mtr: Metiltransferase; Pro:Protease; HEL: Helicase; X: Função desconhecida; Rep: Replicase.

Figura 3 - Esquema do genoma de RNA dos Alphavirus.

Fonte: Adaptado de ICTV, 2012.

Sorologicamente, os Alphavirus são classificados em 9 complexos antigênicos

(incluindo Alphavirus de peixe) baseados em suas propriedades antigênicas e relacionados

antigenicamente entre si, segundo testes sorológicos, tais como neutralização, fixação do

complemento e inibição da hemaglutinação. Dados de soroprevalência de alphavirus indicam

que eles infectam as pessoas e /ou animais domésticos, porém com manifestações clínicas

desconhecidas ou causam apenas uma doença febril leve. Curiosamente, tal gênero causa

sintomatologias semelhantes sendo mantidos sob diversas condições ecológicas e podendo ter

uma distribuição generalizada. Por exemplo, a infecção Mayaro virus está limitada

geograficamente para a América Latina, enquanto o'nyong-nyong vírus nunca foram

identificados fora da África, no entanto, esses dois vírus causam sinais e sintomas clinicos

Genoma dos Alphavirus

An 3’ 5’ M7G

Mtr Rep X Hel Pro

An 3’ sgRNA 5’

19

quase que idênticos Tal padrão epidemiológico incomum visto em vários Alphavirus levanta

questões intrigantes a respeito da relação de evolução de seus membros, a origenm geográfica

do gênero e posterior expansão do gênero e espécie (Casals & Whitman, 1957; Powers et al.,

2001; Lavergne et al., 2005; Griffin, 2007; PiaLoux et al., 2007; ICTV, 2012).

Diversos vírus evoluiram em numerosos mecanismos para inibir a reposta celular

antiviral, e embora a grande maioria interfira em vias de sinalizações celular, os Alphavirus

do Velho Mundo, altamente citopáticos e conhecido por evadir a resposta celular antiviral

induzem a inibição global da transcrição em células vertebradas, mediada pela proteina não

estrutural nsP2. Estes estudos com a proteina nsP2 dos vírus Sindbis, Semliki Forest e

Chikungunya mostram que ela inibir a transcrição celular, independente da atividade de

protease nsP2-associada, através da indução de uma rápida degradação de Rpb1, uma

subunidade catalitica da polimerase II, desempenhando um papel indispensável no bloqueio

da ativação de genes celulares e baixa regulação da resposta celular antiviral (Akhrymuk et

al., 2012).

1.4. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE O MAYARO VIRUS

O Mayaro virus (MAYV) é um arbovírus pertencente à família Togaviridae, gênero

Alphavirus, destas, seis espécies podem causar distúrbios nas articulações humanas, são eles:

Chikungunya vírus, O’nyong-nyong virus (África central), Ross River virus e Barmah Forest

virus (Austrália e no Pacífico), Sindbis virus (cosmopolita), e o Mayaro virus (America do Sul

e Guiana Francesa). De acordo com a sorologia, é integrante do grupo A, o complexo

antigênico Semliki Forest, sendo primeiramente relacionado ao Semliki Forest virus (SFV),

porém semelhanças antigênicas com o Chikungunya virus também já foram relatadas (Casals

& Whitman, 1957; Vasconcelos et al., 1992; Lavergne et al., 2005; Griffin, 2007; PiaLoux et

al., 2007; ICTV, 2012).

Análises filogenéticas com diversas cepas desse vírus demonstraram a existência de

dois genótipos altamente conservados: o genótipo D, que contêm vírus com divergência de

nucleotídeos menor do que 6%, representados pelos vírus isolados originalmente em Trinidad

e na América do Sul (Peru, Guiana Francesa, Suriname, Brasil e Bolívia), e o genótipo L, com

vírus isolados originalmente apenas no Brasil, com divergência de nucleotídeos menor que

4%, porém bastante distintos dos vírus do genótipo D, com cerca de 15-19% de divergência

(Powers et al., 2006).

20

1.4.1. Modo de transmissão

Assim como os demais arbovírus, o MAYV é transmitido por artrópodes hematófagos

a hospedeiros vertebrados silvestres, incluindo primatas não humanos, roedores e aves, sendo

os dois últimos considerados como hospedeiros secundários, porém importantes para a

disseminação do vírus. Semelhante ao ciclo da febre amarela silvestre, o ciclo do MAYV

apresenta macacos como hospedeiros primários, considerado também amplificador em

epidemias, devido apresentarem elevada viremia e servirem de fonte de infecção para muitos

mosquitos vetores do gênero Haemagogus, especialmente a espécie Haemagogus

janthinomys, encontrada principalmente nas copas das árvores na floresta e considerada como

reservatório natural do MAYV (Vasconcelos et al., 1992; Gubler, 2002; Coimbra et al., 2007;

Figueiredo, 2007; Vasconcelos et al., 2009).

Alguns autores, sugerem a possibilidade de o MAYV ser transmitido por mosquitos do

gênero Aedes, principalmente as espécies Aedes aegypti e Aedes albopictus, o que

possibilitaria o deslocamento deste vírus para cidades em aves ou viajantes humanos

virêmicos, podendo assim se adaptar a um novo ciclo de transmissão natural que envolveria o

homem como principal hospedeiro. Apesar da quantidade de vírus necessária para infectar o

vetor não ter sido estabelecida, o homem é tido como amplificador na transmissão do MAYV

durante epidemias rurais, por circular com o vírus em quantidade suficiente para

eventualmente infectar os vetores potenciais (Tesh et al., 1999; Coimbra et al., 2007).

A maioria das infecções humanas é esporádica e os ciclos enzoóticos ocorrem em

ambientes silvestres, de modo que as pessoas se infectam ao penetrarem nestas áreas para

executarem atividades dentro ou próximo a florestas. Vários surtos de febre do Mayaro têm

sido notificados na Região Amazônica, geralmente limitados ao interior das florestas ou áreas

rurais próximas a elas (Vasconcelos et al., 1992; Tesh et al., 1999; Torres, 2004; Coimbra et

al., 2007).

1.4.2. Breve histórico e epidemiologia

Os primeiros isolamentos originais do MAYV ocorreram a partir do sangue de cinco

trabalhadores febris, que haviam adentrado áreas florestais em Trinidad & Tobago em 1954.

Após este período, o vírus tem sido identificado como responsável por surtos de doença febril

aguda na região da Amazônia e do Planalto Central do Brasil, bem como na região amazônica

e outros países sul-americanos, sendo recuperado a partir de seres humanos, vertebrados

silvestres e mosquitos no Brasil, Bolívia, Colômbia, Guiana Francesa, Guiana, Peru,

21

Suriname e Venezuela (Anderson et al., 1957; Pinheiro et al., 1981; Talarmin et al., 1988;

Coimbra et al., 2007).

Casos de MAYV também foram descrito em membros da mesma família, após

exposição de um único dia em áreas de floresta semi rural na Venezuela. Além disso,

prevalência de anticorpos para MAYV tem sido encontrada em Costa Rica, Guatemala,

Panamá e América central (Torres, 2004; Figueiredo, 2007).

Considerado enzoótico para a América do Sul e endêmico em áreas rurais, o MAYV, é

considerado um dos arbovírus mais importantes pelo seu poder patogênico aos humanos. No

Brasil, o vírus é endêmico na Região Amazônica, onde pelo menos cinco epidemias já foram

notificadas no Estado do Pará: no rio Guamá (1955); Belterra (1978); Conceição do Araguaia

(1981); Benevides (1994) e em Santa Bárbara (2008) (Causey et al., 1958; Coimbra et al.,

2007; Figueiredo, 2007; Azevedo et al., 2009).

O surto ocorrido em Belterra no ano de 1978, em uma vila rural de plantações de

borracha, foi extensivamente estudado e contribuiu para a primeira descrição detalhada da

epidemiologia do MAYV, onde foi possível isolar o vírus e recuperá-lo de mosquitos da

espécie Haemagogus janthinomys. Durante este estudo, os investigadores encontraram

anticorpos contra MAYV em 1% das aves capturadas e em 27% no soro de sagüis

(Callithrix), indicando que os primatas que vivem em árvores seriam os hospedeiros

vertebrados primários do vírus. Em Benevides (1994), foram registrados dois casos humanos

pelo isolamento viral e nove sorologias positivas por MAC ELISA, indicativas de infecção

recente pelo vírus, além de 16 isolamentos a partir de lotes do mosquito Hg. (Hag.)

janthinomys, que corrobora o papel desse artrópode como principal vetor do MAYV. No

município de Santa Bárbara (2008), 36 pessoas foram confirmadas com IgM para o MAYV

pelo ELISA, das quais 23 (64%) eram moradores de áreas de invasão, 13 (36%) moradores do

município de Belém e Ananindeua, e que haviam visitado a área de invasão por apenas uma

semana. (Pinheiro et al., 1981; Travassos da Rosa et al., 2000; Powers et al., 2006; Azevedo

et al., 2009).

Dois outros surtos foram registrados: em Itarumã/GO, em 1987 e em Peixe/TO, em

1991, com três isolamentos virais e 14 sorologias indicativas de infecção recente pela

presença de anticorpos IgM específicos por MAC ELISA. Anticorpos específicos contra

MAYV também foram encontrados em índios Xavante no Mato Grosso, em três homens que

pescavam em Camapuã/MS e em habitantes das áreas rurais do Estado de Goiás (Travassos

da Rosa et al., 2000; Coimbra et al., 2007).

22

1.4.3. Manifestações Clínicas

As infecções por MAYV nos animais silvestres aparentemente se apresentam como

assintomáticas, devido à ausência de manifestações clínicas perceptíveis. Já em humanos

produzem sintomatologia clínica não específica, cujos quadros febris são similares àqueles

causados por outros arbovírus como Oropouche e Dengue (Vasconcelos et al., 2009).

O MAYV se caracteriza por produzir uma doença febril aguda, não fatal, com

exantema maculopapular, cefaléia frontal, dor epigástrica, mialgias incapacitantes, artralgias

que se manifestam com grande intensidade, afetando punhos, dedos, tornozelos, artelhos e

articulações maiores, obrigando os doentes a permanecer recurvados e imóveis, sintoma este

semelhante ao observado em pacientes infectados com o CHIKV, característica clínica que

originou o nome do vírus, que significa “andar recurvado” no dialeto africano onde é

endêmico (Travasso-da-Rosa et al., 1998; PiaLoux et al., 2007).

Outros sintomas frequentemente observados incluem os calafrios, náuseas, fotofobia,

vertigem e linfonodos aumentados. Tais manifestações clínicas persistem em média de 2 a 7

dias, com exceção da artralgia que pode permanecer por vários meses. Não são observados

sinais hemorrágicos, porém leucopenia com contagem de 2.500 glóbulos brancos/mm3 é

constante, acompanhada de linfocitose moderada. Observam-se ainda níveis séricos de

bilirrubina e da alanina amino trasaminase (ALT) nos limites da normalidade (Torres, 2004;

Levinson & Jawetz, 2005; Vasconcelos et al., 2009).

No Brasil, até o momento, o MAYV, Oropouche e Dengue, são os únicos arbovírus

conhecidos capazes de induzir resposta clínica com quadro febril exantemático. Esse tipo de

manifestação cutânea em casos de febre por MAYV não era relatado na Amazônia brasileira

antes de 1978, quando ocorreu a epidemia em Belterra/PA (1978), o exantema foi observado

em 2/3 dos infectados, sendo mais freqüente no tórax, dorso, braços, pernas e mãos, sendo o

rosto o menos atingido. As lesões surgem em torno do quinto dia e persistem em média por

três dias (Pinheiro et al., 1981; Vasconcelos et al., 2009).

De fato, até o momento, em todos os casos de infecção pelo MAYV, os pacientes se

recuperaram sem sequelas aparentes e nenhum óbito devido a esta doença foi relatado

(Vasconcelos et al., 2009).

23

1.4.4. Patogenia e Resposta Imunológica

Como os demais arbovírus, o MAYV, é intracelular obrigatório, passando por uma

fase extracelular no período inicial da infecção e na ocasião em que são liberados após lise

das células infectadas, sendo a resposta imunológica eficiente contra este agente viral,

composta da integração dos mecanismos da imunidade inata (natural) e da imunidade

adquirida (específica). Os primeiros a realizarem o controle da infecção são os componentes

da imunidade inata, os interferons do tipo I: interferon alfa (IFN-α) e interferon beta (IFN-β),

citocinas produzidas por fagócitos mononucleares e fibroblastos respectivamente, que

estimulam a sua produção para que eles possam agir em células não infectadas, protegendo-as

da infecção viral, inibindo assim a disseminação da partícula viral as células do hospedeiro.

Após os estágios iniciais da infecção, estabelece-se a resposta imune adquirida, iniciada após

o intervalo de tempo necessário para a ativação, proliferação e diferenciação dos linfócitos

reconhecedores dos epítopos virais, das células apresentadoras de antígenos (APC), dos

anticorpos específicos, das citocinas e das moléculas de classe I e II do complexo de

histocompatibilidade principal (MHC). Considerada como uma resposta imunológica

específica pode ser de dois tipos: celular e humoral (Levinson & Jawetz, 2005; Azevedo et

al., 2007).

O sistema imune inato e adaptativo é importante na patogênese da artrite reumatóide

(RA). A presença de células T ativadas e células B, os rearranjo dos seus respectivos

receptores e suas especificidades para os antígenos suporta o papel da resposta adaptativa na

patogênese da artrite reumatóide. No entanto, estudos do papel do sistema imune inato em

modelos experimentais mostram receptores Toll-like (TLR) como sendo crítico para a geração

tanto da imunidade inata como adaptativa. Em resposta aos patógenos, a ativação do sistema

imune inato através de TLRs em macrófagos e células dendríticas (DC) resulta na produção

de citocinas pró-inflamatórias, incluindo o factor de necrose tumoral (TNF-α) e interleucina-1

(IL-2). Essa ativação promove o desenvolvimento da resposta imune adaptativa, envolvendo

Linfócitos T e B, o que contribui para a remoção do estímulo patogênico e resolução da

resposta inflamatória. Apesar do desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa, a

expressão de TNF-α e IL-2 persiste e pode diretamente contribuir para a patogênese da artrite

reumatóide (Huang et al., 2007).

O mecanismo que desencadeia as manifestações clínicas e as alterações

imunopatológicas em pacientes com MAYV, ainda não é suficientemente conhecido. Estudos

experimentais demonstram que esse vírus se multiplica inicialmente nos linfonodos regionais

da área do tegumento onde o artrópode infectado fez o repasto sanguíneo. Alcança a corrente

24

sanguínea através dos vasos linfáticos, disseminando-se pelos órgãos e tecidos do hospedeiro.

O MAYV se multiplica nesses locais, sendo lançado novamente na corrente sangüínea,

determinando a viremia que coincide com o período febril. O titulo viral no sangue é elevado

nas primeiras 24 horas após a infecção, porém decrescem rapidamente, sendo rara a detecção

do vírus após as 72 horas de infecção, uma vez que após o período virêmico, o paciente

apresenta elevados títulos de anticorpos neutralizantes que depuram o vírus do organismo

(Pinheiro et al., 1981; Levinson & Jawetz, 2005; Azevedo et al., 2007; Vasconcelos et al.,

2009).

Em alguns casos a infecção pelo MAYV não passa de um quadro febril, onde o

paciente se recupera totalmente, sem sequelas. Outras vezes a infecção progride, com uma

tríade de sintomas: febre, exantema e artralgia, sendo considerada autolimitante, porém uma

doença reumática debilitante. Pesquisas sobre a patogênese da artrite relacionada com

infecções por Alphavirus foram desenvolvidas utilizando ratos como modelo experimental e

Ross River virus (RRV) como indutor da doença, e mostraram o papel dos macrófagos como a

principal causa imunopatológica para o desenvolvimento da doença, sendo encontrado

principalmente nos músculos e articulações. Estudos com primatas não humanos suscetíveis a

infecção pelo vírus Chikungunya também obtiveram os macrófagos como atores centrais

durante as infecções e persistência da doença sendo encontrado principalmente nos órgãos

linfóides, fígado e músculo (Azevedo et al., 2007; Lidbury et al., 2008; Labadie et al., 2010;

Herrero et al., 2011).

Os macrófagos em si não são uma importante fonte de replicação do vírus, mas são a

fonte principal de mediadores da inflamação responsáveis pela produção de uma série de

citocinas pró-inflamatórias importantes na patogênese da artrite reumatóide. Dentre essas

citocinas, destaca-se o TNF-α (fator de necrose tumoral), um mediador inflamatório que em

baixas concentrações aumenta a síntese de linfocinas pelas células T e estimula a produção de

células B, e em altas concentrações é um importante mediador do choque tóxico induzido por

endotoxinas contribuindo para doença inflamatória, encontrado em níveis elevados em ambos

os trabalhos mencionados (Levinson & Jawetz, 2005; Azevedo et al., 2007; Lidbury et al.,

2008; Herrero et al., 2011).

Estudos apontam que a prevalência da imunidade contra o MAYV aumenta com a

idade, e as taxas em comunidades rurais na região Amazônica aumentam de 10% para 60%.

Estudos têm mostrado que em diversas tribos indígenas na Amazônia, cerca de 20% a 47% da

população, apresentaram imunidade ao MAYV. Porém, apesar das taxas elevadas de

anticorpos na população, é extremamente difícil isolar o vírus, uma vez que o período de

25

viremia é muito curto (2-3 dias), durante o qual é normalmente improvável a suspeita do

MAYV como agente causador da doença (Pinheiro et al., 1981; Vasconcelos et al., 1992).

1.4.5. Diagnóstico, tratamento e prevenção.

O diagnóstico clínico da infecção pelo MAYV é difícil devido à natureza não

específica da doença e a presença de outros vírus, como o Dengue virus, que comumente

produz manifestação clínica similar, especialmente nos trópicos (Vasconcelos et al., 2009).

Aliado a este fator, a ausência de um método diagnóstico simples para a detecção

rápida das infecções agudas ainda durante os estágios iniciais da doença, dificulta a avaliação

do potencial de uma epidemia e a implementação de medidas de controle adequadas, como o

controle do mosquito. Neste sentido, o diagnóstico virológico moderno tem como

característica importante o uso de vários métodos para detecção da infecção viral, sendo de

grande importância para a saúde pública, pois auxiliam no diagnóstico de pacientes e no

monitoramento da virose nas diferentes regiões do país (Vasconcelos et al., 2009).

Ensaios convencionais para detecção da infecção incluem o isolamento do vírus pela

inoculação viral em culturas celulares ou camundongos recém-nascidos, considerado como

padrão ouro, testes sorológicos para detecção de anticorpos específicos IgM ou soro

conversão de IgG, e amplificação do RNA viral (Azevedo et al., 2007).

No método de isolamento em cultura celular, uma grande variedade de cultivos

celulares tem sido utilizada, onde se observa a multiplicação viral mediante a evidência de

efeito citopático ou de formação de placas sob camada de ágar, pela inoculação de material

infectado com o vírus (sangue total ou soro) de pacientes com até 3 dias de doença em

culturas celulares. Dentre as linhagens celulares continuas que apresentam sensibilidade a um

grande número de arbovírus estão às células Vero (obtidas a partir de rim de macaco verde

africano, Cercopithecus aethiops), BHK-21 (obtidas a partir rim de hamster neonato), LLC-

MK2 (obtidas a partir rim de macaco do gênero Rhesus) e as células de artrópodes Aedes

pseudoscutellaris (AP61) e Aedes albopictus (clone C6/36). A confirmação do isolamento

viral em culturas celulares é feita por teste de imunofluorescência indireta (Azevedo et al.,

2007; Vasconcelos et al., 2009)

Quanto aos métodos sorológicos, os testes de Inibição da Hemaglutinina (IH) e ELISA

são os mais empregados. A IH por ser uma técnica sensível, rápida e de fácil execução é

recomendada na rotina laboratorial, principalmente nos estudos soro-epidemiológicos, devido

à longa persistência dos anticorpos inibidores da hemaglutinação após a infecção, permitindo

26

diferenciar entre infecções primária e secundária. Entretanto, a confirmação do diagnóstico

exige amostras de soros pareadas, colhidas na fase aguda e de convalescença da doença, as

quais, nem sempre são de fácil obtenção. O teste de ELISA, utilizado para detecção de IgM

específica, tem a vantagem de identificar infecção atual ou recente; ou a detecção de

antígenos, técnica que apresenta alta sensibilidade, rápida e de fácil execução, porém deve ser

utilizada apenas em amostras de soro obtidas a partir do 5º dia de doença (Wang et al., 2006;

Vasconcelos et al., 2009).

O desenvolvimento de técnicas moleculares permitiu a detecção de seqüências

específicas do genoma viral, eliminando assim alguns dos problemas encontrados na

utilização de métodos sorológicos como, sensibilidade, especificidade e tempo, sendo este de

grande importância em situações epidêmicas. Os métodos são baseados na RT-PCR,

transcrição reversa do RNA em DNA, seguida de um ensaio de amplificação da seqüência do

DNA viral, um método mais rápido e sensível para detecção do MAYV, além do que a

sequencia nucleotídica amplificada poderá ser utilizada em estudo filogenéticos,

possibilitando a diferenciação entre os genótipos existentes, a determinação da origem

evolutiva desse vírus e sua relação geográfica com o país e com o mundo (Wang et al., 2006;

Azevedo et al., 2007; Vasconcelos et al., 2009).

O tratamento para infecções pelo MAYV, assim como nas demais arboviroses, se

limita a manutenção do estado geral do doente; as medidas irão dar suporte para a manutenção

das funções vitais do paciente, que deve, sobretudo, observar repouso e fazer uso de

terapêutica sintomática quando necessário (Wang et al., 2006; Azevedo et al., 2007).

Com relação às medidas de controle da doença, a febre do Mayaro não dispõe de

medidas profiláticas coletivas que possam ser aplicadas, pois o vírus apresenta dispersão

apenas em áreas rurais ou de floresta, sendo as medidas de controle individuais as que podem

impedir a picada do vetor infectado, dentre as quais, uso de mosqueteiros, roupas longas e

grossas e repelentes, principalmente nos membros inferiores, durante o trabalho em áreas de

floresta, haja vista que o vetor principal Hg janthinomys tem hábitos silvestre e preferências

por essas partes do corpo (Wang et al., 2006; Azevedo et al., 2007; Vasconcelos et al., 2009).

27

1.5. RELEVÂNCIA DO TRABALHO

O Mayaro virus é um vírus considerado endêmico na Amazônia brasileira e enzoótico

para América do Sul onde é amplamente distribuído. No Brasil, o MAYV possui um alto

potencial para tornar-se um importante problema de saúde pública nos próximos anos,

considerando as recentes mudanças demográficas e o uso desordenado da terra com mais

pessoas entrando em contato com áreas de floresta para o trabalho e recreação, possibilitando

a alteração e o aumento assim da frequência desta doença na população. A maioria das

infecções humanas é esporádica e os ciclos enzoóticos ocorrem em ambientes silvestres,

sendo o principal vetor, mosquitos do gênero Haemagogus, especialmente a espécie

Haemagogus janthinomys, reportada como reservatório natural do vírus. Em animais

silvestres, as infecções apresentam-se como assintomáticas, devido à ausência de

manifestações clinicas perceptíveis, já em humanos produzem sintomatologia clínica não

especifica, cujos quadros são similares aqueles causados por outros arbovírus, geralmente

com quadro clínico febril não fatal, sendo consideradas auto limitantes, porém uma doença

reumática debilitante caracterizada por mialgias incapacitante e artralgias, que se manifestam

com grande intensidade obrigando os doentes a permanecerem recurvados e imóveis. Tais

manifestações clínicas persistem em média de 2 a 7 dias, com exceção da artralgia que pode

permanecer por vários meses (Tesh et al., 1999; Vasconcelos et al., 2009).

Considerando a importância desse vírus devido a sua ampla distribuição na região,

onde nos últimos anos alguns surtos já foram diagnosticados no Estado do Pará de forma

endêmica e por sua capacidade de incapacitar temporariamente muitos doentes, o MAYV

levanta a necessidade de uma vigilância como parte de programas efetivos de controle, capaz

de detectar os primeiros casos dessa arbovirose emergente e diagnóstico laboratorial rápido de

casos suspeitos, seguido de medidas de controle e estudos detalhados acerca da

imunopatogenicidade desse agente viral causada pela infecção, correlacionando-as com a

severidade da doença. Portanto, o estudo se justifica pela importância de se conhecer melhor a

patogenia da doença, com ênfase na resposta imunológica do doente por meio da expressão de

RNA mensageiro IL-2 e TNF-α, citocinas pro-inflamatórias importantes na patogênese da

artrite reumatóide, utilizando-se para isso, um modelo experimental animal (Dias, 1986; Tesh

et al., 1999; Gubler, 2002; Huang et al., 2007; Azevedo et al., 2009; Vasconcelos et al.,

2009).

28

1.6. OBJETIVOS

1.6.1. Objetivo geral

Analisar a expressão de RNA mensageiro das citocinas IL-2 e TNF-α em

camundongos (Mus musculus) recém-nascidos infectados experimentalmente via

subcutânea com o MAYV.

1.6.2. Objetivos específicos:

Determinar a expressão de genes de IL-2 e TNF-α no cérebro, fígado, rim e

músculo esquelético de camundongos recém-nascidos infectados

experimentalmente com MAYV;

Verificar a presença do VMAY no cérebro, fígado, rim e músculo esquelético de

camundongos recém-nascidos infectados experimentalmente com MAYV;

Correlacionar a expressão dos genes das citocinas com a presença do vírus no

cérebro, fígado, rim e músculo esquelético de camundongos recém-nascidos

infectados experimentalmente com MAYV.

29

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. AMOSTRA VIRAIL

O espécime viral foi cedido do acervo de isolamentos virais da Seção de

Arbovirologia e Febres Hemorrágicas (SEARB) do Instituto Evandro Chagas (IEC). A cepa

selecionada é proveniente de um caso humano de Febre do Mayaro oriundo do surto ocorrido

em fevereiro de 2008, no município de Santa Bárbara, no Estado do Pará (Fig. 4). Para que

fosse utilizado este isolado no presente estudo foi realizada a solicitação de autorização para

utilização da cepa viral à direção do IEC, bem como anuência do chefe da seção SEARB

conforme orientação do Comitê de Ética em Pesquisa dessa instituição (Anexo 1 e 2). Sendo

posteriormente submetido e aprovado no Comitê de Ética em pesquisa com animais (CEPAN)

do IEC (Anexo 3).

Figura 4: Localização do município de Santa Bárbara no Estado do Pará.

A) localização do Estado do Pará, Norte do Brasil. B) Localização de

Belém, capital do Estado do Pará. C) localização do município de Santa

Bárbara/PA e municípios vizinhos na região metropolitana de Belém e ao

longo da PA-391, rodovia de acesso ao município. (Fonte: adaptado de

Azevedo et al., 2009).

A B

C

30

O isolado selecionado (SBA91 H743921) foi coletado de um caso de febre do Mayaro

com complicação diagnosticado pelo IEC e oriundo de um paciente do gênero feminino, com

52 anos, agricultora e residente em um assentamento no município de Santa Barbara (PA). A

paciente desenvolveu um quadro clinico de febre alta, cefaléia, artralgia, calafrios, dor ocular,

mialgia e edema nas mãos, joelhos e pés.

2.2. PREPARAÇÃO DO ESTOQUE VIRAL I

O vírus SBA91 H743921 usado neste estudo foi inoculado pela via intracerebral em

camundongos albinos suíços recém-nascidos para tentativas de um novo isolamento e

preparação de estoque viral. Os camundongos foram cedidos pela Seção de Criação e

Produção de Animais (SACPA/IEC/SVS/MS), sendo distribuídos em número de seis animais

em cada microisolador (gaiolas) de acrílico com tampa de aço cromado, em racks de

exaustão, com fornecimento de ração balanceada e água à vontade. Os animais foram

mantidos no infectório NBA-3 em ambiente refrigerado, temperatura aproximada de 25ºC (±

3ºC) acompanhados de uma fêmea recentemente parida. Todos os procedimentos com os

animais foram realizados por ou sob orientação de veterinário.

Para compor o estoque viral da amostra, foi preparada uma suspensão a 10%, na

proporção de 1:10 em solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7.2 contendo

albumina bovina a 0,75%, estreptomicina (100 g/mL) e penicilina (100 UI/mL), a partir da

alíquota do sangue do indivíduo com a cepa selecionada para o estudo e inoculados via

intracerebral (i.c.) em camundongos suíços albinos recém-nascidos (1 a 2 dia de idade). Esses

animais foram inoculados com 0,02 mL das respectivas suspensões utilizando agulhas 13 x

4,5 mm e seringas hipodérmica de 1 mL. Para inoculação foi usada contenção física, sendo

neste momento os animais foram seguros pela cabeça com o dedo indicador e polegar, tendo o

resto do corpo apoiado nos outros dedos.

Para esta etapa foram utilizadas três gaiolas contendo cada uma seis recém-nascidos.

Os animais infectados foram observados diariamente em intervalos de, aproximadamente, 12

horas e quando apresentaram sinais de doença (dificuldade de alimentação, falta de

coordenação motora, tremores, hipodesenvolvimento e hipoatividade) foram retirados das

respectivas gaiolas, eutanasiados a partir do método físico “deslocamento cervical” conforme

recomendação do Manual Para Técnicos em Bioterismo do COBEA (De Luca at al., 1996;

Mezadri et al., 2004), o qual refere que esse “é o método mais simples e humanitário adotado

31

para eutanásia de camundongos e cobaias”. Em seguida foram identificados e congelados à -

70ºC para compor o estoque viral que seriam utilizados nos experimentos.

2.3. TITULAÇÃO VIRAL EM CÉLULA VERO

Neste trabalho foi utilizada uma linhagem celular de células Vero, provenientes do rim

do macaco verde africano Cercopithecus aethiops. A linhagem celular foi mantida em estufa

(NAPCO) à 37ºC com 5% CO2, em microplacas de 6 poços de cultura com meio de

manutenção 199 suplementado com 2% de soro bovino fetal e antibiótico (100 UI/mL de

penicilina e 100 µl/mL de streptomicina). Quando as células formavam uma monocamada

eram consideradas prontas para serem utilizadas nos experimentos ou para a sua manutenção,

realizada primeiramente com a assepsia rigorosa da sala de cultura, passando-se álcool a 70 %

em todos os materiais a serem utilizados no fluxo laminar. A técnica utilizada na preparação

das microplacas para o experimento foi a da tripsinização. Após a observação da

monocamada celular em microscópio invertido (Zeiss modelo Axiovert S100) com objetiva

de 20 X, retirou-se o meio de cultura da mesma, e a camada celular foi então lavada

rapidamente com tripsina (2 mL), para retirar o excesso de soro. Em seguida, foi adicionado

0,5 mL de tripsina à 0,25 % sobre as células, para desprendê-las da garrafa, e 5 mL meio 199

de manutenção. Após homogeneização mecânica utilizando pipeta automática, a suspensão

obtida foi distribuída em outras microplacas na proporção de 1:3 para manutenção, sendo

complementadas com meio de manutenção 199, incubadas em estufa a 37ºC até o momento

de serem utilizadas ou passadas novamente.

A titulação viral foi realizada partindo-se de uma suspensão de cérebro de

camundongo estoque infectado com o vírus do estudo. Os camundongos tiveram seus

cérebros retirados e macerados em gral e pestilo, e acrescido de PBS (1,8 mL por cérebro)

contendo albumina bovina a 0,75 % e os antibióticos penicilina (100 UI/mL) e estreptomicina

(100 μg/mL), nas diluições de 10-1

a 10-6

, respectivamente, em meio de manutenção 199.

Foram utilizadas microplacas com seis poços com culturas subconfluentes de células Vero.

Desprezou-se o meio de cultura das placas e em seguida foi inoculado em cada poço 0,1 ml de

suspensão viral, em duplicata, para cada diluição, para o controle do teste alguns poços

ficaram apenas com o meio de cultura de manutenção para o testemunho de células não

infectadas. As placas foram então incubadas em estufa de CO2

(5%) durante 60 minutos a 37

°C (período de adsorção viral). Após esse período, foi desprezado o meio e adicionado em

cada poço 3 ml de Carboximetilcelulose (CMC) à 3% e incubado na estufa de CO2

por 7 dias,

32

sendo então fixadas com adição de 3 ml de formol à 10% em cada poço por 60 minutos . As

placas foram lavadas em água corrente e coradas com 3 ml de cristal violeta durante a noite e

posteriormente lavadas em água corrente. Com base no número de placas formadas pelo vírus,

considerado como positivo o efeito citopatológico (ECP) característico em células Vero, o

titulo viral foi calculado pelo método de Reed & Muench (1938), onde é expresso em

unidades formadoras de placas por mililitro (pfu/ml), conforme fórmula abaixo.

T = n x f / i

- n é a soma dos números de placas virais contadas nos poços em que se inocularam

diluições que resultaram num número contável de placas.

- f é o factor relativo à menor diluição que contribuiu para o valor n

- i é a soma dos volumes (em ml) dos inóculos virais aplicados nos poços em que se

contaram placas.

2.4. PREPARAÇÃO DO ESTOQUE VIRAL II

Com a informação do título do vírus em estudo de 3,7 x 107 pfu/mL, obtido a partir da

titulação do estoque viral I, realizou-se um novo estoque viral a partir do estoque viral I,

através da inoculação via intracerebral (i.c) de 0,02mL de suspensão de cérebro de

camundongo a 10% infectados com o vírus do estudo, em camundongos albinos suíços

recém-nascidos. Foram utilizadas três gaiolas contendo cada uma seis recém-nascidos, sendo

os mesmos eutanasiados após serem observados sinais de doença e identificados e congelados

à -70ºC. Também foram utilizadas três gaiolas contendo cada uma seis recém-nascidos não

infectados, os quais foram eutanasiados, identificados e congelados à -70ºC, com o mesmo

tempo de vida dos animais infectados para servirem de controle negativo no presente estudo.

2.5. TITULAÇÃO VIRAL EM CAMUNDONGO

A titulação viral foi realizada partindo-se de uma suspensão de cérebro de

camundongo estoque viral II, nas diluições seriadas de 10-1

a 10-8

. Cada diluição no volume

de 0,02 ml foi inoculada por via i.c., em camundongos albinos suínos recém-nascidos (2 dia

de vida) sendo as informações com relação a doença, morte e coleta armazenadas e um cartão

de inoculação. O título foi calculado pelo método de Reed e Muench (1938) e expresso em

DL50/0,02 mL, que representa a dose letal mediana (dose capaz de matar 50 % dos

camundongos infectados).

33

2.6. EXPERIMENTO

2.6.1. Critérios de Inclusão e Exclusão de Animais no Experimento

Foram incluídos no experimento todos os camundongos suíços albinos recém-nascidos

com 1 a 2 dias de vida sadios (controle negativo) e susceptíveis a infecção (grupo infectado).

Foram excluídos do experimento todos os camundongos suíços albinos que não

estavam entre a faixa-etária pré-estabelecida para o grupo recém-nascidos. Após a infecção

foram excluídos todos os animais que não foram susceptíveis a infecção e ou foram a óbito

antes de eutanasiados.

2.6.2. Dose Infectante

O vírus foi inoculado na região dorsal de camundongos recém-nascidos, via

subcutânea (s.c.) com 0,02mL de suspensão viral a 10% contendo 10-9,5

DL50/0,02 mL da

cepa SBA91 H743921. Para comparar a infecção com a cepa do vírus SBA91, foi inoculado

na região dorsal de camundongos recém-nascidos, via subcutânea (s.c.) com 0,02mL de

suspensão viral da cepa protótipo (AR20290) a 10% contendo 10-9,4

DL50/0,02 mL. Os

animais foram observados diariamente e examinados para presença de sinais e/ou sintomas

característicos de infecção (dificuldade de alimentação, falta de coordenação motora,

tremores, hipodesenvolvimento e hipoatividade), anotados nos cartões de inoculação.

2.6.3. Colheita e Preparação do Material para Análise

Após a infecção experimental, diariamente, em intervalos de 24, 48 e 72 horas, três

camundongos recém-nascidos infectados com a cepa em estudo, três camundongos infectados

com a cepa do protótipo do MAYV (controle positivo) e três camundongos não infectados

(controle negativo) foram anestesiados e eutanasiados. Constatada a morte, todos os animais

foram necropsiados, sendo os fragmentos dos órgãos (cérebro, coração, fígado, rim, baço e

músculos esqueléticos) extraídos e preservados à -70 °C, até o momento de uso.

2.7. TESTES VIROLÓGICOS

Os fragmentos do cérebro, coração, fígado, rim, baço e músculo esquelético de todos os

camundongos recém-nascidos infectados e controle negativo foram submetidos à técnica de RT-

PCR (Transcrição Reversa seguida da Reação em cadeia mediada pela polimerase) para

confirmação da infecção pelo MAYV. Primeiramente foi utilizado o Kit Viral Pure LinkTM

34

(Invitrogen) para a extração do RNA viral, seguindo as orientações do fabricante como a seguir:

Em um tubo de microcentrífuga (1,5 ml), adicionou-se 25 µl de proteinase K, 200 µl de tampão

de lise e 200 µl da amostra previamente macerada, sendo então incubado à 56ºC por 15 minutos

e adicionado 250 µl de etanol (96-100%). O lisado foi incubado novamente por 5 minutos à

temperatura ambiente e transferido para coluna e centrifugado a 8.000 rpm por 1 minuto. Após

essa etapa o tubo coletor foi descartado e adicionado 500 µl de tampão de lavagem (Wash

Buffer) e centrifugado a 8.000 rpm por 1 minuto, sendo esta etapa de lavagem repetida duas

vezes. Finalmente a coluna foi centrifugada a velocidade máxima (14.000 rpm) por 1 minuto e

transferida para um tubo de microcentrífuga (1,5 ml) onde foi adicionado 50 µl de água livre de

nuclease, posteriormente incubada por 1 minuto em temperatura ambiente e centrifugada a

velocidade máxima por 1 minuto.O RNA extraído foi identificado e estocado à –70 °C até o

momento do uso.

Após a extração do RNA, foi gerado pela reação de transcrição reversa do RNA a

síntese de DNA complementar (cDNA) em duas etapas, utilizando-se para isso,

oligonucleotídeos iniciadores específicos e iScript ™ cDNASíntese kit (Promega), seguindo

as instrunções do fabricante. Primeiramente, 1 µl de RNA total, 1 µl de primer reverso e 5 µl

de água livre de DNAse, foi desnaturado à 65 °C por 5 min. O RNA foi homogenizado a uma

mistura previamente preparada, contendo 4 µl buffer RT (5x), 2 µl DTT, 1 µl RNAseout e 1

µl Superscrit II, obtendo-se assim um volume final de 20 µL para a sintese do cDNA.

O cDNA obtido na reação de transcrição reversa do RNA foi utilizado na reação da

PCR segundo informações do fabricante seguindo os seguintes parâmetros: desnaturação

inicial à 95 ºC por 5 min, 45 ciclos com desnaturação à 95 ºC por 30 segundos, hibridização à

55 ºC por 30 segundos e extensão à 68 ºC por 1 minuto. A etapa de extensão final foi

realizada à 68 ºC por 5 minutos. O volume final da reação foi de 50 µl contendo 5 µl tampão

buffer (10x); 1,5 µl MgCl2; 1 µl dNTP; 1 µl Taq. Platinum; 32,5 µl água livre de nuclease; 1

µl de iniciadores senso e complementar e 5 µl de cDNA. Os oligonucleotídeos iniciadores

específicos utilizados tanto para a obtenção do cDNA como do PCR estão descritos no quadro

abaixo (Pfeffer et al., 1997; Bronzoni et al., 2004).

Quadro 2- Oligonucleotídeos iniciadores usados na reação de RT-PCR.

Oligonucleotídeos Seqüência Tamanho (pb)

M2W 5’-YAGAGCDTTTTCGCAYSTRGCHW-3’ 434

M3W 5’-ACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC -3’

35

Os produtos da RT-PCR foram então submetidos à eletroforese horizontal em gel de

agarose à 1,5% usando SYBR SAFE (Invitrogen), sendo visualizados e analisados em um

transiluminador com luz UV (Vilber Lourmat, EUA).

2.8. EXPRESSÃO DE RNA MENSAGEIRO PARA DETECÇÃO DE CITOCINAS POR

TRANSCRIÇÃO REVERSA E REAÇÃO EM CADEIA MEDIADA PELA

POLIMERASE EM TEMPO REAL (RT-qPCR) USANDO SISTEMA SYBR

GREEN.

2.8.1. Análise da Expressão de mRNA de IL-2, TNF-α e GAPDH.

A expressão de RNA mensageiro que codifica as IL-2 e TNF-α foi realizada pela

técnica de Transcrição Reversa e Reação em Cadeia mediada pela Polimerase em Tempo Real

(RT-qPCR) pelo método de SYBR Green. Tal técnica é capaz de monitorar o progresso da

PCR e coletar seus dados enquanto ela progride. Para isso, utiliza o momento do ciclo da

reação no qual a amplificação do alvo é detectada pela primeira vez, assim quanto mais alto o

número de cópias iniciais do ácido nucléico alvo, mais rápido será observado o aumento

significativo na fluorescência, que será detectada pelo sistema do corante SYBR Green que

possui ligação altamente específica ao DNA dupla-fita formado durante a reação, tendo como

resultado, o aumento na intensidade da fluorescência proporcional à quantidade de produto

gerado pela PCR (Peirson et al., 2003).

A quantificação relativa das citocinas por RT-qPCR foi realizada pelo Sistema de

Detecção de ViiA™ 7 system Real-Time PCR (Applied Biosystem). Utilizando-se o

EXPRESS SYBR® GreenER™ qPCR SuperMix Kits (Applied Biosystem). Foram

selecionados quatro fragmentos dos seis extraídos dos camundongos recém-nascidos

infectados pela via subcutânea com a cepa SBA91 H743921 e do grupo controle não

infectado, dentre os quais estão o cérebro, fígado, rim e músculo esquelético. A exclusão dos

fragmentos do coração e baço ocorreu devido a pouca quantidade de RNA obtido na extração

e confirmado pelo método de quantificação de RNA fluorométrica, usando o equipamento

Qubit®

(Invitrogen).

A PCR foi realizada em um volume de 10 μl contendo 2 µl do DNA (100 ng); 5 μl

Super Mix with premixed Rox; 1μl de iniciadores de cada primer gene-específico senso e

complementa; 0,25 μl One-step SybrGreenER

e 0,75 μl de água livre de nuclease, seguindo os

seguintes parâmetros: desnaturação inicial à 50 °C por 5 minutos, 95 °C por 10 minutos

36

seguidos de 40 ciclos de desnaturação à 95 °C por 15 segundos, hibridização à 60 °C por 1

minuto. A etapa final foi a de obtenção de uma curva melt para os produtos de PCR para

determinar a especificidade da amplificação. A quantificação da expressão gênica de citocinas

por PCR em tempo real foi realizada, conforme detalhado por Peirson et al. (2003). Os pares

de primers utilizados seguem abaixo.

Quadro 3 - Primer usados na reação de RT-PCR em Tempo Real para a determinação

da expressão de citocinas.

Gene Alvo Primer Tamanho do

amplicon (pb)

GAPDH* F - 5’ CGA CTT CAA CAGCAA CTC CAC TC 3’

278pb R – 5’ CAC CCT GTT GCT GTA GCC CGT ATT C 3’

IL-2p40** F - 5’ CCC AAG CAG GCC ACA GAA TTG AAA 3’

81 pb R - 5’ AGT CAA ATC CAG AAC ATG CCG CAG 3’

TNF-α*** F - 5’ ATC TTC TCA AAA TTC GAG TGA CAA 3’

174 pb R - 5’ TGG GAG TAG ACA AGG TAC AAC CC 3’

*Sequencia de primer descrita por Bordignon et al., 2008.

** Sequencia de primer descrita por Cezario et al., 2011.

***Sequencia de primer descrita por Yamaguchi et al., 2007.

Esta expressão foi determinada em amostras de cérebro, fígado, rim e músculo

esquelético de camundongos recém-nascidos infectados experimentalmente com MAYV e

não infectados (controle negativo), com o objetivo de determinar a expressão das citocinas de

interesse, nos diferentes órgãos e tecido desses animais. Para isso, um ensaio de quantificação

relativa foi utilizado para analisar alterações na expressão gênica destes alvos. O método de

cálculo utilizado para a quantificação foi o método de CT comparativo, também referido

como ∆∆Ct e determinado pela fórmula: ∆Ct = Ct (gene alvo) – Ct (gene endógeno). O gene

da GAPDH foi utilizado como controle endógeno para verificar a integridade dos cDNAs e

padronizar as concentrações iniciais de cDNA de todas as amostras, uma vez que, é expresso

de forma constitutiva em todas as células.

2.9. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para as análises estatísticas foi utilizado o programa GraphPad Prism versão 5.0

(GraphPad Software, San Diego, Califórnia, USA). As diferenças estatíst k bicas entre os

grupos experimentais foram determinadas através da Análise de Variância (ANOVA), seguida

pelo método pós-teste (Bonferroni, ou Student t Test). Foram consideradas diferenças

estatisticamente significante quando p<0,05.

37

3. RESULTADOS

3.1. CONFIRMAÇÃO DA INFECÇÃO POR MAYV

No presente estudo, camundongos recém-nascidos (Mus musculus) foram inoculados

via subcutânea com a cepa SBA91 H774173 juntamente com o controle positivo (Protótipo

AR20290) e negativo, onde foram observados diariamente, por um período de três dias, em

intervalos de 24, 48 e 72 horas, sendo utilizado o método de RT-PCR para a confirmação da

infecção pelo MAYV. Nas imagens obtidas com a eletroforese, foi possível observar a

presença de amostras positivas em todos os fragmentos em estudo e em todos os intervalos de

tempo, mostrando que o MAYV circula por uma grande variedade de órgão e tecidos em um

curto período de tempo (Figura 5, 6 e 7).

Figura 5- Produto de RT-PCR, em gel

de agarose a 1,5% corado por SYBR®

Safe, de amostras de camundongos

infectados via s.c. com MAYV, após 24

horas de infecção: Faixa 1: Cérebro;

Faixa 2: Coração; Faixa 3: Fígado;

Faixa 4: Rim; Faixa 5: Baço; Faixa

6:Músculo esquelético; Faixa 7:

Controle positivo (Cérebro do Protótipo

do MAYV); Faixa 8: Controle Negativo

(Cérebro camundongo não infectado

24h); Faixa 9: Controle Negativo

(água); Faixa 10: Peso Molecular (100

pb DNA Ladder).

Figura 6 - Produto de RT-PCR, em gel











48h); Faixa 9: Controle Negativo : água;

Faixa 10: Peso Molecular (100 pb DNA

Ladder).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

38

O quadro 4 apresenta a síntese da análise das amostras biológicas dos camundongos

inoculados com os isolados do MAYV para a amostra em estudo (SBA91), o controle

positivo (AR 20290) e controle negativo (camundongos não infectados). Os animais foram

diariamente observados e examinados para presença de sinais e sintomas característicos da

infecção pelo MAYV, classificados como presença ou ausência de sinais de distúrbios

neuromotores como dificuldade de alimentação, tremores, hipodesenvolvimento,

hipoatividade e dificuldade de locomoção principalmente com as patas traseiras, sendo

observados 24 horas após infecção nos animais do controle positivo e 48 horas após infecção

nos animais infectados com a amostra em estudo. Apesar das variações de tempo no

aparecimento dos sinais clínicos, a confirmação da presença do vírus nos órgãos e tecido

estudados pelo método de RT-PCR, foi positiva desde o primeiro dia de infecção.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Figura 7 - Produto de RT-PCR, em gel











72h); Faixa 9: Controle Negativo :

água; Faixa 10: Peso Molecular (100 pb

DNA Ladder).

39

Quadro 4 - Análises de amostras biológicas de camundongos inoculados com isolados de

MAYV.

AMOSTRAS ANALISADAS

AR 20290 SBA 91 Controle Negativo

Dia Sinais

Clínicos RT-PCR

Sinais

Clínicos RT-PCR

Sinais

Clínicos RT-PCR

1º + Positivo 0 Positivo 0 Negativo

2º + Positivo + Positivo 0 Negativo




Legenda: 0= sem sinal de doença; += sinais de distúrbios neuromotores; Positivo= com amplifacação de

genoma; Negativo= sem amplificação de genoma.

3.2. ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE mRNA DE IL-2, TNF-α E GAPDH

A quantificação da expressão de mRNA das citocinas IL-2, TNF-α e o controle

endógeno GAPDH, foi analisado utilizado a técnica de Transcrição Reversa e Reação em

Cadeia mediada pela Polimerase em Tempo Real (RT-qPCR) usando sistema SYBR Green.

Para cada intervalo de tempo, 24, 48 e 72 horas, foi realizado um experimento de RT-

qPCR, onde cada citocina foi analisada em triplicata para cada um dos órgãos e tecido

selecionados para o estudo. A figura 8 mostra a curva de amplificação do experimento de RT-

qPCR.

40

Os valores de CT obtidos pela análise das curvas de amplificação foram utilizados na

avaliação da variação de expressão (fold-change) de cada gene de interesse por meio do

método de comparação do CT, utilizando o gene GAPDH para normalização, conforme

descrito na metodologia. Tal método requer uma validação, realizada para mostrar a eficiência

das amplificações do alvo e a eficiência da amplificação do controle endógeno são

aproximadamente iguais (Figura 9, 10 e 11).

Figura 8 – Curva de amplificação do experimento de RT-qPCR para determinação da

expressão de mRNA das citocinas IL-2, TNF-α e GAPDG (gene endógeno) em

camundongos infectados após 24horas com o MAYV pela via subcutânea e camundongos

não infectados (controle negativo) nos fragmentos de cérebro, fígado, rim e músculo

esquelético.

41

Figura 5 - Curva padrão da RT-qPCR demonstrando a eficiência

da reação para o gene GAPDH.


da reação para o gene IL-2.

42

Após o término de cada reação, uma etapa de dissociação foi realizada para

visualização da cinética de dissociação dos produtos amplificados. Para isso, a temperatura da

reação foi aumentada de forma linear e a fluorescência de cada amostra foi representada

graficamente, com o eixo da ordenada mostrando a derivada da intensidade da fluorescência e

o da abscissa, a temperatura. O gene endógeno (GAPDH) e o gene da citocina IL-2 tiveram

seus produtos amplificados com uma Temperatura (Tm) 81,32 ºC e Tm 78,49 ºC

respectivamente, sem qualquer formação de dímeros dos iniciadores, amplificação de produto

inespecífico ou contaminação das amostras (Figura 12 e 13). Já o gene da citocina TNF-α teve

seu produto amplificado com uma temperatura mais elevada, de 87,24 ºC, e com uma pequena

formação de dímero, demonstrado pela seta (Figura 14).


da reação para o gene TNF-α.

43

Figura 13 – Curva de dissociação com amplificação do gene da

citocina IL-2 em camundongos infectados após 24horas com o

MAYV pela via subcutânea nos fragmentos de cérebro, fígado, rim e

músculo esquelético.

Figura 12 – Curva de dissociação com amplificação do gene

endógeno (GAPDH) em camundongos infectados após 24horas com o



44

A variação de expressão de genes das citocinas IL-2 e TNF-α nas amostras coletadas

de cérebro, fígado, rim e músculo esquelético de camundongos recém-nascidos infectados

com MAYV nos intervalos de tempo 24, 48 e 72 horas foram analisada pela quantificação

relativa utilizando os valores de CT obtidos pela análise das curvas de amplificação e

normalizados com o gene GAPDH, utilizando a fórmula: ∆Ct = Ct (gene alvo) – Ct (gene

GAPDH). Com a eficiência das amplificações dos genes alvo (IL-2 e TNF-α) e controle

endógeno aproximadamente igual, os resultados obtidos permitiram usar a expressão 2-∆∆ct

(∆∆ct = ∆Ctinfectados – ∆Ctnão infectados) para a quantificação dos transcritos.

Os níveis de expressão de mRNA das citocinas pró-inflamatórias IL-2 e TNF-α nos

diferentes intervalos de tempo e órgãos selecionados, foram comparados com o controle

negativo (não infectados) e apresentaram expressão significativa estatisticamente com p<0,05.

No cérebro, tanto a expressão de genes de IL-2 quanto de TNF-α tiveram sua expressão

reduzida significativamente após 48 horas de infecção, nos demais intervalos, não houve

mudança de expressão significativa. Já no músculo esquelético, observou-se um aumento

significativo de expressão de ambos os genes, após 48 e 72 horas de infecção. O rim

apresentou um aumento de expressão do gene IL-2 após 48 e 72 horas de infecção e redução

de expressão do gene TNF-α no mesmo período. O fígado por sua vez, não apresentou

Figura 14 – Curva de dissociação com amplificação do gene da

citocina TNF-α em camundongos infectados após 24horas com o



45

variação de expressão gênica em nenhum dos genes alvo em todos os intervalos de tempo

(Tabela 2).

No intervalo de tempo de 24 horas, não foi possível observar nenhuma mudança

estatisticamente significativa nos órgãos e tecido muscular selecionado, em ambos os genes.

Assim as figuras 15 e 16 mostram em porcentagem apenas os intervalos de tempo em que

houve variação gênica estatisticamente significativa, seja ela tanto positiva como negativa.

Tabela 2 - Valores de expressão de mRNA de IL-2 e TNF-α nos diferentes intervalos de

tempo e órgãos selecionados comparados *.

Citocinas 24h 48h 72h

Cérebro IL-2 -0,071 -0,864 0,106

TNF-α -0,073 -1,063 0,09

Fígado IL-2 -0,058 0,277 0,07

TNF- α 0,078 0,297 0,247

M.E IL-2 -0,063 1,683 0,528

TNF- α 0,019 0,409 0,510

RIM IL-2 -0,008 0,559 1,345

TNF- α -0,135 -2,085 -2,094

*Os valores em preto, não houve alteração estatística significativa na expressão da citocina quando

comparado com o controle negativo; valores em azul, aumento significativo de expressão de citocinas

quando comparado com o controle negativo e valores em vermelho, redução significativa de expressão de

citocinas quando comparado com o controle negativo, segundo teste estatístico Student t, sendo

consideradas diferenças estatisticamente significante quando p<0,05.

Figura 15 – Diferença em porcentagem da expressão de gene

da IL-2 nos órgãos e tecido muscular infectados com o MAYV

com 48 e 72 horas após infecção comparados com o controle

negativo.

46

No quadro 5 observamos a síntese das análises das expressões dos genes de IL-2 e

TNF- α nos diferentes intervalos de tempo (24, 48 e 72 horas) e órgãos estudados (cérebro,

fígado, rim e músculo esquelético) tanto no grupo de camundongos infectados com isolado do

MAYV em estudo (SBA91) quanto o grupo de camundongos não infectados (controle

negativo), onde nota-se a permanência da expressão de citocinas sem qualquer alteração em

todos os intervalos de tempo e em todos os órgãos e tecidos em estudo no grupo de

camundongos não infectados, enquanto que nos camundongos infectados com a cepa SBA 91

observa-se um aumento significativo de expressão de citocinas no músculo esquelético no

intervalo de tempo de 48 e 72 horas de ambas as citocinas e no rim no intervalo de tempo de

48 e 72 horas da IL-2; redução significativa de expressão de citocina no cérebro no intervalo

de tempo de 48 horas em ambas as citocinas e no rim do TNF- α no intervalo de tempo de 48

e 72 horas, nos demais períodos e órgãos não houve alteração significativa.

Figura 16 – Diferença em porcentagem da expressão de gene da

IL-2 nos órgãos e tecido muscular infectados com o MAYV com

48 e 72 horas após infecção comparados com o controle

negativo.

47

Quadro 5 - Análises de expressão de mRNA de IL-2 e TNF-α nos diferentes intervalos

de tempo e órgãos de camundongos inoculados com isolados de MAYV.

AMOSTRAS ANALISADAS

SBA 91 Controle Negativo

IL 2 TNF-alfa IL 2 TNF-alfa

ÓRGÃO 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h

Cérebro 0 - 0 0 - 0 0 0 0 0 0 0

Fígado 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Rim 0 + + 0 - - 0 0 0 0 0 0

Músculo

esquelético 0 + + 0 + + 0 0 0 0 0 0

Legenda: 0 = sem alteração estatística significativa na expressão da citocina; + = aumento significativo de

expressão de citocinas; - = redução significativa de expressão de citocinas.

48

4. DISCUSSÃO

Os Alphavirus, como MAYV, CHIKV e RRV, são frequentemente associados a surtos

de doenças reumáticas infecciosas pelo mundo, onde artralgia e artrite grave são os sintomas

mais comuns, sendo considerada uma doença autolimitada, porém debilitante devido

apresentar dor muscular e articular persistente por semanas e até meses, caracterizada por

infiltrados inflamátórios compostos em sua maioria de células mononucleares, sugerindo os

monócitos e macrófagos como um dos principais constituintes desses infiltrados. A maioria

dos estudos da patogênese dos alphavírus tem sido feito àqueles causadores de encefalite,

contudo o mecanismo pelo qual alphavírus artralgênicos causam doença são em grande parte

desconhecido (Morrison et al., 2006; 2007; Huang et al., 2007; Lidbury et al, 2008).

Praticamente todos os arbovírus são patogênicos para camundongos recém-nascidos,

adultos, hamsters e cobaias, porém, animais recém-nascidos são os mais vulneráveis,

enquanto que os animais jovens e adultos, de modo espontâneo ou dependendo do título do

inóculo se sobrepõe a natural resistência do adulto. Diversos estudos com Alphavirus têm

utilizado camundongos como animal experimental, sendo utilizados como modelos na

suscetibilidade e resistência ao vírus para analise imunopatologica das doenças causados pelos

integrantes desse gênero. Desta forma iniciamos nossos estudos utilizado camundongos (Mus

musculus) recém-nascidos como modelo experimental animal a fim de analisar a expressão de

citocinas pro-inflamatórias (IL-2 e TNF-α) nos diferentes órgãos e tecidos e intervalo de

tempo(Dias, 1986; Morrison et al., 2006).

Neste estudo, camundongos recém-nascidos infectados com MAYV pela via

subcutânea com o titulo viral de 10-9,5

DL50/0,02 mL, foram a óbito cinco dias após infecção.

Quando comparamos com estudos experimentais em hamster de 9 a 10 dias de vida por Li et

al. (2008) para análise de expressão de citocinas para o vírus da febre amarela, tiveram óbitos

entre o sexto e décimo dia após infecção pela via intraperitoneal, período este em que o nível

de viremia era baixo ou indetectável no sangue, sugerindo que a morte dos animais pode estar

correlacionado com a reposta imune do hospedeiro. Em nossos estudos, a morte após cinco

dias da infecção, pode estar relacionada ao nível de viremia e por se tratar de camundongos

recém-nascidos com sistema imune ainda prematuro em relação a camundongos jovens.

Na análise dos três primeiros dias após infecção (s.c.), observou-se a presença do vírus

em todos os fragmentos em estudo (cérebro, fígado, rim e músculo esquelético) e em todos os

intervalos de tempo (24, 48 e 72 horas) evidenciando a rápida replicação do vírus em uma

grande variedade de órgãos e tecidos em um curto período de tempo (quadro 4). Semelhante

ao obervado por Morrison et al. (2006), que detectaram picos de títulos virais no tecido dos

49

músculos quadriceps e tornozelo de camundongos infectatos pela via subcutânea com o RRV

após 24 e 48 horas pós infecção e em contraste, picos de títulos virais no cérebro e baço foram

marcadamente mais baixos do que os observados nos tecido muscular do quadriceps e

tornozelo.

Segundo Akhrymuk et al. (2012) descreve que o ciclo de replicação dos Alphavirus

ocorre no citoplasma e é concluido dentro de 24 a 48 horas pós-infecção (p.i.). A nível

citoplasmático ocorre a inibição global da transcrição celular pela nsP2, que é um eficiente

meio de resposta a inibição antiviral, sem afetar a replicação e saida do vírus. Como resultado

temos, a incapacidade das células infectadas para ativar expressão de citocinas e quimiocinas,

fato este que corrobora com os achados deste estudo, onde não foi possível observar nenhuma

mudança estatisticamente significativa nos órgãos e tecido muscular selecionados em um

intervalo de tempo de 24 horas após a infecção pelo MAYV, sugerindo que neste intervalo de

tempo possivelmente houve uma evasão a resposta celular antiviral do hospedeiro. Porém,

estudo sobre a imunopatogenicidade dos Alphavirus torna cada vez mais claro que a

imunogenicidade é devido a ativação de resposta imune inata em vez de aumento na produção

de antígenos, segundo Naslund et al. (2011). Morrinson et al. (2007) analisando o papel do

sistema complemento, componente importante de imunidade inata, descobriram que

camundongos deficientes em C3 desenvolvem inflamação nos ossos, tecido muscular

esquelético e articular, com sinais de doença e danos nos tecidos menos graves após infecção

por RRV, sugerindo que a ativação do complemento, independente do recrutamento de

células inflamatórias para os tecidos, contribui para a lesão tecidual, desempenhando um

papel central e imunorregulador na patogênese dos alphavirus que provocam doença

inflamatória, podendo também estar associada com formas mais graves de outras doenças

virais, incluindo a dengue.

Neste estudo foi encontrado no músculo esquelético, aumento significativo da

expressão dos genes da IL-2 e TNF-α, após 48 e 72 horas de infecção, sugerindo que tais

citocinas pró-inflamatórias podem ter um papel fundamental na patogênese das doenças

reumáticas. Lidbury et al. (2008) utilizando ratos como modelo, infectados com RRV pela via

subcutânea, demonstrou o papel dos macrófagos na patogênese da doença, comprovando que

mediadores pró-inflamatórios derivados de macrófagos, como IL-2 e TNF-α são a causa

principal de processos imunopatológicos que levam a doença reumática. Estudos com

primatas não humanos suscetíveis a infecção pelo CHIKV realizados por Labadie et al.

(2010), observaram principalmente nos órgãos linfóides, fígado e músculo, os macrófagos

como atores centrais durante as infecções e persistência da doença.

50

Análises realizadas a partir de articulações de pacientes com artrite reumatoide, Huang

et al. (2007), observaram receptores Toll-like (TLRs) como sendo crítico para a geração da

reposta imune, devido ativarem o sistema imune inato em macrofágos e células dendríticas,

resultando na produção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo o TNF-α e a IL-2, que

tiveram expressão persistente, apesar do desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa,

o que contribuiu para a patogênese da doença. Tal estudo corrobora com os achados em

nossos experimentos, onde também observamos uma maior expressão dessas citocinas pró-

inflamátorias no músculo esquelético dos animais infectados por MAYV.

Li et al. (2008), relataram que desde o terceiro dia após a infecção, foi evidente o

aumento das citocina Th1 nos órgão dos animais como o fígado e o rim, sugerindo o papel

protetor dessas citocinas contra a infecção, sendo importantes efetores na resposta mediada

por célula, uma tentativa do hospedeiro para controlar a infecção. No presente estudo, o rim

apresentou um aumento de expressão do gene IL-2 após 48 e 72 horas de infecção, porém a

expressão do gene TNF-α teve redução no mesmo período. O fígado por sua vez, não

apresentou variação de expressão gênica em nenhum dos genes alvo em todos os intervalos de

tempo. A causa dessa redução ou mesmo a sua não variação é desconhecida, sendo

necessários estudos futuros para determinar a sua causa, seja pelo depuramento passivo da

resposta inflamatória inicial pelo vírus, seja pela supressão da resposta de citocinas pelo vírus,

regulação de citocinas ou pela combinação desses mecanismos.

Nos estudos de Carmen et al. (2009) com NSV (Neuroadapted Sindbis virus) em

cultura de medula espinhal, demonstraram que o TNF-α é secretado em níveis elevados a

partir de 12 e 24 horas após infecção e está correlacionado com os efeitos deletérios no

sistema nervoso central, implicando-o como um mediador importante na morte de neurónios

em encefalomielite viral. Já outras citocinas inflamátorias como IL-2, IL-4, IL-17 e IFN-γ

não tiveram níveis elevados secretados nas culturas de medula espinhal infectadas. Em

nossos estudos, no cérebro, tanto a expressão de genes de IL-2 quanto de TNF-α tiveram sua

expressão reduzida significativamente após 48 horas de infecção, e nos demais intervalos, não

houve mudança significativa de expressão. Segundo Dias (1986), lesões no sistema nervoso

central são frequentes, determinando inclusive quadros de encefalite em animais recém-

nascidos. Porém há uma variação desse comportamento, nem sempre se comprovando uma

agressão ao sistema nervoso central, dependendo assim do tipo viral, a via de inoculação ou o

titulo do vírus. Na maioria das vezes não se percebe uma resposta inflamatória, quer seja

discreta ou ampla a injúria celular neuronal e glial, principalmente nos animais que morrem

em 24 ou 48 horas após a infecção. Sugerindo assim, que a redução na expressão dos genes de

51

citocinas pro inflamatórias e até mesmo a sua não variação, pode ser devido a uma

inexpressível resposta inflamatória a infecção pelo MAYV ou por se tratar de um vírus não

neurotrópico, estando presente, porém sem causar danos inflamatórios graves.

De acordo com Morrison et al. (2006) as análises histológicas de ossos dos membros

posteriores, juntas, tecido do músculo esquelético e tecidos do sistema nervoso central,

resultaram em pouca ou nenhuma inflamação cinco dias após a infecção, diferente do

encontrado nos ossos e articulações dos membros inferiores, com presença abundante de

células inflamatórias após cinco dias de infecção atingindo o seu pico de gravidade entre sete

e dez dias de pós-infecção, ocorrendo bem depois do pico do título viral, sendo pouco

expressiva ou ausente no terceiro dia pós infecção, o que nos leva a pensar em futuros

experimentos analisando o quarto e quinto dia após infecção no intuito de observar expressão

signficativamente elevada das citocinas em estudo, bem como avaliar outras possíveis

citocinas como INF- γ e TGF-β, envolvidas na patogênese da doença.

Nosso estudos mostraram o aumento significativo de citocinas pró-inflamatórias (IL-2

e TNF-α) em tecido muscular esquelético e no rim após 48 horas de infecção pelo MAYV,

semelhante ao observado em outros estudos com Alphavirus artralgênicos. Porém a

diminuicão ou ausência de variação nos demais órgãos, levanta a necessidade de estudos mais

detalhados acerca dos mecanismos de evasão do vírus à resposta imunológica do hospedeiro,

bem como a análise por um período mais prolongado pós-infecção, a fim de se observar um

aumento de expressão das citocinas.

52

5. CONCLUSÕES

No presente estudo camundongos infectados com MAYV pela via subcutânea com o título

viral de 10-9,5

DL50/0,02 mL, foram a óbito cinco dias após infecção.

Nas análises dos três primeiros dias após infecção, todos os fragmentos em estudo

(cérebro, fígado, rim e músculo esquelético) e em todos os intervalos de tempo (24, 48 e 72

horas) foram confirmados por RT- PCR com infecção pelo MAYV;

Apesar das variações de tempo no aparecimento dos camundongos infectados com isolado

do MAYV, a confirmação da presença do vírus nos órgãos e tecido estudados pelo método de

RT-PCR, foi positiva desde o primeiro dia de infecção;

A quantificação de expressão de mRNA das citocinas IL-2 e TNF-α apresentou no cérebro

redução significativa de expressão de ambos os genes após 48 horas de infecção; no rim um

aumento de expressão do gene IL-2 após 48 e 72 horas de infecção, porém redução de

expressão do gene TNF-α no mesmo período; o fígado não apresentou variação de expressão

gênica em nenhum dos genes alvo em todos os intervalos de tempo, já o músculo esquelético,

teve aumento significativo de expressão dos genes da IL-2 e TNF-α, após 48 e 72 horas de

infecção.

No intervalo de tempo de 24 horas após infecção pelo MAYV, não foi possível observar

nenhuma mudança estatisticamente significativa nos órgãos e tecido muscular selecionados,

sugerindo que neste intervalo de tempo possivelmente houve uma evasão a resposta celular

antiviral do hospedeiro.

53

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59

ANEXO 1

60

ANEXO 2

61

ANEXO 3

anÁlise da expressÃo dos genes das citocinas il-2 e α … · 2016. 7. 5. · citocinas por...

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