anaplasma platys e ehrlichia canis em cães: avaliação de alterações oculares ... ·...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

Anaplasma platys e Ehrlichia canis em cães: Avaliação de alterações

oculares, desenvolvimento e validação de técnica de diagnóstico molecular

Hérika Xavier da Costa

Orientador: Prof. Dr. Guido Fontgalland Coelho Linhares

GOIÂNIA

2015

HÉRIKA XAVIER DA COSTA

Anaplasma platys e Ehrlichia canis em cães: Avaliação de alterações

oculares, desenvolvimento e validação de técnica de diagnóstico molecular

Tese apresentada para a obtenção do título de

Doutor em Ciência Animal junto à Escola de

Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de

Goiás

Área de Concentração:

Sanidade Animal e Higiene e Tecnologia de

alimentos

Linha de pesquisa:

Parasitos e doenças parasitárias

Orientador:

Prof. Dr. Guido F, Coelho Linhares – EVZ/UFG

Comitê de Orientação:

Dra. Sabrina Castilho Duarte- EMBRAPA/SC

Prof (a). Dra. Valéria de Sá Jayme- EVZ/UFG

GOIÂNIA

2015

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar, agradeço a Deus por mais este presente e por tudo que aprendi

nos últimos quatro anos. Aos meus pais, Maria Bernadete e Arcidino, que foram os maiores

responsáveis pela minha formação e desenvolvimento humano. Os senhores são meu orgulho.

Ao meu querido orientador Prof. Dr. Guido F. C. Linhares pela imensa paciência,

incrível competência e por todo apoio, incentivo, ensinamentos e generosidade em repassar

seus conhecimentos.

Á minha amiga Sabrina por ter me oferecido seu apoio quando eu mais precisei. A

sua ajuda foi imprescindível para o desenvolvimento deste trabalho. Você é um dos anjos que

Deus colocou na minha vida. Obrigada por estar ao meu lado mesmo distante, me dando força

e me colocando para cima, sempre com palavras positivas e bom humor, tornando mais leves

os problemas do dia a dia.

Aos meus grandes amigos e familiares pela ajuda, imensa paciência e

compreensão. Agradeço por vocês entenderem o motivo das minhas ausências em diversas

reuniões.

Aos médicos veterinários, todos os funcionários e diretoria do Hospital

Veterinário Pluto pela imensa disponibilidade em ajudar e por disponibilizar as amostras

sanguíneas e os dados dos animais utilizados no presente estudo.

À oftalmologista veterinária, Camila Donatti, por ter realizado exames oftálmicos

minuciosos em todos os cães identificados com alterações oculares.

À FAPEG por conceder o financiamento necessário para o desenvolvimento e

execução da pesquisa que culminou na minha tese de doutorado.

Agradeço a todos os funcionários da UFG por serem tão prestativos e

acolhedores.

À professora Valéria de Sá Jayme por ter fornecido dicas preciosas para o

desenvolvimento desta pesquisa e ao professor Emmanuel Arnhold por ter auxiliado a

aplicação da estatística.

Aos cães que participaram e contribuíram com esta pesquisa, pois sem eles

nenhuma dessas páginas estaria completa.

A todas as pessoas que, direta ou indiretamente, contribuíram para a execução

dessa tese de doutorado.

SUMÁRIO

CAPÍTULO 1 ........................................................................................................................ 1

CONSIDERAÇÕES INICIAIS .......................................................................................... 1

REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 7

CAPÍTULO 2 ...................................................................................................................... 12

DETECÇÃO ESPECÍFICA POR PCR EM TEMPO REAL DE Anaplasma platys E Ehrlichia

canis .................................................................................................................................... 29

RESUMO ........................................................................................................................ 29

ABSTRACT .................................................................................................................... 29

INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 30

MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 31

RESULTADOS ............................................................................................................... 37

DISCUSSÃO ................................................................................................................... 49

CONCLUSÃO ................................................................................................................. 52

REFERENCIAS ............................................................................................................... 54

CAPÍTULO 3 ...................................................................................................................... 12

DETECÇÃO MOLECULAR DE Anaplasma platys E Ehrlichia canis EM CÃES COM E

SEM ALTERAÇÕES OCULARES ................................................................................. 12

RESUMO ........................................................................................................................ 12

ABSTRACT .................................................................................................................... 12

INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 13

MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 15

RESULTADOS ............................................................................................................... 19

DISCUSSÂO ....................................................................................................................... 23

CONCLUSÃO ................................................................................................................. 25

REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 26

CAPÍTULO 4 ...................................................................................................................... 57

CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................... 57

ANEXO A ........................................................................................................................... 60

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 2

FIGURA 1. Uveíte no olho direito de um cão SRD, macho, de quatro anos com PCR

positivo para E. canis....................................................................................................21

FIGURA 2. Uveíte, hipópio e úlcera de córnea no olho esquerdo de um cão Shih Tzu,

macho, de dois anos com PCR positivo para E. canis.........................................................21

FIGURA 3. Úlcera de córnea no olho esquerdo de um cão SRD, macho, de três anos com

PCR positivo para A. platys...........................................................................................23

CAPÍTULO 3

FIGURA 1. Alinhamento da região correspondente ao gene 16S rRNA de A. platys

(AF156784), A. phagocytophilum (U02521), E. canis (AF162860), E. ewingii (U96436), E.

chaffeensis (U86665), E. bovis (AF294789) e E. risticii (M21290) pelo método de Clustal

W, com localização do iniciador senso espécie-específico AXCf (caixa com bordas

marron), iniciador anti-senso gênero-específico AXCr (caixa com bordas laranja) e

sonda AXC SR (caixa com bordas azul). ........................................................................... 38



chaffeensis (U86665), E. bovis (AF294789) e E. risticii (M21290) pelo método de Clustal

W, com localização do iniciador senso espécie-específico EXCf (caixa com bordas

vermelhas), iniciador anti-senso espécie-específico EXCr (caixa com bordas roxa) e

sonda EXC SR (caixa com bordas verde). ........................................................................ 39

FIGURA 3. Curva de amplificação de A. platys utilizando diferentes concentrações dos

iniciadores AXCf e AXCr (A). Interface do software Step One Plus (v. 2.3) mostrando o

resultado (presença e ausência) da qPCR utilizando diferentes concentrações dos

iniciadores AXCf e AXCr para detecção de A. platys (B). ................................................ 40

FIGURA 4. Curva de amplificação de E. canis utilizando diferentes concentrações dos

iniciadores EXCf e EXCr (A). Interface do software Step One Plus (v. 2.3) mostrando o

resultado da qPCR utilizando diferentes concentrações dos iniciadores EXCf e EXCr

para detecção de E. canis (B). ............................................................................................ 40

FIGURA 5. Curva de amplificação de A. platys utilizando diferentes concentrações da

sonda AXC SR (A). Interface do software Step One Plus (v. 2.3) mostrando o resultado

da qPCR utilizando diferentes concentrações da sonda AXC SR para detecção de A.

platys (B). ............................................................................................................................ 41

FIGURA 6. Curva de amplificação de E. canis utilizando diferentes concentrações da

sonda EXC SR (A). Interface do software Step One Plus (v. 2.3) mostrando o resultado

da qPCR utilizando diferentes concentrações da sonda EXC SR para detecção de E.

canis (B). ............................................................................................................................. 42

FIGURA 7. Teste de especificidade utilizando qPCR para detecção de A. platys

utilizando DNA de C. familiaris, R. sanguineus, A. platys, B. vogeli, E. canis, H. canis e M.

haemofelis (A). Resultado positivo com amplificação específica somente de A. platys (B).

............................................................................................................................................ 44

FIGURA 8. Teste de especificidade qPCR para detecção de E. canis utilizando DNA de

C. familiaris, R. sanguineus, A. platys, B. vogeli, E. canis, H. canis e M. haemofelis (A).

Resultado positivo com amplificação específica somente de E. canis (B). ........................ 44

FIGURA 9. Produtos amplificados através da PCR convencional com Primer PLATYS

F/ EHR16SR. Avaliação da sensibilidade da PCR convencional utilizando 4 diluições de

DNA extraído de cão com exame parasitológico positivo para A. platys e 10 diluições do

DNA de A. platys com diferentes concentrações. Eletrofores em gel de agarose (1,2%)

corado com brometo de etídio. Na canaleta 1 está o marcador de peso molecular de 100

pb (Invitrogen). Nas canaletas de 2 a 5 estão indicadas as amostras com DNA alvo de A.

platys nas diferentes concentrações: 4 fg (16 ng de DNA extraído); 0,9 fg (1,6 ng de DNA

extraído); DNA alvo não quantificado (0,2 ng de DNA extraído) e DNA alvo não

quantificado (0,02 ng de DNA extraído). E nas canaletas 6 a 14 estão o DNA de E. canis

em diluições seriadas na base 10 (14000 fg a 14 x 10-6

fg/2 µL), respectivamente.

Canaleta 16: controle negativo. ......................................................................................... 45

FIGURA 10. Interface do software Step One Plus (v. 2.3) mostrando a curva-padrão do

ensaio de quantificação absoluta. Os pontos vermelhos representam os Cts gerados pelo

Log de cada concentração de DNA padrão. Os pontos azuis representam os Cts gerados

pelo Log de cada concentração de A. platys contidas no DNA extraído do sangue de cão

positivo para A. platys no exame parasitologico direto (A). DNA diluído obtido da

extração de DNA do sangue de cão positivo no exame parasitologico direto para para A.

platys (B). ............................................................................................................................ 45

FIGURA 11. Curva de amplificação de avaliação do limiar e detecção. As linhas

coloridas representam quantidades decrescentes de DNA alvo (14000 fg a 14 x 10-6

fg/2

µL) quanto maior a quantidade de DNA (primeira linha azul), menor o valor de Ct

(menos ciclos de amplificação são necessários para atingir o limiar de detecção). A linha

amarela mostra a boa performance do sistema em detectar até 0,9 fg de A. platys (A).

Resultado da diluição seriada do DNA de A. platys (B). ................................................... 46

FIGURA 12. Produtos amplificados através da PCR convencional com Primer EBR1/

EBR5. Avaliação da sensibilidade da PCR convencional utilizando 4 diluições de DNA

extraído de cão com exame parasitológico positivo para E. canis e 10 diluições do DNA

de E. canis com diferentes concentrações. Eletroforese em gel de agarose (1,2%) corado

com brometo de etídio. Na canaleta 1 está o marcador de peso molecular de 100 pb

(Invitrogen). Nas canaletas de 2 a 5 estão indicadas as amostras com DNA alvo de E.

canis nas diferentes concentrações: 7,48 fg (20 ng de DNA extraído); 1,15 fg (2 ng de

DNA extraído); 0,25 fg (0,2 ng de DNA extraído) e DNA alvo não quantificado (0,02 ng

de DNA extraído). E nas canaletas 6 a 14 estão o DNA de E. canis em diluições seriadas

na base 10 (14000 fg a 14 x 10-6

fg/2 µL), respectivamente. Canaleta 16: controle

negativo. ............................................................................................................................. 47


ensaio de quantificação absoluta. Os pontos vermelhos representam os Cts gerados pelo

Log de cada concentração de DNA padrão. Os pontos azuis representam os Cts gerados

pelo Log de cada concentração de E. canis contidas no DNA extraído do sangue de cão

positivo para E. canis no exame parasitologico direto (A). DNA diluído obtido da

extração de DNA do sangue de cão positivo no exame parasitologico direto para E. canis

(B). ...................................................................................................................................... 47

FIGURA 14. Curva de amplificação de avaliação do limiar e detecção. As linhas

coloridas representam quantidades decrescentes de DNA alvo (14000 fg a 14 x 10-6

fg/2

µL) quanto maior a quantidade de DNA (primeira linha azul), menor o valor de Ct

(menos ciclos de amplificação são necessários para atingir o limiar de detecção). A linha

cinza mostra a boa performance do sistema em detectar até 0,14 fg de E. canis (A).

Resultado da diluição seriada do DNA de E. canis (B). .................................................... 48

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 2

TABELA 1. Resultados dos testes de PCR para detecção de E. canis e A. platys em

amostras de sangue de cães com alterações oculares (CAO) e sem alterações oculares

(SAO) atendidos na cidade de Goiânia- GO, Brasil. ......................................................... 19

TABELA 2. Tipos de manifestações oculares identificadas nos 100 cães pertencentes ao

grupo (CAO). ..................................................................................................................... 22

CAPÍTULO 3

TABELA 1. Valor preditivo (resultado positivo de teste) e valor preditivo (resultado

negativo de teste) do ensaio de qPCR para detecção de E. canis e A. platys. ................... 49

LISTA DE QUADROS

CAPÍTULO 2

QUADRO 1. Tipos de manifestação ocular em cães PCR positivo para A. platys. .......... 23

CAPÍTULO 3

QUADRO 1. Sequências de iniciadores e sondas selecionados para amplificação

específica de fragmentos dos genes 16S rRNA de A. platys e E. canis por qPCR. ........... 43

QUADRO 2- Valores do método de qPCR (TaqMan) para detecção de A. platys e E.

canis. ................................................................................................................................... 52

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

°C Graus Celsius

CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais

Ct Cicle threshold

DNA Deoxyribonucleic acid (ácido desoxirribonucléico)

EDTA Ethylenediaminetetracetic acid

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

fg Fentogramas

IC Intervalo de confiança

Kit Conjunto diagnóstico

Log Logaritmo

mL Mililitro

ng Nanograma

pb Pares de base

PCR Polymerase chain reaction (Reação em Cadeia da Polimerase)

pmoles Picomoles

qPCR Quantitativa PCR

R2 Coeficiente de correlação

Slope Coeficiente angular

μl Microlitro

RESUMO

Anaplasma platys e Ehrlichia canis são riquétsias intracelulares obrigatórias de cães. A. platys

parasita plaquetas causando a trombocitopenia cíclica infecciosa canina (TCIC), enquanto que

E. canis possui tropismo por células mononucleares circulantes, causando a erliquiose

monocítica canina (EMC). Os sinais clínicos da EMC e TCIC são inespecíficos e comuns a

inúmeras outras enfermidades transmitidas por carrapatos. O diagnóstico definitivo de E.

canis e A. platys é firmado através do emprego de testes de diagnóstico específicos. Dessa

forma, dois novos protocolos de ensaios de PCR em tempo real (qPCR) para o detecção de A.

platys e E. canis foram desenvolvidos a partir de sequências de referência para o gene 16S

rRNA de A. platys e E. canis. Os novos iniciadores e sondas desenhados foram capazes de

detectar A. platys e E. canis. Identificação de infecções naturais em cães por A. platys e E.

canis, previamente confirmada por PCR convencional demonstrou alta correlação na

sensibilidade (100% para A. platys e E. canis) e especificidade epidemiológicas (100% para

A. platys e 98,41% para E. canis) com os novos protocolos de qPCR utilizando sondas de

hidrólise TaqMan. Os testes de especificidade analítica produziram resultado espécie

específicos, não ocorrendo amplificação de DNA dos seguintes hemoparasitos: Babesia

vogeli, Hepatozoon canis e Mycoplasma haemofelis. DNA de Rhipicephalus sanguineus

também não foi amplificado. Os dois novos protocolos de qPCR descritos aqui foram capazes

de detectar até 0,14 fg de DNA de E. canis e 0,9 fg de DNA de A. platys e representam

alternativas como ferramenta de diagnóstico para a detecção específica de A. platys e E. canis,

sendo útil para o diagnóstico dessas hemoparasitoses em cães. As alterações oculares estão

entre os sinais clínicos encontrados em cães infectados com Ehrlichia canis e casos de uveítes

já foram atribuídos a infecção por A. platys, porém a frequência de lesões oculares em casos

de infecção por A. platys ainda é desconhecida. Após pesquisar a frequência de infecções por

E. canis e A. platys em 100 cães com alterações oculares (CAO) e 100 cães sem alterações

oculares (SAO), utilizando-se a PCR como método de diagnóstico, verificou-se que dentre os

hemoparasitos, E. canis e A. platys, detectados e identificados por PCR, E. canis foi o de

maior frequência, tanto no grupo de cães CAO (33%; 33/100) quanto no grupo de cães SAO

(24%; 24/100). A frequência de A. platys foi de 5% (5/100) para o grupo de cães CAO e 4%

(4/100) para o grupo de cães SAO. As alterações oculares que apresentaram relação com a

infecção por E. canis foram uveíte bilateral e descolamento de retina. Não foi possível

verificar a relação das alterações oculares com a infecção por A. platys devido ao baixo

número de cães com alterações oculares infectados com esta riquétsia.

Palavras-chave: hemoparasitoses canina, cães, diagnóstico molecular, PCR.

ABSTRACT

Anaplasma platys and Ehrlichia canis are obligate intracellular rickettsial organisms of dogs.

A. platys appear to parasitize only platelets causing canine infectious cyclic thrombocytopenia

(CICT), whereas E. canis has tropism for circulating mononuclear cells causing canine

monocytic ehrlichiosis (CME). Clinical signs of CME and CICT are nonspecific and common

to many other diseases transmitted by ticks. Definitive diagnosis of A. platys and E. canis is

made by specific diagnostic tests; however, two new real time PCR protocols (qPCR) for the

detection of A. platys and E. canis were developed from reference sequences for the 16S

rRNA gene of A. platys and E. canis. New primers and probes were able to detect A. platys

and E. canis. Identification of natural infections in dogs by A. platys and E. canis, previously

confirmed by conventional PCR, showed high correlation sensitivity (100% for A. platys and

E. canis) and epidemiological specificity (100% for A. platys and 98,41% for E. canis) with

new qPCR using hydrolyses probe (TaqMan) protocols Analytical specificity tests produced

species-specific results, not occurring DNA amplification of the following blood parasites

Babesia vogeli, Hepatozoon canis and Mycoplasma haemofelis. R. sanguineus DNA. Two

new qPCR protocols described were able to detect 0,14 fg of E. canis DNA and 0,9 fg of A.

platys DNA and represent alternative as a diagnostic tool for the specific detection of A.

platys and E. canis being useful for diagnosis of these canine hemoparasitosis. Ocular

abnormalities are among the clinical signs found in dogs infected with E. canis and cases of

uveitis have been attributed to infection with A. platys, but the frequency of eye injuries in

cases of infection with A. platys is still unknown. After searching the frequency of infections

by A. platys and E. canis in 100 dogs with ocular (OA) and 100 dogs without ocular

alterations (WOA), using the PCR as a diagnostic method, we found that among the

hemoparasites, A. platys and E. canis detected and identified by PCR, E. canis was the most

frequent, both in the group of OA dogs (33%; 33/100) and in the group of WOA dogs (24%;

24 / 100). The frequency of A. platys was 5% (5/100) for the group of OA dogs and 4%

(4/100) for the group of WOA dogs. Ocular changes associated with infection by E. canis

were bilateral uveitis and retinal detachment. It was not possible to verify the relationship of

ocular manifestations with infection by A. platys due to the low number of dogs with ocular

abnormalities infected with this rickettsia.

Keywords: Canine hemoparasitosis, dogs, molecular diagnosis, PCR.

1

CAPÍTULO 1

CONSIDERAÇÕES INICIAIS

As hemoparasitoses são de grande importância na clínica médica, pois são

enfermidades frequentes, levando ao adoecimento dos animais infectados e em casos mais

graves, à morte. Os animais infectados também podem atuar como reservatórios de patógenos

com potencial de infecção para os seres humanos, desenvolvendo um importante papel no

contexto da saúde pública (1, 2)

.

No Brasil, os principais hemoparasitos de cães são: Anaplasma platys, Ehrlichia

canis, Babesia vogeli, Hepatozoon canis e Mycoplasma spp. (3, 4)

. Os carrapatos são os

principais vetores dos hemoparasitos, sendo o carrapato marrom do cão, Rhipicephalus

sanguineus, o principal vetor de E. canis, M. haemocanis, M. haemofelis, B. vogeli e H. canis

em áreas urbanas das regiões de clima tropical e subtropical, principalmente devido à sua

maior abundância nessas regiões (1, 5)

. R. sanguineus também é incriminado como potencial

vetor de A. platys, pois o DNA de A. platys tem sido detectado em carrapatos desta espécie (6-

8). Entretanto, a transmissão experimental de A. platys utilizando R. sanguineus como vetor

não foi comprovada (9)

.

A. platys, agente etiológico da trombocitopenia cíclica infecciosa canina (TCIC), é

uma bactéria Gram-negativa que infecta especificamente as plaquetas determinando episódios

cíclicos de trombocitopenia, característica esta que dá origem ao nome da enfermidade,

pertence à ordem Rickettssiales, família Anaplasmataceae e gênero Anaplasma (10)

.

Casos clínicos da TCIC têm sido reportados por todo o mundo, incluindo os

Estados Unidos, Grécia, Taiwan, Espanha, Sul da China, Austrália, Tailândia e Venezuela (11)

.

A. platys também causa trombocitopenia em cães nas várias regiões do Brasil, não sendo rara

a coinfecção com E. canis e B. vogeli, podendo o carrapato R. sanguineus ser o mesmo vetor

destas três espécies (10, 12-15)

.

A frequência de infecção por A. platys no Brasil varia de 5,1% (16)

a 18,8% (14)

. E

os cães com TCIC frequentemente apresentam sinais clínicos mais brandos ou são

assintomáticos (17)

, exceto em casos de coinfecção com B. vogeli, E. canis e outros

microrganismos (18)

. Pouco se sabe sobre fatores de risco associados à doença no Brasil.

No entanto, co-infecções com A. platys e E. canis foram relatadas em cães do

Brasil, o que leva ao agravamento do quadro clínico destes animais (4, 19, 20)

.

2

A. platys causa parasitemia e trombocitopenia cíclica a intervalos de 10 a 14 dias e

alguns dias após a infecção ocorrem diminuições bruscas no número de plaquetas e A. platys

desaparece da circulação. Em seu ponto mais baixo, a trombocitopenia pode ser grave (20.000

a 50.000 plaquetas/µL), e a agregação plaquetária fica diminuída (21)

.

Os sinais clínicos começam após um período de incubação de oito a 15 dias, com

alguns sinais sugestivos, como anorexia e distúrbios hemostáticos (22)

. Cães infectados

frequentemente são assintomáticos (23)

. Hiperplasia folicular de nódulos linfáticos e

plasmocitose têm sido observadas na fase aguda da infecção, e alguns órgãos, tal como baço,

podem desenvolver hemorragia (11)

. Uveíte também pode ser associada com infecção por A.

platys em cães (22, 24)

.

A trombocitopenia é um achado comum em infecções por A. platys, entretanto

não é patognomônico da TCIC ou de outras hemoparasitoses (10)

. Anemia arregenerativa

normocítica normocrômica, associada à anemia de inflamação, leucopenia, hipoalbuminemia,

e hiperglobulinemia foi descrita em associação com a infecção experimental por A. platys (25)

.

E. canis, agente etiológico da erliquiose monocítica canina (EMC), é uma bactéria

estritamente intracelular, Gram-negativa, pertencente à ordem Rickettsiales, família

Anaplasmataceae e gênero Ehrlichia (26)

. A EMC é considerada uma das mais importantes

doenças que acometem os cães, sendo potencialmente fatal, tanto para os cães domésticos,

quanto para os demais membros da família Canidae (27)

.

No Brasil, o primeiro caso da EMC foi relatado em cão domiciliado em Belo

Horizonte, Minais Gerais na década de 70 (28)

. Apesar da existência de relatos da EMC

acometendo cães em todo o País, dados precisos sobre a prevalência da doença nas diferentes

áreas do Brasil ainda são escassos. Atualmente, é considerada endêmica em diversas regiões

brasileiras, sendo a doença infecciosa transmitida por carrapatos com maior frequência em

cães (29)

.

E. canis foi relatada em aproximadamente 20% a 30% dos cães atendidos em

hospitais e clínicas veterinárias de Estados das regiões Nordeste, Sudeste, Sul e Centro-Oeste

(12, 13, 30-32). O risco de infecção por E. canis é maior em cães mais expostos a áreas com

intensa infestação por carrapatos (16, 33)

.

A transmissão de E. canis geralmente ocorre durante o parasitismo por ninfas e/

ou adultos do carrapato R. sanguineus, o qual mantém a bactéria por transmissão transestadial

(34). O período de incubação da EMC é de oito a 20 dias, e os sinais clínicos da doença são

bastante variados. As fases da EMC do ponto de vista clínico são: aguda, subclínica e crônica,

e acomete cães de idades variadas (27)

.

3

As principais alterações clínicas observadas são apatia, anorexia/ hiporexia,

vômito, secreção óculo nasal, esplenomegalia, mucosas pálidas, hemorragias (petéquias,

equimoses e epistaxe) e uveíte (27, 35)

. Os sinais oculares podem estar presentes em todas as

fases da EMC (24, 36)

.

O exame ocular de animais com doenças sistêmicas é um componente diagnóstico

essencial do exame físico completo, o qual pode auxiliar o diagnóstico da EMC e TCIC em

cães. Alterações oculares podem estar presentes em todas as fases da EMC e casos de uveíte

já foram atribuídos à infecção por A. platys (24)

. As alterações oculares relacionadas à EMC

incluem uveíte anterior, coriorretinite, hemorragias da retina e conjuntivais, congestão

episcleral, opacidade de córnea, hipópio e hifema (37)

.

A prevalência de lesões oculares em casos de infecção natural por E. canis é

muito variável e a patogênese das lesões oculares associada à EMC não está totalmente

elucidada. De acordo com MARTIN (38)

, 50% dos cães infectados experimentalmente

apresentaram lesões oculares durante a fase aguda. ORIÁ et al. (39)

encontraram uma

frequência para E. canis de 86,27% (44/51) ao analisar 51 cães com uveíte utilizando testes

sorológicos como métodos de diagnóstico. Já KOMNENOU et al. (40)

ao analisarem cães com

uveítes, detectaram que 100% dos animais apresentaram-se sorologicamente positivos para E.

canis, sugerindo a inclusão da EMC como diagnóstico diferencial para cães com uveítes em

áreas endêmicas.

Os achados laboratoriais mais comuns são trombocitopenia e anemia.

Trombocitopenia grave provoca hemorragias retinianas e hifema, e petéquias conjuntivais

podem ser vistas na fase crônica da doença (22)

. Hiperviscosidade devido à hiperproteinemia

intensifica ainda mais a disfunção plaquetária e pode resultar em anormalidades oculares e no

sistema nervoso central (1)

.

Em virtude da gravidade da EMC e do seu caráter endêmico em regiões tropicais

e subtropicais, a detecção precoce da infecção é extremamente importante. Dessa forma, há

grande preocupação com o desenvolvimento e uso cada vez maior de novas técnicas para o

diagnóstico da infecção por E. canis (37)

.

As técnicas tradicionais de diagnóstico laboratorial dos hemoparasitos, A. platys e

E. canis, incluem os métodos diretos, como a identificação direta do microrganismo com base

na morfologia, pela avaliação por meio da microscopia ótica dos parâmetros e formas

intracelulares observadas nos esfregaços sanguíneos dos animais, e métodos indiretos, como a

quantificação de anticorpos e/ou antígenos em espécimes clínicos (12)

, os quais são valiosas

ferramentas de diagnóstico para TCIC e EMC. No entanto, o diagnóstico definitivo de

4

infecção por A. platys e E. canis de forma mais eficaz e rápida requer a identificação do

agente etiológico por meio do uso de técnicas moleculares.

Historicamente, o exame parasitológico direto por meio da microscopia ótica tem

sido bastante utilizado na detecção de A. platys e E. canis por ser um método simples,

específico e que não necessita de reagentes e equipamentos sofisticados, porém, é pouco

sensível, principalmente nos casos de infecções de fase crônica onde a parasitemia é baixa (22)

.

A detecção de mórulas de E. canis ocorre por um curto período de tempo (geralmente na fase

aguda da EMC) nos monócitos e a visualização durante as fases subclínicas e crônicas da

doença é rara, conduzindo a resultados falso-negativos. Inclusões de E. canis já foram

descritas parasitando plaquetas e quando ocorre, não é possível identificá-los apenas pela

morfologia. Já na TCIC, este método de diagnóstico não é o mais indicado para detecção de

A. platys em virtude da parasitemia cíclica do agente (24)

.

O exame parasitológico direto nem sempre é conclusivo para a diferenciação entre

espécies ou subespécies morfologicamente semelhantes, sendo em alguns casos imprecisos,

principalmente em decorrência da parasitemia cíclica dos microrganismos e da semelhança

morfológica entre as diferentes espécies de hemoparasitos (10, 35, 41)

. Além disso, a ausência de

parasitos em esfregaços de sangue ou creme leucocitário não exclui a possibilidade de

infecção (27)

.

A identificação de mórulas de E. canis no esfregaço sanguíneo ocorre apenas nas

duas primeiras semanas da infecção e em pequenas quantidades, devido à baixa parasitemia, e

a porcentagem de células infectadas raramente ultrapassar 1% (37)

. OLIVEIRA et al. (42)

, ao

analisarem através do exame parasitológico direto, 48 amostras de sangue de cães em

Jaboticabal-SP positivas no dot-ELISA, verificaram a presença de mórulas de E. canis em

uma das amostras avaliadas, obtendo uma frequência de 2% (1/48). Resultados semelhantes

foram observados por FARIA et al. (43)

, os quais verificaram pelo exame parasitológico direto

uma frequência de E. canis de 5,7% (2/35) em cães sintomáticos em Jaboticabal-SP.

Entre as técnicas de diagnóstico utilizando biologia molecular, a mais usada na

detecção de A. platys e E. canis é a reação em cadeia da polimerase (PCR). Esta é uma técnica

que apresenta especificidade e sensibilidade elevadas, sendo capaz de detectar fragmentos-

alvo do agente em amostras de sangue ou em outro tipo de amostra clínica, estando ou não os

parasitos viáveis, sendo considerada uma ferramenta promissora para o diagnóstico de muitas

doenças parasitárias (44)

.

A PCR convencional é considerada um dos métodos de diagnóstico direto mais

sensível, específico e rápido, atualmente disponível para a detecção de espécies de Ehrlichia e

5

Anaplasma em cães (41, 45)

. No Brasil, têm sido realizados estudos avaliando a prevalência de

A. platys e E. canis em cães, e infecções concomitantes entre estes dois hemoparasitos têm

sido confirmadas usando PCR (3, 4)

.

A PCR é o método apropriado para a confirmação do diagnóstico de infecções na

fase crônica da EMC. Além disso, é capaz de identificar o agente envolvido na infecção por

espécie ou mesmo subespécie (45)

. Dessa forma, são ferramentas que suprem as limitações das

técnicas convencionais de diagnóstico, identificação e diferenciação de microrganismos (46)

.

Outras técnicas resultantes de modificações da PCR têm sido desenvolvidas com

o objetivo de aumentar a sensibilidade desta metodologia, como por exemplo, a PCR em

tempo real (qPCR), a qual vem ganhando espaço nos diagnósticos clínicos e nos laboratórios

de pesquisa por apresentar a capacidade de gerar resultados quantitativos (15, 47, 48)

.

Protocolos de ensaios de PCR convencional, nested-PCR e qPCR têm sido

amplamente empregados na detecção e discriminação de hemoparasitos em cães (4, 19, 31, 41, 45,

49-52). Entre as vantagens da PCR, destaca-se sua elevada sensibilidade, especificidade e

capacidade de amplificar uma sequência precisa de DNA. Contudo, a PCR também apresenta

limitações, como a necessidade de conhecer a sequência de DNA a amplificar para que

possam ser sintetizados iniciadores específicos. Além disso, a PCR convencional e nested-

PCR não apresentam valores quantitativos, não são automatizadas e precisam passar por

padronização mais meticulosa, apresentando tempo maior de execução. Os géis de agarose

apresentam precisão ruim, baixa sensibilidade e baixa resolução. E as chances de

contaminação do ambiente são maiores ( 41, 45, 49-52)

.

As desvantagens comumente observadas na PCR convencional e nested-PCR

podem ser minimizadas ou até mesmo evitadas com o uso da qPCR. As características

relevantes da qPCR são rapidez de resultados, alta especificidade, alta sensibilidade e

capacidade de quantificação de DNA, permitindo um aumento na velocidade da tomada de

decisões, além de possuir menor risco de contaminação, pois o processo de amplificação do

DNA ocorre em um sistema fechado (50)

. A qPCR permite o acompanhamento da reação e a

apresentação dos resultados de forma mais precisa e rápida em relação à PCR que apresenta

somente resultados qualitativos. Outra vantagem além do acompanhamento da reação em

tempo real é a eliminação da etapa de eletroforese em gel de agarose diminuindo o tempo de

obtenção do diagnóstico (53)

.

Os métodos indiretos baseiam-se principalmente em exames sorológicos para

pesquisa de anticorpos. Vários métodos sorológicos têm sido desenvolvidos para o

diagnóstico da TCIC e EMC, sendo consideradas valiosas ferramentas de triagem. A

6

propagação de E. canis em cultura celular tem sido a base para produção de antígenos a serem

aplicados em testes sorológicos, havendo detecção de anticorpos precoces em até sete dias

pós-infecção, embora a maioria dos cães se tornem soropositivos somente após 28 dias da

infecção (54)

.

A reação de imunofluorescência indireta (RIFI) é utilizada no diagnóstico das

erliquioses, sendo aplicável tanto para estudos de infecções experimentais quanto naturais.

Embora o emprego de testes sorológicos para o diagnóstico da erliquiose seja frequente, sabe-

se que as várias espécies de erlíquias compartilham determinados antígenos, gerando reações

cruzadas entre espécies do mesmo gênero. Além disso, os anticorpos chegam a níveis

máximos após 80 dias da infecção e persistem, a menos que se efetue o tratamento (55)

. Dessa

forma, os testes sorológicos não são capazes de distinguir uma infecção corrente de uma

exposição prévia sem estabelecimento ou persistência de infecção (56)

.

A RIFI para detecção de anticorpos contra A. platys pode ser utilizada, não sendo

detectadas reações cruzadas entre A. platys e E. canis. Porém, é provável que ocorra reação

cruzada entre A. platys e A. phagocytophilum neste tipo de teste (22)

. Além da RIFI, testes

imuno enzimáticos (ELISA) têm sido desenvolvidos e utilizados no diagnóstico da TCIC e

EMC.

O diagnóstico clínico da EMC e TCIC é quase sempre inconclusivo quanto à

doença específica, e frequentemente constitui um desafio para o clínico veterinário devido à

característica multissistêmica da EMC e ausência de sinais clínicos específicos destas doenças

(22).

Novos estudos a respeito das manifestações clínicas oculares decorrentes da TCIC

e EMC empregando técnicas de detecção rápida, altamente sensíveis e específicas capazes de

detectar A. platys e E. canis, incluindo co-infecções com outros hemoparasitos são

extremamente valiosos para o diagnóstico eficaz e precoce, contribuindo para sustentar o

emprego da terapêutica adequada e um melhor prognóstico para essas doenças. Assim, diante

do exposto, buscou-se com este estudo detectar infecções por A. platys e E. canis em cães

com alterações oculares e desenvolver e validar novos protocolos de qPCR para detecção

rápida destes hemoparasitos.

7

REFERÊNCIAS

1. Shaw SE, Day MJ, Birtles RJ, Breitschwerdt EB. Tick-borne infectious diseases of

dogs. Trends in Parasitology. 2001 2/1/;17(2):74-80.

2. Dantas-Torres F, Chomel BB, Otranto D. Ticks and tick-borne diseases: a One Health

perspective. Trends in Parasitology. 2012;28(10):437-46.

3. Ramos R, Ramos C, Araujo F, Oliveira R, Souza I, Pimentel D, et al. Molecular

survey and genetic characterization of tick-borne pathogens in dogs in metropolitan Recife

(north-eastern Brazil). Parasitology research. 2010 Oct;107(5):1115-20. PubMed PMID:

20680344.

4. Santos F, Coppede JS, Pereira AL, Oliveira LP, Roberto PG, Benedetti RB, et al.

Molecular evaluation of the incidence of Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Babesia spp.

in dogs from Ribeirao Preto, Brazil. Veterinary journal. 2009 Jan;179(1):145-8. PubMed

PMID: 17920967.

5. Stich RW, Schaefer JJ, Bremer WG, Needham GR, Jittapalapong S. Host surveys,

ixodid tick biology and transmission scenarios as related to the tick-borne pathogen, Ehrlichia

canis. Veterinary parasitology. 2008 Dec 20;158(4):256-73. PubMed PMID: 18963493.

Pubmed Central PMCID: 3053144.

6. Sanogo YO, Davoust B, Inokuma H, Camicas JL, Parola P, Brouqui P. First evidence

of Anaplasma platys in Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodida) collected from dogs in

Africa. The Onderstepoort journal of veterinary research. 2003 Sep;70(3):205-12. PubMed

PMID: 14621316.

7. Abarca K, Lopez J, Perret C, Guerrero J, Godoy P, Veloz A, et al. Anaplasma platys in

dogs, Chile. Emerging infectious diseases. 2007 Sep;13(9):1392-5. PubMed PMID:

18252119. Pubmed Central PMCID: 2857280.

8. Almeida AdBPFd, Paula DAJd, Dahroug MAA, Freitas AGd. Ehrlichia canis and

Anaplasma platys in ticks of dogs in Cuiabá, Mato Grosso. Semina : Ciências Agrárias.

2012;33(3):4.

9. Ramos RA, Latrofa MS, Giannelli A, Lacasella V, Campbell BE, Dantas-Torres F,

Otranto D. Detection of Anaplasma platys in dogs and Rhipicephalus sanguineus group ticks

by a quantitative real-time PCR. Veterinary parasitology. 2014 Sep 15;205(1-2):285-8.

PubMed PMID: 25027609.

10. Ferreira RF, Cerqueira Ade M, Pereira AM, Velho PB, Azevedo RR, Rodrigues IL,

Almosny NRP. Cross-reaction evaluation of PCR-Anaplasma platys positive dogs tested to

Anaplasma phagocytophilum antibodies by commercial ELISA. Rev Bras Parasitol Vet. 2008

Sep;17 Suppl 1:5-8. Portuguese.

11. Huang H, Unver A, Perez MJ, Orellana NG, Rikihisa Y. Prevalence and molecular

analysis of Anaplasma platys in dogs in Lara, Venezuela. Brazilian Journal of Microbiology.

Braz. J. Microbiol. [Internet]. 2005 Sep [cited 2015 July 06] ; 36( 3 ): 211-216. Available

from:http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S151783822005000300002&ln

g=en. http://dx.doi.org/10.1590/S1517-83822005000300002.

12. Dagnone AS, de Morais HSA, Vidotto MC, Jojima FS, Vidotto O. Ehrlichiosis in

anemic, thrombocytopenic, or tick-infested dogs from a hospital population in South Brazil.

Veterinary parasitology. 2003 11/28/;117(4):285-90.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=cross-reaction+evaluation+of+PCR-Anaplasma+platys+positive+dogs+tested+to+Anaplasma+phagocytophilum+antibodies+by+commercial+ELISA.+Revista+brasileira+de+parasitologia+veterinaria

8

13. Moreira SM, Bastos, CV, Araújo RB, Santos M, Passos LMF. Retrospective study

(1998-2001) on canine ehrlichiosis in Belo Horizonte, MG, Brazil. Arq Bras Med Vet Zoot

2003;55(2):141-147. http://dx.doi.org/10.1590/S0102-09352003000200003.

14. Ferreira RF, Cerqueira AMF, Pereira AM, Guimaraes CM, Sa AG, Abreu FS, Massard

CL, Almosny NRP. Anaplasma platys diagnosis in dogs: comparison between morphological

and molecular tests. International Journal of Applied Research in Veterinary Medicine.

2007;5(3):113-119.

15. Labruna MB, McBride JW, Camargo LMA, Aguiar DM, Yabsley MJ, Davidson WR,

et al. A preliminary investigation of Ehrlichia species in ticks, humans, dogs, and capybaras

from Brazil. Veterinary parasitology. 2007 1/31/;143(2):189-95.

16. Costa-Junior LM, Rembeck K, Passos LM, Ribeiro MF. Factors associated with

epidemiology of Anaplasma platys in dogs in rural and urban areas of Minas Gerais State,

Brazil. Preventive veterinary medicine. 2013 May 1;109(3-4):321-6.

17. Cardozo GP, Oliveira LP, Mansur MA, Santos EV, Roberto PG, Marins M. Molecular

characterisation of two strains of Anaplasma platys in Brazil. The Veterinary record. 2009

Mar 14;164(11):338-40.

18. Dantas-Torres F. Canine vector-borne diseases in Brazil. Parasites & vectors.

2008;1:25. doi:10.1186/1756-3305-1-25

19. Macieira DdB, Messick JB, Cerqueira AdM, Freire IM, Linhares GF, Almeida NK,

Almosny NRP. Prevalence of Ehrlichia canis infection in thrombocytopenic dogs from Rio

de Janeiro, Brazil. Veterinary clinical pathology. 2005;34(1):44-8.

20. Ramos CAN, Ramos RAN, Araújo FR, Guedes Jr DS, Souza IIF, Ono TM, Vieira

AS, Pimentel DS, Rosas

EO, Faustino

MAG, Alves, LC. Comparison of nested-PCR with

blood smear examination in detection of Ehrlichia canis and Anaplasma platys in dogs.

Revista brasileira de parasitologia veterinaria (Online) [Internet]. 2009; 18( Suppl 1 ): 58-62.

Available from: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1984-

29612009000500011&lng=en. http://dx.doi.org/10.4322/rbpv.018e1011.

21. Greene CE. Infectious diseases of the dog and cat. 3. ed. St. Louis, Mo.: Elsevier

Saunders; 2006. 1387 p.

22. Neer TMH, S. Ehrlichiosis, Neorickettsiosis, Anaplasmosis, and Wolbachia Infection.

Chapter 28, 203-232 p. In: Elsevier S, editor. IN: GREENE, CE Infectious Diseases of the

dog and cat Saunders Elsevier, 3 Ed, St Louis, Elsevier, 2006, 1387 p.

23. Cardozo GP, Oliveira LP, Zissou VG, Donini IAN, Roberto PG, Marins M. Analysis

of the 16S rRNA gene of Anaplasma platys detected in dogs from Brazil. Brazilian Journal of

Microbiology. 2007;38:478-9.

24. Cullen CLW, AA. Ocular manifestations of systemic diseases. Part 1: The dogs.

Chapter 30., p.1470-1537. In: GELATT, KN Veterinary Ophtalmology. 2. Flórida: Blackwell

publishing; 2007. 1644 p.

25. Harvey J. Thrombocytitropic Anaplasmosis (A. platys [E. platys] Infection). 229-231

p. IN: GREENE, CE Infectious Diseases of the dog and cat Saunders Elsevier, 3 Ed, St

Louis, Elsevier, 2006. 1387 p.

26. Dumler JS, Barbet AF, Bekker CP, Dasch GA, Palmer GH, Ray SC, et al.

Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order

Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with

Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new species combinations and

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Almosny%20NR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15732017

9

designation of Ehrlichia equi and 'HGE agent' as subjective synonyms of Ehrlichia

phagocytophila. International journal of systematic and evolutionary microbiology. 2001

Nov;51(Pt 6):2145-65.

27. Borin S, Crivelenti LZ, FERREIRA, FA. Epidemiological, clinical, and hematological

aspects of 251 dogs naturally infected with Ehrlichia spp. morulae. Arq Bras Med Vet

Zootec. 2009;61(3):566-71.

28. Costa JO, Batista-Júnior JA, Silva M, Guimarães MP. Ehrlichia canis infection in dog

in Belo Horizonte, Brazil. Arquivo da Escola de Veterinária da Universidade Federal de

Minas Gerais. 1973;25:199-200.

29. Vieira RF, Biondo AW, Guimaraes AM, Dos Santos AP, Dos Santos RP, Dutra LH, et

al. Ehrlichiosis in Brazil. Revista brasileira de parasitologia veterinaria. 2011 Jan-

Mar;20(1):1-12.

30. Labarthe N, de Campos Pereira M, Barbarini O, McKee W, Coimbra CA, Hoskins J.

Serologic prevalence of Dirofilaria immitis, Ehrlichia canis, and Borrelia burgdorferi

infections in Brazil. Veterinary therapeutics : research in applied veterinary medicine. 2003

Spring;4(1):67-75.

31. Bulla C, Kiomi Takahira R, Pessoa Araujo J, Jr., AparecidaTrinca L, Souza Lopes R,

Wiedmeyer CE. The relationship between the degree of thrombocytopenia and infection with

Ehrlichia canis in an endemic area. Veterinary research. 2004 Jan-Feb;35(1):141-6.

32. Trapp SM, Dagnone AS, Vidotto O, Freire RL, Amude AM, de Morais HS.

Seroepidemiology of canine babesiosis and ehrlichiosis in a hospital population. Veterinary

parasitology. 2006 Sep 10;140(3-4):223-30.

33. Soares AO, Souza AD, Feliciano EA, Rodrigues AF, D'Agosto M, Daemon E.

Evaluation of ectoparasites and hemoparasites in dogs kept in apartments and houses with

yards in the city of Juiz de Fora, Minas Gerais, Brazil. Revista brasileira de parasitologia

veterinaria. 2006 Jan-Mar;15(1):13-6.

34. Ueno TE, Aguiar DM, Pacheco RC, Richtzenhain LJ, Ribeiro MG, Paes AC, et al.

Ehrlichia canis in dogs attended in a veterinary hospital from Botucatu, São Paulo State,

Brazil. Revista brasileira de parasitologia veterinaria. 2009 Jul-Sep;18(3):57-61.

35. Nakaghi ACH, Machado RZ, Costa MT, André MR, Baldani CD. Canine ehrlichiosis:

clinical, hematological, serological and molecular aspects. Ciência Rural. 2008;38:766-70.

36. Oriá AP, Pereira PM, Laus JL. Uveitis in dogs infected with Ehrlichia canis. Ciência

Rural. 2004;34:1289-95.

37. Harrus S, Waner T. Diagnosis of canine monocytotropic ehrlichiosis (Ehrlichia canis):

an overview. Veterinary journal. 2011 Mar;187(3):292-6.

38. Martin CL. Ocular manifestations of systemic disease. Cap.37, p.1408-1409.

In:GELATT, KN Veterinary ophthalmology Philadelphia : Lippincott Williams & Wilkins,

1999.

39. Oriá APea. Ophthalmic, hematologic and serologic findings in dogs with suspected

Ehrlichia canis infections. Revista Brasileira de Ciência Veterinaria. 2008;15(2):94-7.

40. Komnenou AA, Mylonakis ME, Kouti V, Tendoma L, Leontides L, Skountzou E, et

al. Ocular manifestations of natural canine monocytic ehrlichiosis (Ehrlichia canis): a

retrospective study of 90 cases. Veterinary ophthalmology. 2007 May-Jun;10(3):137-42.

10

41. Alves LM, Linhares GFC, Chaves NST, Monteiro LC, Linhares DCL. Avaliação de

iniciadores e protocolo para o diagnóstico de pancitopenia tropical canina por PCR. 2005.

Ciência Animal Brasileira. Goiânia;6(1):6.

42. Oliveira DN CT, Costa MT, Machado RZ, Castro MB. Anti- Ehrlichia canis

antibodies detection by “Dot- ELISA” in naturally infected dogs. Revista Brasileira de

Parasitologia Veterinária. 2000;9(1):1-5.

43. Faria JL, Dagnone AS, Munhoz TD, Joao CF, Pereira WA, Machado RZ, et al.

Ehrlichia canis morulae and DNA detection in whole blood and spleen aspiration samples.

Revista brasileira de parasitologia veterinaria = Brazilian journal of veterinary parasitology:

Orgao Oficial do Colegio Brasileiro de Parasitologia Veterinaria. 2010 Apr-Jun;19(2):98-102.


44. Lauerman LH. Nucleic acid amplification assays for diagnosis of animal diseases.

Washington: Ed Library of Congress Cataloging-in- Publication Data. 1998:152.

45. Martin AR, Brown GK, Dunstan RH, Roberts TK. Anaplasma platys: an improved

PCR for its detection in dogs. Experimental parasitology. 2005 Mar;109(3):176-80. PubMed

PMID: 15713449.

46. Gasser RB. Molecular tools—advances, opportunities and prospects. Veterinary

Parasitology. 2006;136:69-89.

47. Teglas M, Matern E, Lein S, Foley P, Mahan SM, Foley J. Ticks and tick-borne

disease in Guatemalan cattle and horses. Veterinary parasitology. 2005 7/15/;131(1–2):119-

27.

48. Sirigireddy KR, Ganta RR. Multiplex detection of Ehrlichia and Anaplasma species

pathogens in peripheral blood by real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction.

The Journal of molecular diagnostics : JMD. 2005 May;7(2):308-16. PubMed PMID:


49. Baneth G, Harrus S, Ohnona FS, Schlesinger Y. Longitudinal quantification of

Ehrlichia canis in experimental infection with comparison to natural infection. Veterinary

microbiology. 2009 May 12;136(3-4):321-5. PubMed PMID: 19128893.

50. Doyle CK, Labruna MB, Breitschwerdt EB, Tang YW, Corstvet RE, Hegarty BC, et

al. Detection of medically important Ehrlichia by quantitative multicolor TaqMan real-time

polymerase chain reaction of the dsb gene. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 2005

Oct;7(4):504-10. PubMed PMID: 16237220. Pubmed Central PMCID: 1888493.

51. Peleg O, Baneth G, Eyal O, Inbar J, Harrus S. Multiplex real-time qPCR for the

detection of Ehrlichia canis and Babesia canis vogeli. Veterinary parasitology. 2010 Oct

29;173(3-4):292-9. PubMed PMID: 20674177.

52. Nakaghi AC, Machado RZ, Ferro JA, Labruna MB, Chryssafidis AL, Andre MR, et al.

Sensitivity evaluation of a single-step PCR assay using Ehrlichia canis p28 gene as a target

and its application in diagnosis of canine ehrlichiosis. Revista brasileira de parasitologia

veterinaria = Brazilian journal of veterinary parasitology : Orgão Oficial do Colégio

Brasileiro de Parasitologia Veterinária. 2010 Apr-Jun;19(2):75-9. PubMed PMID: 20624341.

53. Novais CMP-A, M. PCR em tempo real. Revista Biotecnologia Ciência e

Desenvolvimento. 2004 (33):10-3.

54. Harrus SW, T.; Bark, H. Canine monocytic ehrlichiosis update. Compendium for

Continuing Education for the Practicing Veterinarian. 1997;19:431-44.

11

55. Almosny NRPM, C.L. . Erliquiose em pequenos animais e como zoonose. p. 14-56.

In: ALMOSNY, NRP Hemoparasitoses em Pequenos Animais Domésticos e como Zoonoses

1 ed Rio de Janeiro: LF Livros Ltda2002.

56. Aguiar DMS, T.B.; Hagiwara, M.K.; Machado, R.Z.; Labruna, M.B. Diagnóstico

sorológico de erliquiose canina com antígeno brasileiro de Ehrlichia canis. Ciência Rural.

2007;37:p. 796-802.

12

CAPÍTULO 2

DETECÇÃO MOLECULAR DE Anaplasma platys E Ehrlichia canis EM

CÃES COM E SEM ALTERAÇÕES OCULARES

MOLECULAR DETECTION OF Anaplasma platys and Ehrlichia canis in dogs with and

without OCULAR DISEASES

Herika Xavier da Costa1, Sabrina C. Duarte

2, Camila Donati

3, Osvaldo José da Silveira Neto

4,

Guido F. C. Linhares5.

1 Doutoranda em Ciência Animal, Universidade Federal de Goiás-UFG, Goiânia-GO, Brasil. Email: [email protected]

2 Pesquisadora da EMBRAPA, Concórdia-SC, Brasil. 3 Médica veterinária com atendimento especializado em Oftalmologia Veterinária, Goiânia-GO, Brasil

4. Professor efetivo do curso de zootecnia da UEG e professor titular da Faculdade Objetivo- IUESO

5. Professor titular de Doenças parasitárias da Escola de Veterinária e Zootecnia (EVZ)- UFG.

RESUMO

As doenças oculares em cães são diagnosticadas com frequência na clínica de pequenos animais e estão entre os sinais clínicos encontrados em cães infectados com Ehrlichia canis. Já a frequência de

lesões oculares em casos de infecção por Anaplasma platys ainda é desconhecida. O objetivo com este

estudo foi verificar a frequência de infecções por E. canis e A. platys em cães com alterações oculares,

utilizando-se a PCR como método de diagnóstico. Para o estudo, foram utilizados 100 cães com alterações oculares (CAO) e 100 cães sem alterações oculares (SAO). Dentre os hemoparasitos, E.

canis e A. platys, detectados e identificados por PCR, E. canis foi o de maior frequência, tanto no

grupo de cães CAO (33%; 33/100) quanto no grupo de cães SAO (24%; 24/100). A frequência de A. platys foi de 5% (5/100) para o grupo de cães CAO e 4% (4/100) para o grupo de cães SAO. As

alterações oculares que apresentaram relação com a infecção por E. canis foram uveíte bilateral e

descolamento de retina. Não foi possível verificar a relação das alterações oculares com a infecção por

A. platys devido ao baixo número de cães com alterações oculares infectados com esta riquétsia.

PALAVRAS-CHAVE: Canino, hemoparasitos, lesões oftálmicas, PCR.

ABSTRACT Ocular diseases are diagnosed in dogs often in clinical small animal and are found between the clinical

signs in dogs infected with Ehrlichia canis. Have the frequency of ocular lesions in cases of infection

with Anaplasma platys is still unknown. The objective of this study was to verify the frequency of

infections by E. canis and A. platys in dogs with ocular changes, using the PCR as a diagnostic method. For the study, we used 100 dogs with ocular abnormalities (OA) and 100 dogs without ocular

abnormalities (WOA). Among the blood parasites, E. canis and A. platys detected and identified by

PCR, E. canis was the most frequent in both dogs group OA (33%; 33/100) and in the group of dogs WOA (24%, 24/100). The frequency of A. platys was 5% (5/100) for the group of dogs OA and 4%

(4/100) for the group of dogs WOA. Ocular changes were associated with infection by E. canis were

bilateral uveitis and retinal detachment. It was not possible to verify the relationship of ocular manifestations with infection by A. platys due to the low number of dogs with ocular abnormalities

infected with this rickettsia.

KEYWORDS: Blood parasites, canine, ophthalmic injuries, PCR.

13

INTRODUÇÃO

A erliquiose monocítica canina (EMC) é uma doença causada por bactérias

estritamente intracelulares, Gram-negativas, pertencentes à Ordem Rickettsiales, Família

Anaplasmataceae, gênero Ehrlichia (1)

e espécie Ehrlichia canis (2)

. É considerada uma das

mais importantes doenças que acometem os cães (3)

.

No Brasil, o primeiro caso da EMC foi relatado em cão domiciliado em Belo

Horizonte, Estado de Minais Gerais em 1973 (4)

. Posteriormente, foi relatada acometendo

aproximadamente 20% a 30% dos cães atendidos em hospitais e clínicas veterinárias de

Estados das regiões Nordeste, Sudeste, Sul e Centro-Oeste (5-8)

.

A transmissão de E. canis geralmente ocorre durante o parasitismo por ninfas e/

ou adultos do carrapato Rhipicephalus sanguineus, o qual mantém a bactéria por transmissão

transestadial (9)

. Acomete cães de idades variadas (10)

, e as manifestações clínicas da EMC são

inespecíficas. As fases da EMC do ponto de vista clínico são: aguda, subclínica e crônica (11)

,

embora seja difícil esta classificação dos casos clínicos em fases tão distintas nos países em

que a doença ocorre de forma endêmica.

As principais alterações clínicas observadas são apatia, anorexia/ hiporexia,

vômito, secreção oculonasal, esplenomegalia, mucosas pálidas, hemorragias (petéquias e

epistaxe) e uveíte (3, 12)

.

Os sinais oculares envolvem a maioria das estruturas oculares e são achados

comuns nos casos de EMC, podendo estar presentes em todas as fases da doença. As lesões

oculares podem variar na gravidade e não ocorrem em todos os casos de EMC (13)

. Lesões

oculares subclínicas ou ostensivas são características comuns em infecções naturais e

experimentais por E. canis, possuindo frequência variada. Estudos anteriores relatam

ocorrência de manifestações oculares desde 6,86% a 86,27% em cães com EMC utilizando a

sorologia como método de diagnóstico (14-17)

. De acordo com MARTIN (14)

, 50% dos cães

infectados experimentalmente apresentaram lesões oculares durante a fase aguda. Já ORIÁ et

al. (18)

encontraram uma frequência para E. canis de 86,27% (44/51) ao analisar 51 cães com

uveíte utilizando testes sorológicos como métodos de diagnóstico.

A frequência de lesões oculares em casos de infecção natural por E. canis é muito

variável e a patogênese das lesões oculares associada a EMC não está totalmente elucidada.

As lesões oftalmológicas incluem uveíte, coriorretinite, hemorragias da retina e conjuntivais,

congestão episcleral, opacidade de córnea, hipópio e hifema (11, 18)

. A hiperviscosidade

sanguínea, secundária a gamopatia monoclonal, elevação da pressão oncótica, vasculite e

14

disfunção plaquetária são fatores importantes na patogênese da hemorragia ocular nos casos

de EMC. Efeitos oculares de hiperviscosidade incluem dilatação dos vasos sanguíneos da

retina e tortuosidade e hemorragias na retina. A elevação da pressão oncótica, bem como

alterações isquémicas secundárias de hiperviscosidade, pode causar retinopatia hipertensiva e

hifema (19)

.

No processo inflamatório, as vasculites na EMC são causadas pela deposição de

imunocomplexos nas paredes vasculares, caracterizada por infiltrados linfoplasmáticos

perivasculares. Tendo em vista que a EMC possui a característica de associação com a

formação generalizada de imunocomplexos, é possível que as uveítes induzidas pela EMC

tenham uma base imunopatogênica (15, 19-21)

.

Os achados laboratoriais mais comuns são trombocitopenia e anemia.

Trombocitopenia grave provoca hemorragias retinianas e hifema e petéquias conjuntivais

podem ser vistas na fase crônica da doença (22)

.

A trombocitopenia cíclica infecciosa canina (TCIC) é uma doença causada por

uma bactéria Gram-negativa, pertencente à ordem Rickettssiales, família Anaplasmataceae e

gênero Anaplasma. O agente etiológico da TCIC é denominado de Anaplasma platys e infecta

as plaquetas do cão (23)

. Casos clínicos da TCIC têm sido reportados por todo o mundo,

incluindo os Estados Unidos, Grécia, Taiwan, Espanha, Sul da China, Austrália, Tailândia e

Venezuela (24)

.

A. platys também causa trombocitopenia em cães nas várias regiões do Brasil,

não sendo rara a coinfecção com E. canis e Babesia vogeli, podendo o carrapato R.

sanguineus ser o mesmo vetor destas três espécies (23)

. A prevalência de infecção por A. platys

no Brasil varia de 5,1% (25)

a 18,8% (26)

. Pouco se sabe sobre fatores de risco associados à

doença no Brasil. A infecção por A. platys raramente é associada à doença clínica (27)

. Há

diferentes cepas de A. platys circulantes em cães no Brasil, como revelada pela análise de

seqüências parciais do gene 16S rRNA (28)

.

A. platys causa parasitemia e trombocitopenias cíclicas a intervalos de 10 a 14

dias. Alguns dias após a infecção ocorrem diminuição brusca no número de plaquetas e o

desaparecimento de A. platys da circulação. Em seu ponto mais baixo, a trombocitopenia pode

ser grave (20.000 a 50.000 plaquetas/µL) e a agregação plaquetária fica diminuída (29)

.

A. platys é considerada de menor importância patogênica que E. canis e cães com

TCIC frequentemente apresentam sinais clínicos mais brandos ou são assintomáticos (24)

. No

entanto, co-infecções com A. platys e E. canis foram relatadas em cães do Brasil, o que leva

ao agravamento do quadro clínico destes animais (30-32)

.

15

Os sinais clínicos quando presentes começam após um período de incubação de

oito a 15 dias, com alguns sinais sugestivos, como anorexia e distúrbios hemostáticos (33)

.

Casos de uveíte já foram atribuídos à infecção por A. platys (34, 35)

. Hiperplasia folicular de

nódulos linfáticos e plasmocitose têm sido observadas na fase aguda da infecção e em alguns

órgãos, tal como baço, pode ocorrer hemorragia (24)

.

A trombocitopenia é um achado comum em infecções por A. platys, entretanto

não é patognomônica desta rickettsiose (23)

. Anemia arregenerativa normocítica

normocrômica, associada à anemia de inflamação, leucopenia, hipoalbuminemia, e

hiperglobulinemia foi descrita em associação com a infecção experimental por A. platys (29)

.

Dentre os métodos de diagnóstico para hemoparasitos, os mais utilizados são a

pesquisa de mórulas em esfregaço sanguíneo para E. canis e pesquisa de inclusões em

plaquetas para A. platys, detecção de anticorpos por imunofluorescência indireta, ou

amplificação de DNA através da reação em cadeia da polimerase (PCR) (23)

.

O uso de técnicas moleculares para o estabelecimento do diagnóstico é necessário

para a detecção específica de infecções por E. canis e A. platys, permitindo melhor

compreensão sobre a enfermidade e sua relação com as alterações oculares observadas. O

exame ocular minucioso de animais com doenças sistêmicas é um componente essencial do

exame físico dos animais, o qual pode auxiliar o diagnóstico da EMC e TCIC em cães. Diante

do exposto, buscou-se com este estudo verificar a frequência de infecções por E. canis e A.

platys em cães com alterações oculares na cidade de Goiânia, Estado de Goiás, utilizando

como método de diagnóstico, a PCR.

MATERIAL E MÉTODOS

Grupo de cães utilizados

Foram avaliados os cães atendidos entre junho de 2013 e abril de 2014 por

médicos veterinários no Hospital Veterinário Pluto (HVP), localizado em Goiânia-GO, Brasil,

selecionando-se previamente os cães que atenderam ao critério de presença ou ausência de

lesões oculares. Os animais que apresentaram manifestações oculares foram incluídos no

estudo após atenderam os seguintes critérios: (1) Não apresentar nenhuma evidência histórica

de trauma ocular ou exposição a medicamentos pelo menos 30 dias antes da consulta

veterinária e (2) apresentarem prévio exame oftalmológico com a inspeção das pálpebras e do

16

bulbo ocular utilizando uma fonte de luz focal, cujas informações clínicas sobre a presença de

alterações oculares foram registradas no momento da consulta veterinária.

Após a triagem dos animais, obedecendo como único critério de seleção a

presença ou ausência de alterações oculares, os cães foram separados em dois grupos: Grupo

caso (cães com alterações oculares (CAO), n=100) e grupo controle (cães sem alterações

oculares (SAO), n=100). Todos os cães que apresentaram alterações oculares foram

submetidos a um exame oftalmológico mais completo e minucioso. O protocolo experimental

com cães foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFG

sob protocolo n. 025/13.

Exame oftalmológico

Exame ocular foi realizado em todos os cães que apresentavam alterações

oculares, visualizando os reflexos oculares e empregando-se teste da lágrima de Schirmer

(Schirmer strips®, Ophthalmos, São Paulo-SP), prova da fluoresceína (Fluoresceína

sódica

1%, Ophthalmos, São Paulo-SP), anestesia ocular (Colírio Anestésico®, Allergan Produtos

Farmacêuticos Ltda), tonometria de aplanação (TonoPen XL®

, Mentor, Norwell, MA, USA),

exame do bulbo, midríase farmacológica e oftalmoscopia (Welch Allyn, Skaneateles, NY,

EUA). A identificação e classificação do tipo de anormalidades oculares observadas nos cães

foram registradas.

Coleta de amostras

Foram coletados de cada um dos 200 cães selecionados, 0,5 mL de sangue da veia

cefálica ou jugular, em tubo esterilizado contendo anticoagulante universal EDTA

(Anticoagulante Universal, Doles). Após a coleta, as 200 amostras sanguíneas (100 amostras

sanguíneas de cães com alterações oculares e 100 amostras sanguíneas de cães sem alterações

oculares) foram encaminhadas ao Laboratório de Diagnóstico de Doenças Parasitárias da

Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás (LDDP/ EVZ/UFG) para

a execução de testes moleculares (PCR) para detecção de A. platys e E. canis.

17

Extração do DNA genômico das amostras

Após a coleta das amostras de sangue com EDTA dos 200 cães selecionados

foram realizados os testes de PCR para detecção dos hemoparasitos: A. platys e E. canis. O

DNA genômico das 200 amostras de sangue colhidas dos animais selecionados para o estudo

foi extraído utilizando o Kit GFX (Genomic Blood DNA Purification Kit, Pharmacia, Biotech

®) seguindo protocolo convencional de extração de DNA de acordo com instruções do

fabricante para um volume de 200µL de sangue total. As amostras obtidas foram

posteriormente utilizadas para a realização das reações de PCR para detecção de A. platys e E.

canis.

Amplificação do DNA por meio da PCR Convencional

As amostras de DNA genômico extraído dos 200 cães selecionados foram

submetidas à reação de PCR convencional para a identificação espécie-específica de A. platys

(36) e E. canis

(37).

Amplificação do DNA de Anaplasma platys por meio da PCR Convencional

O protocolo para o preparo da mistura de reagentes utilizados para a execução da

técnica de PCR convencional para a identificação espécie-específica de A. platys seguiu o

protocolo publicado por MARTIN et al. (36)

, com adaptações: 35,75µL de água ultrapura; 5

µL de 10X PCR Buffer (Invitrogen); 1 µL de dNTP 10 µM; 2 µL de MgCl2; 0,5 µL do primer

foward PLATYSF (5’-GAT TTT TGT CGT AGC TTG CTA GT-3’); 0,5 µL do primer

reverse EHR16SR (5’- TAG CAC TCA TCG TTT ACA GC -3’); 0,25 µL de TaqDNA

polymerase (5U/µL) (Invitrogen) e 5 µL do DNA extraído da amostra testada, alcançando-se

assim o volume total de 50 µL para o mix.

O programa de amplificação empregado nesta etapa constou de um passo inicial

de desnaturação a 94 ºC por dois minutos, seguido de 40 ciclos repetidos com as temperaturas

de 94 ºC por 30 segundos, anelamento a 58 °C por 30 segundos, extensão a 72 °C por um

minuto, finalizando-se com o adicional de extensão de 72 ºC por cinco minutos. O produto

final esperado para a reação de amplificação era um fragmento de 678pb do gene 16S rRNA

de A. platys.

18

Como controle positivo foi utilizado um isolado de referência para A. platys do

LDDP/EVZ/UFG e como controle negativo utilizou-se a água ultra-pura.

Amplificação do DNA de Ehrlichia canis por meio da PCR Convencional

O protocolo utilizado para a detecção de E. canis foi previamente estabelecido por

ALVES et al. (37)

com pequenas modificações para manter o volume total do mix da reação

em 50 µL: 37,75µL de água ultrapura (Invitrogen); 5 µL de 10X PCR Buffer; 1 µL de dNTP

10µM; 0,5 µL de EBR-1 forward primer (20 pmole/µL) (5’-CCT CTG GCT ATA GGA AAT

TG- 3’); 0,5 µL de EBR-5 reverse primer (20 pmole/µL) (5’-GGA GTG CTT AAC GCG

TTA G- 3’); 0,25 µL de TaqDNA polymerase (5U/µL) (Invitrogen) e 5 µL de DNA extraído

da amostra a ser testada. Como controle positivo, foi utilizada amostra de referência de E.

canis procedentes do LDDP/EVZ/UFG e como controle negativo do mix, utilizou-se água

ultra-pura.

Para o processo de amplificação por PCR, os ciclos e as temperaturas foram

definidos de acordo com adaptações do protocolo desenvolvido por ALVES et al. (37)

,

estabelecendo-se as seguintes condições: desnaturação inicial a 94 ºC por dois minutos,

seguido de 40 ciclos repetidos com as temperaturas de 94 ºC por 30 segundos, 53 ºC por 30

segundos e 72 ºC por um minuto, finalizando-se com um ciclo extra de extensão a 72 ºC por

cinco minutos. O produto alvo esperado para a reação foi um fragmento de 765 pb do gene

16S RNAr de E. canis.

Leitura e documentação das reações de PCR Convencional

Os amplicons obtidos da reação de PCR para detecção de E. canis e A. platys

foram inoculados em gel de agarose a 1,2% e corados por imersão em solução com brometo

de etídio (Life Technologies) a 0,4mg/mL. As leituras foram realizadas por visualização sob

luz ultravioleta, em transiluminador, como previamente descrito (38)

. Para a determinação do

tamanho dos fragmentos amplificados, utilizaram-se 1 µL de marcador de peso molecular de

100pb (Invitrogen) para cada corrida de eletroforese e 2,5 µL de corante para cada amostra.

Os resultados obtidos foram capturados e gravados utilizando um sistema de imagem digital

(Doc Print, Vilber Lourmat).

19

Análise estatística

Os dados referentes aos resultados dos exames laboratoriais foram organizados e

submetidos às avaliações quantitativas, analisados em tabelas de contingência 2x2, segundo

os tratamentos utilizados. A dispersão de frequência obtida foi testada pelo Teste exato de

Fisher para verificação de possíveis associações entre a presença e ausência de alterações

oculares observadas com as infecções por A. platys e E. canis em cães. As análises estatísticas

foram realizadas com o auxílio do programa Bioestat 5.0.

RESULTADOS

Dos 200 cães incluídos no estudo, 28,5% (57/200) e 4,5% (9/200) foram PCR-

positivos, respectivamente, para E. canis e A. platys (FIGURA 1). Foram identificadas

infecções mistas entre E. canis e A. platys em apenas 2% (4/200) do total de cães do estudo.

A população canina do estudo incluiu cães com alterações oculares (CAO;

n=100), dos quais 33 foram PCR- positivos para E. canis (33%) e cinco foram PCR-

positivos para A. platys (5%), e cães sem alterações oculares (SAO; n=100), dos quais 24

cães foram PCR- positivos para E. canis (24%) e quatro cães foram PCR- positivos para A.

platys (4%) (TABELA 1).

TABELA 1. Resultados dos testes de PCR para detecção de E. canis e A. platys em amostras

de sangue de cães com alterações oculares (CAO) e sem alterações oculares (SAO) atendidos

na cidade de Goiânia- GO, Brasil.

Grupos de

estudo

PCR para detecção de Ehrlichia

canis Total Exato de Fisher

Positivo Negativo

Alteração ocular

Sim 33 67 100 p = 0,1634

Não 24 76 100

Grupos de

estudo

PCR para detecção de A. platys Total Exato de Fisher

Positivo Negativo

Alteração ocular

Sim 5 95 100 p = 0,7488

Não 4 96 100

Dentre os hemoparasitos, E. canis e A. platys, detectados e identificados por PCR,

E. canis foi o de maior frequência, tanto no grupo de cães com alterações oculares (33%;

20

33/100) quanto no grupo de cães sem alterações oculares (24%; 24/100). A frequência de A.

platys foi de 5% (5/100) para o grupo de cães com alterações oculares e 4% (4/100) para o

grupo de cães sem alterações oculares. As co-infecções de E. canis com A. platys foram

observadas em proporções iguais para o grupo de cães com alterações oculares e o grupo de

cães sem alterações oculares, com frequência de infecções mistas de 2% (2/100) para ambos

os grupos.

Relação entre infecções por Ehrlichia canis e alterações oculares

Foram detectados 57 cães PCR-positivos para E. canis, sendo 33 cães (58%;

33/57) pertencentes ao grupo de cães com alterações oculares (CAO) e 24 cães (42%; 24/57)

pertencentes ao grupo de cães sem alterações oculares (SAO).

No grupo de cães com alterações oculares e PCR positivos para E. canis (n=33),

uveíte bilateral, uveíte unilateral e panuveíte foram identificadas, respectivamente, em 70%

(23/33), 6% (2/33) e 3% (1/33) destes cães. No grupo de cães com alterações oculares (CAO),

o complexo panuveíte, uveíte unilateral e uveíte bilateral corresponderam às lesões oculares

mais frequentes, sendo identificados em 79% (26/33) dos cães PCR positivos para E. canis

(n=33) (TABELA 2). As alterações oculares que apresentaram associação estatística com a

infecção por E. canis foram uveíte bilateral e descolamento de retina.

21

FIGURA 2. Uveíte, hipópio e úlcera de córnea no olho esquerdo

de um cão Shih tzu, macho, de dois anos com PCR positivo para

E. canis.

FIGURA 1. Uveíte no olho direito de um cão SRD, macho, de

quatro anos com PCR positivo para E. canis

22

Todos os cães que apresentaram descolamento de retina (5/5) foram PCR positivos

para E. canis. Alterações oculares como úlcera de córnea, ceratoconjuntivite seca,

conjuntivite, glaucoma e entrópio foram identificados em cães PCR-positivos para E. canis,

porém não houve relação estatística significativa entre a infecção por E. canis e estas

alterações oculares. Os três cães que apresentaram catarata como lesão ocular foram PCR-

negativo para E. canis (TABELA 2).

TABELA 2. Tipos de manifestações oculares identificadas nos 100 cães pertencentes ao

grupo (CAO).

ALTERAÇÃO OCULAR

PCR para detecção de

Ehrlichia canis

Total

n=100

Exato de

Fisher

Positivo Negativo

Panuveíte, uveíte unilateral ou

uveíte bilateral

Sim 26 22 48 p < 0,0001

Não 7 45 52

Descolamento de retina

Sim 5 0 5 p = 0,0032

Não 28 67 95

Ulcera de córnea

Sim 6 23 29 p = 0,1069

Não 27 44 71

Catarata

Sim 0 3 3 p = 0,5488

Não 33 64 97

Ceratoconjuntivite seca

Sim 1 12 13 p = 0,0551

Não 32 55 87

Glaucoma

Sim 1 7 8 p = 0,2651

Não 32 60 92

Conjuntivite

Sim 7 17 24 p = 0,8044

Não 26 50 76

Entrópio

Sim 1 4 5 p = 0,6640

Não 32 63 95

Relação entre infecções por Anaplasma platys e alterações oculares

Dos nove cães (4,5%; 9/200) PCR positivo para A. platys, 55,55% (5/9)

apresentaram alterações oculares. Dos cinco cães PCR positivo para A. platys com lesões

oculares, 40% (2/5) apresentaram-se coinfectados com E. canis. Dessa forma, não foi possível

23

verificar a relação das alterações oculares com a infecção por A. platys devido ao baixo

número de cães com alterações oculares infectados com esta riquétsia (QUADRO 1).

QUADRO 1. Tipos de manifestação ocular em cães PCR positivo para A. platys.

Caso

No. Raça Sinal ocular

Doenças

concomitantes

1 SRD Conjuntivite bilateral + úlcera de córnea no olho direito E. canis

2 SRD Uveíte bilateral E. canis

3 Poodle Uveíte bilateral + conjuntivite -

4 SRD Úlcera de córnea no olho esquerdo -

5 Shih Tzu Conjuntivite -

DISCUSSÂO

Lesões oculares são comumente relatadas em cães com E. canis, podendo estar

presentes em todas as fases da doença. E os resultados deste estudo indicaram que uveíte e

descolamento de retina pode ser associada à EMC.

A frequência de alterações oculares em cães diagnosticados com EMC (58%) no

presente estudo foi maior que os valores reportados anteriormente por Oriá et al. (13)

para

casos de infecção natural por E. canis (10-15%), entretanto, a prevalência de lesões oculares

em casos de infecção natural por E. canis é muito variável e a patogênese das lesões oculares

FIGURA 3. Úlcera de córnea no olho esquerdo de um cão SRD,

macho, de três anos com PCR positivo para A. platys.

24

associada a EMC não está totalmente elucidada. Resultados semelhantes aos descritos aqui

foram relatados por Martin (14)

, em que 50% dos cães infectados experimentalmente

apresentaram lesões oculares durante a fase aguda da EMC, porém como o presente estudo

avaliou cães naturalmente infectados por E. canis, não foi possível determinar o dia da

infecção e estabelecer uma associação entre as manifestações oculares e a fase clínica da

EMC.

Frequência de lesões oculares um pouco menor (37%) foi relatada em cães

sorologicamente positivos para E. canis, sendo panuveítes com descolamento de retina as

lesões oculares mais frequentes (15)

.

O complexo panuveíte, uveíte unilateral e uveíte bilateral corresponderam às

lesões oculares mais frequentes nos cães deste estudo, sendo identificados em 79% (26/33)

dos cães PCR positivos para E. canis (n=33), o que permite sugerir que estas alterações

oculares sejam decorrentes da infecção por E. canis. Esta frequência foi menor que a

reportada por ORIÁ et al. (18)

, os quais verificaram uma frequência para E. canis de 86,27%

(44/51) ao analisarem 51 cães com uveíte utilizando testes sorológicos como métodos de

diagnóstico. Já KOMNENOU et al. (16)

, ao analisarem somente cães com sorologia positiva

para E. canis, encontraram uveíte em 100% (90/90) destes cães. Em um estudo, realizado no

ano de 2002, E. canis foi o organismo infeccioso com maior associação com os casos de

uveíte em 102 cães (17)

. O exame histológico dos olhos de 27 cães infectados

experimentalmente com E. canis, E. ewingii ou E. chaffeensis revelou uveíte em 100% (n=14)

dos cães infectados experimentalmente apenas com E. canis, não sendo observadas em cães

infectados com E. ewingii ou E. chaffeensis (39)

.

A maioria dos estudos realizados anteriormente realizou o diagnóstico da EMC

com base em testes sorológicos para detecção de anticorpos específicos contra E. canis. No

entanto, estes métodos são, muitas vezes, inconclusivos devido à baixa produção de

anticorpos na fase aguda da doença, reação cruzada entre organismos relacionados, e

persistência de anticorpos pós-infecção (11)

. Dessa forma, a detecção direta do agente

infeccioso, utilizando como método de diagnóstico a PCR descrita neste trabalho, oferece a

vantagem de que uma infecção pode ser diferenciada de uma possível presença de anticorpos

residuais sem infecção.

Conjuntivite já foi observada nos casos de EMC e a presença de DNA de E. canis

foi identificada em secreções da conjuntiva de cães naturalmente e experimentalmente

infectados (20)

. Neste estudo, a conjuntivite foi observada em 21,21% (7/33) dos cães com

alterações oculares e PCR positivos para E. canis.

25

Verificou-se que 18,18% (6/33) dos cães com alterações oculares e PCR positivos

para E. canis apresentaram úlcera de córnea, a qual já foi reportada anteriormente nos casos

de EMC (16)

, porém sem diferença estatística significativa.

A. platys é considerada de menor importância patogênica que E. canis, e cães com

TCIC frequentemente apresentam sinais clínicos mais brandos ou são assintomáticos. No

entanto, co-infecções com A. platys e E. canis foram relatados em cães do Brasil, o que leva

ao agravamento do quadro clínico destes animais (30-32)

. Dentre os cães com manifestação

ocular e PCR positivos para A. platys, 40% (2/5) apresentaram infecção concomitante com E.

canis, não permitindo atribuir a lesão ocular a infecção específica por A. platys. Não foi

possível verificar a relação das manifestações oculares com a infecção por A. platys devido ao

baixo número de cães com manifestações oculares infectados com esta riquétsia.

Alterações oculares podem estar presentes em todas as fases da EMC e casos de

uveíte já foram atribuídos à infecção por A. platys (34, 35)

. Assim, o exame ocular de animais

com doenças sistêmicas é um componente diagnóstico essencial do exame físico completo, o

qual pode auxiliar o diagnóstico da EMC e TCIC em cães. Porém, novos estudos a respeito

das manifestações clínicas oculares decorrentes da EMC se fazem necessários.

CONCLUSÃO

A. platys e E. canis foram detectados por PCR tanto no grupo de cães com

alterações oculares como nos cães sem alterações oculares. Verificou-se alta correlação entre

a presença de uveíte e descolamento de retina e resultados PCR positivos para E. canis. Foram

observadas conjuntivite, uveíte e úlcera de córnea em cães naturalmente infectados por A.

platys.

26

REFERÊNCIAS

1. Dumler JS, Barbet AF, Bekker CP, Dasch GA, Palmer GH, Ray SC, et al.

Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order

Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with

Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new species combinations and

designation of Ehrlichia equi and 'HGE agent' as subjective synonyms of Ehrlichia

phagocytophila. International journal of systematic and evolutionary microbiology. 2001

Nov;51(Pt 6):2145-65. PubMed PMID: 11760958.

2. Donatien A LF. Existence en Algére d´une Rickettsia du chien. . Bull Soc Pathol Exot

1935;28: :408-9.

3. BORIN SC, L.Z; FERREIRA, F.A. Aspectos epidemiológicos, clínicos e

hematológicos de 251 cães portadores de mórula de Ehrlichia spp. naturalmente infectados. .

Arq Bras Med Vet Zootec. 2009;61(3):566-71.

4. Costa JO, Batista-Júnior JA, Silva M, Guimarães MP. Ehrlichia canis infection in dog

in Belo Horizonte, Brazil. Arquivo da Escola de Veterinária da Universidade Federal de

Minas Gerais. 1973;25:199-200.

5. Bulla C, Kiomi Takahira R, Pessoa Araujo J, Jr., AparecidaTrinca L, Souza Lopes R,

Wiedmeyer CE. The relationship between the degree of thrombocytopenia and infection with

Ehrlichia canis in an endemic area. Veterinary research. 2004 Jan-Feb;35(1):141-6. PubMed

PMID: 15099511.




7. Labarthe N, de Campos Pereira M, Barbarini O, McKee W, Coimbra CA, Hoskins J.

Serologic prevalence of Dirofilaria immitis, Ehrlichia canis, and Borrelia burgdorferi

infections in Brazil. Veterinary therapeutics : research in applied veterinary medicine. 2003

Spring;4(1):67-75. PubMed PMID: 12756637.

8. Moreira SM BC, Araújo RB, Santos M, and Passos LMF. . Estudo retrospectivo (1998

a 2001) da erliquiose canina em Belo Horizonte. . Arq Bras Med Vet Zoot 2003;55(2):7.

9. Costa LM, Jr., Rembeck K, Ribeiro MF, Beelitz P, Pfister K, Passos LM. Sero-

prevalence and risk indicators for canine ehrlichiosis in three rural areas of Brazil. Veterinary

journal. 2007 Nov;174(3):673-6. PubMed PMID: 17204439.

10. Ueno TE, Aguiar DM, Pacheco RC, Richtzenhain LJ, Ribeiro MG, Paes AC, et al.

Ehrlichia canis in dogs attended in a veterinary hospital from Botucatu, São Paulo State,

Brazil. Brazilian journal of veterinary parasitology : Orgão Oficial do Colégio Brasileiro de

Parasitologia Veterinaria. 2009 Jul-Sep;18(3):57-61. PubMed PMID: 19772777.


an overview. Veterinary journal. 2011 Mar;187(3):292-6. PubMed PMID: 20226700.



13. Oriá AP, Pereira PM, Laus JL. Uveitis in dogs infected with Ehrlichia canis. Ciência

Rural. 2004. 34:1289-95.

27

14. MARTIN CL. Ocular manifestations of systemic disease. Cap.37, p.1408-1409.

In:GELATT, KN Veterinary ophthalmology Philadelphia : Lippincott Williams & Wilkins,

1999.

15. Leiva M, Naranjo C, Pena MT. Ocular signs of canine monocytic ehrlichiosis: a

retrospective study in dogs from Barcelona, Spain. Veterinary ophthalmology. 2005. Nov-

Dec;8(6):387-93. PubMed PMID: 16359361.

16. Komnenou AA, Mylonakis ME, Kouti V, Tendoma L, Leontides L, Skountzou E, et

al. Ocular manifestations of natural canine monocytic ehrlichiosis (Ehrlichia canis): a

retrospective study of 90 cases. Veterinary ophthalmology. 2007 May-Jun;10(3):137-42.


17. Massa KL, Gilger BC, Miller TL, Davidson MG. Causes of uveitis in dogs: 102 cases

(1989-2000). Veterinary ophthalmology. 2002. Jun;5(2):93-8. PubMed PMID: 12071865.

18. ORIÁ APea. Ophthalmic, hematologic and serologic findings in dogs with suspected

Ehrlichia canis infections. . Revista Brasileira de Ciência Veterinaria. 2008;15(2):94-7.

19. Harrus S, Ofri R, Aizenberg I, Waner T. Acute blindness associated with monoclonal

gammopathy induced by Ehrlichia canis infection. Veterinary parasitology. 1998 Jul

31;78(2):155-60. PubMed PMID: 9735920.




21. Walser-Reinhardt Lea. Direct detection of Ehrlichia canis by PCR in the conjunctiva

of a dog with bilateral anterior uveitis. . Schweizer Archiv für Tierheilkunde. 2012.154:149-

52.

22. ALMOSNY NRP. Ehrlichia canis (Donatien & Lestoquard, 1935): Avaliação

parasitológica, hematológica e bioquímica sérica da fase aguda de cães e gatos

experimentalmente infectados.: Tese (Doutorado em medicina veterinária) –Universidade

Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica; 1998. p. 202f.

23. Ferreira RF, Cerqueira Ade M, Pereira AM, Velho PB, Azevedo RR, Rodrigues IL, et

al. Cross-reaction evaluation of PCR-Anaplasma platys positive dogs tested to Anaplasma

phagocytophilum antibodies by commercial ELISA. Brazilian Journal of Veterinary

Parasitology : Orgão Oficial do Colégio Brasileiro de Parasitologia Veterinária. 2008 Sep;17

Suppl 1:5-8. PubMed PMID: 20059806.

24. Huang, Haibin, Unver, Ahmet, Perez, J. M, et al. Prevalence and molecular analysis of

Anaplasma platys in dogs in Lara, Venezuela. Brazilian Journal of Microbiology. 2005.

25. Costa-Junior LM, Rembeck K, Passos LM, Ribeiro MF. Factors associated with

epidemiology of Anaplasma platys in dogs in rural and urban areas of Minas Gerais State,

Brazil. Preventive veterinary medicine. 2013 May 1;109(3-4):321-6. PubMed PMID:

23157927.

26. Ferreira RF, de Mello Figueiredo Cerqueira A, Pereira AM, Guimaraes CM, de Sa

AG, da Silva Abreu F, et al. Anaplasma platys diagnosis in dogs: comparison between

morphological and molecular tests. International Journal of Applied Research in Veterinary

Medicine. 2007;5(3):7.

27. Dantas-Torres F. Canine vector-borne diseases in Brazil. Parasites & vectors.

2008;1(1):25. PubMed PMID: 18691408. Pubmed Central PMCID: 2533296.

28




29. Greene CE. Infectious diseases of the dog and cat. 3. ed. St. Louis, Mo.: Elsevier

Saunders; 2006. 1387 p.

30. Macieira DdB, Messick JB, Cerqueira AdM, Freire IM, Linhares GF, Almeida NK, et

al. Prevalence of Ehrlichia canis infection in thrombocytopenic dogs from Rio de Janeiro,

Brazil. Veterinary clinical pathology / American Society for Veterinary Clinical Pathology.

2005;34(1):44-8. PubMed PMID: 15732017.

31. Santos F, Coppede JS, Pereira ALA, Oliveira LP, Roberto PG, Benedetti RBR, et al.


in dogs from Ribeirão Preto, Brazil. The Veterinary Journal. 2009 1//;179(1):145-8.

32. Ramos CA, Ramos RA, Araujo FR, Guedes DS, Jr., Souza, II, Ono TM, et al.

Comparison of nested-PCR with blood smear examination in detection of Ehrlichia canis and

Anaplasma platys in dogs. Revista brasileira de parasitologia veterinaria = Brazilian journal

of veterinary parasitology : Orgão Oficial do Colégio Brasileiro de Parasitologia Veterinária.

2009 Dec;18 Suppl 1:58-62. PubMed PMID: 20040193.

33. Dagnone AS, de Morais HS, Vidotto MC, Jojima FS, Vidotto O. Ehrlichiosis in


Veterinary parasitology. 2003 Nov 28;117(4):285-90. PubMed PMID: 14637030.

34. Glaze MBG, S.D. . Uveitis associated with Ehrlichia platys infection in a dog. . J Am

Vet Med Assoc. 1986;189(8):916-7.

35. Gaunt S, Beall M, Stillman B, Lorentzen L, Diniz P, Chandrashekar R, et al.

Experimental infection and co-infection of dogs with Anaplasma platys and Ehrlichia canis:

hematologic, serologic and molecular findings. Parasites & vectors. 2010;3(1):33. PubMed

PMID: 20377870. Pubmed Central PMCID: 2859368.



PMID: 15713449.



2005 2005-03-28Avaliação de iniciadores e protocolo para o diagnóstico da pancitopenia

tropical canina por PCR. Ciên Animal Bras. Goiânia;6(1):6. Epub 2005-01-01.

38. Sambrook JF, E.F.; Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring

harbor laboratory press, . 2 ed. New York1989.

39. Pancieira RJE, S.A.; Confer, A.W. . Ocular histopathology of ehrlichial infections in

the dog. . Veterinary Pathology. 2001;38:43-6.

29

CAPÍTULO 3

DETECÇÃO ESPECÍFICA POR PCR EM TEMPO REAL DE Anaplasma

platys E Ehrlichia canis

SPECIFIC DETECTION BY REAL-TIME PCR OF Anaplasma platys AND Ehrlichia canis

Herika Xavier da Costa

1, Sabrina Castilho Duarte

2, Mauricio Egídio Cantão

2, Valéria de Sá Jayme

3,

Osvaldo José da Silveira Neto4, Guido F. C. Linhares

5.

1. Doutoranda em Ciência Animal, Universidade Federal de Goiás-UFG, Goiânia-GO, Brasil. Email: [email protected]

2. Pesquisador da EMBRAPA, Concórdia-SC, Brasil. 3. Professora de Epidemiologia e Saúde Pública da Escola de Veterinária e Zootecnia (EVZ)- UFG

4. Professor efetivo do curso de zootecnia da UEG e professor titular da Faculdade Objetivo- IUESO

5. Professor de Doenças Parasitárias da Escola de Veterinária e Zootecnia (EVZ)- UFG.

RESUMO

Anaplasma platys e Ehrlichia canis são riquétsias intracelulares obrigatórias de cães. A. platys parasita plaquetas causando a trombocitopenia cíclica infecciosa canina (TCIC), enquanto que E. canis possui

tropismo por células mononucleares circulantes causando a erliquiose monocítica canina (EMC). O

diagnóstico definitivo é firmado através do emprego de testes de diagnóstico específicos. Dois novos

protocolos de ensaios de PCR em tempo real (qPCR) para o detecção de A. platys e E. canis foram desenvolvidos a partir de sequências de referência para o gene 16S rRNA de A. platys e E. canis. Os

novos iniciadores e sondas desenhados foram capazes de detectar A. platys e E. canis. Identificação de

infecções naturais em cães por A. platys e E. canis, previamente confirmada por PCR convencional demonstrou alta correlação na sensibilidade (100% para A. platys e E. canis) e especificidade

epidemiológicas (100% para A. platys e 98,41% para E. canis) com os novos protocolos de qPCR

(sondas de hidrólise TaqMan). Os testes de especificidade analítica produziram resultado espécie

específicos, não ocorrendo amplificação de DNA dos seguintes hemoparasitos: Babesia vogeli, Hepatozoon canis e Mycoplasma haemofelis. DNA de R. sanguineus também não foi amplificado. Os

dois novos protocolos de qPCR descritos aqui foram capazes de detectar até 0,14 fg de DNA de E.

canis e 0,9 fg de DNA de A. platys e representam alternativas como ferramenta de diagnóstico para a detecção específica de A. platys e E. canis, sendo útil para o diagnóstico destas hemoparasitoses em

cães.

PALAVRAS-CHAVE: Cães, diagnóstico molecular, hemoparasitoses caninas, PCR.

ABSTRACT

Anaplasma platys and Ehrlichia canis are obligate intracellular rickettsial organisms of dogs. A. platys

appears to parasitize only platelets causing canine infectious cyclic thrombocytopenia (CICT) in dogs, whereas E. canis has tropism for circulating mononuclear cells causing canine monocytic ehrlichiosis

(CME). Definitive diagnosis is made by specific diagnostic tests. Two new real time PCR protocols

(qPCR) for the detection of A. platys and E. canis were developed from reference sequences for the 16S rRNA gene of A. platys and E. canis. New primers and probes were able to detecting A. platys and

E. canis. Identification of natural infections in dogs by A. platys and E. canis, previously confirmed by

conventional PCR showed high correlation sensitivity (100% for A. platys and E. canis) and epidemiological specificity (100% for A. platys and 98, 41% for E. canis) with new qPCR (hydrolysis

probe TaqMan) protocols. Analytical specificity tests results an specific species not occurring DNA

amplification of the following blood parasites Babesia vogeli, Hepatozoon canis and Mycoplasma

haemofelis. R. sanguineus DNA was not amplified. Two new qPCR protocols described was able to

detect 0,14 fg of E. canis DNA and 0,9 fg of A. platys DNA and represent alternative as a diagnostic

tool for the specific detection of A. platys and E. canis and is useful for diagnosis of these canine

hemoparasitosis. KEYWORDS: Canine hemoparasitosis, dogs, molecular diagnosis, PCR.

30

INTRODUÇÃO

Anaplasma platys e Ehrlichia canis são patógenos de canídeos, com importância

mundial, transmitidos por carrapatos. São riquétsias intracelulares obrigatórias, sendo que a

primeira parasita plaqueta no curso da doença conhecida por trombocitopenia cíclica

infecciosa canina (TCIC), enquanto a segunda apresenta tropismo por células mononucleares

circulantes, causando a erliquiose monocítica canina (EMC). Ambos os organismos são

encontrados em todos os continentes do mundo, no entanto, as maiores prevalências são

observadas nas regiões de clima tropical e subtropical (1-3)

, como China (4)

, Caribe (3)

,

Venezuela (5)

e Brasil (6-8)

.

O diagnóstico desses patógenos é geralmente realizado por detecção das riquétsias

em esfregaços sanguíneos corados e por métodos sorológicos (9, 10)

. No entanto, em virtude

das semelhanças clínicas com outras enfermidades, baixa parasitemia nas infecções por E.

canis (11)

, parasitemia cíclica nas infecções por A. platys (12)

, baixa resposta de anticorpos na

fase aguda da doença, reação cruzada entre organismos relacionados, e persistência de

anticorpos pós-infecção (11)

, esses métodos são, muitas vezes, inconclusivos. Outro fator que

dificulta o diagnóstico de A. platys por meio de observação de esfregaços sanguíneos é que

têm sido descritos casos de inclusões em plaquetas nas infecções por E. canis (13, 14)

. Dessa

forma, há grande preocupação com o desenvolvimento e uso cada vez maior de novas técnicas

para o diagnóstico da infecção por E. canis e A. platys.

As tradicionais técnicas de diagnóstico, como o exame parasitológico direto e a

sorologia, são valiosas ferramentas de diagnóstico, no entanto, a discriminação e identificação

precisa em nível de espécie requer o uso de técnicas moleculares. Assim, os métodos

moleculares, como a nested-PCR, PCR e PCR em tempo real (qPCR), têm sido desenvolvidos

e otimizados para o diagnóstico eficiente desses hemoparasitos e, mais recentemente,

utilizados para o diagnóstico e detecção específica dessas bactérias (7, 12-22)

. Além disso, a

identificação precisa do estado de infecção dos cães torna-se cada vez mais importante em

virtude do crescente aumento nos estudos dessas riquétsias como potenciais agentes causais

de infecções em humanos (23-26)

.

Recentemente, no ano de 2014, identificaram-se através da PCR dois casos de A.

platys acometendo mulheres na Venezuela, inclusive com a amplificação e sequenciamento

do DNA de A. platys (25)

e um caso de erliquiose humana por E. canis no México (26)

. Dessa

forma, é importante enfatizar a necessidade de avaliar o potencial zoonótico de A. platys e E.

31

canis, bem como implementar técnicas específicas e moleculares para o diagnóstico precoce

destas hemoparasitoses.

Alguns protocolos de qPCR encontram-se disponíveis para a detecção de diversos patógenos.

Porém, protocolos de qPCR para a detecção específica de A. platys (27, 28)

e E. canis (16, 19, 20, 27)

ainda são muito escassos. Diante do exposto, a presente pesquisa teve como objetivos

principais: padronização e otimização de novos protocolos de ensaios de qPCR utilizando

sonda de hidrólise TaqMan para detecção específica de A. platys e E. canis.

MATERIAL E MÉTODOS

Local e período de realização

A presente pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Diagnóstico de Doenças

Parasitárias (L.D.D.P.) e Laboratório de Biologia Molecular (LBM) do Setor de Medicina

Veterinária Preventiva (SMVP) da Escola de Veterinária e Zootecnia (EVZ) da Universidade

Federal de Goiás (UFG), durante o período de setembro de 2013 a fevereiro de 2015.

Obtenção de amostras de DNA referência

Para a realização dos ensaios experimentais de qPCR foram utilizadas amostras de

DNA genômico de Canis familiaris, Rhipicephalus sanguineus e dos hemoparasitos: E. canis,

A. platys, Babesia vogeli, Hepatozoon canis e Mycoplasma haemofelis.

As amostras de DNA genômico de R. sanguineus utilizadas foram provenientes

do Centro de Parasitologia Veterinária (CPV) da EVZ/UFG, e as amostras de DNA genômico

de C. familiaris, E. canis, A. platys, B. vogeli, H. canis e M. haemofelis foram procedentes do

LDDP/EVZ/UFG.

Sequenciamento e análise das sequências de referência

Os produtos de PCR das cinco amostras de DNA genômico dos hemoparasitos

obtidos foram purificados utilizando-se kit comercial (QIAquick Gel Extraction Kit

Protocol, Qiagen), conforme recomendações do fabricante. Após a identificação, as amostras

foram refrigeradas e imediatamente encaminhadas para a realização do sequenciamento no

Centro de Pesquisas sobre o Genoma Humano e Células-tronco (CEGH_CEL), ligado ao

Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (USP) e as análises de Bioinformática

para comprovar a identidade filogenética das amostras utilizadas como referência para os

testes de PCR foram realizadas na Embrapa Suínos e Aves (CNPSA). As cinco amostras

32

foram sequenciadas utilizando o Applied Biosystems ABI 3730 DNA Analyser com o

BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. As sequências Forward e Reverse de cada

amostra foram analisadas e montadas utilizando o pacote phred/phrap/consed. A sequência

consenso (Contig) das referências relativas às bactérias foram classificadas utilizando o banco

de sequências de 16S RDP Database (Versão 11.3 – http://rdp.cme.msu.edu). A sequência

referência de protozoário foi classificada utilizando o banco Silva Database (http://www.arb-

silva.de).

Grupo de cães utilizados no estudo

Foram utilizadas 500 amostras de sangue de cães obtidas dos experimentos

aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFG sob Protocolo n.

002/11 e 025/13 e mantidas no LDDP do Setor de Medicina Veterinária Preventiva (EVZ/

UFG) para a realização dos ensaios moleculares de PCR convencional e qPCR para a

detecção específica de E. canis e A. platys.

Extração do DNA genômico das amostras

O processo de extração do DNA genômico das amostras utilizadas neste

experimento foi realizado empregando-se o Kit Illustra Blood (GenomicPrep Mini Spin Kit,

GE healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) seguindo instruções do fabricante para

um volume de 200 µL de sangue total da amostra. Os eluatos obtidos no final das extrações de

DNAs foram devidamente identificados, alíquotados e armazenados a -20 ºC para

posteriormente serem submetidos aos testes moleculares.

Quantificação do DNA

Após a amplificação por PCR convencional dos fragmentos alvos de DNA

genômico de C. familiaris, R. sanguineus e dos hemoparasitos: E. canis, A. platys, B.vogeli,

H. canis e M. haemofelis, uma alíquota de 2 μL do amplicon obtido de cada reação foi

submetida à análise de concentração do DNA pelo método fluorométrico, empregando-se o

aparelho Qubit® 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).

As amostras de amplicons específicos que apresentaram concentração de DNA

acima de 10ng/μL, foram submetidas a 10 diluições na base 10 (1:10) com água ultra pura

para realização do teste de sensibilidade analítica e quantificação absoluta pela curva padrão

do qPCR, considerando-se a fórmula C1. V1 = C2.V2, onde:

C1 = concentração do DNA obtida na quantificação;

33

V1 = volume inicial do DNA concentrado

C2 = concentração de trabalho correspondente a 10ng/μL;

V2 = volume final, sendo que o volume da água ultra pura a ser adicionada

equivale à fórmula (V2- V1).

Amostras de sangue com anticoagulante EDTA de dois cães com exame

parasitológico direto positivo para A. platys e dois cães com exame parasitológico direto

positivo para E. canis também foram submetidas ao processo de extração e quantificação de

DNA pelo método de fluorometria empregando-se o aparelho Qubit® 2.0 Fluorometer a fim

de auxiliar a realização do teste de sensibilidade analítica e quantificação absoluta pela curva

padrão.

O DNA extraído do sangue de cães positivos para A. platys e E. canis foi diluído

quatro vezes na base 10 (10-1;

10-2;

10-3;

10-4

). Para minimizar riscos de contaminação, os

procedimentos como extração de DNA, preparação do mix de PCR e amplificação foram

realizados em salas separadas, empregando-se diferentes jogos de pipetas e capelas de fluxo

laminar.

Desenvolvimento dos ensaios de PCR em tempo real para A. platys e E. canis

Desenho dos iniciadores e sondas

Os desenhos de iniciadores e sondas utilizadas para a amplificação e detecção

espécie-específica de A. platys e E. canis foram realizados tendo como base os registros sobre

sequências de genes depositados no banco de dados do Genbank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Foram selecionados iniciadores e sondas para amplificação e

detecção espécie-específicos de A. platys e E. canis, com o objetivo de se obter produtos da

amplificação de uma sequência alvo do gene 16S rRNA por qPCR utilizando sonda de

hidrólise TaqMan.

Os iniciadores e sondas foram selecionados a partir de sequências de referência

para o gene 16S rRNA das espécies do gênero Anaplasma e Ehrlichia. Foram, portanto,

utilizadas sequências de referência para as seguintes espécies, com correspondentes números

de acesso no GenBank: A. bovis (AF294789), A. phagocytophilum (U02521), A. platys

(AF156784), E. canis (AF162860), E. chaffeensis (U86665), E. ewingii (U96436) e

Neorickettsia risticii (M21290).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

34

Em seguida, as sequências foram identificadas, copiadas em arquivo digital,

editadas no modelo fasta e submetidas ao alinhamento pelo método de Clustal W 30

, através

do software Meglign (LaserGene, DNAStar, Inc.).

A partir dos alinhamentos obtidos, os iniciadores e sondas de hidrólise para

detecção específica de A. platys e E. canis foram selecionados, dando-se preferência para

regiões de menor consenso na identidade entre as diferentes espécies. Iniciadores e sondas

também foram selecionados de regiões conservadas do gene 16S rRNA quanto à identidade

entre as espécies do gênero Ehrlichia e Anaplasma, a partir dos mesmos alinhamentos.

As especificações técnicas utilizadas para desenhar os novos iniciadores e sondas

foram retiradas do guia de introdução do Primer Express ® Software Version 3.0 relativas ao

tamanho, temperaturas de melting e composição de bases guanina/citosina dos iniciadores,

sondas e amplicons.

Após a seleção e antes da síntese, os iniciadores e sondas de hidrólise foram

submetidos à avaliação de similaridade com as sequências do GenBank, utilizando-se o

algoritmo BLASTN® (Basic Local Alignment Search Tool- Nucleotides) e primer-BLAST-

NCBI.

Foram construídos sondas e iniciadores senso e anti-senso do gene 16S rRNA

para A. platys e E. canis. As sequências dos iniciadores senso e anti-senso que, em conjunto,

apresentaram percentual de identidade específico para A. platys e E. canis, foram

encaminhadas à companhia comercial especializada para a síntese dos oligonucleotídeos

(Invitrogen, Life Technologies Brasil, São Paulo/SP). As sequências das sondas de hidrólise

Taqman (FAM™/MGB) foram sintetizadas pela Life Technologies (Carlsbad, California).

Ensaios de PCR convencional

As amostras de DNA obtidas da extração de DNA das 500 amostras sanguíneas

de cães foram submetidas a ensaios de PCR convencional para detecção espécie-específicas

de E. canis (15)

e A. platys (12)

.

O DNA extraído de cada amostra foi testado por técnica de PCR convencional

para a presença de E. canis e A. platys. Para tal fim, utilizaram-se as seguintes sequências de

iniciadores para detecção específica do gene 16S rRNA de E. canis (15)

: EBR1 (5’-CCT CTG

GCTATA GGA AAT TG- 3’) e EBR5 (5’-GGA GTG CTT AAC GCG TTA G- 3’), para a

amplificação de fragmento de 765pb do gene 16S rRNA. Para A. platys empregou-se as

sequências dos iniciadores: PLATYSF (5’-GAT TTT TGT CGT AGC TTG CTA TG-3’) e

35

EHR16SR (5’- TAG CAC TCA TCG TTT ACA GC -3’) para a detecção específica de um

fragmento de 678pb do gene 16S rRNA de A. platys (12)

.

Os testes de PCR convencional para as hemoparasitoses estudadas foram

realizados adotando-se as seguintes concentrações de reagentes em um volume total de 50 µL:

35,75µL água ultrapura; 5 µL 10X PCR Buffer; 1 µL dNTP 10Mm; 2 µL MgCl2; 0,5 µL de

cada iniciador (10 µM); 0,25 µL TaqDNA polymerase (5U/µL) (Invitrogen) e 5 µL da

amostra teste de DNA.

Para o processo de amplificação por PCR, os ciclos e as temperaturas foram

definidos de acordo com ALVES et al.(15)

e MARTIN et al. (12)

, com pequenas adaptações

estabelecendo-se as seguintes condições: etapa inicial de 94 °C por dois minutos, seguido de

40 ciclos repetidos com as temperaturas de 94 °C por 30 segundos (desnaturação), 53 °C por

30 segundos (anelamento) e 72 °C por um minuto (extensão). As reações foram finalizadas

com um tempo adicional de extensão de cinco minutos a 72 °C.

Como controle positivo para os testes de PCR foram empregados amostras de

referência de E. canis e A. platys procedentes do LDDP/EVZ/UFG. Água ultra-pura foi

utilizada como controle negativo.

Ensaios de PCR em tempo real

Todas as reações de qPCR foram realizadas em triplicata no instrumento

StepOnePlus™ Real-time PCR System (Applied Biosystems, Foster, EUA) para amplificação

do fragmento do DNA alvo com valor de confiança de 95%. A padronização da técnica de

qPCR baseou-se no protocolo “Sequence Detection Systems- Chemistry Guide” (Applied

Biosystems, Foster, EUA) fornecido pelo fabricante, que inclui um roteiro de medidas a

serem tomadas durante a elaboração de uma técnica de qPCR. O protocolo de qPCR padrão

foi calculado para um volume final de 20µL, sendo 10µL de Master mix (2x), 0,4µL de

iniciador senso (50µM), 0,4µL de iniciador anti-senso (50µM), 0,5µL de sonda (10µM), 2µL

de 10x IPC Mix, 0,4µL de 50x IPC DNA, 4,3µL de água ultra pura e 2µL de DNA da amostra

testada.

Os tubos contendo as amostras e a mistura de reagentes foram submetidas à etapa

inicial de 95 °C por 10 minutos, seguido de 40 ciclos repetidos com as temperaturas de 95 °C

por 15 segundos (desnaturação), 60 °C por 1 minuto (anelamento) e extensão final a 60 ºC por

30 segundos.

36

Otimização dos ensaios de qPCR

A partir do protocolo de qPCR definido como padrão para um volume final de

20µL, condições ótimas de amplificação foram determinadas através da variação na:

temperatura de anelamento (48 a 63ºC); concentração dos iniciadores (5 a 60 µM) e

concentração da sonda (2 a 24 µM), conforme indicado pelo “Sequence Detection Systems-

Chemistry Guide” (Applied Biosystems, Foster, EUA). E o threshold foi definido

automaticamente pelo programa StepOne Plus v2.3.

Avaliação da especificidade analítica dos iniciadores

Os novos iniciadores foram avaliados quanto à eficácia e especificidade para a

amplificação de fragmentos do gene 16S rRNA de A. platys e E. canis pela técnica de qPCR,

utilizando-se DNA genômico de cão não infectado, DNA de R. sanguineus e dos

hemoparasitos: E. canis, A. platys, B. vogeli, H. canis e M. haemofelis.

Determinação e avaliação da sensibilidade analítica das reações

Para determinar o limiar de detecção de A. platys e E. canis dos protocolos de

PCR convencional e qPCR, foram realizadas dez diluições seriadas a partir de amplicons de

E. canis e A. platys obtidos dos testes de PCR convencional e submetidos ao processo de

purificação usando o kit QIAquick Gel ® Extraction (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). Os

amplicons purificados foram sequenciados e a concentração dos mesmos foi determinada pelo

método fluorométrico, empregando-se o aparelho Qubit® 2.0 Fluorometer. As diluições

seriadas foram realizadas na base 10 (14 x 103 fg a 14 x 10

-6 fg/2 µL) para quantificação de

DNA e determinação da curva de regressão padrão. Cada diluição foi testada em triplicata.

O DNA extraído do sangue periférico de cães com exame parasitológico positivo

para A. platys e E. canis também foi utilizado no teste de sensibilidade analítica das técnicas

moleculares desenvolvidas, sendo realizadas quatro diluições seriadas de 1:10, a partir da

concentração de DNA extraído de 10 ng/µL oriundo do sangue de cão positivo para E. canis e

8 ng/ µL obtido do sangue de cão positivo para A. platys. Todas as diluições dos amplicons de

A. platys e E. canis e diluições do DNA extraído de sangue total de cães positivos para A.

platys e E. canis foram testadas em paralelo pelas técnicas de PCR convencional e qPCR.

37

Sensibilidade e especificidade epidemiológicas e valores preditivos positivo e negativo da

PCR em tempo real

Os testes moleculares de PCR convencional para amplificação de fragmento do

gene 16S rRNA de E. canis e A. platys foram utilizadas como padrão ouro para definir o real

estado da doença de um animal. Os cálculos da sensibilidade e especificidade epidemiológicas

e dos valores preditivos positivo e negativo da qPCR foram realizados utilizando as fórmulas:

Sensibilidade = a / (a+c) x 100;

Especificidade = d / (b+d) x 100;

VPP= valor preditivo positivo = a / (a+b) e

VPN= valor preditivo negativo= d / (c+d).

Onde: (a) = verdadeiro positivo; (b) = falso positivo; (c) = falso negativo e

(d) = verdadeiro negativo.

500 amostras de sangue de cães foi analisado em paralelo por ensaio de qPCR e

PCR convencional para detecção de A. platys (12)

e E. canis (15).

Análise estatística

Os resultados dos exames laboratoriais foram organizados em tabelas para serem

utilizadas como banco de dados na análise estatística. Os resultados obtidos pelos diferentes

métodos de diagnóstico empregados (PCR convencional e PCR em tempo real) foram

dispostos em tabela de contingência 2 x 2 para a avaliação da intensidade de concordância

entre os resultados obtidos. Empregou-se a análise de concordância Kappa do programa

Bioestat versão 5.3. O teste Kappa foi utilizado como um teste estatístico não paramétrico

destinado a comparar as proporções da mesma variável mensurada a nível nominal em duas

ocasiões distintas. Os resultados foram interpretados para os diferentes valores de Kappa

obtidos, com intervalo de confiança de 95% conforme avaliação de concordância de LANDIS

& KOCH (29)

.

RESULTADOS

Sequenciamento e análise das sequências de referência

Após o sequenciamento dos cinco produtos de PCR purificados, foi verificado

com base na análise de similaridade fornecida pelo algoritmo BLASTn que as sequências

38

deste estudo eram correspondentes a A. platys, E. canis, Babesia vogeli, Hepatozoon canis

e Mycoplasma haemofelis.

Desenho de iniciadores e sondas

Do alinhamento das sequências do gene 16S rRNA, correspondentes às espécies

A. platys (AF156784), A. phagocytophilum (U02521), E. canis (AF162860), E. ewingii

(U96436), E. chaffeensis (U86665), E. bovis (AF294789) e E. risticii (M21290), foram

selecionados para detecção de A. platys os iniciadores: senso espécie-específico AXCf (5'-

GGATTTTTGTCGTAGCTTGCTATG-3´), anti-senso gênero-específico AXCr (5'-

CACCATTTCTAGTGGCTATCCCA-3') e a sonda AXC SR (5'-FAM-

CTACTAGGTAGATTCCTATGCA-MGB-3') (FIGURA 1).



chaffeensis (U86665), E. bovis (AF294789) e E. risticii (M21290) pelo método de Clustal W,

com localização do iniciador senso espécie-específico AXCf (caixa com bordas marron),

iniciador anti-senso gênero-específico AXCr (caixa com bordas laranja) e sonda AXC SR

(caixa com bordas azul).

Do alinhamento das sequências do gene 16S rRNA, correspondentes às espécies

A. platys (AF156784), A. phagocytophilum (U02521), E. canis (AF162860), E. ewingii

(U96436), E. chaffeensis (U86665), E. bovis (AF294789) e E. risticii (M21290) foram

selecionados para detecção de E. canis os iniciadores espécie-específicos: senso EXCf (5'-

GCCTCTGGCTATAGGAAATTGTTAGT-3') e anti-senso EXCr (5'-

39

ACAGTATTACCCACCATTTCTAATGG-3'), e a sonda EXC SR (5'-FAM-

CGTACTACTAGGTAGATTC-MGB-3') (FIGURA 2).



chaffeensis (U86665), E. bovis (AF294789) e E. risticii (M21290) pelo método de Clustal W,

com localização do iniciador senso espécie-específico EXCf (caixa com bordas vermelhas),

iniciador anti-senso espécie-específico EXCr (caixa com bordas roxa) e sonda EXC SR (caixa

com bordas verde).

Otimização do protocolo de qPCR para detecção de A. platys e E. canis

O desempenho das reações de qPCR para detecção de A. platys e E. canis foram

avaliados a partir de modificações na concentração dos inciadores, sondas e temperatura de

anelamento do protocolo de qPCR definido como padrão para um volume final de 20µL.

O threshold, que é definido como o ponto de corte entre amostras positivas e

negativas de acordo com a emissão de fluorescência por amostra, foi definido

automaticamente pelo equipamento StepOne Plus em um valor de 0.2 para detecção de A.

platys e E. canis. Já o ciclo threshold (Ct) é o ciclo da qPCR na qual cada amostra passou o

threshold e se tornou positiva.

Amostras de referência para A. platys e E. canis foram submetidas a reações de

qPCR para detecção espécie-específica de A. platys e E. canis com modificações nas

concentrações de iniciadores, sonda e temperatura de anelamento a partir do protocolo

definido como padrão.

40

Os valores de Ct das reações utilizando os iniciadores AXCf/AXCr nas

concentrações de 10 µM a 60µM para detecção de A. platys variaram de 20 a 28 ciclos. A

reação de qPCR utilizando os iniciadores AXCf/AXCr na concentração de 5µM apresentou Ct

de 40 ciclos (FIGURA 3).

O menor Ct (=20) foi observado nas reações que utilizaram os iniciadores AXCf e

AXCr na concentração de 50µM e 60µM, e a emissão de fluorescência foi maior quando

utilizados os iniciadores na concentração de 60µM (FIGURA 3).

FIGURA 3. Curva de amplificação de A. platys utilizando diferentes concentrações dos

iniciadores AXCf e AXCr (A). Interface do software Step One Plus (v. 2.3) mostrando o

resultado (presença e ausência) da qPCR utilizando diferentes concentrações dos iniciadores

AXCf e AXCr para detecção de A. platys (B).

Os valores de Ct das reações utilizando os iniciadores EXCf/EXCr nas

concentrações de 10 µM a 60µM para detecção de E. canis não demonstraram variação no Ct,

o qual permaneceu no ciclo 16 para todas as concentrações dos iniciadores avaliadas. No

entanto, a intensidade de fluorescência detectada pelo equipamento de qPCR foi maior ao se

utilizarem os iniciadores EXCf e EXCr na concentração de 50µM (FIGURA 4).

FIGURA 4. Curva de amplificação de E. canis utilizando diferentes concentrações dos

iniciadores EXCf e EXCr (A). Interface do software Step One Plus (v. 2.3) mostrando o

A B

B A

41

resultado da qPCR utilizando diferentes concentrações dos iniciadores EXCf e EXCr para

detecção de E. canis (B).

Na análise das reações utilizando diferentes concentrações da sonda de hidrólise

AXC SR, verificou-se que a intensidade de fluorescência emitida foi diretamente proporcional

a concentração da sonda de hidrólise AXC SR (Taqman). Os Cts variaram de 21 a 24 ciclos,

sendo o Ct de 21 ciclos, menor, para a sonda de hidrólise AXC SR utilizada nas

concentrações de 10 µM e 12µM (FIGURA 4). A utilização da sonda de hidrólise em uma

concentração maior permitiu o resultado positivo para A. platys mais precocemente (Ct 21). Já

a sonda de hidrólise utilizada em uma concentração menor (2 µM), demonstrou menor

emissão de fluorescência, indicando resultado positivo em um ciclo posterior (Ct 24). Mesmo

assim, todas as concentrações da sonda de hidrólise testada demonstraram resultado positivo

pela técnica de qPCR, conforme consta na FIGURA 5.

FIGURA 5. Curva de amplificação de A. platys utilizando diferentes concentrações da sonda

de hidrólise AXC SR (A). Interface do software Step One Plus (v. 2.3) mostrando o resultado

da qPCR utilizando diferentes concentrações da sonda de hidrólise AXC SR para detecção de

A. platys (B).

Verificou-se que a intensidade de fluorescência emitida foi diretamente

proporcional à concentração da sonda de hidrólise EXC SR (Taqman). Os Ct variaram de 16 a

20 ciclos com a variação na concentração de sonda, sendo o Ct de 16 ciclos, mais baixo, para

a sonda de hidrólise EXC SR utilizada na concentração de 12µM (FIGURA 2-6). Com a

utilização da sonda de hidrólise em uma concentração maior (12µM) obteve-se resultado

positivo com um Ct menor (Ct 16). Já a sonda de hidrólise utilizada em uma concentração

menor (2µM) demandou maior tempo para emissão de fluorescência (Ct 20), indicando

resultado positivo em um ciclo posterior. Mesmo assim, todas as concentrações da sonda de

hidrólise testada demonstraram resultado positivo para E. canis pela técnica de qPCR,

conforme consta na FIGURA 6.

A B

42

Após a otimização do protocolo de qPCR para detecção de E. canis, verificou-se

que condições ótimas para amplificação foram obtidas com sonda de hidrólise AXC SR e

EXC SR na concentração de 12µM (FIGURA 5; FIGURA 6).

FIGURA 6. Curva de amplificação de E. canis utilizando diferentes concentrações da sonda

de hidrólise EXC SR (A). Interface do software Step One Plus (v. 2.3) mostrando o resultado

da qPCR utilizando diferentes concentrações da sonda de hidrólise EXC SR para detecção de

E. canis (B).

Após a realização de reações com modificação na temperatura de anelamento da

reação, verificou-se que a intensidade de fluorescência foi maior quando a reação foi

submetida a uma temperatura de anelamento de 60ºC para A. platys e 55 ºC para E. canis.

Análise de similaridade dos oligonucleotídeos e especificidade analítica dos protocolos de

qPCR para detecção de A. platys e E. canis

O iniciador AXCf senso, espécie-específico, contendo 24 bases, foi selecionado

em uma região semi conservada do gene 16S rRNA, localizado na posição 46-69 da sequência

(AF156784), com temperatura de anelamento de 58 ºC (QUADRO 1), calculada pelo

software Primer Express® (Applied Biosystems, Foster, CA, USA). Através da operação de

BLAST (GenBank), o iniciador apresentou resultados de 100% de similaridade apenas para A.

platys. O iniciador AXCr anti-senso, com 23 bases, localizado na posição 145-123 do

alinhamento das sequências do mesmo gene das espécies acima (QUADRO 1) foi identificado

como sendo gênero- específico.

A sonda de hidrólise AXC SR (Taqman), com 19 bases, foi selecionada em uma

região conservada do gene 16S rRNA, localizada na posição 120-99 do alinhamento das

A B

43

sequências do mesmo gene das espécies acima (QUADRO 1). Através da operação BLAST

(Genbank), a sonda de hidrólise foi caracterizada como sendo gênero-específica.

Os iniciadores EXCf senso e EXCr anti-senso, espécie-específicos, contendo 26

bases cada, foram selecionados em uma região semi conservada do gene (AF162860),

localizados, respectivamente, nas posições 61-86 e 161-136 da sequência, ambos com

temperatura de anelamento de 58 ºC (QUADRO 1), calculada pelo software Primer Express®

(Applied Biosystems, Foster, CA USA). Através da operação de BLAST (GenBank), os

iniciadores apresentaram resultados de 100% na análise de similaridade apenas para E. canis.

A sonda de hidrólise EXC SR (Taqman), com 19 bases, foi selecionada em uma

região semi-conservada para o gênero Ehrlichia, localizada na posição 129-111 do

alinhamento das sequências do mesmo gene das espécies acima (QUADRO 1). Através da

operação BLAST (Genbank), a sonda de hidrólise foi caracterizada como sendo gênero-

específica.

QUADRO 1. Sequências de iniciadores e sondas de hidrólise (Taqman) selecionados para

amplificação específica de fragmentos dos genes 16S rRNA de A. platys e E. canis por qPCR. Gene e nº de acesso no

GenBank Iniciadores Sequências

Posição no

gene %GC

Tm

(ºC)

Tamanho

(nt)

16S rRNA

(AF156784) Senso AXCf 5'-GGATTTTTGTCGTAGCTTGCTATG-3´ 46-69 42 58 24

16S rRNA

(AF156784)

Anti-senso

AXCr 5'-CACCATTTCTAGTGGCTATCCCA-3' 145-123 48 59 23

16S rRNA

(AF156784) Probe AXC SR

5'-FAM-CTACTAGGTAGATTCCTATGCA-

MGB-3' 120-99 41 68 22

16S rRNA

(AF162860) Senso EXCf 5'-GCCTCTGGCTATAGGAAATTGTTAGT-3' 61-86 42 58 26

16S rRNA

(AF162860)

Anti-senso

EXCr 5'-ACAGTATTACCCACCATTTCTAATGG-3' 161-136 38 58 26

16S rRNA

(AF162860) Probe EXC SR 5'-FAM-CGTACTACTAGGTAGATTC-MGB-3' 129-111 42 68 19

Os iniciadores AXCf e AXCr, avaliados em conjunto com a sonda de hidrólise

AXC SR (Taqman) através da reação de qPCR, demonstraram uma especificidade de 100%

na amplificação do gene 16S rRNA de A. platys. Não houve resultado positivo inespecífico

para amostras de DNA genômico de C. familiaris, R. sanguineus e dos seguintes

hemoparasitos: E. canis, B. vogeli, H. canis e M. haemofelis (FIGURA 7).

44

FIGURA 7. Teste de especificidade utilizando qPCR para detecção de A. platys utilizando

DNA de C. familiaris, R. sanguineus, A. platys, B. vogeli, E. canis, H. canis e M. haemofelis

(A). Resultado positivo com amplificação específica somente de A. platys (B).

O par de iniciadores EXCf e EXCr, avaliados em conjunto com a sonda de

hidrólise EXC SR (Taqman) através da reação de qPCR, demonstraram uma especificidade de

100% na amplificação do gene 16S rRNA de E. canis. Não houve resultado positivo

inespecífico para amostras de DNA genômico de C. familiaris, R. sanguineus e dos seguintes

hemoparasitos: A. platys, B. vogeli, H. canis e M. haemofelis (FIGURA 8).

FIGURA 8. Teste de especificidade qPCR para detecção de E. canis utilizando DNA de C.

familiaris, R. sanguineus, A. platys, B. vogeli, E. canis, H. canis e M. haemofelis (A).

Resultado positivo com amplificação específica somente de E. canis (B).

Sensibilidade analítica dos testes de detecção de A. platys

O limiar de detecção foi avaliado por meio da realização de dez diluições

decimais seriadas e sucessivas a partir de alíquotas de DNA de concentração conhecida para

A. platys, variando entre 14000 fg a 14 x 10-6

fg/ 2 µL.

Os resultados do teste de sensibilidade dos testes de PCR convencional

demonstraram resultados positivos em amostras de A. platys com concentrações de 14000 fg

até 4 fg do DNA alvo. As amostras com concentrações menores foram negativas, como pode

ser observado na FIGURA 9.

B A

A B

45

FIGURA 9. Produtos amplificados através da PCR convencional com Primer PLATYS F/

EHR16SR. Avaliação da sensibilidade da PCR convencional utilizando quatro diluições de

DNA extraído de cão com exame parasitológico positivo para A. platys e 10 diluições do

DNA de A. platys com diferentes concentrações. Eletrofores em gel de agarose (1,2%) corado

com brometo de etídio. Canaleta 1: marcador de peso molecular de 100 pb. Canaletas 2-5:

amostras com DNA alvo de A. platys nas diferentes concentrações: 4 fg (16 ng de DNA

extraído); 0,9 fg (1,6 ng de DNA extraído); DNA alvo não quantificado (0,2 ng de DNA

extraído) e DNA alvo não quantificado (0,02 ng de DNA extraído). E nas canaletas 6 a 14

estão o DNA de A. platys em diluições seriadas na base 10 (14000 fg a 14 x 10-6

fg/2 µL),

respectivamente. Canaleta 16: controle negativo.

A sensibilidade analítica do protocolo de qPCR para detecção de A. platys foi

avaliada utilizando amostras de DNA extraído de cão com exame parasitológico positivo para

A. platys e amplicons de A. platys em diferentes concentrações. Os valores de Ct da reação

variaram de 19 a 39 ciclos. As amostras com maior concentração (= 14000 fg/2 µL)

obtiveram um Ct mais baixo, indicando que o resultado positivo aconteceu mais

precocemente (Ct=19). Nas amostras com menor concentração (0,9 fg/2 µL) a emissão de

fluorescência foi mais tardia, indicando resultado positivo em um ciclo posterior (Ct= 39)

(FIGURA 10).


ensaio de quantificação absoluta. Os pontos vermelhos representam os Cts gerados pelo Log

de cada concentração de DNA padrão. Os pontos azuis representam os Cts gerados pelo Log

B

A

46

de cada concentração de A. platys contidas no DNA extraído do sangue de cão positivo para

A. platys no exame parasitologico direto (A). DNA diluído obtido da extração de DNA do

sangue de cão positivo no exame parasitologico direto para para A. platys (B).

Foi realizada a curva padrão para quantificar a concentração de DNA de A. platys

contido no DNA extraído de sangue periférico de um cão com exame parasitológico direto

positivo para A. platys cuja concentração de DNA obtida foi de 8 ng/µL. Verificou-se pelos

resultados da curva padrão a existência de aproximadamente 4 fg de A. platys nos 16 ng (2

µL) de DNA extraído de sangue periférico de um cão com exame parasitológico direto

positivo para A. platys (FIGURA 10). Foram feitas quatro diluições seriadas de 1:10 no DNA

extraído e o protocolo de qPCR foi capaz de detectar até 0,9 fg de DNA de A. platys em 1,6

ng (2 µL) de DNA extraído de sangue periférico de um cão com exame parasitológico direto

positivo para A. platys (FIGURA 11).

FIGURA 11. Curva de amplificação de avaliação do limiar e detecção. As linhas coloridas

representam quantidades decrescentes de DNA alvo (14000 fg a 14 x 10-6

fg/2 µL) quanto

maior a quantidade de DNA (primeira linha azul), menor o valor de Ct (menos ciclos de

amplificação são necessários para atingir o limiar de detecção). A linha amarela mostra a boa

performance do sistema em detectar até 0,9 fg de A. platys (A). Resultado da diluição seriada

do DNA de A. platys (B).

Sensibilidade analítica dos testes de detecção de E. canis

O limiar de detecção foi avaliado por meio da realização de dez diluições

decimais seriadas e sucessivas a partir de alíquotas de DNA de concentração conhecida para

E. canis, variando entre 14000 fg a 14 x 10-6

fg/ 2 µL.

Os resultados do teste de sensibilidade feitos pela técnica de PCR convencional

demonstraram que foi possível obter diagnóstico positivo em amostras de E. canis em

concentrações de 14000 fg até 7,48 fg do DNA alvo. As amostras com concentrações menores

foram negativas, como pode ser observado na FIGURA 12.

A B

47

FIGURA 12. Produtos amplificados através da PCR convencional com Primer EBR1/ EBR5.

Avaliação da sensibilidade da PCR convencional utilizando quatro diluições de DNA extraído

de cão com exame parasitológico positivo para E. canis e 10 diluições do DNA de E. canis

com diferentes concentrações. Eletroforese em gel de agarose (1,2%) corado com brometo de

etídio. Canaleta 1: marcador de peso molecular de 100 pb; canaletas de 2-5: amostras com

DNA alvo de E. canis nas diferentes concentrações: 7,48 fg (20 ng de DNA extraído); 1,15 fg

(2 ng de DNA extraído); 0,25 fg (0,2 ng de DNA extraído) e DNA alvo não quantificado

(0,02 ng de DNA extraído). E nas canaletas 6 a 14 estão o DNA de E. canis em diluições

seriadas na base 10 (14000 fg a 14 x 10-6

fg/2 µL), respectivamente. Canaleta 16: controle

negativo.

O limiar de detecção do protocolo de qPCR para detecção de E. canis foi avaliado

com DNA extraído de cão com exame parasitológico positivo para E. canis e amplicons de E.

canis em diferentes concentrações. Os valores de Ct obtidos na reação variaram de 18 a 38

ciclos. As amostras com maior concentração (= 14000 fg/2 µL) obtiveram um Ct mais baixo,

indicando que o resultado positivo aconteceu em um ciclo menor (Ct=18). E as amostras com

menor concentração (0,14 fg/2 µL) demandaram maior tempo para emissão de fluorescência,

indicando resultado positivo em um ciclo posterior (Ct= 38) (FIGURA 13).


ensaio de quantificação absoluta. Os pontos vermelhos representam os Cts gerados pelo Log

de cada concentração de DNA padrão. Os pontos azuis representam os Cts gerados pelo Log

de cada concentração de E. canis contidas no DNA extraído do sangue de cão positivo para E.

B A

48

canis no exame parasitologico direto (A). DNA diluído obtido da extração de DNA do sangue

de cão positivo no exame parasitologico direto para E. canis (B).

Verificou-se a existência de 7,48 fg de E. canis nos 20 ng (2 µL) de DNA extraído

de sangue periférico de um cão com exame parasitológico direto positivo para E. canis

(FIGURA 13). Foram feitas quatro diluições seriadas de 1:10 (20 ng a 0,02 ng/ 2 µL) no DNA

extraído e o protocolo de qPCR foi capaz de detectar até 0,25 fg de DNA de E. canis em 0,2

ng (2 µL) de DNA extraído de sangue periférico de um cão com exame parasitológico direto

positivo para E. canis (FIGURA 14).

FIGURA 14. Curva de amplificação de avaliação do limiar e detecção. As linhas coloridas

representam quantidades decrescentes de DNA alvo (14000 fg a 14 x 10-6

fg/2 µL) quanto

maior a quantidade de DNA (primeira linha azul), menor o valor de Ct (menos ciclos de

amplificação são necessários para atingir o limiar de detecção). A linha cinza mostra a boa

performance do sistema em detectar até 0,14 fg de E. canis (A). Resultado da diluição seriada

do DNA de E. canis (B).

Eficácia do novo protocolo de qPCR para A. platys e E. canis e análise de concordância

Kappa entre os testes de diagnóstico empregados

A sensibilidade, proporção de positivos verdadeiros detectados, e a especificidade,

proporção de negativos verdadeiros detectados, foram utilizadas como indicadores da

validade do teste de diagnóstico de A. platys e E. canis por qPCR. A variável medida foi

nominal e dicotômica: positiva e negativa.

Entre as 500 amostras de cães analisadas, 185 (37%; 185/500) foram positivas

para E. canis por ambas as técnicas (qPCR e PCR convencional), cinco (1%; 5/500) amostras

foram positivas apenas por testes de qPCR e 310 (62%; 315/500) amostras foram negativas

em ambos os testes de diagnóstico (TABELA 1). Para A. platys, verificou-se que 30 (6 %;

30/500) foram positivas para A. platys por ambas as técnicas (qPCR e PCR convencional) e

B A

49

470 (94%; 470/500) amostras foram negativas em ambos os testes de diagnóstico. Não foi

verificada nenhuma discordância no resultado das amostras entre os testes de diagnóstico

empregados.

A concordância entre as técnicas de PCR convencional e qPCR foi calculada de

acordo com a medida KAPPA. O índice Kappa geral calculado para a concordância entre os

testes empregados para a detecção de E. canis foi de 0.9787 (p<0,0001) com intervalo de

confiança de 95%, sendo verificada excelente concordância entre os resultados dos testes de

qPCR e PCR convencional para detecção de E. canis.

A qPCR para detecção de A. platys demonstrou sensibilidade e especificidade de

100%, e os ensaios de qPCR para detecção de E. canis demonstraram sensibilidade de 100% e

especificidade de 98,41%. O valor preditivo positivo e valor preditivo negativo calculados para

o diagnóstico por qPCR para detecção de E. canis e A. platys estão demonstrados na

TABELA 1.

TABELA 1. Valor preditivo (resultado positivo de teste) e valor preditivo (resultado negativo

de teste) do ensaio de qPCR para detecção de E. canis e A. platys.

Resultado do teste

PCR em tempo real

Estado verdadeiro

(PCR convencional) Padrão-ouro Total

E. canis positivo E. canis negativo

Prevalência de E. canis: 30%

E. canis positivo 185 (a) 5 (b) 190

E. canis negativo 0 (c) 310 (d) 310

Total 185 315 500

Valor preditivo positivo: 97,36%

Valor preditivo negativo: 100%

Prevalência de A. platys: 5%

A. platys positivo A. platys negativo

A. platys positivo 30 (a) 0 (b) 30

A. platys negativo 0 (c) 470 (d) 470

Total 30 470 500

Valor preditivo positivo: 100%

Valor preditivo negativo: 100%

DISCUSSÃO

Avanços na área de biologia molecular têm proporcionado métodos altamente

específicos e sensíveis, para identificação direta do agente etiológico da EMC e TCIC, e o

emprego de técnicas de diagnóstico utilizando PCR para a detecção de A. platys e E. canis

vem aumentando gradativamente, servindo para sustentar o emprego da terapêutica adequada.

50

A prática das aplicações das técnicas de PCR e suas técnicas derivadas em diagnósticos

moleculares tem se mostrado de grande efetividade, especialmente no diagnóstico de doenças

cujo diagnóstico precoce é crucial no sucesso do tratamento. Porém, protocolos de PCR em

tempo real para a detecção específica de A. platys e E. canis ainda são muito escassos.

Os resultados alcançados com os testes de especificidade e sensibilidade para os

iniciadores PLATYSF/EHR16SR e EBR1/EBR5 dos protocolos de PCR convencional,

serviram como padrão-ouro e deram suporte para validar os ensaios de qPCR com os pares de

iniciadores e sondas desenhados neste estudo como protocolos confiáveis e de detecção rápida

e específica de A. platys e E. canis.

A qPCR para detecção de E. canis desenvolvida neste estudo demonstrou limiar

de detecção para E. canis menor do que o da PCR convencional (15)

. O menor limiar de

detecção da qPCR aliada a inclusão de uma sonda de hidrólise para detecção de E. canis,

além do uso de dois iniciadores, contribuíram para elevar a sensibilidade analítica do teste, o

que pode ter sido a causa da detecção de E. canis em cinco cães que foram negativos no teste

de PCR convencional. Em muitos casos, ensaios qPCR são mais específicos devido à

exigência de três oligonucleotídeos para emparelhar o DNA alvo (28)

.

A qPCR associa a metodologia de PCR a um sistema de detecção e quantificação

de fluorescência produzida durante os ciclos de amplificação, sendo uma técnica descrita

como quantitativa porque consegue realizar a avaliação do número de moléculas produzidas a

cada ciclo. A possibilidade de monitorar, ao longo da reação, a quantidade de produto

formado a cada ciclo de amplificação e de quantificar este produto durante a sua fase ótima de

formação, confere maior precisão e reprodutibilidade à qPCR quando comparada com a PCR

convencional.

O primeiro ensaio de qPCR capaz de detectar e discriminar três espécies de

Ehrlichia clinicamente importantes em uma única reação de amplificação do gene da proteína

(dsb) foi descrito por DOYLE et al.(16)

. Posteriormente, BANETH et al.(19)

desenvolveram um

protocolo de qPCR usando a subunidade 16S rRNA de E. canis, em que as sondas e

iniciadores desenhados foram espécie-específicos para E. canis. E mais recentemente,

PELEG et al. (20)

descreveram um protocolo de qPCR capaz de detectar simultaneamente E.

canis e B. vogeli, dois importantes patógenos de cães transmitidos por carrapatos.

A qPCR vem se tornando rapidamente o método preferencial para o diagnóstico

de A. platys e E. canis. O gene 16S rRNA é o mais utilizado como alvo molecular para a

detecção de Anaplasma e Ehrlichia e foi o gene de escolha para o desenvolvimento de ensaios

de qPCR para a detecção específica de A. platys e E. canis. Apesar das sequências do gene

51

16S rRNA serem altamente conservadas entre os membros do gênero Anaplasma e Ehrlichia,

buscou-se a identificação de sequências heterogênicas para realizar o desenho dos

oligonucleotídeos e sondas espécie-especificas para A. platys e E. canis.

As sequências de iniciadores e sondas desenhados respeitaram os parâmetros

indicados pelo sistema da TaqmanR/MGB

R (Applied Biosystems, Inc., EUA). A escolha do

sistema de detecção da TaqManR e da sonda MGB

R (Applied Biosystems, Inc., EUA)

baseou-se na sensibilidade e especificidade superiores as do sistema SBYR GreenR

(Applied

Biosystems, Inc., EUA) (20)

.

O sistema utilizando sonda de hidrólise da Taqman, por ser mais específico que o

SYBR Green é o mais empregado no desenvolvimento de protocolos de qPCR para o

diagnóstico da EMC (16, 19, 20)

e TCIC (27, 28)

. O método de quantificação da TaqMan utiliza

sondas de hidrólise altamente específicas a sequência alvo, liberando fluorescência apenas na

presença do produto de PCR de interesse. Quanto maior o número de cópias iniciais do ácido

nucléico alvo, mais rápido será observado o aumento significativo na fluorescência.

EDDLESTONE et al.(28)

desenvolveram um protocolo de qPCR utilizando o

sistema da TaqMan capaz de detectar A. phagocytophilum, E. canis, E. chaffeensis e A. platys,

porém sem diferenciar as espécies detectadas. Já os novos protocolos de qPCR para detecção

de E. canis e A. platys desenvolvidos neste estudo demonstraram ser espécie-específicos com

amplificação específica da sequência alvo de interesse.

Em relação à análise custo-benefício, o resultado dos cálculos indicaram que a

mecanização do processo verificada na qPCR, diminui o risco de contaminação entre

amostras e também a torna mais ágil, possibilitando, dessa maneira, um aumento no número

de amostras testadas em um mesmo período, além do teste ser mais específico e dispensar

procedimentos adicionais como a corrida eletroforética dos produtos em gel de agarose e foto

documentação, tudo isso aliado a maior sensibilidade analítica encontrada no presente

trabalho. Além disso, a qPCR possui a capacidade de quantificar a amostra e apresenta maior

confiança e chances de acerto, devido a menor manipulação humana. Esse conjunto de fatores

evidencia as vantagens reais dessa técnica.

O custo dos reagentes necessários para a realização de uma reação em unicata de

qPCR foi semelhante ao custo da PCR convencional. Porém, como a recomendação do

sistema de qPCR é de realizar as reações em triplicata, a reação por amostra acaba sendo mais

onerosa, o que eleva o custo da técnica. Os outros fatores que influenciam nos custos da

qPCR são os gastos com mão de obra especializada, aquisição dos equipamentos e criação da

infra-estrutura laboratorial.

52

Os novos ensaios de qPCR desenvolvidos e descritos no presente estudo

apresentaram um custo de R$ 8,80 por reação e um custo total de R$26,40 por amostra do

ensaio realizado em triplicata (QUADRO 2). Ressalta-se, no entanto, que a análise de custos

se referiu apenas ao material de consumo, não sendo considerados, nos cálculos, os custos

com a extração do DNA, as despesas com equipamentos, vidrarias, mão-de-obra, custos

indiretos entre outros. De forma geral, o custo da qPCR é maior que a PCR convencional,

porém esse valor é compensado quando se considera que essa técnica tem o dobro da

capacidade de realização de exames em comparação à técnica convencional. Dessa maneira,

se a qPCR for utilizada em sua capacidade máxima e em larga escala, os custos tendem a

igualar ou até mesmo serem menores que os da PCR convencional, podendo ser aplicada ao

uso comercial.

QUADRO 2- Valores do método de qPCR utilizando sonda de hidrólise (TaqMan) para

detecção de A. platys e E. canis.

Reagentes ou insumos Valor unitário (R$)

Master mix 4,35

Iniciadores 0,30

Sonda de hidrólise Taqman 0,96

Kit exogenous IPC 1,98

Água ultra pura 0,01

Placa 0,25

Adesivo para selar a placa 0,15

Ponteiras 0,80

Total 8,80

CONCLUSÃO

A análise do alinhamento múltiplo das sequências das várias espécies de

Anaplasma e Ehrlichia permitiu informações para o desenho dos iniciadores e sondas para

detecção específica de A. platys e E. canis, os quais foram aplicáveis para o desenvolvimento

de sistemas de diagnóstico utilizando sondas de hidrólise Taqman para detecção espécie-

específica de A. platys e E. canis.

Os métodos padronizados de PCR em tempo real para detecção e quantificação de

A. platys e E. canis apresentaram:

Excelente limiar de detecção para a A. platys e E. canis

Excelente precisão

53

Com relação ao desempenho do método frente a amostras clínicas, os novos

protocolos de qPCR demonstraram boa performance e eficácia, podendo ser considerados

uma ferramenta útil na detecção de A. platys e E. canis.

54

REFERENCIAS

1. Shaw SE, Day MJ, Birtles RJ, Breitschwerdt EB. Tick-borne infectious diseases of

dogs. Trends in Parasitology. 2001 2/1/;17(2):74-80.

2. Stich RW, Schaefer JJ, Bremer WG, Needham GR, Jittapalapong S. Host surveys,

ixodid tick biology and transmission scenarios as related to the tick-borne pathogen, Ehrlichia

canis. Veterinary parasitology. 2008 Dec 20;158(4):256-73. PubMed PMID: 18963493.

Pubmed Central PMCID: 3053144.

3. Yabsley MJ, McKibben J, Macpherson CN, Cattan PF, Cherry NA, Hegarty BC, et al.

Prevalence of Ehrlichia canis, Anaplasma platys, Babesia canis vogeli, Hepatozoon canis,

Bartonella vinsonii berkhoffii, and Rickettsia spp. in dogs from Grenada. Veterinary

parasitology. 2008 Feb 14;151(2-4):279-85. PubMed PMID: 18160223.

4. Hua P, Yuhai M, Shide T, Yang S, Bohai W, Xiangrui C. Canine ehrlichiosis caused

simultaneously by Ehrlichia canis and Ehrlichia platys. Microbiology and immunology.

2000;44(9):737-9. PubMed PMID: 11092236.

5. Huang, Haibin, Unver, Ahmet, Perez, J. M, et al. Prevalence and molecular analysis of

Anaplasma platys in dogs in Lara, Venezuela. Brazilian Journal of Microbiology. 2005.

6. Santos F, Coppede JS, Pereira ALA, Oliveira LP, Roberto PG, Benedetti RBR, et al.


in dogs from Ribeirão Preto, Brazil. The Veterinary Journal. 2009 1//;179(1):145-8.

7. Ramos R, Ramos C, Araujo F, Oliveira R, Souza I, Pimentel D, et al. Molecular

survey and genetic characterization of tick-borne pathogens in dogs in metropolitan Recife

(north-eastern Brazil). Parasitology research. 2010 Oct;107(5):1115-20. PubMed PMID:

20680344.

8. Souza BM, Leal DC, Barboza DC, Uzeda RS, De Alcantara AC, Ferreira F, et al.

Prevalence of ehrlichial infection among dogs and ticks in Northeastern Brazil. Revista

brasileira de parasitologia veterinaria = Brazilian journal of veterinary parasitology : Orgão

Oficial do Colegio Brasileiro de Parasitologia Veterinaria. 2010 Apr-Jun;19(2):89-93.





10. Ferreira RF, Cerqueira Ade M, Pereira AM, Velho PB, Azevedo RR, Rodrigues IL, et

al. Cross-reaction evaluation of PCR-Anaplasma platys positive dogs tested to Anaplasma

phagocytophilum antibodies by commercial ELISA. Revista brasileira de parasitologia

veterinaria = Brazilian journal of veterinary parasitology : Orgão Oficial do Colégio

Brasileiro de Parasitologia Veterinária. 2008 Sep;17 Suppl 1:5-8. PubMed PMID: 20059806.


an overview. Veterinary journal. 2011 Mar;187(3):292-6. PubMed PMID: 20226700.



PMID: 15713449.

13. Dagnone AS, Souza AI, Andre MR, Machado RZ. Molecular diagnosis of

Anaplasmataceae organisms in dogs with clinical and microscopical signs of ehrlichiosis.

Revista brasileira de parasitologia veterinaria = Brazilian journal of veterinary parasitology :

55

Orgao Oficial do Colegio Brasileiro de Parasitologia Veterinaria. 2009 Oct-Dec;18(4):20-5.


14. Ramos CA, Ramos RA, Araujo FR, Guedes DS, Jr., Souza, II, Ono TM, et al.

Comparison of nested-PCR with blood smear examination in detection of Ehrlichia canis and

Anaplasma platys in dogs. Revista brasileira de parasitologia veterinaria = Brazilian journal

of veterinary parasitology : Orgão Oficial do Colégio Brasileiro de Parasitologia Veterinária.

2009 Dec;18 Suppl 1:58-62. PubMed PMID: 20040193.



2005 2005-03-28Avaliação de iniciadores e protocolo para o diagnóstico da pancitopenia

tropical canina por PCR. Ciên Animal Bras. Goiânia;6(1):6. Epub 2005-01-01.

16. Doyle CK, Labruna MB, Breitschwerdt EB, Tang YW, Corstvet RE, Hegarty BC, et

al. Detection of medically important Ehrlichia by quantitative multicolor TaqMan real-time

polymerase chain reaction of the dsb gene. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 2005

Oct;7(4):504-10. PubMed PMID: 16237220. Pubmed Central PMCID: 1888493.









20. Peleg O, Baneth G, Eyal O, Inbar J, Harrus S. Multiplex real-time qPCR for the

detection of Ehrlichia canis and Babesia canis vogeli. Veterinary parasitology. 2010 Oct

29;173(3-4):292-9. PubMed PMID: 20674177.

21. Rufino CP, Moraes PH, Reis T, Campos R, Aguiar DC, McCulloch JA, et al.

Detection of Ehrlichia canis and Anaplasma platys DNA using multiplex PCR. Vector borne

and zoonotic diseases. 2013 Dec;13(12):846-50. PubMed PMID: 24107211.

22. Ramos RA, Latrofa MS, Giannelli A, Lacasella V, Campbell BE, Dantas-Torres F, et

al. Detection of Anaplasma platys in dogs and Rhipicephalus sanguineus group ticks by a

quantitative real-time PCR. Veterinary parasitology. 2014 Sep 15;205(1-2):285-8. PubMed

PMID: 25027609.

23. Tamí IdCd, Tamí-Maury IM. Identificación morfológica de Ehrlichia sp. en las

plaquetas de pacientes con infección por virus de la inmunodeficiencia humana, en

Venezuela. Revista Panamericana de Salud Pública. 2004;16:345-9.

24. Perez M, Bodor M, Zhang C, Xiong Q, Rikihisa Y. Human infection with Ehrlichia

Canis accompanied by clinical signs in Venezuela. Annals of the New York Academy of

Sciences. 2006;1078(1):110-7.

25. Arraga-Alvarado CM, Qurollo BA, Parra OC, Berrueta MA, Hegarty BC,

Breitschwerdt EB. Case report: Molecular evidence of Anaplasma platys infection in two

women from Venezuela. The American journal of tropical medicine and hygiene. 2014

Dec;91(6):1161-5. PubMed PMID: 25266347. Pubmed Central PMCID: 4257640.

26. Beatriz Silva A, Pina Canseco S, Gabriel de la Torre Mdel P, Mayoral Silva A,

Mayoral MA, Perez-Campos Mayoral L, et al. Asymptomatic human infection from contact

56

with dogs: a case of human ehrlichiosis. Gaceta medica de Mexico. 2014 Mar-

Apr;150(2):171-4. PubMed PMID: 24603998. Infeccion humana asintomatica por contacto

con perros. Un caso de ehrlichiosis humana.

27. Sirigireddy KR, Ganta RR. Multiplex detection of Ehrlichia and Anaplasma species

pathogens in peripheral blood by real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction.

The Journal of molecular diagnostics : JMD. 2005 May;7(2):308-16. PubMed PMID:


28. Eddlestone SM, Gaunt SD, Neer TM, Boudreaux CM, Gill A, Haschke E, et al. PCR

detection of Anaplasma platys in blood and tissue of dogs during acute phase of experimental

infection. Experimental parasitology. 2007 Feb;115(2):205-10. PubMed PMID: 17034792.

29. Landis JR, Koch GG. The Measurement of Observer Agreement for Categorical Data.

Biometrics. 1977;33(1):159-74.

30. Thompson, JD, Higgins DG, Gibson, TJ. CLUSTAL W: improving the sensitivity of

progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap

penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 1994. Nov 11; 22(22): 4673–4680.

PMCID: PMC308517

57

CAPÍTULO 4

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Em virtude da gravidade das erliquioses, potencial zoonótico e caráter endêmico

em regiões tropicais e subtropicais, a detecção precoce da infecção é extremamente

importante. Porém, a identificação dos hemoparasitos é complexa e trabalhosa e requer o uso

em conjunto de várias técnicas de diagnóstico. Assim, a disponibilidade de testes de detecção

rápida viabiliza o diagnóstico precoce, minimizando o potencial para disseminação da

infecção, tornando relevante a discussão das indicações de cada teste a partir de sua

sensibilidade e especificidade. Além disso, a identificação do agente etiológico contribui com

o monitoramento da interação homem-animal auxiliando na detecção oportuna de zoonoses

que podem ser graves para seres humanos.

Nos últimos anos, verifica-se que a incidência das erliquioses vem aumentando

gradativamente tanto nos animais como no homem, destacando-se a importância do

diagnóstico etiológico para o monitoramento epidemiológico das hemoparasitoses, porém a

maioria dos testes usados rotineiramente apresenta limitações. As recentes introduções de

técnicas diagnósticas que empregam biologia molecular permitem caracterizar quais espécies

de erlíquias estão infectando o paciente. Avanços na área de biologia molecular têm

proporcionado métodos altamente específicos e sensíveis para identificação direta do agente

etiológico da EMC e TCIC, e as técnicas moleculares, como a PCR, surgem como

metodologias alternativas que sobrepõem às limitações dos métodos rotineiros de diagnóstico,

identificação e diferenciação de microrganismos, possibilitando um diagnóstico preciso e

seguro.

Vários protocolos de PCR têm sido desenvolvidos para o diagnóstico da infecção

por A. platys e E. canis em cães, sendo capazes de indicar uma infecção ativa e identificar a

espécie infectante, constituindo importantes ferramentas de diagnóstico da doença.

Diferentemente dos métodos imunológicos, nos quais se identifica a doença por meio dos

anticorpos dirigidos aos microrganismos, os métodos moleculares evidenciam a molécula do

DNA na amostra do paciente.

Mesmo decorridos mais de vinte anos desde os primeiros relatos do emprego da PCR para o

diagnóstico molecular terem sido publicados, tais testes ainda não foram disponibilizados

comercialmente e não são usados além do ambiente de pesquisa. Além do custo, pode ser

citada a necessidade de sua execução em laboratórios com elevada tecnologia

58

e com espaço exclusivo para a sua realização, como os principais fatores

limitantes no que diz respeito ao emprego do teste de PCR e suas técnicas derivadas em

situação ambulatorial ou hospitalar. Porém, a rapidez diagnóstica da técnica proporciona

economia em relação aos gastos com medicações desnecessárias e redução da disseminação

da enfermidade com a descoberta precoce da doença.

Outras técnicas resultantes de modificações da PCR têm sido desenvolvidas com

o objetivo de aumentar a sensibilidade desta metodologia, como por exemplo, a PCR em

tempo real (qPCR), a qual vem ganhando espaço nos diagnósticos clínicos e nos laboratórios

de pesquisa por apresentar a capacidade de gerar resultados quantitativos. As vantagens da

qPCR em relação à PCR convencional são inúmeras e incluem: velocidade, reprodutibilidade

e capacidade de quantificação. A qPCR é uma técnica inovadora, capaz de promover a

quantificação acurada e o monitoramento em tempo real do produto amplificado. Outra

vantagem da qPCR é a eliminação da etapa laboriosa pós-amplificação (preparo do gel para

eletroforese), convencionalmente necessária para visualização do produto amplificado.

Existem poucas publicações utilizando protocolos de qPCR para detecção de E.

canis e A. platys. Assim, os novos protocolos de qPCR desenvolvidos neste estudo para

detecção de A. platys e E. canis que apresentaram alta sensibilidade e especificidade analítica,

surgem como uma ótima alternativa para a detecção rápida desses hemoparasitos.

Diagnósticos baseados no DNA estão em crescimento no estudo de patógenos, e

as características de especificidade e sensibilidade da qPCR abrirão novas oportunidades para

pesquisa sobre interações patógeno-hospedeiro e diagnósticos pré-sintomáticos. A

combinação de uma excelente sensibilidade e especificidade, baixo risco de contaminação,

facilidade de desempenho e velocidade de reação, fez da qPCR uma ótima alternativa para

diagnóstico das hemoparasitoses. Por suas vantagens, a qPCR tende a substituir a PCR

convencional como método molecular de diagnóstico.

Atualmente a utilização das tecnologias de amplificações por qPCR ainda

permanecem com uso limitado devido aos elevados custos relacionados aos sistemas de

detecção empregados e, principalmente, às despesas iniciais de aquisição dos equipamentos.

Entretanto, tal viés possui a tendência de resolução em curto prazo com a ampliação e

divulgação da importância das aplicações multidisciplinares do uso rotineiro da qPCR.

A avaliação das manifestações clínicas é importante e necessária para avaliar o

prognóstico das hemoparasitoses, e o exame ocular de animais com doenças sistêmicas

também pode auxiliar no diagnóstico da EMC e TCIC em cães, entretanto, a confirmação de

E. canis e A. platys requer o uso de testes de diagnóstico específicos.

59

Alterações oculares podem estar presentes em todas as fases da EMC e uma alta

correlação entre a presença de uveíte e descolamento de retina e resultados PCR positivos

para E. canis foram observadas neste estudo, o que permite sugerir que estas alterações

oculares sejam decorrentes da infecção por E. canis. Casos de uveíte já foram relacionados

com a infecção por A. platys em estudos anteriores. Porém, devido ao baixo número de cães

com manifestações oculares infectados por A. platys neste estudo não foi possível verificar a

relação das manifestações oculares com esta riquétsia.

É inegável a contribuição dos ensaios de qPCR para o diagnóstico precoce da

EMC e TCIC, bem como para o desenvolvimento de estudos epidemiológicos na

identificação de agentes infecciosos potencialmente letais e de difícil cultivo. A necessidade

de desenvolvimento de métodos de diagnóstico altamente sensível é cada vez maior, em

decorrência da importância da agilidade no diagnóstico.

O desenvolvimento da presente pesquisa promoveu a ampliação da adoção de

técnicas moleculares para fins de pesquisa e extensão no âmbito da Escola de Veterinária e

Zootecnia da UFG, o que também possibilitará a transferência de tecnologia a outros alunos,

laboratórios de diagnóstico e parceiros de outras instituições, estreitando a relação com

pesquisadores externos.

Os dois novos ensaios de qPCR desenvolvidos e validados neste estudo,

preencheram as expectativas iniciais do trabalho, e contribuirão como ferramenta de

diagnóstico para a detecção específica de A. platys e E. canis de forma rápida, atendendo as

necessidades clínicas e minimizando o uso indiscriminado de antibióticos. Já as limitações do

uso da qPCR devido ao seu alto custo com a aquisição dos equipamentos podem ser

compensadas com a ampliação das aplicações multidisciplinares do uso rotineiro da qPCR.

Assim, as ferramentas moleculares devem ser consideradas como complementares

à microscopia direta e sorologia, pois sua fundamental importância se dá pela rapidez,

praticidade na execução e capacidade em detectar e identificar precisamente as espécies de

hemoparasitos, especialmente em condições de baixa parasitemia ou em situações onde a

morfologia não é conclusiva.

60

ANEXO A

anaplasma platys e ehrlichia canis em cães: avaliação de alterações oculares ... ·...

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