anÁlise imunoistoquÍmica da distribuiÇÃo de … · direta e/ou indiretamente estiveram...
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André Luiz Bezerra de Pontes
ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA DA DISTRIBUIÇÃO DE
SEROTONINA, TRANSPORTADOR DE SEROTONINA E
RECEPTORES DE SEROTONINA NO HIPOTÁLAMO DO SAGUI
(Callithrix jacchus)
Dissertação apresentada a Universidade
Federal do Rio Grande do Norte para
obtenção de título de Mestre em Psicobiologia.
NATAL-RN
2011
André Luiz Bezerra de Pontes
ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA DA DISTRIBUIÇÃO DE
SEROTONINA, TRANSPORTADOR DE SEROTONINA E
RECEPTORES DE SEROTONINA NO HIPOTÁLAMO DO SAGUI
(Callithrix jacchus)
Dissertação apresentada a Universidade
Federal do Rio Grande do Norte para
obtenção de título de Mestre em Psicobiologia.
Orientador: Prof. Dr. Jeferson de Souza
Cavalcante
NATAL-RN
2011
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências
Pontes, André Luiz Bezerra de. Análise imunoistoquimica distribuição de serotonina, transportador de serotonina e receptores de serotonina no hipotálamo do sagüi (Callithrix jacchus) / André Luiz Bezerra de Pontes. – Natal, RN, 2011. 123 f. : Il.
Orientador: Prof. Dr. Jeferson de Souza Cavalcante. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia.
1. Callithrix jacchus – Dissertação 2. Serotonina – Dissertação. 3. Hipotálamo – Dissertação. I. Cavalcante, Jeferson de Souza.. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 599.821
T�TULO: Análise imunoistoquímica da distribuição de serotonina, transportador de serotonina e receptores de serotonina no hipotálamo do sagui (Callithrix jacchus).
AUTOR: André Luiz Bezerra de Pontes
DATA DA DEFESA: 11 de abril de 2011
BANCA EXAMINADORA:
________________________________________________________________
Prof. Dr. Luiz Fernando Takase
Universidade Federal de S�o Carlos
________________________________________________________________
Prof. Dr. Expedito Silva do Nascimento Junior
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
________________________________________________________________
Prof. Dr. Jeferson de Souza Cavalcante – Orientador
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Dedico este trabalho a um amigo, um amigo sem o qual este trabalho não seria possível. Um amigo que depositou em mim sua confiança. Confesso que cheguei a julgar que não seria capaz de retribuir essa confiança. Se este trabalho está concluído hoje, é por sua causa, Jeferson Cavalcante. Esse trabalho é seu, pois você fez a parte mais difícil, a de me fazer acreditar que eu podia. Muito obrigado, pela confiança, pela ajuda e, sobretudo, pela amizade.
AGRADECIMENTOS
Ninguém chega ao fim de uma jornada sozinho, sem amparo ou sem ajuda.
Sinto-me afortunado por ter uma longa lista de pessoas a quem agradecer por me
acompanhar nesse período, e só isso já é motivo de sobra pra eu agradecer.
Agradeço imensamente à minha família, pelo incentivo, apoio e compreensão.
Aos meus pais, Lúcia e Antonio, por acreditar em mim e me apoiar sempre; aos meus
avós, Eulália e Solino, pelo exemplo que são para mim; a minha bisavó, Maria (in
memoriam), pela garra e pela força que sempre me mostrou e queria que eu também
tivesse; meus irmãos pela torcida, e pelo apoio, sobretudo, num momento crucial desta
jornada; aos meus tios, Ivo e Alice, pelos incentivos que sempre me deram.
Agradeço à equipe do Laboratório de Neuranatomia, pelos momentos de
crescimento mútuo, pelas trocas de idéias. Aos professores Judney e Expedito pelas
dúvidas esclarecidas, pelas dicas e pela disponibilidade. Gilberto e Fausto, convivência
sempre agradável e iguais fontes de idéias; Regina, pela manutenção do nosso ambiente
de trabalho e convivência, e pela alegria que sempre traz pro ambiente; Kátia e
Rayane, sempre quietas e caladas, mas lutadoras pelos seus objetivos, e, por isso,
exemplos; Ruthnaldo e Leandro, duas figuras ilustres do nosso laboratório,
trabalhadores, mas nem por isso menos animados; aos alunos de iniciação cientifica que
direta e/ou indiretamente estiveram relacionados a esse trabalho: Raysa, Nayra, Kayo,
Vinicius e Péricles; Twyla, além da ajuda no trabalho, agradeço a torcida extra no X
LASC e no Congresso da SBNeC (risos), espero não a ter desapontado! Alane, Paulo,
Melquisedec, Adriana, Ana Carla, Renata, Francimar, Marcia, Franco, pessoal que
chegou recentemente, ou que já deixou a equipe, mas que mesmo assim fazem parte
desse trabalho, porque é em equipe que nós trabalhamos nesse laboratório.
Do ambiente de trabalho no laboratório eles passaram a fazer parte do meu
convívio fora do laboratório também: Rovena e Janaina, que me adotaram como irmão
(ou teria sido o oposto?), e com quem divido mais do que momentos de trabalho no
laboratório, agradeço a torcida e a disponibilidade de sempre querer me ajudar, e peço
desculpas se eu não sou sempre tão solícito e aberto a receber a ajuda. Ao gaiato Joacil,
que apesar de gaiato, � um cara gente boa, e mesmo com a anima��o exacerbada dele �
extremamente capaz, e prestativo (valeu, J�����!). Rodolfo, o enrugado, ainda bem que
tem voc� pra contrabalancear a gaiatice do J�, e pra me tirar d�vidas, ou pra me fazer
aprender mais quando me faz alguma pergunta (valeu, ZeroBoy!).
Agrade�o a professora Miriam, a quem eu me descobri com a imensa
liberdade de trat�-la simplesmente por “Miriam”. Acho que isso se deve � maneira
como a vejo tratando as pessoas, e comigo n�o foi diferente, sempre dispon�vel (at�
mesmo quando ocupada), prestativa, sorridente e dona de uma humildade que
surpreende. Agrade�o por ter sido t�o prestativa desde a minha inicia��o cientifica, e
pelas in�meras dicas que recebi pra esse trabalho. Certa vez me pediu desculpas por
estar “se metendo” no assunto; n�o havia necessidade, eu era quem devia pedir
desculpas por incomodar tantas vezes, e agradecer pelas sugest�es e corre��es.
Aos amigos: Breno, pela gentileza peculiar, apoio e ajuda fundamentais! Ao
“Team Deco”: Flavio (Dec�o), o irm�o Cortez; Carlos André (Dequinho), o afilhado;
Clayton (Dekote), o irm�o “Apar�cio”. Amigos de longa data! Ana Paula (Paulinha),
pela do�ura e delicadeza. Wallace, amigo que me ensinou a rir das “desventuras” da
vida acad�mica. Ronaldo, acredite que seus conselhos foram dos melhores que eu
recebi nestes dois �ltimos anos, muito obrigado. Pablo (meu filho), s� saiba que eu
agrade�o muito.
Aos amigos distantes, mas que sempre estiveram na torcida: Felipe Beijamini,
Lucas Alves, André Reynaldo, Rodolfo Lira, Renata Pereira, e os nem t�o distantes
assim, Adriano e Cristiano.
Suzanny Lays, Lucas Filgueira, Luana Santana, Pedro Saler, Lidiane,
Marília, Kellyn, Augusto, Cintía, Álister e Wivison, que se tornaram especiais pra
mim, pela amizade, cumplicidade, torcida e conselhos.
Aos alunos do programa de p�s gradua��o em psicobiologia, especialmente:
Patricia, Rafaella, Jordana, Aline, Fabiano, Álvaro e Ricardo. A todos os
professores e funcion�rios do programa de p�s gradua��o em psicobiologia, e N�cleo de
Primatologia, a quem agrade�o nominalmente a Prof. Fivia e a secret�ria Ana Cláudia.
E aos professores e funcionários do Departamento de Morfologia do Centro de
Biociências, a quem agradeço nominalmente ao Prof. Celcimar e Edilson.
Ao professor Claudio Toledo, da UNICID, pela partilha dos anticorpos
utilizados.
A CAPES e CNPq pelo auxílio financeiro indispensável.
“N�o h� receitas m�gicas que nos fa�am vencer os
obst�culos.Mas ouso dizer que h� um jeito interessante de olhar
para as quedas que sofremos.
� s� n�o permitir que elas sejam definitivas.”
Fábio de Melo
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
TABELA 1: Famílias e subtipos de receptores 5-HT.
TABELA 2: Lista de anticorpos e soros normais.
FIGURA 1: esquema de localização de neurônios serotonérgicos.
FIGURA 2: Categorias de neurotransmissores.
FIGURA 3: Fotomicrografias de secções do hipotálamo do sagui corados pela técnica de
Nissl.
FIGURA 4: Fotomicrografias de secções do hipotálamo submetidas à imunoistoquímica
para revelar a presença de NeuN.
FIGURA 5: Fotomicrografias de secções do hipotálamo submetidas à imunoistoquímica
para revelar a presença de serotonina.
FIGURA 6: Fotomicrografias de secções do hipotálamo submetidas à imunoistoquímica
para revelar a presença de transportador de serotonina.
FIGURA 7: Fotomicrografias de secções do hipotálamo submetidas à imunoistoquímica
para revelar a presença do receptor 5-HT1A, e desenhos esquemáticos ilustrando a
distribuição deste receptor.
FIGURA 8: Fotomicrografias de secções do hipotálamo submetidas à imunoistoquímica
para revelar a presença do receptor 5-HT1B, e desenhos esquemáticos ilustrando a
distribuição deste receptor.
LISTA DE ABREVIATURAS
3V Terceiro Ventrículo
5-HT Serotonina
5-HTT Transportador de Serotonina
AHA Área Hipotalâmica Anterior
AHD Área Hipotalâmica Dorsal
AHL Área Hipotalâmica Lateral
APO Área Pré Óptica
APOl Área Pré Óptica Lateral
APOm Área Pré Óptica Medial
ARQ Núcleo Arqueado
ca Comissura Anterior
ET Estria Terminal
fx Fórnix
-IR Imunorreativo (a)
NDH Nucleo Dorsal Hipotalâmico
NDM Núcleo Dorsomedial
NDR Núcleo Dorsal da Rafe
NLC Núcleo Linear Caudal
NMaR Núcleo Magno da Rafe
NMI Núcleo mamilar Intermédio
NML Núcleo Mamilar Lateral
NMM Núcleo Mamilar Medial
NMnR Núcleo Mediano da Rafe
NObR Núcleo Obscuro da Rafe
NPaR Núcleo Pálido da Rafe
NPOm Núcleo Pré Óptico Medial
NPOpv Núcleo Pré Óptico Periventricular
NPoR Núcleo Pontino da Rafe
NPV Núcleo Paraventricular
NSO Núcleo Supra Óptico
NSQ Núcleo Supraquiasmático
NTL Núcleo Tuberal Lateral
NTM Núcleo Tuberal Medial
NVM Núcleo Ventromedial
PMD Núcleo Pré Mamilar Dorsal
PML Núcleo Pré Mamilar Lateral
PMM Núcleo Pré Mamilar Medial
qo Quiasma Óptico
to Tracto Óptico
11
SUM�RIO
Pg.
RESUMO 13
ABSTRACT 14
1. 1. INTRODU��O 15
1.1 – O Hipot�lamo 15
1.2 – A Rafe e a Serotonina 21
1.3 – Os Receptores de 5-HT 25
1.3.1 – Fam�lia 5-HT1 27
1.3.1.1 – 5-HT1A 27
1.3.1.2 – 5-HT1B 28
1.3.1.3 – 5-HT1D 29
1.3.1.4 – 5-HT1E 29
1.3.1.5 – 5-HT1F 30
1.3.2 – Fam�lia 5-HT2 30
1.3.2.1 – 5-HT2A 31
1.3.2.2 – 5-HT2B 31
1.3.2.3 – 5-HT2C 32
1.3.3 – Fam�lia 5-HT3 32
1.3.4 – Fam�lia 5-HT4 32
1.3.5 – Fam�lia 5-HT5 33
1.3.6 – Fam�lia 5-HT6 33
1.3.7 – Fam�lia 5-HT7 34
2. JUSTIFICATIVA 35
3. OBJETIVOS 36
4. METODOLOGIA 37
4.1 Procedimentos Experimentais 38
5. RESULTADOS 43
5.1 – Colora��o Citoarquitet�nica de Nissl 43
5.2 – Imunorreatividade a NeuN 44
12
5.3 – Imunorreatividade a 5-HT 44
5.4 – Imunorreatividade a 5-HTT 45
5.5 – Imunorreatividade a 5-HT1A 46
5.6 – Imunorreatividade a 5-HT1B 47
5.7 – Imunorreatividade a 5-HT2A, 5-HT2B, 5-HT2C, 5-HT3 e 5-HT7 48
6. DISCUSS�O 72
6.1 – Citoarquitetura Hipotal�mica 72
6.2 – 5-HT 73
6.3 – 5-HTT 74
6.4 – 5-HT1A 75
6.5 – 5-HT1B 76
6.6 - 5-HT2A, 5-HT2B, 5-HT2C, 5-HT3 e 5-HT7 77
7. CONCLUS�O 78
REFERENCIAS
ANEXOS
13
RESUMO
O hipotálamo é uma porção diencefálica localizada ao redor do terceiro ventrículo, abaixo
do sulco hipotalâmico, ventralmente vemos seu limite anterior feito pelo quiasma óptico e
posterior pelos corpos mamilares. Atuando como centro que integra funções homeostáticas
e comportamentais. A serotonina é um neurotransmissor produzido em sítios restritos ao
mesencéfalo e tronco encefálico, mas que é distribuído por todo o sistema nervoso central
e tem inúmeras funções, atuando através de receptores específicos que também estão
distribuídos por todo o sistema nervoso. Utilizando técnicas imunoistoquímicas o objetivo
desse trabalho foi delimitar os núcleos hipotalâmicos do sagui (Callithrix jacchus), bem
como estudar a distribuição de serotonina, transportador e receptores de serotonina no
hipotálamo dessa espécie. Utilizamos o método de nissl para determinar a citoarquitetura
dos núcleos hipotalâmicos, e a imunoistoquímica para revelar a presença de NeuN como
método auxiliar para determinar os contornos dos núcleos hipotalâmicos. Como resultados,
encontramos fibras e terminais contendo serotonina por toda a extensão rostro-caudal do
hipotálamo, sendo mais concentrados em alguns núcleos, e até mesmo ausente em alguns;
assim como a serotonina, o transportador de serotonina foi observado entre a área pré
óptica e a região tuberal do hipotálamo, com densidades e distribuição semelhantes às da
serotonina. Os receptores 5-HT1A e 5-HT1B foram encontrados com diferenças mínimas,
entre si, quanto a disposição e intensidade de marcação.
Palavras chave: serotonina, hipotálamo, Callithrix jacchus.
14
ABSTRACT:
The hypothalamus is a diencephalic portion located around the third ventricle below the
hypothalamic sulcus, limited by the optic chiasm, and by the mammillary bodies, acting as
a center that integrates behavioral and homeostatic functions. Serotonin is a
neurotransmitter produced in limited sites in the midbrain and brain stem, but is distributed
throughout the central nervous system and has many functions, acting through specific
receptors that are also distributed throughout the nervous system. Using
immunohistochemical techniques, the aim of this study was to delineate the hypothalamic
nuclei of the marmoset (Callithrix jacchus) and study the distribution of serotonin
transporter and serotonin receptors in the hypothalamus of this species. We used the Nissl
method to determine the cytoarchitecture of the hypothalamic nuclei, and
immunohistochemistry to reveal the presence of NeuN as a method to determine the
contours of the hypothalamic nuclei. As a result, we found serotonin containing fibers and
terminals throughout the rostrocaudal extent of the hypothalamus, more concentrated in
some nuclei, and even absent in some. Like serotonin, serotonin transporter was observed
between pre-optic area and tuberal region of the hypothalamus, in densities and
distribution similar to serotonin. The 5-HT1A and 5-HT1B receptors were found with minor
differences among itselves regarding the disposition and intensity of staining.
Keywords: serotonin, hypothalamus, Callithrix jacchus.
15
1. INTRODU��O
1.1 – O Hipot�lamo
Manipulações experimentais no hipotálamo resultam em alterações na expressão
de comportamentos de alimentação, sexual, defesa, ritmos biológicos e na atividade
endócrina. Essas observações levaram à conclusão de que o hipotálamo participa do
controle de inúmeras funções que garantem a sobrevivência de indivíduos atuando como
centro que integra informações endócrinas, autonômicas e respostas comportamentais que
permitem a manutenção da homeostase e reprodução (Swanson, 1987). Ramón Y Cajal
propôs que os núcleos hipotalâmicos compõem circuitos neurais que atuam na integração
de respostas somatomotoras e visceromotoras importantes para a manutenção da
homeostase (1894). Em 1954 Stellar propôs que cada um dos núcleos hipotalâmicos seria
responsável por um comportamento como a ingestão hídrica, a ingestão alimentar, por
exemplo. Já a teoria proposta por Morgane, em 1979, diz que as alterações
comportamentais observadas após manipulações no hipotálamo são decorrentes da
alteração nas fibras ascendentes ou descendentes que passam pelo hipotálamo. Hoje sabe-
se que todas essas teorias são verdadeiras e nenhuma das teorias exclui as demais. O
hipotálamo é uma porção diencefálica localizada abaixo do sulco hipotalâmico ao redor
do terceiro ventrículo. Uma projeção localizada posterior ao quiasma óptico, o
infundíbulo, faz a conexão entre o hipotálamo e a glândula hipófise. Os corpos mamilares
são duas protuberâncias arredondadas encontradas no limite ventroposterior do
hipotálamo. Os limites laterais são compostos pelos tractos ópticos. Em posição dorso-
caudal ao hipotálamo está o tálamo, e em posição latero-caudal encontra-se a região
subtalâmica (Swanson, 1987). A organização dos grupamentos neuronais e tractos
hipotalâmicos, e dos tractos que cruzam essa região é extremamente complexa. Tendo
16
isso em vista, faz-se clara a importância de estudos hodológicos e histológicos para a
compreensão do funcionamento do hipotálamo.
Anatomicamente podemos dividir o hipotálamo em regiões no sentido rostro-
caudal: Região pré-óptica, região supra-óptica, região tuberal e região mamilar; ou em
áreas no sentido médio-lateral: área hipotalâmica periventricular; área hipotalâmica
medial e área hipotalâmica lateral. A área hipotalâmica lateral localiza-se lateralmente
ao tracto mamilo-talâmico e ao fórnix e é limitada lateralmente pela cápsula interna,
anteriormente pelo núcleo pré-óptico lateral e posteriormente pelo tegmento
mesencefálico. Nessa área identificamos o núcleo hipotalâmico lateral. O tracto mamilo-
talâmico e o fórnix fazem o limite lateral da área hipotalâmica medial que localiza-se
caudal à região pré-óptica e circunda o terceiro ventrículo e se estende desde a região
supra-óptica até a região mamilar. A área periventricular, localizada medialmente em
relação à área hipotalâmica medial, encontra-se aderida à parede do terceiro ventrículo
(Carpenter, 1991). Imediatamente anterior ao quiasma óptico está a região pré-óptica, a
porção mais anterior do hipotálamo. Nessa região, ao redor do terceiro ventrículo
encontra-se o núcleo pré-óptico periventricular, e o núcleo pré-óptico medial localizado
lateralmente ao núcleo pré-óptico periventricular, estendendo-se ventralmente até o
quiasma óptico. O núcleo mais posterior dessa região faz limite com área hipotalâmica
anterior e é chamado núcleo pré-óptico lateral. (Carpenter, 1991; Swanson, 1987)
A região supra-óptica está localizada acima do quiasma óptico e nela encontram-
se os seguintes núcleos: núcleo paraventricular justaposto ao terceiro ventrículo, tendo
sua porção mais dorsal se estendendo lateralmente até o fórnix; o núcleo
supraquiasmático localizado sobre o quiasma óptico, lateral ao terceiro ventrículo; o
núcleo supra-óptico sobre a porção mais lateral do quiasma óptico, e continua
lateralmente sobre o tracto óptico dividindo-se em duas porções, uma lateral e uma
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medial no nível mais caudal do tracto óptico; e o núcleo hipotalâmico anterior,
posicionado posteriormente à área pré-óptica (Carpenter, 1991; Swanson, 1987).
A região tuberal é dividida pelo fórnix em: área hipotalâmica lateral e área
hipotalâmica medial. A porção medial está ao redor do terceiro ventrículo e podemos
encontrar nela o núcleo arqueado, localizado abaixo da extremidade ventral do terceiro
ventrículo próximo ao recesso infundibular; o núcleo ventromedial um núcleo de forma
oval dorsal ao núcleo arqueado e lateral ao terceiro ventrículo; e o núcleo dorsomedial,
que assim como os outros núcleos da área hipotalâmica medial está justaposto ao terceiro
ventrículo, dorsal ao núcleo ventromedial (Carpenter, 1991; Swanson, 1987).
A região mamilar é a porção mais posterior do hipotálamo e abriga os núcleos
mamilares e o núcleo posterior do hipotálamo. Os núcleos mamilares fazem
protuberância arredondada na face ventral do hipotálamo e podem ser divididos em três
sub-núcleos: o núcleo mamilar medial abaixo do núcleo hipotalâmico posterior; núcleo
mamilar intermédio lateral ao núcleo mamilar medial; e o núcleo mamilar lateral
margeando lateralmente o núcleo mamilar intermédio. O núcleo hipotalâmico posterior
localiza-se sobre corpo mamilar e é um contínuo da porção posterior do núcleo
ventromedial (Carpenter, 1991; Swanson, 1987).
As principais fibras que chegam ao hipotálamo são o fascículo prosencefálico
medial, o tracto hipocampo-hipotalâmico, o tracto amigdalo-hipotalâmico, fibras do
tronco encefálico, o tracto retino-hipotalâmico, fibras córtico-hipotalâmicas e aferências
do prosencéfalo (Swanson, 1987). O feixe prosencefálico medial conduz informações de
regiões olfativas, área septal e subiculum. Esse feixe cruza o hipotálamo passando pelas
áreas pré-óptica e lateral. O tracto hipocampo-hipotalâmico se origina em células da área
CA1 do hipocampo e subiculum, formando o fórnix, o feixe mielinizado mais
proeminente no hipotálamo. O fórnix se divide em dois feixes de fibras, um feixe pré-
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comissural e um pós-comissural. As fibras pré comissurais se espalham pelos núcleos
septais, área pré-óptica e área hipotalâmica dorsal. As fibras pós comissurais se projetam
para o núcleo mamilar medial. As fibras do tracto amigdalo-hipotalâmico seguem duas
vias diferentes: uma composta pela estria terminal, e, uma mais direta, composta pela via
amigdalofugal. A estria terminal tem como alvos a área pré-óptica medial, a área anterior
e os núcleos ventromedial e arqueado; já a via amigdalofugal tem como alvos a área
hipotalâmica lateral. As aferências do tronco encefálico tem origem nos núcleos
mesencefálicos da rafe, locus coeruleus e núcleo parabraquial. As fibras serotonérgicas
que chegam ao hipotálamo ascendem principalmente dos núcleos mediano e dorsal da
rafe, passando pela área hipotalâmica lateral e atingindo seus principais alvos: área pré-
óptica, área hipotalâmica lateral, núcleo paraventricular e núcleo supraquiasmático. As
projeções noradrenérgicas do locus coeruleus ascendem até os núcleos dorsomedial,
paraventricular e supra-óptico. O tracto retino-hipotalâmico origina-se nas células
ganglionares da retina e se projeta para o núcleo supraquiasmático (Moore, 1972; Costa
et al., 1999; Cavalcante et al., 2006). As fibras córtico-hipotalâmicas originam-se
principalmente nos córtices frontal, parietal e occipital, e chegam até a área lateral e
núcleo mamilar lateral (Swanson, 1987).
O hipotálamo emite projeções para diversas áreas do sistema nervoso. Dos
núcleos paraventricular, dorsomedial, ventromedial e posterior emerge o tracto
hipotalamoespinal que termina sobre neurônios do tronco encefálico e da medula espinal.
Essa via de comunicação é pouco mielinizada e de pequeno diâmetro. O fascículo
mamilar, um feixe mielinizado se origina nos núcleos mamilares e se projeta para a
porção dorsal do tálamo. Também se origina nos núcleos mamilares o tracto
mamilointerpeduncular, que se projeta até o núcleo interpeduncular no mesencéfalo. Já o
tracto mamilotegmentar emerge dos núcleos mamilares e se projeta para os núcleos da
19
formação reticular mesencefálica, passando dorsalmente ao tracto mamilopeduncular. O
feixe periventricular se origina nos núcleos da zona periventricular, fazendo a conexão
entre esses núcleos, e se projeta para o córtex frontal e para o tronco encefálico, passando
pela substância cinzenta periaquedutal. Na região tuberal o núcleo arqueado emite
projeções através do tracto tuberoinfundibular para o pedículo infudibular (Parent, 1996;
Swanson, 1987).
O hipotálamo é caracteristicamente conhecido como o centro integrativo de
sistemas neurais responsáveis pela manutenção de funções homeostáticas como o
equilíbrio eletrolítico, controle de ingestão alimentar, consumo hídrico, metabolismo
energético, reprodução, regulação térmica e controle de estados emocionais, regulação do
ciclo sono vigília e controle de secreção hormonal pela glândula hipófise. O hipotálamo
atua também como centro integrador entre as vias simpáticas e parassimpáticas (Parent,
1996; Swanson, 1987).
As regiões lateral e medial do hipotálamo mediam respostas simpáticas tais como
o estresse emocional, reações de luta ou fuga; em contrapartida lesões no hipotálamo
posterior levam à letargia, sonolência, queda da temperatura e redução da taxa metabólica
(Parent, 1996). O hipotálamo anterior está relacionado ao controle da temperatura
corporal, sendo esta região sensível ao aumento de temperatura do sangue. Esta região
hipotalâmica atua na vasodilatação de veias e artérias, controlando assim a dissipação do
calor. A região hipotalâmica sensível à redução da temperatura sanguínea é o hipotálamo
posterior, e atua através da vasoconstricção de veias e artérias, fazendo o organismo reter
calor (Parent, 1996). O balanço hídrico é regulado pelos núcleos supra-óptico e
paraventricular. Lesões nesses núcleos levam à gênese da diabetes insípido, condição na
qual aumenta a excreção de urina com baixa concentração de glicose; uma vez que as
células dos núcleos supra-óptico e paraventricular são produtoras de vasopressina. Em
20
condições normais a produção de vasopressina responde à variação da pressão osmótica
do sangue. A ingestão hídrica, no entanto, é regulada também pelo hipotálamo anterior
(Carpenter, 1991; Swanson, 1987). O comportamento alimentar apresenta diversos
componentes de controle. O núcleo paraventricular do hipotálamo é uma dessas peças.
Lesões nesse núcleo levam animais experimentais a se tornar hiperfágicos. Lesões na área
hipotalâmica lateral resultam em hipofagia (Swanson, 1987)
A diversidade de funções desempenhadas pelo hipotálamo gera o interesse em
estudar a distribuição de neurotransmissores nessa região, incluindo a serotonina, um
neurotransmissor de inúmeras funções já relatadas, entre as quais muitas são relacionadas
às funções hipotalâmicas. Estudos histológicos mostram inervação serotonérgica no
hipotálamo de espécies como o rato (Beaudet e Descarries, 1979; Descarries e Beaudet,
1978; Frankfurt et al., 1981; Frankfurt e Azmitia, 1983; Frankfurt e Azmitia, 1984;
Steinbusch e Nieuwenhuys, 1981), o gato (Ueda et al., 1983), e primatas não humanos e
humanos (Kawata et al., 1984; Kuikka et al., 1995). O hipotálamo recebe projeções dos
núcleos do grupamento rostral da rafe, principalmente do núcleo dorsal da rafe e núcleo
mediano da rafe. Essas projeções são mais densas no núcleo supraquiasmático, área pré-
óptica medial e núcleos pré-mamilares. Áreas como a região perifornical e estruturas
periventriculares também são densamente inervadas por neurônios serotonérgicos de
núcleos mesencefálicos da rafe. Neurônios histaminérgicos no hipotálamo também
recebem projeções serotonérgicas da rafe (Ericson et al., 1989; Vertes, 1991; Vertes e
Martin, 1988; Törk, 1985).
1.2 – A Rafe e a Serotonina (5-HT)
Estendendo-se rostrocaudalmente entre o nível do núcleo interpeduncular no
mesencéfalo e a decussação das pirâmides no bulbo, encontramos um conjunto de
21
grupamentos neuronais ocupando a linha média do tronco encefálico: o complexo da rafe.
Grande proporção dos neurônios do sistema da rafe é produtora de serotonina que pode
estar co-localizada com outros neurotransmissores produzidos nestes grupamentos. Este
complexo neuronal apresenta uma extensa rede de eferências, por isso podemos encontrar
terminais serotonérgicos em quase todo o sistema nervoso, muito embora essa
distribuição varie em proporção para cada área (Figura 01) (Törk, 1985).
Os núcleos deste complexo podem ser agrupados em duas divisões. Um
grupamento rostral, ou anterior, que inclui os núcleos: Núcleo Linear Caudal (NLC),
Núcleo Dorsal da Rafe (NDR) e o Núcleo Mediano da Rafe (NMnR). E o grupamento
caudal, ou posterior, inclui os núcleos: Núcleo Pontino da Rafe (NPoR), Núcleo Magno
da Rafe (NMaR), Núcleo Obscuro da Rafe (NObR) e o Núcleo Pálido da Rafe (NPaR)
(Jacobs e Azmitia, 1992).
Figura 1: Esquema de localização dos grupos de neurônios serotonérgicos, no tronco encefálico, e suas eferencias para o sistema nervoso central.
22
O complexo da rafe emite uma extensa rede de projeções para diversas áreas do
sistema nervoso central. Os núcleos de maior densidade serotonérgica e com a maior
quantidade de projeções identificadas são o NDR e NMnR. Do NDR destacam-se, por
sua magnitude, as projeções para o colículo superior e corpo geniculado lateral. A
projeção para o corpo geniculado lateral é originada na porção lateral do NDR (Pasquier
e Villar, 1982; Woolf e Butcher, 1985; Shibata et al., 1986; Villar et al., 1988; Vertes,
1991). Vertes (1991) demonstrou que o NDR se projeta para inúmeras estruturas do
telencéfalo, diencéfalo e mesencéfalo. O NDR também apresenta uma densa projeção
para o NMnR em hamsteres (Tischler e Morin, 2003). O NMnR, assim como o NDR, se
projeta para várias estruturas corticais e do diencéfalo (Vertes e Martin, 1988). Em 1999,
um estudo mais detalhado empregando traçadores mais sensíveis, mostra as projeções do
NMnR para: formação reticular pontina, tegmento pontino dorsolateral, NDR, núcleo
cuneiforme, núcleo interpeduncular, formação reticular mesencéfalica, NLC, núcleo
retrorrubral, substância negra, área tegmental ventral, núcleo supramamilar, corpo
mamilar, núcleo parafascicular do tálamo, zona incerta, NSQ, córtex perirrinal, corpo
cauloso, cíngulo e hipocampo (Vertes et al., 1999). No hipotálamo há uma densa projeção
sobre o NSQ, em hamsteres e ratos (Meyer-Bernstein e Morin, 1996; Pickard e Rea,
1997; Hay-Schmidt et al., 2003; Pontes et al., 2010).
A serotonina tem diversos efeitos no sistema nervoso central e nos sistemas
periféricos, agindo como hormônio ou neurotransmissor. Primeiramente foi denominada
enteramina, por ter sido isolada em células enterocromafins do trato gastrointestinal
(Ersparmer e Asero, 1952). Ersparmer observou que a enteramina era responsável pela
contração muscular. Na década de 40 Rapport e colaboradores reportaram a existência de
uma substância vasoconstritora contida nas plaquetas. Essa substância foi isolada e
caracterizada, e nomeada como serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) (Rapport et al.,
23
1948a-c). Seu nome é um acrônimo de Serum (pois é encontrada no soro) e vaso-tonic
(devido às suas propriedades vasotônicas). Com o desenvolvimento de técnicas de estudo
a 5-HT foi rapidamente identificada em diversos tecidos, tais como o cérebro, pulmões,
sangue, sistema endócrino, sistema sensorial, sistema cardiovascular e trato
gastrintestinal. A função da 5-HT como neurotransmissor foi proposta por Brodie e Shore
(1957) que se basearam em estudos que mostravam receptores de 5-HT em regiões
especificas do cérebro (Twarog e Page, 1953; Amin et al., 1954). O mapeamento de
núcleos neuronais que continham 5-HT foi feito por Dahlström e Fuxe (1964), esses
núcleos passaram então a ser conhecidos como sistema serotonérgico.
Uma vez produzida, a 5-HT é armazenada em vesículas sinápticas até ser liberada
por um mecanismo de exocitose cálcio-dependente. Nestas vesículas ela pode estar
associada a outros transmissores como a acetilcolina, noradrenalina, dopamina,
substância P, encefalina, Hormônio Liberador da Tireotropina e prostaglandinas (Halbach
e Dermietzel, 2006). Após ser liberada na fenda sináptica a 5-HT pode se ligar a
receptores pós- sinápticos ou autorreceptores localizados na membrana pré-sináptica
(Cerrito e Raiteri, 1979). Esse mecanismo de auto-recepção promove uma alça de
retroalimentação que impede a liberação excessiva deste neurotransmissor na fenda
sináptica. Na membrana pré-sináptica encontra-se o transportador de serotonina (5-HTT)
que é responsável por remover a 5-HT da fenda sináptica. As moléculas transportadas
pelo 5-HTT serão recicladas nas vesículas sinápticas do neurônio pré-sináptico, evitando
assim que sejam metabolizadas no citoplasma (Halbach e Dermietzel, 2006).
Enquanto neurotransmissor a 5-HT é classificada como amina biogênica, e integra
o grupo das monoaminas (Figura 02). Como qualquer neurotransmissor, esta amina
possui algumas características básicas: é produzida em neurônios e acumulada em
terminais sinápticos até que seja liberada após uma despolarização; exerce seu efeito nas
24
células pós-sinápticas, mediada por seus receptores específicos; e pode ser inativada ou
metabolizada através de mecanismos de recaptação. Aplicações experimentais de 5-HT
sintética produzem efeitos semelhantes àqueles induzidos pela 5-HT produzida no
sistema nervoso (Halbach e Dermietzel, 2006).
Os neurônios serotonérgicos projetam-se virtualmente para todas as áreas do
cérebro, e por isso a 5-HT tem uma variedade de funções no sistema nervoso central
muito ampla. Projeções dos núcleos rostrais do sistema serotonérgico ajudam a regular
temperatura, apetite, sono, comportamento sexual, ritmos biológicos circadianos (Gaspar
et al, 2003; Jouvet, 1999; Matsumoto et al 1981); enquanto as projeções dos núcleos mais
caudais participam da regulação da nocicepção e tônus motor (Jacobs e Fornal, 1999;
Rebsam et al 2002; Takase et al, 2004). Além disso a 5-HT participa de mecanismos de
desenvolvimento do sistema nervoso, incluindo divisão celular, migração neuronal,
diferenciação e sinaptogênese (Bonnin et al, 2007; Lebrand et al, 1996; Whitaker-
Azmitia, 2001; Persico et al, 2006). O mal funcionamento da transmissão serotonérgica
está relacionado à gênese de desordens neurológicas tais como a depressão, ansiedade e
FIGURA 2: CATEGORIAS DE NEUROTRANSMISSORES
25
agressividade (Handley et al, 1995; Olivier et al, 1995; Lucki, 2001; Blier e de Montigny,
1999; Gingrich e Hen, 2001 ).
A 5-HT tamb�m est� envolvida no controle do eixo hipot�lamo hipofis�rio,
participando da estimula��o da secre��o da prolactina e do horm�nio adeno
corticotr�pico, e do controle hipotal�mico de outros horm�nios como o horm�nio
luteinizante, tireotropina e horm�nio do crescimento (Antoni, 1986). O 5-HTP (precursor
da 5-HT) e a fenfluramina, um agonista seroton�rgico, estimulam a secre��o de ACTH
(Heninger et al, 1984; Siever et al, 1984; O’Keane e Dinan, 1991; Grossman e Costa,
1993). A ritanserina, um antagonista seroton�rgico, por sua vez atenua a resposta
estimulada pelo 5-HTP sobre a secre��o de ACTH (Lee et al 1991). C�lulas da hip�fise
anterior se mostraram imunorreativas � 5-HT (Piezzi e Wurtman, 1970). Essas c�lulas,
quando tratadas, in vitro, em solu��o contendo 5-HT aumentam a secre��o de ACTH,
mostrando um efeito dose-dependente para a express�o dessa resposta. Quando a
metergolina, um antagonista seroton�rgico, � empregada nessa cultura esse efeito �
atenuado (Spinedi e Negro-Vilar, 1983).
1.3 - Os Receptores de 5-HT
Para entender melhor a a��o da 5-HT � necess�rio conhecer os seus alvos. Os
primeiros receptores seroton�rgicos descritos foram os subtipos D e M (Gaddum e
Picarelli, 1957). Com o advento da auto-radiografia foi poss�vel estudar v�rias �reas do
enc�falo e descobrir outros receptores seroton�rgicos. T�cnicas imunoistoqu�micas
tamb�m permitem estudar a localiza��o destes receptores. Al�m disso tamb�m � poss�vel
empregar reconhecer genes que codificam os receptores de 5-HT. Hoje temos a descri��o
de v�rios receptores de 5-HT, entre eles, os mais freq�entemente relatados s�o: 5-HT1A,
5-HT1B, 5-HT1C, 5-HT1D, 5-HT1E, 5-HT1F, 5-HT2A, 5-HT3, 5-HT4, 5-HT5, 5-HT6 e 5-HT7.
26
A estrutura de cada receptor é formada por três constituintes: um transportador, um canal
iônico e a proteína G acoplada ao canal iônico. E a maior parte dos receptores 5-HT faz
parte da superfamília G, formada por aqueles receptores acoplados à proteína G (Vergé e
Callas, 2000; Halbach e Dermietzel, 2006).
Os receptores de cada família também podem apresentar funções diferentes
entre si. Por exemplo, 5-HT1B e 5-HT1D são auto-receptores, portanto inibem a liberação
adicional de neurotransmissor e a ativação de adenilciclase. Enquanto os receptores 5-
HT1C e 5-HT2 ativam fosfolipase C, e assim estimulam o funcionamento do mecanismo
de segundo mensageiro do fosfatidil-inusitol. Quando ativados, os receptores 5-HT4
ativam a adenilciclase na célula pós-sináptica, por outro lado, os receptores 5-HT1A
inibem essa enzima. Por se tratar de um canal iônico não acoplado à proteína G, o
receptor 5-HT3 tem tempo de ação mais rápido que os demais receptores 5-HT (Vergé e
Callas, 2000).
A ampla distribuição de terminais serotonérgicos sugere que a ação da 5-HT é
complexa, associado a esse fato temos a distribuição diferencial de receptores 5-HT, nos
permitindo concluir que a ação desempenhada por este neurotransmissor depende da
natureza do seu receptor pós-sináptico.
Receptores 5-HT
Receptores acoplados à proteína G
Família 5-HT1 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1D, 5-HT1E, 5-HT1F
Família 5-HT2 5-HT2A, 5-HT2B, 5-HT2C
Outros Receptores 5-HT4, 5-HT5, 5-HT6, 5-HT7
Canais Iônicos 5-HT3
TABELA 1: FAMÍLIAS E SUBTIPOS DE RECEPTORES DE 5-HT
27
1.3.1 – Fam�lia 5-HT1
Peroutka e Snyder fizeram a primeira descrição dos receptores 5-HT1 em 1979
utilizando técnicas radioligantes. Posteriormente Pedigo e colaboradores, em 1981,
demonstraram a existência de um receptor do tipo 5-HT1A e do tipo 5-HT1B. Depois
foram caracterizados os receptores: 5-HT1C, 5-HT1D, 5-HT1E e 5-HT1F (Pazos et al, 1984;
Hoyer et al, 1985 a-b; Leonhardt et al 1989; Amlaiky et al, 1992). Estes receptores foram
agrupados na mesma família por terem uma alta homologia na sequência de aminoácidos,
e todos são acoplados à proteína G. Após uma revisão da nomenclatura destes receptores
o receptor 5-HT1C foi movido para a família 5-HT2 e as propriedades de 5-HT1B e 5-HT1D
foram revisadas (Humphrey et al 1993; Hoyer et al, 1994; Hartig et al, 1996).
1.3.1.1 – 5-HT1A
Em 1982 Hjort e colaboradores apresentaram um composto com propriedade de
agonista do receptor 5-HT1A, o 8-OH-DPAT. A utilização deste composto permitiu o
reconhecimento dos sítios de ligação de 5-HT1A (Gozlan et al, 1983). Outros
componentes com estrutura semelhante à de 5-HT1A foram apontados como ansiolíticos
ou antidepressivos (Traber e Glaser, 1987; Robinson et al, 1990). A distribuição deste
receptor no sistema nervoso central foi amplamente estudada através de técnicas auto-
radiográficas. Em humanos, mais recentemente a técnica de PET tem sido empregada
para visualizar os sítios de 5-HT1A in vivo. Técnicas moleculares também estão sendo
empregadas no estudo da distribuição destes receptores (Pazos e Palacios, 1985;
Weissman-Nanopoulus et al., 1985; Hoyer et al, 1986; Vergé et al, 1986; Laporte et al,
1994; Pike et al, 1995). As técnicas auto-radiográficas revelam que existe uma grande
densidade desse receptor no hipocampo, área septal, córtices (com destaque para os
córtices entorrinal e cingulado), e nos núcleos da rafe (NDR e NMnR). Estudos
28
moleculares mostram uma distribuição de RNAm-5-HT1A quase idêntica à distribuição
apontada pela auto-radiografia (Chalmers e Watson, 1991; Burnet et al, 1995). Técnicas
de hibridização in situ e imunoistoquímicas mostram este receptor em neurônios
piramidais do córtex (Pompeiano et al, 1992; Burnet et al, 1995). 5-HT1A também é
visualizado em neurônios serotonérgicos na rafe e em neurônios colinérgicos (Francis et
al, 1992; Kia et al, 1996). Azmitia e colaboradores (1996) reportaram a presença de 5-
HT1A em células da glia, mas outros estudos não comprovam esse dado.
1.3.1.2 – 5-HT1B
Primeiramente foi caracterizado por sua baixa afinidade com o 8-OH-DPAT no
cérebro de ratos, o que indicava que se tratava de um receptor com propriedades
diferentes do subtipo 5-HT1A (Pedigo et al, 1981; Middlemiss e Fozard, 1983). Este
receptor apresenta propriedades farmacológicas diferentes em ratos e humanos e por isso
recebe uma nomenclatura diferenciada: r5-HT1B para ratos, h5HT1B para humanos
(Vanhoutte et al, 1996). Estudos auto-radiográficos mostram uma grande concentração de
5-HT1B em sítios como a substância negra e globo pálido (Pazos et al, 1985; Vergé et al,
1986). Hibridização in situ mostra a presença de RNAm para 5-HT1B no NDR e NMnR
(Voigt et al, 1991; Doucet et al, 1995). Por auto-radiografia o 5-HT1B é encontrado no
striatum. Essa visualização também é possível através de hibridização in situ. Entretanto
outras regiões como o globo pálido e a substância negra mostram baixa expressão de
RNAm para 5-HT1B (Jin et al, 1992). Em nível celular esse receptor pode ser encontrado
em terminais não serotonérgicos (Boschert et al, 1994; Bruinvels et al, 1994a-b). Outras
evidências suportam a idéia de que este é um receptor que pode atuar como auto-receptor,
quando localizado em terminais serotonérgicos, atua no controle da liberação do
neurotransmissor (Middlemiss e Hutson, 1990; Bühlen et al, 1996).
29
1.3.1.3 – 5-HT1D
Em 1987 Heuring e Peroutka reportaram um novo receptor que bloqueava o
sítio de ligação para 5-HT1A e, o até então, 5-HT1C com propriedades farmacológicas
distintas de 5-HT1B esse receptor também foi encontrado em ratos, e sítios similares
foram reconhecidos em outras espécies (Waeber et al 1988). Esse receptor foi então
nomeado como 5-HT1D. O estudo da distribuição deste receptor por auto-radiografia foi
dificultado pela baixa afinidade com os radioligantes disponíveis. Relatos baseados em
auto-radiografia, apontam a presença de 5-HT1D no globo pálido, substancia negra,
putamen, hipocampo, córtex (Bruinvels et al, 1993), substancia cinzenta periaquedutal e
medula espinal (Castro et al, 1997). Através de hibridização in situ podemos observar
RNAm para 5-HT1D no putamen, núcleo accumbens, córtex olfatório, NDR e locus
coeruleus (Hamblin et al, 1992; Bruinvels et al, 1994a-b). Em ratos a detecção de níveis
de RNAm para 5-HT1B é muito baixa, mas em áreas como o globo pálido e a substância
negra estes níveis não são detectáveis. Assim como o 5-HT1B, esse é um receptor que
pode atuar como hetero-receptor (Maura e Raiteri, 1996; Feuerstein et al, 1996), ou como
auto-receptor (Starkey e Skingle, 1994; Davidson e Stamford, 1995; Trillat et al, 1997).
1.3.1.4 – 5-HT1E
A primeira descrição deste receptor também foi feita por meio de auto-
radiografia (Waeber et al, 1988; Leonhardt et al, 1989), entretanto não existe um
radioligante específico para 5-HT1E, por isso a descrição desse receptor se baseia em
resultados negativos para 5-HT1A-1B-1D-2C e no estudo de sua distribuição no encéfalo
(Miller e Teitler, 1992; Barone et al, 1993). Ainda assim, por meio de auto-radiografia,
esse receptor aparece no córtex, com destaque para o córtex entorrinal, putamen,
hipocampo e amígdala. Hibridização in situ revela a presença de RNAm-5-HT1E em áreas
30
corticais, e baixos n�veis s�o detectados na am�gdala e em �reas hipotal�micas (Bruinvels
et al, 1994a-b).
1.3.1.5 – 5-HT1F
Caracterizado pela primeira vez com base na homologia com 5-HT1B-1D, tendo
sido denominado 5-HT1Eβ, devido a semelhan�as farmacol�gicas com o 5-HT1E (Amlaiky
et al, 1992). O estudo da distribui��o desse receptor foi iniciado utilizando-se
hibridiza��o in situ tendo como resultado uma densa distribui��o de RNAm-5-HT1F no
hipocampo, cingulado, c�rtex entorrinal e NDR (Adham et al, 1993, Bruinvels et al,
1994a-b). Na subst�ncia negra a presen�a de 5-HT1F � pouco detect�vel por hibridiza��o
in situ (Waeber e Moskowitz, 1995a-b).
1.3.2 – Fam�lia 5-HT2
Essa fam�lia � composta por tr�s receptores: 5-HT2A, 5-HT2B e 5-HT2C. Eles
apresentam semelhan�as com rela��o � estrutura molecular, propriedades farmacol�gicas
e transmiss�o do sinal. Vale ressaltar que o receptor 5-HT1C foi introduzido nesta fam�lia,
recebendo a nomenclatura de 5-HT2C (Humphrey et al, 1993; Hoyer et al, 1994). As
caracter�sticas estruturais s�o estreitamente semelhantes entre os receptores dessa fam�lia,
apresentando sete dom�nios transmembrana. (Baxter et al, 1995). Uma caracter�stica dos
receptores dessa fam�lia � o acoplamento � fosfolipase C e sua atua��o na mobiliza��o do
c�lcio intracelular (Halbach e Dermietzel, 2006).
1.3.2.1 – 5-HT2A
O reconhecimento desse receptor foi feito por meio de auto-radiografia atrav�s
de sua afinidade com a espiperona, e um perfil semelhante ao de outros receptores 5-HT
31
(Peroutka e Snyder, 1979). Estudos auto-radiográficos, de hibridização e
imunoistoquímicos têm sido desempenhados com o intuito de mapear a distribuição deste
receptor no sistema nervoso central. A auto-radiografia mostra a presença de 5-HT2A no
neocortex, córtex entorrinal, córtex piriforme, claustrum, núcleo caudado, núcleo
accumbens, tubérculo olfatório e hipocampo (Pazos et al, 1985, López-Gimenéz et al,
1997). Estudos de hibridização e imunoistoquímica confirmam as descrições feitas pelos
estudos de auto-radiografia. Com relação à localização celular, estudos de hibridização
mostram que este receptor está localizado em células pós sinápticas, e são expressos
também em astrócitos em cultura (Mengod et al, 1990; Morilak et al, 1993, 1994;
Pompeiano et al, 1994; Burnet et al, 1995; Meller et al, 1997).
1.3.2.2 – 5-HT2B
Reconhecido por sua propriedade mediadora da contração muscular estomacal,
esse receptor foi primeiramente descrito como um receptor do tipo 5-HT1 (Bradley et al,
1986). A distribuição deste receptor no sistema nervoso ainda não é totalmente
estabelecida, entretanto estudos de hibridização mostram uma distribuição muito restrita
(Kursar et al, 1994; Bonhaus et al, 1995). Análises imunoistoquímicas permitem
identificar a presença deste receptor em neurônios do cerebelo, área septal lateral,
hipotálamo dorsal e amígdala (Duxon et al, 1997).
1.3.2.3 – 5-HT2C
Esse receptor foi visualizado no plexo coróide em diversas espécies através de
auto-radiografia e foi originalmente denominado 5-HT1C. Após estudos mais detalhados
esse receptor foi reordenando na família 5-HT2 (Pazos et al, 1984). A análise auto-
radiográfica da distribuição deste receptor revela a sua presença no núcleo olfatório,
32
córtex piriforme, cingulado, núcleo accumbens, hipocampo, amígdala, núcleo caudado e
substancia negra (Palacios et al, 1991). Análises por hibridização in situ da distribuição
de 5-HT2C confirmam os dados de análise auto-radiográfica, e acrescentam o núcleo
habenular, NDR e substancia cinzenta periaquedutal, confirmadas por imunoistoquímica
(Mengod et al, 1990; Abramowisk et al, 1995).
1.3.3 – 5-HT3
5-HT3 é um receptor do tipo canal iônico, composto por subunidades (Derkach
et, 1989; Maricq et al, 1991). O primeiro relato descritivo deste receptor baseia-se em
estudos moleculares utilizando um banco de cDNA (Maricq et al, 1991). A distribuição
desse receptor, revelada por auto-radiografia, concentra-se no núcleo do trato solitário,
área postrema, núcleo dorsal do vago, hipocampo, amígdala e córtex cerebral (Pratt et al,
1990). A distribuição apontada por estudos auto-radiográficos é confirmada por estudos
que empregam a técnica de hibridização (Tecott et al, 1993). Por meio de
imunoistoquímica, o 5-HT3 pode ser visualizado em neurônios GABA-érgicos do córtex
cerebral e hipocampo (Morales e Bloom, 1997).
1.3.4 – 5-HT4
Enquanto estudavam a atividade de adenilato ciclase em células do colículo em
cultura Bockaert e colaboradores (1990) visualizaram pela primeira vez o receptor 5-HT4.
Estudando a distribuição de 5-HT4 por meio de auto-radiografia é possível encontrá-lo
predominantemente nos sistemas nigro-estriatal e mesolímbico (Grossman et al, 1993;
Waeber et al, 1993; Doménech et al, 1994; Mengod et al, 1996). A análise de transcritos
de 5-HT4 por RT-PCR mostra a sua presença no striatum (Gerald et al, 1995).
33
1.3.5 - 5-HT5
Plassat e colaboradores (1992a-b) identificaram a sequência de cDNA a partir de
uma biblioteca gerada a partir de tecido nervoso de camundongos. Pouco tempo depois
foram identificadas duas variações nesse receptor, baseando-se também em técnicas
moleculares, as quais foram denominadas 5-HT5A e 5-HT5B (Matthes et al, 1993;
Erlander et al, 1993). Um estudo empregando northern blot encontrou 5-HT5A no
cerebelo, hipocampo, hipotálamo, córtex, tálamo, ponte, striatum e medula (Erlander et
al, 1993). Aplicando a mesma técnica no estudo da distribuição de 5-HT5B foi possível
encontrá-lo no hipocampo (Erlander et al, 1993). Analisando a distribuição de 5-HT5B
através de hibridização in situ foi possível encontrá-lo no núcleo supra-óptico,
hipocampo, subiculum, habenula, NDR, bulbo olfatório e córtex entorrinal (Erlander et
al, 1993).
1.3.6 - 5-HT6
À exemplo do 5-HT5, o receptor 5-HT6 também foi descrito baseando-se em
técnicas moleculares de seqüenciamento de cDNA (Monsma et al, 1993). É possível
encontrar RNAm de 5-HT6 no núcleo caudado através de hibridização in situ. Técnicas
de northern blot também permitem delinear a sua distribuição no tubérculo olfatório,
núcleo acumbens e hipocampo (Monsma et al, 1993; Ward et al, 1995; Kohen et al,
1996). Por imunocitoquímica foi possível visualizar que no hipocampo e striatum este
receptor está associado a processos dendríticos, indicando sua presença em neurônios
pós-sinápticos (Gérald et al, 1997).
34
1.3.7 – 5-HT7
O último dos receptores serotonérgicos a ser descrito, 5-HT7 tem sido
identificado em diversas espécies utilizando técnicas de seqüenciamento de cDNA (Bard
et al, 1993; Ruat et al, 1993a-b; Tsou et al, 1994; Nelson et al, 1950). O RNAm de 5-HT7
é expresso em regiões do tálamo, hipotálamo, córtex cerebral, amígdala e hipocampo (To
et al, 1995; Gustafson et al, 1996; Stowe e Barnes, 1998).
35
2. JUSTIFICATIVA
O hipotálamo é um centro integrador de funções homeostáticas e
comportamentais, participando até mesmo no controle de alguns processos cognitivos.
Esta região do sistema nervoso tem sido bastante estudada em diversas espécies de
mamíferos. Contudo estudos que abordam essa estrutura em espécies de primatas ainda
são escassos.
5-HT é um neurotransmissor distribuído por todo o sistema nervoso central, que
exerce as mais diversas funções, muitas delas de grande importância na área clinica. As
ações desse neurotransmissor dependem de seu alvo principal, os seus receptores que
estão distribuídos por todo o sistema nervoso, e apresentam uma ampla diversidade de
representantes.
Estudar a distribuição de elementos do sistema serotonérgico no hipotálamo do
sagui abre caminho para o desenvolvimento de mais trabalhos que busquem esclarecer a
função da 5-HT no hipotálamo de primatas. O desenvolvimento, por exemplo, de estudos
farmacológicos, uma vez considerada a importância clínica da serotonina; ou avaliações
neurobiológicas. Abrindo um leque ainda maior de informações sobre as funções
serotonérgicas em espécies primatas. Além disso esta espécie já é um modelo
experimental para estudos neurais consolidada no meio cientifico, e desenvolvendo
trabalhos como este, estamos contribuindo ainda mais para entender a sua biologia.
36
3. OBJETIVOS
3.1 – Objetivo Geral
Fazer a delimitação citoarquitetônica de núcleos hipotalâmicos, identificar a
presença de terminais e fibras serotonérgicas, do transportador de serotonina, e receptores
serotonérgicos, através de análises imunoistoquímicas no hipotálamo do primata
Callithrix jacchus.
3.2 – Objetivos espec�ficos
Comparar a citoarquitetura dos núcleos hipotalâmicos
utilizando coloração de Nissl e imunoistoquímica para NeuN;
Descrever a distribuição de fibras e terminais serotonérgicos
em diferentes núcleos hipotalâmicos;
Descrever a distribuição do transportador de serotonina em
diferentes núcleos hipotalâmicos;
Descrever a distribuição de receptores (5-HT7, 5-HT3, 5-
HT2C, 5-HT2B, 5-HT2A, 5-HT1B, 5-HT1A) em diferentes núcleos
hipotalâmicos.
37
4. METODOLOGIA
Neste estudo utilizamos saguis adultos jovens obtidos atrav�s N�cleo de
Primatologia da UFRN (Licen�a do IBAMA No 1/24/92/0039-0). Estes animais,
enquanto estiveram em cativeiro, antes da realiza��o de nossos experimentos, foram
monitorados por um veterin�rio, portanto todos os animais utilizados em condi��es
saud�veis. Na col�nia esses animais se encontravam em ambiente semi-natural, em
gaiolas medindo 2,0 x 1,0 x 1,00m. Nessas gaiolas os animais estavam expostos �s
varia��es ambientais de temperatura, ilumina��o e umidade. Sua alimenta��o era
fornecida duas vezes ao dia, e era composta por uma mistura balanceada contendo ra��o
para primatas e suplementos vitam�nicos, e frutas regionais, as quais os animais
encontrariam em ambiente natural. A �gua estava dispon�vel continuamente em
bebedouros.
Utilizamos 12 animais, considerando-se este como o n�mero m�nimo poss�vel
para a obten��o de resultados adequados � pesquisa. Vale destacar que esses mesmos
animais tamb�m foram utilizados em outros projetos de pesquisa, desenvolvidos no
mesmo laborat�rio, com metodologias convergentes, de forma a n�o haver interfer�ncia
nos resultados de nenhuma pesquisa envolvendo os mesmos sujeitos experimentais. Ao
manusear os animais todos os cuidados necess�rios foram adotados para minimizar o
estresse e/ou sofrimento. Todos os procedimentos seguem as normas estabelecidas pelo
National Research Council of the National Academy, publicadas no livro “Guidelines for
the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research”. Uma vers�o
digital pode ser obtida, atrav�s de acesso livre, no site da Sociedade Brasileira de
Neuroci�ncias e Comportamento (SBNeC) em: www.sbnec.org.br/links.
38
4.1 – Procedimentos experimentais
No Núcleo de Primatologia, no dia anterior ao dia experimental, os animais foram
isolados em gaiolas individuais que mediam 0,90m x 0,60 x 0,75m. No dia seguinte, pela
manhã, antes que a alimentação fosse oferecida, os animais foram transportados para o
Laboratório de Neuroanatomia do Centro de Biociências da UFRN, onde foram
realizados todos os procedimentos experimentais.
Os animais foram anestesiados por meio de um procedimento anestésico em duas
etapas. Na primeira etapa os animais recebiam uma medicação pré-anestésica composta
por sulfato de atropina na dosagem de 0,04 mg/Kg, via subcutânea, e 2 mg/Kg de
Tramadol, via intramuscular. Na segunda etapa do procedimento anestésico os animais
recebiam Quetamina e Xilazina, administradas em uma mistura na mesma seringa, na
dosagem de 20 mg/Kg e 2 mg/Kg respectivamente. Uma vez atingido o plano anestésico,
a sua manutenção era feita por meio de ventilação de Isoflurano através de máscara de
oxigênio.
Uma vez estabelecido o plano anestésico prosseguimos com a perfusão
transcardíaca. Nesta etapa o animal foi posicionado em decúbito dorsal sobre uma tela de
arame instalada dentro de uma capela de exaustão com ponto de água. Abrimos acesso à
cavidade torácica, com auxílio de material cirúrgico adequado à remoção da musculatura
e gradil costal, expondo a cavidade abdominal e rebatendo o músculo diafragma para ter
acesso ao coração. Uma agulha (1,6 x 17mm) conectada a uma bomba peristáltica (Cole-
Parmer) foi inserida na músculo cardíaco de maneira a posicioná-la no terceiro ventrículo
com orientação à artéria aorta, e o átrio direito foi seccionado. Com auxílio da bomba
impulsionamos, pelo leito vascular do animal, 500ml de solução salina (0,9%, em tampão
fosfato 0,1M, pH 7,4) acrescida de heparina (2ml/1000ml), e em seguida bombeamos
700ml de paraformaldeído (4%, em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4). Duas horas após o fim
39
da perfusão a calota craniana foi fraturada para a remoção do encéfalo. Uma vez retirados
da cavidade craniana os encéfalos foram submetidos a pós fixação, por 04 horas, no
mesmo fixador utilizado na perfusão, acrescido de sacarose a 30%. Depois da pós fixação
os encéfalos foram armazenados em solução de sacarose (30%, em tampão fosfato 0,1M,
pH 7,4) até que fossem submetidos à microtomia.
A microtomia foi feita por congelamento em micrótomo de deslizamento manual.
As secções foram obtidas em plano frontal, com a espessura de 30µm. Estas secções
foram distribuídas serialmente em um recipiente dividido em seis compartimentos, cada
um contendo tampão fosfato (0,1M, pH 7,4). Em cada um dos compartimentos continha
uma das secções de uma série de seis cortes, de maneira que a distância entre as secções
de cada compartimento era de 180µm. As secções foram armazenadas sob resfriamento
(4 °C) até o processamento imunoistoquímico.
Em cada compartimento selecionamos as secções que representam o hipotálamo e
as submetemos ao processamento de coloração de Nissl para identificar a citoarquitetura,
ou a processos imunoistoquímicos para visualizar NeuN, receptores serotonérgicos, 5-
HT, ou o transportador de serotonina. Para as secções submetidas a imunoistoquímica o
primeiro passo foi o tratamento para recuperação da antigenicidade. As secções foram
lavadas tampão fosfato (0,1M, pH 7,4), por 25 minutos, sendo o tampão trocado a cada 5
minutos. Essas lavagens foram feitas em cubas de vidro, posicionadas sobre um agitador
orbital. Para a eliminação de artefatos e recuperação da antigenicidade os cortes eram
incubados, por 20 minutos, em solução contendo peróxido de hidrogênio a 0,03% em
tampão fosfato (0,1M, pH 7,4). Após essa etapa e mais 05 lavagens em tampão fosfato,
cada uma com a duração de 5 minutos, os cortes eram incubados em uma solução
40
contendo o anticorpo prim�rio1 dilu�do em tamp�o fosfato contendo Triton X-100 0,3%, e
soro normal do animal correspondente � obten��o do anticorpo secund�rio. Os cortes
permaneciam nessa solu��o por um per�odo de 18 a 24 horas, em rotor com rota��o lenta,
e eixo de inclina��o de 30�. Passado esse tempo, os cortes eram incubados em solu��o
contendo o anticorpo secund�rio dilu�do em tamp�o fosfato contendo Triton X-100 0,3%,
por 02 horas. Seguindo-se ent�o � incuba��o no complexo avidina-biotina-HRP, dilu�do
em tamp�o fosfato contendo Triton X-100 0,3% acrescido de cloreto de s�dio, por 02
horas. A rea��o final, a revela��o, ocorria em meio l�quido contendo: tamp�o fosfato,
per�xido de hidrog�nio e 3,3’,4,4’ tetrahidrocloreto-diaminobenzidina (DAB) para as
rea��es de NeuN e 5-HT, j� para as rea��es que buscavam o transportador de serotonina
e os receptores seroton�rgicos acrescentou-se, nessa etapa, 1ml de solu��o de sulfato de
am�nia e n�quel (NAS) a 0,3%. Os cortes foram imersos nessa solu��o por
aproximadamente 10 minutos. Entre cada etapa, e ao final, os cortes foram lavados em
tamp�o fosfato (0,1M, pH 7,4) por 25 minutos, sendo trocado o tamp�o a cada 5 minutos.
As sec��es foram montadas em l�minas de vidro para microscopia, previamente
gelatinizadas, e secaram em temperatura ambiente. Seguindo-se ent�o a intensifica��o da
rea��o em solu��o de tetr�xido de �smio a 0,05%, e desidrata��o e diafaniza��o em uma
bateria de alco�is. As laminas foram ent�o cobertas com uma lam�nula. Uma das s�ries
coletadas serviu para a colora��o citoarquitet�nica de Nissl. Neste caso os cortes foram
montados em l�minas de vidro para micrsocopia, e submetidos � t�cnica de colora��o de
Nissl, com tionina como corante, para melhor demarcar os n�cleos e formato das c�lulas.
Durante o processo de colora��o os cortes, montados em l�minas de vidro para
microscopia, foram mergulhados em uma bateria de alco�is para desidrata��o e
diafaniza��o.
1 Para ver dilui��o dos anticorpos, Soro Normal, Triton X-100, avidina e biotina, consultar a Tabela 2.
41
A visualização das laminas foi feita em campo claro, e quando necessário em
campo escuro, em um microscópio óptico (Olympus BX41). As imagens foram captadas
através de um sistema de imagem acoplado ao mesmo microscópio. Esse sistema é
formado por uma câmera digital (Nikon DXM1200) com saída para uma placa de captura
de vídeo em um computador. O software utilizado pela captura das imagens foi o ACT1.
As imagens capturadas foram tratadas para ajuste de brilho e contraste no software Adobe
Photoshop CS4®, e os desenhos esquemáticos foram montados no software Adobe
Illustrator 8.0®.
42
Tabela 2: Lista de Anticorpos e Soros Normais
Antígeno Anticorpo Primário
Anticorpo Secundário Soro Normal
NeuNMouse
[1:1000](Chemicon)
Cabra[1:1000]
(Jackson Labs)
Soro Normal de Cabra(2% do volume total)
5-HTCoelho
[1:5000](Sigma)
Cabra[1:1000]
(Jackson Labs)
Soro Normal de Cabra(2% do volume total)
5-HTTCoelho
[1:1000]ImmunoStar
Cabra[1:1000]
(Jackson Labs)
Soro Normal de Cabra(2% do volume total)
5-HT1A
Coelho[1:500]
(DiaSorin)
Cabra[1:1000]
(Jackson Labs)
Soro Normal de Cabra(2% do volume total)
5-HT1B
Coelho[1:500]
(DiaSorin)
Cabra[1:1000]
(Jackson Labs)
Soro Normal de Cabra(2% do volume total)
5-HT2A
Camundongo[1:1000]
(Pharmingen)
Asno[1:1000]
(Jackson Labs)
Soro Normal de Asno(2% do volume total)
5-HT2B
Camundongo[1:1000]
(Pharmingen)
Asno[1:1000]
(Jackson Labs)
Soro Normal de Asno(2% do volume total)
5-HT2C
Coelho[1:1000]
(ImmunoStar)
Cabra[1:1000]
(Jackson Labs)
Soro Normal de Cabra(2% do volume total)
5-HT3
Coelho[1:1000](Sigma)
Cabra[1:1000]
(Jackson Labs)
Soro Normal de Cabra(2% do volume total)
5-HT7
Coelho[1:1000]
(DiaSorin)
Cabra[1:1000]
(Jackson Labs)
Soro Normal de Cabra(2% do volume total)
43
5. RESULTADOS
5.1 – Colora��o citoarquitet�nica de Nissl
Através da coloração citoarquitetônica de Nissl pudemos observar o padrão de
organização dos núcleos hipotalâmicos do sagui (Figura 3). Os núcleos observados
mais rostralmente são os núcleos da área pré-óptica: NPOpv, APOm, APOl e NPOm,
na zona periventricular, localizados ao redor do terceiro ventrículo, e na porção mais
lateral o DB (Figura 3 A-C). Ainda no nível rostral é possível identificar núcleos da
região supra-óptica, o NSQ em posição lateral ao terceiro ventrículo sobre o quiasma
óptico, o NSO sobre a extremidade lateral do quiasma óptico, ventral à APOl e
ventrolateral à APOm (Figura 3 B-C). No nível intermédio identificamos a porção
caudal da região Supra Óptica pela presença do NSO, dividido em duas porções, lateral
e medial, pelo tracto óptico; e pela presença da porção mais anterior do NPV localizado
justaposto à porção mais dorsal da parede do terceiro ventrículo (Figura 3 D-E). Nesse
nível também são identificados: a AHD, em posição dorso-lateral ao núcleo
paraventricular; a AHA ventral ao NPV e medial ao tracto óptico; e a AHL, dorsal ao
tracto óptico e lateral às áreas hipotalâmicas anterior e dorsal (Figura 3 D-E). Nesse
nível aparecem também os núcleos da Região Tuberal: NDM, NVM e, de delimitação
mais imprecisa através da coloração de Nissl, o ARQ. NDM e NVM são limitados
lateralmente pelo fórnix e medialmente pelo terceiro ventrículo. Dorsalmente o NDM é
limitado pelo NPV e ventralmente pelo NVM. O NVM é limitado ventrolateralmente
pelo ARQ (Figura 3 F-H). No nível mais posterior observamos os núcleos: NTM e NTL
localizados lateralmente aos núcleos pré mamilares (Figura 3 I). Os núcleos mais
posteriores observados no hipotálamo formam os corpos mamilares, formados pelos
núcleos: NML, NMI e NMM (Figura 3 J).
44
5.2 – Imunorreatividade a NeuN
A presença da proteína NeuN foi observada em toda a extensão do hipotálamo do
sagui (Figura 4), sendo útil na identificação de alguns núcleos dessa região diencefálica.
Contudo a expressão dessa proteína não foi detectada em alguns núcleos, como o NPOpv,
e na porção caudal da AHD, nesses núcleos nota-se uma ausência de imunorreatividade,
em contraste com os núcleos adjacentes a eles. Núcleos como o NSQ e o NSO expressam
essa proteína apenas na porção dorsal (Figura 4 A-C). Contudo observamos um padrão
citoarquitetônico muito semelhante ao observado através da coloração de Nissl, com a
mesma organização dos núcleos nas diferentes regiões hipotalâmicas.
5.3 – Imunorreatividade a 5-HT
A imunorreatividade à 5-HT foi observada em toda a extensão rostro-caudal do
hipotálamo do sagüi (Figura 5). A distribuição de fibras serotonérgicas apresenta-se mais
densamente em determinados núcleos. Na APO (Figura 5.1) observamos uma grande
concentração de fibras na APOm, sobretudo no NPOpv (Figura 5.1 B-C), essas fibras
contem muitas varicosidades (Figura 5.1 C). A APOl recebe uma projeção menos densa
que a APOm (Figura 5.1 D-E), entretanto podemos observar uma maior concentração de
fibras na sua porção medial (Figura 5.1 E). Notamos também um menor número de
varicosidades na APOl que na APOm. A projeção serotonérgica para o NPOm se
restringe à sua periferia (Figura 5.1 F).
Na região supra-óptica (Figura 5.2) observamos que o NSQ recebe uma densa
projeção serotonérgica (Figura 5.2 B-C), composta por fibras e muitas varicosidades.
Essa projeção sobre o NSQ é maior na porção dorsal do núcleo, na sua porção ventral
observamos a ausência de fibras serotonérgicas (Figura 5.2 C). O NSO assim como o
45
NSQ recebe uma densa projeção serotonérgica com muitas varicosidades (Figura 5.2 D-
E), com uma notável concentração na porção dorsal e ausência de imunorreatividade na
sua porção ventral (Figura 5.2 E). O NPV apresenta uma concentração maior de fibras na
porção medial, essa concentração diminui em direção à suas extremidades lateral e
ventral (Figura 5.2 F). A AHD recebe uma densa projeção serotonérgica, com inúmeras
varicosidades, bastante espalhadas (Figura 5.2 G).
Na porção rostral da região tuberal (Figura 5.3) o ARQ é o núcleo que apresenta a
maior concentração de fibras/terminais contendo 5-HT (Figura 5.3 B-C), com inúmeras
varicosidades (Figura 5.3 C). O NVM apresenta várias fibras contendo 5-HT espalhadas
por todo o núcleo (Figura 5.3 D-E). O NDM apresenta uma maior concentração de fibras
serotonérgicas na sua porção medial que na porção lateral (Figura 5.3 F-G).
No último nível, onde encontramos a porção caudal da região tuberal e a região
mamilar (Figura 5.4), observamos uma baixa imunorreatividade nos núcleos pré-
mamilares e no NTM (Figura 5.4 B). O NTL apresenta a maior concentração de fibras
nessa região (Figura 5.4C). Nos corpos mamilares podemos observar uma maior
concentração no NMM e no NMI, sendo a projeção para o NML mais escassa (Figura 5.4
D).
5.4 – Imunorreatividade a 5-HTT
Observamos fibras 5-HTT-IR em toda a extensão rostro-caudal do hipotálamo do
sagui (Figura 6). Na APOm observamos uma maior concentração de fibras contendo 5-
HTT no NPOpv (Figura 6.1 B-C); enquanto na APOl observamos uma menor densidade
de fibras 5-HTT-IR quando comparada à APOm, tendo na porção ventral a maior
concentração destas fibras (Figura 6.1 B).
46
Nos núcleos da região supra-óptica (Figura 6.2) encontramos um denso plexo de
fibras 5-HTT-IR sobre o NSQ (Figura 6.2 B), sobretudo em sua porção dorsal e uma
menor imunorreatividade para o transportador na porção ventral deste núcleo (Figura
6.2C). O mesmo padrão observado no NSQ se repete no NSO (Figura 6.2 D), as fibras
contendo 5-HTT são observadas na porção dorsal do núcleo com muitas varicosidades
(Figura 6.2 E). O NPV apresenta uma maior concentração de fibras 5-HTT-IR na porção
periventricular, essa concentração é menor nos sentidos lateral e ventral da extensão deste
núcleo (Figura 6.2 F-G).
No nível rostral da região tuberal (Figura 6.3) encontramos uma grande
quantidade de fibras 5-HTT-IR no ARQ (Figura 6.3 B-C). No NVM encontramos uma
grande quantidade de fibras, distribuindo-se uniformemente por todo o núcleo (Figura 6.3
D-E) enquanto no NDM encontramos uma grande quantidade de fibras contendo 5-HTT,
com uma tendência a uma maior concentração na porção medial do núcleo (Figura 6.3 F-
G).
5.5 – Imunorreatividade a 5-HT1A
A imunorreatividade ao receptor 5-HT1A foi observada em toda a extensão rostro-
caudal do hipotálamo do sagüi, entretanto algumas regiões apresentam uma marcação
mais pálida que outras (Figura 7). Observamos uma distribuição destes receptores por
toda a APO, a maior concentração está no NPOpv. A APOl apresenta uma marcação
pálida além disso observamos uma menor concentração destes receptores nessa área
(Figura 7.2 A). Na APOm esse receptor está mais concentrado na porção ventromedial,
no entanto é possível encontrá-lo distribuído por toda essa região (Figura 7.1 B, 7.2 A).
Na região supra-óptica observamos a presença deste receptor concentrada
principalmente na porção dorsal do NSQ (Figura 7.1 C, 7.2 A). O NSO apresenta uma
47
maior concentração deste receptor na sua porção dorso-medial (Figura 7.1 D, 7.2 A). É
possível observar uma ampla distribuição destes receptores no NPV (Figura 7.1 F, 7.2 B).
Esse mesmo padrão de marcação é visualizado na AHD, embora esta área apresente uma
marcação mais pálida (Figura 7.2 B).
As regiões tuberal e mamilar apresentam uma marcação mais pálida, e menos
densa que os níveis mais rostrais do hipotálamo (Figura 7.2 B-C). No nível mais anterior
da região tuberal o ARQ apresenta a marcação mais pálida dessa região (Figura 7.1 I, 7.2
B). No NVM identificamos a distribuição deste receptor por todo o núcleo (Figura 7.1 G,
7.2 B). No NDM este receptor aparece com uma maior concentração na porção medial,
mas não limita-se a ela, aparecendo também na porção dorsal (Figura 7.1 H, 7.2 B). O
NTL é o núcleo com a marcação mais expressiva na porção mais rostral da região
mamilar contrastando com os demais núcleos da mesma região (Figura 7.2 C). Os
núcleos mamilares não apresentaram marcação para este receptor.
5.6 – Imunorreatividade a 5-HT1B
A presença deste receptor foi verificada em toda a extensão rostro-caudal do
hipotálamo e, assim como o 5-HT1A, algumas regiões apresentam uma marcação muito
pálida (Figura 8). Além disso, em alguns núcleos o 5-HT1B não foi encontrado por meio
de imunoistoquímica. Na APO a maior concentração deste receptor foi observada na
APOm, sobretudo no NPOpv (Figura 8.1 B). A APOl apresenta uma marcação mais
pálida que a APOm, e com uma menor densidade destes receptores (Figura 8.1 A). O
NPOm não apresentou marcação positiva para este receptor, contrastando com as áreas
adjacentes a ele.
Na região supra-óptica, no NSQ, visualizamos o 5-HT1B na sua porção dorsal,
ficando a porção ventral com uma marcação quase completamente negativa à exceção de
48
alguns poucos elementos positivos (Figura 8.1 C, 8.2 A). No NSO identificamos a
presença deste receptor predominantemente na sua porção dorsal, com alguns elementos
na porção ventral (Figura 8.1 D, 8.2 A). O NPV apresenta este receptor em toda a sua
extensão, embora seja possível verificar uma predominância dorsal e na região
periventricular (Figura 8.1 F, 8.2 B). A AHD apresenta uma marcação bastante pálida
para este receptor (Figura 8.2 B).
No nível rostral da região tuberal, encontramos no ARQ uma distribuição
homogênea do 5-HT1B por todo o núcleo (Figura 8.1 I, 8.2 B). O NDM também apresenta
uma distribuição homogênea para este receptor (Figura 8.1 H, 8.2 B). No NVM este
receptor encontra-se distribuído por todo o núcleo com a mesma densidade para cada
porção (Figura 8.1 G. 8.2 B).
No último nível do hipotálamo, onde encontra-se a porção caudal da região
tuberal e a região mamilar, só é possível visualizar o 5-HT1B no NTL, com poucos
elementos marcados, e uma marcação bastante pálida (Figura 8.2 C). Nos núcleos
mamilares este receptor não foi encontrado.
5.7 – Imunorreatividade a 5-HT2A, 5-HT2B, 5-HT2C, 5-HT3 e 5-HT7
Utilizando técnicas imunoistoquimicas não foi possível identificar nenhum destes
receptores em nenhum dos núcleos hipotalâmicos do sagui.
49
Figura 3 – Fotomicrografias em campo claro de sec��es coronais do enc�falo de sagui
coradas pelo m�todo de Nissl, mostrando os grupamentos neuronais do hipot�lamo dessa
esp�cie. Barra: 300�m.
APOLAPOM
NSQ
NPOpv DB
qo
3v
APOL
NPOvl
APOM
NPOm
NPOpv
NSQNSO
DB
AHL
qo
3v
APOL
NPOvl
APOMNPOpv
NPOm
NSO
DB
AHL
vl
3v
qo
AHD
NPOm
NPVDB
ca
to
AHA
AHL
NSO
3v
ca
3v
AHD
NPV
NDM
NVM
DB
NSO
AHL
to
A
B
C
D
E
ET
AHD
NDM
NVM
AHL
to
3v
NSO
NPV
fx
ET
AHD
NDM
NVM
to
fx
3v
NPV
NHD
AHD
NDM
TM
ETPT
fx
AHL
NDH
AHD
TLTMPML
PMM
PMD
tmt
NMLNMINMM
F
G
H
I
J
52
Figura 4 – Fotomicrografias em campo claro de sec��es coronais do enc�falo do sagui
mostrando a imunorreatividade � NeuN nos n�cleos hipotal�micos. Barra: 300 �m em
A-C e 250 �m em D-H.
APOM
APOL
DB
NPOm
3v
NPOpv
NSONSQ
AHL
qo
APOM
APOL
NPOvlDB
NPOpv
NPOm
NSO
AHL3v
ca
qo
AHDNPV
NSOto
AHA
AHL
ET
AHD
NDM
NVM
NPV
ARQ NSO
to
fx
AHL
ca
3v
ET
AHD
NDM
NVM
NPV
NSO
to
ARQ
fx
A
B
C
D
E
TL
TMPMD
PMM
PMLNMLNMINMM
N M
F
G
H
55
Figura 5 - Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do sagui
mostrando imunorreatividade à 5-HT no hipotálamo do sagui.
Figura 5.1 (pág. 56): Imunorreatividade à 5-HT na APO, detalhando a presença de
imunorreatividade na APOm em B-C, na APOl em D-E e ausência de imunorreatividade
no NPOm em F. Barras: 250 µm em A; 100 µm em B, D e F; e 75 µm em C e E.
Figura 5.2 (pág. 57): Imunorreatividade à 5-HT na área supra-óptica, detalhando a
presença de imunorreatividade no NSQ em B-C; no NSO em D-E, no NPV em F e na
AHD em G. Barras: 250 µm em A; 100 µm em B e D ; e 75 µm em C, E, F e G.
Figura 5.3 (pág. 58): Imunorreatividade à 5-HT na região tuberal detalhando a
presença de imunorreatividade no ARQ em B-C, no NVM em D-E, e no NDM em F-G.
Barras: 250 µm em A; 100 µm em B, D e F; e 75 µm em C, E e G.
Figura 5.4 (pág. 59): Imunorreatividade à 5-HT na região mamilar, detalhando a
presença de imunorreatividade no NTL em B-C e nos corpos mailares em D. Barras: 250
µm em A; 100 µm em B e D; e 75 µm em C.
40x
10X
10X
10X
40x
A
3V
qo
APO
B
3V
APOm
C
D
APOl
E
F
NPOm
APOm 3V
56
qo
A
3V
qo
NSQ
NSO
ca
3V
B
NSQ
C
D
qo
NSO
E
F
1 2
NPV
3V
G
AHD
57
4X
40X
40X
40X
10X
10X
10X
A
to
3V
NVM
NDM
NPV
ARQ
B
3V ARQ
D
NVM
3V
F
NDM
NVM
C
E
G
58
4X
10X
40X
10X
A
B
NT
L
C
D
59
60
Figura 6 - Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do sagui
mostrando imunorreatividade à 5-HTT no hipotálamo do sagui.
Figura 6.1 (pág. 61): Imunorreatividade à 5-HTT na APO, detalhando a presença
de imunorreatividade na APOm em B-C. Barras: 250 µm em A; 100 µm em B; e 75 µm
em C.
Figura 6.2 (pág. 62): Imunorreatividade à 5-HTT na área supra-óptica, detalhando
a presença de imunorreatividade no NSQ em B-C; no NSO em D-E, no NPV em F e G.
Barras: 250 µm em A; 100 µm em B, D e F ; e 75 µm em C, E e G.
Figura 6.3 (pág. 63): Imunorreatividade à 5-HTT na região tuberal detalhando a
presença de imunorreatividade no ARQ em B-C, no NVM em D-E, e no NDM em F-G.
Barras: 250 µm em A; 100 µm em B, D e F; e 75 µm em C, E e G.
A
3V
qo
AP
O
B 3
V
AP
Om
C 3
V
61
A
qo
3V
ca
NSO
C B
3V
3V NSQ
D
qo
NSO
E
F
3V
NPV
G
62
A 3V
to
ARQ
NVM
NDM
B
to
ARQ
C
D
NVM
E
F
NDM
G
63
64
Figura 7 - Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do sagui
mostrando imunorreatividade à 5-HT1A no hipotálamo do sagui e ilustrações
esquemáticas da distribuição de5-HT1A no hipotálamo do sagui.
Figura 7.1 (págs. 65 e 66): Imunorreatividade à 5-HT1A detalhando a presença de
imunorreatividade na APOm em B, no NSQ em C, no NSO em D, no NPV em F, no
NVM em G, no NDM em H e no ARQ em I. Barras: 70 µm
Figura 7.2 (pág. 67): Ilustrações esquemáticas da distribuição de 5-HT1A no
hipotálamo do sagui. Em A do nível entre APO e Área Supra-óptica, em B do nível da
região tuberal, em C do nível entre região tuberal e mamilar. Os pontos vermelhos
indicam a marcação mais intensa e mais densa, os pontos laranjas e amarelos indicam
marcações mais pálidas e menos densas.
3V
A
B
C
D
65
E
F G
H I
66
C
A
qo
APOmNPOpvNSQ
NSO
APOL
NPOvlDB
B
ET
AHD
NPV
NDM
NVM
ARQ
TLPMD
TMPMLPMM
NDH
AHD
68
Figura 8 - Fotomicrografias em campo claro de secções coronais do encéfalo do sagui
mostrando imunorreatividade à 5-HT1B no hipotálamo do sagui e ilustrações
esquemáticas da distribuição de 5-HT1B no hipotálamo do sagui.
Figura 8.1 (págs. 69 e 70): Imunorreatividade à 5-HT1B detalhando a presença de
imunorreatividade na APOm em B, no NSQ em C, no NSO em D, no NPV em F, no
NVM em G, no NDM em H e no ARQ em I. Barras: 70 µm
Figura 8.2 (pág. 71): Ilustrações esquemáticas da distribuição de 5-HT1B no
hipotálamo do sagui. Em A do nível entre APO e Área Supra-óptica, em B do nível da
região tuberal, em C do nível entre região tuberal e mamilar. Os pontos vermelhos
indicam a marcação mais intensa e mais densa, os pontos laranjas e amarelos indicam
marcações mais pálidas e menos densas.
3V
A
D
3V
qo
C
B
69
E
F G
H I
70
C
TLPMD
TMPMLPMM
NDH
AHD
A
qo
APOmNPOpvNSQ
NSO
APOL
NPOvlDB
B
ET
AHD
NPV
NDM
NVM
ARQ
72
6. DISCUSS�O
Este trabalho apresenta a citoarquitetura do hipotálamo da sagui, e baseado nela
mostra a disposição de elementos do sistema serotonérgico entre os núcleos
hipotalâmicos. A divisão do hipotálamo tem sido estudada em diversas espécies, e os
resultados mostram uma conservação filogenética no que diz respeito à anatomia dessa
região. A distribuição de fibras de serotonina e receptores serotonérgicos também têm
sido bastante estudadas em diversas espécies. A presença de elementos como o
transportador de serotonina e receptores serotonérgicos no hipotálamo ajuda a
esclarecer as funções por ele desempenhadas.
6.1 – Citoarquitetura Hipotal�mica
A utilização da técnica de Nissl se mostrou bastante útil na delimitação dos
grupamentos neuronais do hipotálamo do sagui, nos permitindo identificar os núcleos e
seus contornos. A imunoistoquímica para revelar a presença da proteína NeuN, presente
nos núcleos de células neurais maduras (Sarnat et al., 1998), serviu como parâmetro de
comparação da citoarquitetura revelada pela técnica de Nissl. Embora não tenha sido
possível visualizar a presença de NeuN em alguns núcleos, os resultados mostram uma
citoarquitetura consonante com a que se pode observar através do método de Nissl.
Essa delimitação citoarquitetônica foi de fundamental importância para conhecermos e
localizarmos os sítios onde os elementos serotonérgicos estavam localizados, e assim
podermos alcançar os objetivos propostos pelo trabalho. Os núcleos encontrados no
hipotálamo do sagui estão de acordo com referencias prévias encontradas em outras
espécies, e no próprio sagui (Swanson, 1987; Newman et al., 2009).
73
6.2 – 5-HT
Nossos resultados mostram uma inervação serotonérgica distribuída por todas as
regiões do hipotálamo em toda a sua extensão rostro-caudal, com densidade variável
entre os diferentes núcleos hipotalâmicos. No hipotálamo encontram-se especializações
sinápticas nos terminais serotoninérgicos (Azmitia e Ganon, 1983; Calas et al., 1974;
Descarries e Beaudet, 1978; Frankfurt e Beaudet, 1987; Nojyo e Sano, 1978). As
projeções serotonérgicas para o hipotálamo provenientes do NDR são compostas
principalmente por axônios de calibre fino a médio enquanto as provenientes do NMnR
são compostas principalmente por axônios de calibre mais grosso, sendo essa essa
característica comum a diferentes espécies de mamíferos (Beaudet e Descarries, 1979;
Frankfurt et al., 1981; Steinbusch e Nieuwenhuys, 1981; Ueda et al, 1983; Kawata et a,
1984; Kuikka et al, 1995). Entretanto esses dados ainda não são possíveis de se
identificar no sagui. Para identificar a origem da inervação serotonérgica do hipotálamo
faz-se necessário a realização de estudos hodológicos.
Em ratos a 5-HT está envolvida no controle da secreção de prolactina, renina,
angiotensina, vasopressina, ocitocina e corticosterona (van de Kar et al., 1978; Karteszi
et al., 1982; Brownfield et al, 1988; Richardson-Morton et al., 1990; Rittenhouse et al.,
1992; Li et al., 1993). Esses trabalhos apontam que a participação da 5-HT na secreção
desses hormônios é mediada pela projeção da rafe para o NPV e NSO. A projeção
serotonérgica para o NVM está envolvida no controle de secreção de gonadotrofinas,
em ratos (Hery et al., 1976; Wuttke et al., 1977).
A ingestão alimentar é afetada por ação serotonérgica nos núcleos NVM, NPV,
ARQ e a AHL (Kantak et al., 1978; Dryden et al., 1993; Nishimura et al., 1996). O
comportamento sexual mediado pela APO também sofre influencia da inervação
serotonérgica (Moreines e Powers, 1977; Frankfurt et al., 1981;).
74
O plexo serotonérgico que chega ao NSQ está envolvido na modulação dos ritmos
biológicos (Moga e Moore, 1997; Hay-Schmidt et al., 2003; Pontes et al., 2010). Na
maioria das espécies estudadas os terminais serotonérgicos encontrados no NSQ são
localizados na mesma porção onde se encontram terminais retinianos, de onde se pode
inferir que a serotonina atua modulando os estímulos fóticos provenientes da retina. No
entanto, o sagui apresenta um plexo serotonérgico localizado na porção dorsal do NSQ,
em um sítio diferente dos terminais retinianos, que se localizam na porção ventral do
núcleo (Cavalcante et al., 2002), o que nos leva a crer que a serotonina atua de maneira
diferente nesta espécie.
A função da 5-HT no hipotálamo do sagui ainda não é esclarecida. Para
compreende-la melhor é necessário o desenvolvimento de estudos da transmissão
serotonérgicas, a comparação com outras espécies também é uma ferramenta útil para
ajudar a esclarecer os mecanismos de ação da serotonina no hipotálamo do sagui.
6.3 – 5-HTT
Nosso estudo revelou a presença do transportador de serotonina em todas as áreas
do hipotálamo, assim como a distribuição de fibras serotonérgicas. Aparentemente esse
transportador foi encontrado em elementos pré-sinápticos, o que faz dele um marcador
para axônios serotonérgicos. A distribuição desse transportador é a mesma observada
para as fibras serotonérgicas. Essa disposição pode ser observada em outras áreas, por
outros autores (Lidov et al., 1980; Steinbusch, 1981). A diferença de densidade do
transportador entre as diversas áreas do hipotálamo, assim como a de serotonina
confirma a presença de transportador em regiões onde encontram-se os axônios
serotonérgicos. Esse dado pode contribuir para o desenvolvimento de estudos
farmacológicos que empregam bloqueadores da recaptação de serotonina para a
75
compreensão da relação do sistema serotonérgico com o hipotálamo. Estudos
autoradigráficos usando citalopram e fluoxetina, dois bloqueadores da recaptação de 5-
HT já foram empregados para mapear a distribuição de 5-HTT (Watanabe et al., 1993).
6.4 –5-HT1A
A imunorreatividade ao receptor 5-HT1A foi observada em toda a extensão rostro-
caudal do hipotálamo do sagui, entretanto algumas regiões apresentam uma marcação
mais pálida que outras. Na APOm a marcação sugere a presença destes receptores em
neurônios pós-sinápticos e em elementos pré-sinápticos, já a marcação visualizada na
APOl sugere a presença destes receptores em neurônios pós sinápticos. Esses resultados
indicam que a ação deste receptor pode ser diferente em cada uma dessas regiões.
A distribuição deste receptor no hipotálamo do sagui apresenta altas densidades
em determinadas áreas e não é observado em algumas outras áreas, reforçando assim o
papel determinante do tipo de receptor na transmissão serotonérgica. No NSQ, o
principal componente no controle dos ritmos biológicos, nós encontramos esse receptor
na porção dorsal do núcleo, um dado que está de acordo com a distribuição de terminais
serotonérgicos neste núcleo (Cavalcante et al., 2002). Diversas áreas hipotalâmicas
estão envolvidas na regulação da ingestão alimentar, como o ARQ, NPV e NVM
(Gundlah et al., 1999; Centeno et al, 2007); e alguns estudos apontam o 5-HT1A como o
receptor serotonérgico envolvido no controle alimentar (Hutson et al., 1988; Vickers e
Dourish, 2004). Entre esses núcleos nós encontramos uma densa concentração de 5-
HT1A no NVM, embora não tenhamos encontrado forte imunorreatividade para este
receptor no ARQ. Entretanto o sistema que controla a ingestão alimentar não está
completamente estabelecido, dessa maneira não podemos atribuir nenhuma função para
este receptor nestas estruturas do sagui.
76
A estimulação serotonérgica do NPV leva a um aumento na secreção de
vasopressina (Jorgensen et al., 2007) e a ativação do 5-HT1A nesse mesmo núcleo
aumenta o consumo hídrico e a excreção de urina (de Souza et al., 2008). Este receptor
pode, também, estar envolvido com a liberação de ocitocina pelo NSO (Kia et al.,
1996).
6.5 – 5-HT1B
Este receptor aparece em diversas áreas do hipotálamo do sagui, podendo variar
de intensidade. Em algumas regiões este receptor se apresenta em elementos pré
sinápticos, em outras em elementos pós sinápticos, podendo aparecer em ambos em
alguns núcleos hipotalâmicos. Este receptor pode atuar tanto como auto-receptor como
hetero-receptor (Barnes e Sharp, 1999). Os efeitos do comportamento agressivo são
atenuados pelo 5-HT1B na AHA (Lucas et al, 1998). A presença de 5-HT1B no NPV
intermedia a liberação de ocitocina nesse núcleo (van de Kar et al., 1995). Este receptor
pode também estar envolvido no controle da ingestão alimentar exercido pelo NPV
(Myata et al., 1999). Em trabalho recente Cavalcante e colaboradores (2011) mostram a
presença de 5-HT1B na porção dorsal do NSQ, assim como mostramos aqui, em
ocorrência diferente da que é possível encontrar em roedores, em que esse receptor
ocupa a porção central do NSQ. Essa diferença de localização indica que este receptor
apresenta funções diferentes nessas diferentes espécies, e que o sistema serotonérgico
pode influenciar de maneira diferente os ritmos biológicos do sagui.
No sagui a distribuição deste receptor guarda poucas similaridades com espécies
de roedores, o que dificulta o estabelecimento de alguma função específica. Entretanto
abre novas perspectivas para a elaboração de estudos que busquem esclarecer essa
77
função. Estudos farmacológicos, ou que empreguem técnicas moleculares podem ser
úteis para esclarecer essas funções.
6.6 - 5-HT2A, 5-HT2B, 5-HT2C, 5-HT3 e 5-HT7
A impossibilidade de visualizar estes receptores no hipotálamo do sagui não
significa necessariamente a sua ausência nesse sítio anatômico. A técnica utilizada pode
não ser capaz de detectar esses receptores, o que pode ser devido à especificidade dos
anticorpos utilizados. Outras técnicas podem ser empregadas, tanto para confirmar os
dados imunoistoquimicos, quanto para detectar estes receptores no hipotálamo e em
outras áreas do sistema nervoso central. O teste de especificidade do anticorpo pode
servir para confirmar que este realmente funciona em nosso modelo experimental.
Entretanto, outras técnicas como a hibridização in situ, por exemplo, podem ser mais
eficazes que a imunoistoquímica na detecção destes receptores.
78
7. CONCLUSÃO
1) Os núcleos do hipotálamo do sagui foram identificados por meio de técnicas de
coloração citoarquiteônica, e apresentou um padrão semelhante ao já apresentado na
literatura para esta espécie, e para outras espécies de primatas e não primatas,
mostrando poucas variações quanto a estrutura.
2) O hipotálamo do sagui recebe uma rica projeção serotonérgica. A densidade da
projeção serotonérgica difere entre os núcleos.
3) A distribuição de 5-HTT observada no hipotálamo do sagui é coerente com a
distribuição de fibras 5-HT-IR, e aparece somente em fibras. Dessa forma podemos
apontar o 5-HTT como um marcador para axônios serotonérgicos.
4) Os receptores 5-HT1A e 5-HT1B embora encontrados em toda a extensão rostro-caudal
não são encontrados em todos os núcleos do hipotálamo do sagui.
5) A presença desses receptores em elementos pré ou pós sinápticos mostra a função
deste receptor como auto ou heteroreceptor.
6) A distribuição de 5-HT1A e 5-HT1B mostra que esses receptores tem funções
determinantes na função da 5-HT nos diferentes núcleos hipotalâmicos.
7) Os receptores 5-HT2A, 5-HT2B, 5-HT2C, 5-HT3 e 5-HT7 não foram encontrados por
meio de imunoistoquimica, o que pode ser devido a fatores tais como a
79
especificidade do anticorpo, ou impossibilidade da técnica em identificar esses
receptores nessa espécie.
8) A função da 5-HT nesta espécie de primata ainda não é estabelecida. Para tanto se faz
necessário o desenvolvimento de outros estudos, como estudos hodológicos ou
farmacológicos, que busquem elucidar melhor o funcionamento desse sistema.
80
REFERÊNCIAS1
Abramowski D, Rigo M, Duc D. 1995. Localization of the 5-hydroxytryptamine2C
receptor protein in human and rat brain using specific antisera. Neuropharmacology
34:1635–1645.
Adham N, Kao HT, Schechter LE. 1993. Cloning of another human serotonin receptor (5-
HT1F): a 5th 5-HT1 receptor subtype coupled to the inhibition of adenylate cyclase. Proc
Natl Acad Sci USA 90:408–412.
Amin A, Crawford T, Gaddum J. 1954. The distribution of substance P and 5-
hydroxytryptamine in the central nervous system of the dog. J Physiol 126:596-618.
Amlaiky N, Ramboz S, Boschert U, Plassat JL, Hen R. 1992. Isolation of a mouse 5-
HT1E-like serotonin receptor expressed predominantly in hippocampus. J Biol Chem
267:19761-19764.
Antoni FA. 1986. Hypothalamic control of adrenocorticotropin secretion: advances since
the discovery of 41-residue corticotropin-releasing factor. Endocr Rev 7(4):351-378.
Azmitia E, Gannon P. 1983. The ultrastructural localization of serotonin
immunoreactivity in myelinated and unmyelinated axons within the medial forebrain
bundle of rat and monkey. J Neurosci 3(10):2083-2090.
Azmitia EC, Gannon PJ, Kheck NM, Whitaker-Azmitia PM. 1996. Cellular Localization
of the 5-HT1A receptor in primate brain neurons and glial cells. Neuropsycopharmacology
14:35-46.
1 A listagem de refer�ncias e cita��es segue �s normas do The Journal Of Comparative Neurology.
81
Bard JA, Zgombick J, Adham N. 1993. Cloning of a novel human serotonin receptor (5-
HT7) positively linked to adenylate cyclase. J Biol Chem 268:23422–23426.
Barnes NM, Sharp T. 1999. A review of central 5-HT receptors and their function.
Neuropharmacology 38(8):1083-152
Barone P, Millet S, Moret C. 1993. Quantitative autoradiography of 5-HT1E binding sites
in rodent brains: effect of lesion of serotonergic neurones. Eur J Pharmacol 249:221–230.
Baxter G, Kennett G, Blaney F. 1995. 5-HT2 receptor subtypes: a family re-united?
Trends Pharmacol Sci 16:105–110.
Beaudet A, Descarries L. 1979. Radioautographic characterization of a serotonin-
accumulating nerve cell group in adult rat hypothalamus. Brain Res 160(2):231-243.
Blier P, de Montigny C. 1999. Serotonin and drug-induced therapeutic responses in major
depression, obsessive-compulsive and panic disorders. Neuropsychopharmacol 21:91-98.
Bonhaus DW, Bach C, DeSouza A. 1995. The pharmacology and distribution of human
5-hydroxytryptamine2B (5-HT2B) receptor gene products: comparison with 5-HT2A and 5-
HT2C receptors. Br. J. Pharmacol. 115, 622–628.
Bonnin A, Torii M, Wang L, Rackic P, Levitt P. 2007. Serotonin modulates the response
of embryonic thalamocortical axons to netrin-1. Nat Neurosci 10-588-597.
Bockaert J, Sebben M, Dumuis A. 1990. Pharmacological characterisation of 5-
hydroxytryptamine4 (5-HT4) receptors positively coupled to adenylate cyclase in adult
82
guinea pig hippocampal membranes: effect of substituted benzamide derivatives. Mol
Pharmacol 37:408–411.
Boschert U, Amara DA, Segu L. 1994. The mouse 5-hydroxytryptamine1B receptor is
localized predominantly on axon terminals. Neuroscience 58:167–182.
Bradley PB, Engel G, Feniuk W. 1986. Proposals for the classification and nomenclature
of functional receptors for 5-hydroxytryptamine. Neuropharmacology 25:563–576.
Brodie B, Shore P. 1957. A concept for a role of serotonin and norepinephrine as
chemical mediators in the brain. Ann NY Academ Sci 66:631-642.
Brownfield MS, Greathouse J, Lorens SA, Armstrong J, Urban JH, Van de Kar LD.
1988. Neuropharmacological characterization of serotoninergic stimulation of
vasopressin secretion in conscious rats. Neuroendocrinology 47(4):277-283.
Bruinvels AT, Landwehrmeyer B Gustafson EL. 1994a. Localization of 5-HT1B, 5-HT1Dα,
5-HT1E and 5-HT1F, receptor messenger RNA in rodent and primate brain.
Neuropharmacology 33:367–386.
Bruinvels AT, Palacios JM, Hoyer D. 1993. Autoradiographic characterisation and
localisation of 5-HT1D compared to 5-HT1B binding sites in rat brain. Naunyn-
Schmiedeberg’s Arch Pharmacol 347:569–582.
Bruinvels AT, Landwehrmeyer B, Probst A. 1994b. A comparative autoradiographic
study of 5-HT1D binding sites in human and guinea-pig brain using different radioligands.
Brain Res Mol Brain Res 21:19–29.
83
B�hlen M, Fink K, Boing C. 1996. Evidence for presynaptic location of inhibitory 5-
HT1D beta-like autoreceptors in the guineapig brain cortex. Naunyn-Schmiedeberg’s
Arch. Pharmacol. 353:281–289.
Burnet PWJ, Eastwood SL, Lacey K. 1995. The distribution of 5-HT1A and 5-HT2A
receptors mRNA in human brain. Brain Res 676:157-168.
Calas A, Alonso G, Arnauld E, Vincent JD. 1974. Demonstration of indolaminergic
fibres in the media eminence of the duck, rat and monkey. Nature 250(463):241-243.
Castro E, Pascual J, Rom�n T. 1997. Differential distribution of [3H]sumatriptan binding
sites (5-HT1B, 5-HT1D and 5-HT1F) in human brain: focus on brain stem and spinal
cord. Neuropharmacology 36:535–542.
Cavalcante JS, Alves AS, Costa MSMO, Britto LRG. 2002. Differential distribution of
afferent containing serotonin and neuropeptide Y within the marmoset suprachiasmatic
nucleus. Brain Res 927:200-203.
Cavalcante JS, Nascimento J�nior ES, Costa MSMO. 2006. Componentes centrais do
sistema de temporiza��o circadiana: o n�cleo supraquiasm�tico e o folheto
intergeniculado. Neuroci�ncias 3:1-10.
Cavalcante JS, Pontes ALB, Engelberth RCGJ, Cavalcante JC, Nascimento Jr ES, Borda
JS, Pinato L, Costa MSMO, Toledo CAB. 2011. 5-HT1B receptor in the suprachiasmatic
nucleus of the common marmoset (Callithrix jacchus). Neurosci Lett 488:6-10.
Carpenter MB. 1991. The Hypothalamus. In: Carpenter MB. 1991. Core Text Of
Neuroanatomy. Williams and Wilkins p297-394.
84
Centeno ML, Sanchez RL, Cameron JL, Bethea CL. 2007. Hypothalamic expression of
serotonin 1A, 2A and 2C receptor and GAD67 mRNA in female cynomolgus monkeys
with different sensitivity to stress. 1142:1-12.
Cerrito F, Raiteri M. 1979. Serotonin release is modulated by pre-synaptic autoreceptors.
Eu J Pharmacol 57:427-430.
Chalmers DT, Watson SJ. 1991. Comparative anatomical distribution of 5-HT1A receptor
mRNA and 5-HT1A binding in rat brain – a combined in situ hybridasation/in vitro
receptor autoradiographic study. Brain Res 561:51-60.
Costa MSMO, Santee UR, Cavalcante JS, Moraes PRA, Santos NP, Britto LRG. 1999.
Retinohypothalamic projections in the commom marmosets (Callitrhix jacchus): A study
using cholera toxin subunit. J Comp Neurol 415:393-403.
Dahlstr�m A, Fuxe K. 1964. Evidence for the existence of monoamine-containing
neurons in the central nervous system. I. Demonstration of monoamines in the cell bodies
of brain stem neurons. Acta Physiol Scand 64(232):1-55.
Davidson C, Stamford JA. 1995. Evidence that 5-hydroxytryptamine release in rat dorsal
raphe nucleus is controlled by 5-HT1A, 5-HT1B and 5-HT1D autoreceptors. Br J Pharmacol
114:1107–1109.
Derkach V, Surprenant A, North RA. 1989. 5-HT3 receptors are membrane ion channels.
Nature 339:706–709.
Descarries L. Beaudet A. 1978. The monoamine innervation of rat cerebral cortex:
synaptic and nonsynaptic axon terminals. Neuroscience 3(10):851-60.
85
Dom�nech T, Beleta J, Palacios JM. 1997. Characterization of human serotonin 1D and
1B receptors using [3H]-GR-125743, a novel radiolabelled serotonin 5HT1D/1B receptor
antagonist. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol 356:328–334.
Doucet E, Pohl M, Fattaccini CM. 1995. In situ hybridization evidence for the synthesis
of 5-HT1B receptor in serotoninergic neurons of anterior raphe nuclei in the rat brain.
Synapse 19:18–28.
Dryden S, McCarthy HD, Malabu UH, Ware M, Williams G. 1993. Increased
neuropeptide Y concentrations in specific hypothalamic nuclei of the rat following
treatment with methysergide: evidence that NPY may mediate serotonin's effects on food
intake. Peptides 14(4):791-796.
Duxon MS, Flanigan TP, Reavley AC. 1997. Evidence for the expression of the 5-
hydroxytryptamine2B receptor protein in the rat central nervous system. Neuroscience 76,
323–329.
Ericson H, Blomqvist A, K�hler C. 1989. Brainstem afferents to the tuberomammillary
nucleus in the rat brain with special reference to monoaminergic innervation. J Comp
Neurol 281(2):169-192.
Ersparmer V, Asero B. 1952. Identification of enteramine, specific hormone of
enterochromaffin cells, as 5-hydroxytryptamine. Nature 169:800-801.2
Erlander MG, Lovenberg TW, Baron BM. 1993. Two members of a distinct subfamily of
5-hydroxytryptamine receptors differentially expressed in rat brain. Proc Natl Acad Sci
90:3452–3456.
2 O artigo original foi publicado em italiano
86
Feuerstein TJ, Huring H, van Velthoven V. 1996. 5-HT1D-like receptors inhibit the
release of endogenously formed [3H]GABA in human, but not in rabbit, neocortex.
Neurosci Lett 209:210–214.
Francis PT, Pangalos MN, Pearson RC. 1992. 5-hydroxytriptamine1A but not 5-
hydroxytriptamine but not 5-hydroxytriptamine2 receptors are enriched on neocortical
pyramidal neurons destroyed by intrastriatal volkensin. J Pharmacol Exp Ther 261:1273-
1281.
Frankfurt M, Azmitia EC. 1983. The effect of intracerebral injections of 5,7-
dihydroxytryptamine and 6-hydroxydopamine on the serotonin-immunoreactive cell
bodies and fibers in the adult rat hypothalamus. Brain Res 261(1):9-91.
Frankfurt M, Azmitia EC. 1984. Regeneration of serotonergic fibers in the rat
hypothalamus following unilateral 5,7-dihydroxytryptamine injection. Brain Res
298(2):82-273.
Frankfurt M, Beaudet A. 1987. Ultrastructural organization of regenerated serotonin
axons in the dorsomedial hypothalamus of the adult rat. J Neurocytol 16(6):799-809.
Frankfurt M, Lauder JM, Azmitia EC. 1981. The immunocytochemical localization of
serotonergic neurons in the rat hypothalamus. Neurosci Lett 24(3):227-232.
Frechilla D, Cobreros A, Saldise L, Moratalla R, Insausti R, Luquin MR, Del Rio J. 2001.
Serotonin 5-HT (1A) receptor expression is selectively enhanced in the striosomal
compartment of chronic parkinsonian monkeys. Synapse 39:288–296.
Gaddum JH, Picarelli ZP. 1957. Two kinds of tryptamine receptor. Br J Pharmacol
12:323-328.
87
Gaspar P, Cases O, Maroteaux L. 2003. The developmental role of serotonin: news from
mouse molecular genetics. Nat Rev Neurosci 4:1002-1012.
Gerald C, Adham A, Kao HT. 1995. The 5-HT4 receptor: molecular cloning and
pharmacological characterisation of two splice variants. EMBO J 14:2806–2815.
G�rald C, Martres MP, Lef�vre K. 1997. Immuno-localization of serotonin 5-HT6
receptor-like material in the rat central nervous system. Brain Res 746:207–219.
Gingrich JA, Hen R. 2001. Dissecting the role of the serotonin system in neuropsychiatric
disorders using knockout mice. Psychopharmacology 155:1-10.
Gozlan H, El Mestikawy S, Pichat L. 1983. Identification of presynaptic serotonin
autoreceptor using a new ligand: [3H]PAT. Nature 305:140-142.
Grossman A, Costa A.1993. The regulation of hypothalamic CRH: impact of in vitro
studies on the central control of stress response. Funct Neurol 8(5):325-334.
Grossman CJ, Kilpatrick GJ, Bunce KT. 1993. Development of a radioligand binding
assay for 5-HT4 receptors in guinea-pig and rat brain. Br J Pharmacol 109:618–624.
Gundlah C, Pecins-Thompson M, Schutzer WE, Bethea CL. 1999. Ovarian steroid effects
on serotonin 1A, 2A and 2C receptor mRNA in macaque hypothalamus. Brain Res Mol
63(2):325-339.
Gustafson EL, Durkin MM, Bard JA, Zgombick J, Branchek TA. 1996. A receptor
autoradiographic and in situ hybridization analysis of the distribution of the 5-ht7
receptor in rat brain. Br J Pharmacol 117:657–666.
88
Halbach OVBU, Dermietzel R. 2006. Serotonin (5-Hydroxytryptamine). In:
Neurotransmitters and neuromodulators: handbook of receptors and biological effects.
Weinheim: Wiley-VCH. p 132-142.
Hamblin MW, McGuffin RW, Metcalf MA. 1992. Distinct 5-HT1B and 5-HT1D receptors
in rat: structural and pharmacological comparison of the two cloned receptors. Mol Cell
Neurosci 3:578–587.
Handley SL. 1995. 5-Hydroxytriptamine pathways in anxiety and its treatment.
Pharmacol Ther 66:103-148.
Hartig PR, Hoyer D, Humphrey PPA. 1996. Alignment of receptor nomenclature with the
human genome: classification of the 5-HT1B e 5-HT1D receptor subtypes. Trends
Pharmacol Sci 17:103-105.
Hay-Schimdt A, Vrang N, Larsen PJ, Mikkelsen JD. 2003. Projections from the raphe
nuclei to the suprachiasmatic nuclei of the rat. J Chem Neuroanat 25:293-310.
Heninger GR, Charney DS, Sternberg DE. 1984. Serotonergic function in depression.
Prolactin response to intravenous tryptophan in depressed patients and healthy subjects.
Arch Gen Psychiatry 41(4):398-402.
Heuring RE, Peroutka SJ. 1987. Characterization of a novel [3H]-5-hydroxytryptamine
binding site subtype in bovine brain membranes. J Neurosci 7:894–903.
Hery M, Laplante E, Kordon C. 1976. Participation of serotonin in the phasic release of
LH. I. Evidence from pharmacological experiments. Endocrinology 99(2):496-503.
89
Hjort S, Carlsson A, Lindberg P. 1982. 8-Hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin, 8-OH-
DPAT, a potent and selective simplifies erot congener with central 5-HT receptor
stimulating activity. J Neural Transm 55:169-188.
Hoyer D, Clarke DE, Fozard JR. 1994. International union of pharmacological
classification of receptor for 5-hydroxytriptamine (serotonin). Pharmacol Rev 46:157-
193.
Hoyer D, Engel G, Kalkman HO, 1985a. Characterisation of the 5-HT1B recognition site
in rat brain: binding studies with [125I]iodocyanopindolol. Eur J Pharmacol 118:1-12.
Hoyer D, Engel G, Kalkman HO. 1985b. Molecular pharmacology of 5-HT1 and 5-HT2
recognition sites in rat and pig brain membranes: radioligand binding studies with [3H]5-
HT, [3H]8-OH-DPAT, (-)[125I]iodo-cyanopindolol, [3H]mesulergine and
[3H]kentanserine. Eur J Pharmacol 118:13-23.
Hoyer D, Pazos A, Probst A, Palacios JM. 1986. Serotonin receptors in the human brain.
I. Characterisation and autoradiographic localization of 5-HT1A recognition sites,
apparent absence of 5-HT1B recognition sites. Brain Res 376:85-96.
Humphrey PPA, Hartig P, Hoyer D. 1993. A proposed new nomenclature for 5-HT
receptors. Trends Pharmacol Sci 14:233-236.
Hutson PH, Donohoe TP, Curzon G. 1988. Infusion of the 5-hydroxytryptamine agonists
RU24969 and TFMPP into the paraventricular nucleus of the hypothalamus causes
hypophagia. Psychopharmacology 95(4):550-552.
Jacobs BL, Azmitia EC. 1992. Structure and function of the brain serotonin system.
Physiol Rev 72:165-229.
90
Jacobs BL, Fornal AC. 1999. Activity of serotonergic neurons in behaving animals.
Neuropsychopharmacol 21:9-15.
Jin H, Oksenberg D, Askenazi A. 1992. Characterisation of the human 5-
hydroxytryptamine1B receptor. J Biol Chem 267:5735–5738.
Jouvet M. 1999. Sleep and serotonin: an unfinished story. Neuropsychopharmacol 21:24-
27.
Kantak KM, Wayner MJ, Stein JM. 1978. Effects of various periods of food deprivation
on serotonin turnover in the lateral hypothalamus. Pharmacol Biochem Behav 9(4):529-
534.
Karteszi M, Van de Kar LD, Makara GB, Stark E, Ganong WF. 1982. Evidence that the
mediobasal hypothalamus is involved in serotonergic stimulation of renin secretion.
Neuroendocrinology 34(5):323-326.
Kawata M, Takeuchi Y, Ueda S, Matsuura T, Sano Y. 1984. Immunohistochemical
demonstration of serotonin-containing nerve fibers in the hypothalamus of the monkey,
Macaca fuscata. Cell Tissue Res 236(3):495-503.
Kia HK, Brisorgueil MJ, Daval G. 1996. Serotonin 5-HT1A receptors expressed by a
subpopulation of cholinergic neurons in the rat medial septum and diagonal band of
Broca – a double immunocytochemical study. Neuroscience 74:143-154.
Kohen R, Metcalf MA, Khan N. 1996. Cloning, characterisation, and chromosomal
localization of a human 5-HT6 serotonin receptor. J. Neurochem. 66:47–56.
91
Kuikka JT, Tiihonen J, Bergstr�m KA, Karhu J, Hartikainen P, Viinam�ki H, L�nsimies
E, Lehtonen J, Hakola P. 1995. Imaging of serotonin and dopamine transporters in the
living human brain. Eur J Nuc Med 22(4):346-350.
Kursar JD, Nelson DL, Wainscott DB. 1994. Molecular cloning, functional expression,
and mRNA distribution of the human 5-hydroxytryptamine2B receptor. Mol Pharmacol
46:227–234.
Laporte AM, Lima L, Gozlan H. 1994. Selective in vivo labelling of brain 5-HT1A
receptor by [3H] WAY 100 635 in the mouse. Eur J Pharmacol 271:505-514.
Lebrand C, Cases O, Adelbrecht C, Doye A, Alvarez C, El Mestikawy S, Seif I, Gaspar
P. 1996. Transient uptake and storage of serotonin in developing thalamic neurons.
Neuron 17:823-835.
Lee MA, Nash JF, Barnes M, Meltzer HY. 1991. Inhibitory effect of ritanserin on the 5-
hydroxytryptophan-mediated cortisol, ACTH and prolactin secretion in humans.
Psychopharmacology 103(2):258-264.
Leonhardt S, Herryck-Davis K, Teitler M. 1989. Detection of a novel serotonin receptor
subtype (5-HT1E) in human brain: interaction with a GTP-binding protein. J Neurochem
53:465-471.
Lidov HG, Grzanna R, Molliver ME. 1980. The serotonin innervation of the cerebral
cortex in the rat--an immunohistochemical analysis. Neuroscience 5(2):207-227.
L�pez-Gim�nez JF, Mengod G, Palacios JM. 1997. Selective visulaisation of rat brain 5-
HT2A receptors by autoradiography with [3H]MDL 100 907. Naunyn-Schmeideberg’s
Arch Pharmacol 356:446–454.
92
Lucki I. 2001. The spectrum of behaviors influenced by serotonin. Biol Psychiatry
44:151-162.
Maricq AV, Peterson AS, Brake AJ. 1991. Primary structure and functional expression of
the 5-HT3 receptor, a serotonin-gated ion channel. Science 254, 432–437.
Maura G, Raiteri M. 1996. Serotonin 5-HT1D and 5-HT1A receptors respectively mediate
inhibition of glutamate release and inhibition of cyclic GMP production in rat cerebellum
in vitro. J Neurochem 66:203–209.
Matsumoto M, Kimura K, Fujisawa A, Uyama O, Yoneda S, Imaizumi M, Wada H, Abe
H. 1981. Diurnal variations in monoamine contents in discrete brain regions of the
Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). J Neurochem 37:792-794.
Matthes H, Boschert U, Amlaiky N. 1993. Mouse 5-hydroxytryptamine5A and 5-
hydroxytryptamine5B receptors define a new family of serotonin receptors: cloning,
functional expression, and chromosomal localization. Mol Pharmacol 43:313–319.
Meller R, Smith SE, Harrison PJ. 1997. 5-HT2A receptor induced release of glutamate
from C6 glioma cells. The Pharmacologist 39:61.
Mengod G, Pompeiano M, Martinez Mir MI. 1990. Localization of the mRNA for the 5-
HT2 receptor by in situ hybridization histochemistry. Correlation with the distribution of
receptor sites. Brain Res 524:139–143.
Mengod G, Vilar� MT, Raurich A. 1996. 5-HT receptors in mammalian brain: receptor
autoradiography and in situ hybridization studies of new ligands and newly identified
receptors. Histochem J 28:747–758.
93
Meyer-Bernstein EL, Morin LP. 1996. Differential serotonergic innervation of the
suprachiasmatic nucleus and the intergeniculate leaflet and its role in circadian rhythm
modulation. J Neurosci 16:2097-2111.
Middlemiss DN, Fozard JR. 1983. 8-Hydroxy-2-(di-n-propylamino)-tetralin
discriminates between subtypes of the 5-HT1 recognition site. Eur J Pharmacol 90:151–
153.
Middlemiss DN, Hutson PH. 1990. The 5-HT1B receptors. Ann NY Acad Sci 600:132–
147.
Miller KJ, Teitler M. 1992. Quantitative autoradiography of 5-CT sensitive (5-HT1D) and
5-CT insensitive (5-HT1E) serotonin receptors in human brain. Neurosci Lett 136:223–
226.
Moga MM, Moore RY. 1997. Organization of neural inputs to the suprachiasmatic
nucleus in the rat. J Comp Neurol 389:508-534.
Monsma FJ, Shen Y, Ward RP. 1993. Cloning and expression of a novel serotonin
receptor with high affinity for tricyclic psychotropic drugs. Mol Pharmacol 43:320–327.
Morales M, Bloom FE. 1997. The 5-HT3 receptor is present in different subpopulations
of GABAergic neurons in the rat telencephalon. J Neurosci 17:3157–3167.
Moreines JK, Powers JB. 1977. Effects of acute ovariectomy on the lordosis response of
female rats. Physiol Behav 19(2):277-283.
94
Morilak DA, Garlow SJ, Ciaranello RD. 1993. Immunocytochemical localization and
description of neurons expressing serotonin2 receptors in the rat brain. Neuroscience
54:701–717.
Morilak DA, Somogyi P, Lujan-Miras R. 1994. Neurons expressing 5-HT2 receptors in
the rat brain: neurochemical identification of cell types by immunocytochemistry.
Neuropsychopharmacology 11:157–166.
Moore RY, Lenn NJ. 1972. A retinohypothalamic projection in the rat. J Comp Neurol
180:1-14.
Morgane PJ. 1979. Historical and modern concepts of hypothalamic organization and
function. In: Morgane PJ, Panksepp J. (eds). 1979. Handbook Of Hypothalamus Vol. I.
Anatomy of Hypothalamus. Marcel Dekker. p1-64.
Nelson CS, Cone RD, Robbins LS. 1995. Cloning and expression of a 5HT7 receptor
from Xenopus laevis. Recept Channel 3:61–70.
Newman JD, Kenkel WM, Aronoff EC, Bock NA, Zametkin MR, Silva AS. 2009. A
combined histological and MRI brain atlas of the common marmoset monkey, Callithrix
jacchus. Brain Res Rev 62:1-18.
Nishimura F, Nishihara M, Torii K, Takahashi M. 1996. Changes in responsiveness to
serotonin on rat ventromedial hypothalamic neurons after food deprivation. Physiol
Behav 60(1):7-12.
Nojyo Y, Sano Y. 1978. Ultrastructure of the serotonergic nerve terminals in the
suprachiasmatic and interpeduncular nuclei of rat brains. Brain Res 149(2):482-488.
95
O’Keane V, Dinan TG. 1991. Prolactin and cortisol responses to d-fenfluramine in major
depression: evidence for diminished responsivity of central serotonergic function. Am J
Psychiatry 148(8):1009-1015
Olivier B, Mos J, van Oorschot R, Hen R. 1995. Serotonin receptors and animal models
of aggressive behavior. Pharmacopsychiatry 28(2):80-90.
Palacios JM, Waeber C, Mengod G. 1991. Autoradiography of 5-HT receptors: a critical
appraisal. Neurochem Int 18:17–25.
Parent A. 1996. Hypothalamus. In: Human Neuroanatomy. William & Wilkins p.706-
743.
Pasquier DA, Villar MJ. 1982. Specific serotonergic projections to the lateral geniculate
body from the lateral cell groups of the dorsal raphe nucleus. Brain Res 249:142-146.
Pazos A, Hoyer D, Palacios JM. 1984. The binding of serotonergic ligands to the porcine
choroid plexus: characterisation of a new type of serotonin recognition site. Eur J
Pharmacol 106:539-546.
Pazos A, Cortes R, Palacios JM. 1985. Quantitative autoradiographic mapping of
serotonin receptors in the rat brain. II. Serotonin-2 receptors. Brain Res 346:231–249.
Pazos A, Palacios JM. 1985. Quantitative autoradiographic mapping of serotonin
receptors in the rat brain. I. Serotonin-1 receptors. Brain Res 246:205-230.
96
Pedigo NW, Yamamura HI, Nelson DI. 1981. Discrimination of multiple [3H]5-
hydroxytryptamine binding sites by neuroleptic spiperone in the rat brain. J Neurochem
36:205-230.
Peroutka SJ, Snyder SH. 1979. Multiple serotonin receptors: differential binding of
[3H]5-hydroxytryptamine, [3H]lysergic acid diethylamide and [3H]spiroperidol. Mol
Pharmacol 16:687-699.
Persico AM, Di Pino G, Levitt P. 2006. Multiple receptors mediate the trophic effects of
serotonin on ventroposterior thalamic neurons in vitro. Brain Res 1095:17-25.
Pickard GE, Rea MA. 1997. Serotonergic innervation of the hypothalamic
suprachiasmatic nucleus and photic regulation of circadian rhythms. Biol Cell 89:513-
523.
Piezzi RS, Wurtman RJ. 1970. Pituitary serotonin content: effects of melatonin or
deprivation of water. Science 169(942):285-286.
Pike VW, McCarron JA, Lammerstma AA. 1995. First delineation of 5-HT1A receptors in
human brain with PET and [3H]WAY-100635. Eur J Pharmacol 283:1-3.
Plassat JL, Boschert U, Amlaiky N. 1992a. The mouse 5-HT5 receptor reveals a
remarkable heterogeneity within the 5-HT1D receptor family. EMBO J 11:4779–4786.
Plassat JL, Boschert U, Amlaiky N. 1992b. The mouse 5-HT5 receptor reveals a
remarkable heterogeneity within the 5-HT1D receptor family. EMBO J 11:4779–4786.
97
Pompeiano M, Palacios JM, Mengod G. 1994. Distribution of the serotonin 5-HT2
receptor family messenger RNAs: comparison between 5-HT2A and 5-HT2C receptors.
Mol Brain Res 23:163–178.
Pontes ALB, Engelberth RCGJ, Nascimento Jr ES, Cavalcante JC, Costa MSMO, Pinato
L, Toledo CAB, Cavalcante JS. 2010. Serotonin and circadian rhythms. Psychol &
Neurosci 3(2):217-228.
Pratt GD, Bowery NG, Kilpatrick GJ. 1990. The distribution of 5-HT3 receptors in
mammalian hindbrain — a consensus. Trends Pharmacol Sci 11:135–137.
Rapport M, Green A, Page I. 1948a. Crystalline serotonin. Science 108:329-330.
Rapport M, Green A, Page I. 1948b. Partial purification of the vasoconstrictor in beef
serum. J Biol Chem 174:735-741.
Rapport M, Green A, Page I. 1948c. Serum vasoconstrictor IV. Isolation and
characterization. J Biol Chem 176:12443-1251.
Rebsam A, Seif I, Gaspar P. 2002. Refinement of thalamocortical arbors and emergence
of barrel domains in the primary somatosensory cortex: a study of normal and
monoamine oxidase a knock-out mice. J Neurosci 22:8541-8552.
Richardson-Morton KD, Van de Kar LD, Brownfield MS, Lorens SA, Napier TC, Urban
JH. 1990. Stress-induced renin and corticosterone secretion is mediated by
catecholaminergic nerve terminals in the hypothalamic paraventricular nucleus.
Neuroendocrinology 51(3):33-43.
98
Rittenhouse PA, Li Q, Levy AD, Van de Kar LD. 1992. Neurons in the hypothalamic
paraventricular nucleus mediate the serotonergic stimulation of renin secretion. Brain Res
593(1):105-113.
Robinson DS, Rickels K, Feighner J. 1990. Clinical effects of the partial 5-HT1A agonists
in depression: a composite analysis of buspirone in the treatment of depression. J Clin
Psycopharmacol 10:67-76.
Ruat M, Traifford E, Arrang JM. 1993a. A novel rat serotonin (5-HT6) receptor:
molecular cloning, localization and stimulation of cAMP accumulation. Biochem
Biophys Res Comm 193:268–276.
Ruat M, Traifford E, Leurs R. 1993b. Molecular cloning, characterization, and
localization of a high-affinity serotonin receptor (5-HT7) activating cAMP formation.
Proc Natl Acad Sci 90:8547–8551.
Sarnat HB, Nochin D, Born DE. 1998. Neuronal nuclear antigen (NeuN): a marker of
neuronal maturation in the early human fetal nervous system. Brain & Develop 20:88-94.
Shibata H, Suzuki T, Matsushita M. 1986. Afferent projections to the interpeduncular
nucleus in the rat, as studied by retrograde and anterograde transport of wheat germ
agglutinin conjugated to horseradish peroxidase. J Comp Neurol 248:272-284.
Siever LJ, Murphy DL, Slater S, de la Vega E, Lipper S. 1984. Plasma prolactin changes
following fenfluramine in depressed patients compared to controls: an evaluation of
central serotonergic responsivity in depression. Life Sci 34(11):1029-39.
99
Spinedi E, Negro-Vilar A. 1983. Serotonin and adrenocorticotropin (ACTH) release:
direct effects at the anterior pituitary level and potentiation of arginine vasopressin-
induced ACTH release. Endocrinology 112(4):1217-2123.
Starkey SJ, Skingle M. 1994. 5-HT1D as well as 5-HT1A autoreceptors modulate 5-HT
release in the guinea-pig dorsal raphe nucleus. Neuropharmacology 33:393–402.
Steinbusch HWM. 1981. Distribution of serotonin-immunoreactivity in the central
nervous system of the rat-cell bodies and terminals. Neuroscience 6:557-618.
Steinbusch HW, Nieuwenhuys R. 1981. Localization of serotonin-like immunoreactivity
in the central nervous system and pituitary of the rat, with special references to the
innervation of the hypothalamus. Adv Exp Med Biol 133:7-35.
Stellar E. 1954. The physiology of motivation. Psycho Rev 61:5-22.
Stowe RL, Barnes NM. 1998. Cellular distribution of 5-HT7 receptor mRNA in rat brain.
Br J Pharmacol 123:p229.
Swanson LW. 1987. The hypothalamus. In: Bj�rklund A, H�kfelt T, Swanson LW. 1987.
Handbook of chemical neuroanatomy. Vol 5. Integrated systems of the CNS. Part 1.
Elsevier Science Publishers p1-124.
Takase LF, Nogueira MI, Baratta M, Bland ST, Watkins LR, Maier SF, Fornal CA,
Jacobs BL. 2004. Inescapable shock activates serotonergic neurons in all raphe nuclei of
rat. Behav Brain Res 153:233-239.
100
Tecott LH, Maricq AV, Julius. 1993. Nervous system distribution of the serotonin 5-HT3
receptor messenger RNA. Proc Natl Acad Sci 90:1430–1434.
Tischler RC, Morin LP. 2003. Reciprocal serotonergic connections between the hamster
median and dorsal raphe nuclei. Brain Res 981:126-132.
To ZP, Bonhaus DW, Eglen RM, Jakeman LB. 1995. Characterisation and distribution of
putative 5-ht7 receptors in guinea pig brain. Br J Pharmacol 115:107–116.
T�rk I. 1985. Raphe nuclei and serotonin containing systems. In: Paxinos G, editor. The
rat nervous system. Sidney: Academic Press. p 43-78.
Trabber J, Glaser T. 1987. 5-HT1A-related anxyolitics. Trends Pharmacol Sci 8:432-437.
Trillat AC, Malagi� I, Scearce K. 1997. Regulation of serotonin release in the frontal
cortex and ventral hippocampus of homozyggous mice lacking 5-HT1B receptors: in vivo
microdialysis studies. J Neurochem 69:2019–2025.
Tsou, AP, Kosaka A, Bach C. 1994. Cloning and expression of a 5-hydroxytryptamine7
receptor positively coupled to adenylyl cyclase. J Neurochem 63:456–464.
Twarog B, Page I. 1953. Serotonin content of some mammalian tissues and urine and a
method for its determination. Am J Physiol 175:157-161.
Ueda S, Kawata M, Takeuchi Y, Sano Y. 1983. Immunohistochemical demonstration of
serotonin nerve fibers in the hypothalamus of the cat. Anat Embryol 168(1):1-19.
101
Van De Kar L, Levine J, Van Orden LS 3rd. 1978. Serotonin in hypothalamic nuclei:
increased content after castration of male rats. Neuroendocrinology 27(3-4):186-192.
Van De Kar LD, Rittenhouse PA, Li Q, Levy AD, Brownfield MS. 1995. Hypothalamic
paraventricular, but not supraoptic neurons, mediate the serotonergic stimulation of
oxytocin secretion. Brain Res Bull 36(1):45-50
Vanhoutte PM, Humphrey PPA, Spedding M. 1996. Recommendations for nomenclature
of new receptor subtypes. Pharmacol Rev 48:1–2.
Verg� D, Calas A. 2000. Serotoninergic neurons and serotonin receptor: gains from the
cytochemical approaches. J Chem Neuroanat 18:41-58.
Verg� D, Daval G, Marcinkiewcz M. 1986. Quantitative autoradiography of multiple 5-
HT1 subtypes in the brain of control or 5,7-dihydroxytryptamine-treated rats. J Neurosci
6:3473-3482.
Vertes RP, Fortin WJ, Crane AM. 1999. Projections of the median raphe nucleus in the
rat. J Comp Neurol 407(4):555-582.
Vertes RP, Martin GF. 1988. An autoradiographic analysis of ascending projections from
the pontine and mesencephalic reticular formation and the median raphe nucleus in the
rat. J Comp Neurol 275:511-541.
Vertes RP. 1991. A PHA-L analysis of ascending projections of the dorsal raphe nucleus
in the rat. J Comp Neurol 407:555-582.
102
Vickers SP, Dourish CT. 2004. Serotonin receptor ligands and the treatment of obesity.
Curr Opin Investig Drugs 5(4):377-88.
Villar MJ, Vitale ML, H�kfelt T, Verhofstad AAJ. 1988. Dorsal raphe serotonergic
branching neurons projecting to the lateral geniculate body and superior colliculus: a
combined retrograde tracing-immunohistochemical study in the rat. J Comp Neurol
277:126-140.
Voigt MM, Laurie DJ, Seeburg PH. 1991. Molecular cloning and characterization of a rat
brain cDNA encoding a 5-hydroxytryptamine1B receptor. EMBO J 10:4017–4023.
Waeber C, Schoeffter P, Palacios JM. 1988. Molecular pharmacology of 5-HT1D
recognition sites: radioligand binding studies in human, pig and calf brain membranes.
Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol 337:595–601.
Waeber C, Sebben M, Grossman C. 1993. [3H]GR113 808 labels 5-HT(4) receptors in the
human and guinea pig brain. NeuroReport 4:1239–1242.
Waeber C, Moskowitz MA. 1995a. Autoradiographic visualization of [3H]5-
carboxamidotryptamine binding sites in the guinea pig and rat brain. Eur J Pharmacol
283:31–46.
Waeber C, Moskowitz MA, 1995b. [3H]sumatriptan labels both 5-HT1D and 5-HT1F
receptor binding sites in the guinea pig brain: an autoradiographic study. Naunyn-
Schmiedeberg’s Arch Pharmacol 352:263–275.
Ward RP, Hamblin MW, Lachowicz JE. 1995. Localization of serotonin subtype 6
receptor messenger RNA in the rat brain by in situ hybridization histochemistry.
Neuroscience 64:1105–1111.
103
Weissmann-Nanopoulus D, Mach E, Margre J. 1985. Evidence for the localization of 5-
HT1A binding sites on serotonin containing neurons in the raphe dorsalis and raphe
centralis nuclei of the rat brain. Neurochem Int 7:1061-1072.
Whitaker-Azmitia PM. 2001. Serotonin and brain development: role in human
developmental diseases. Brain Res Bull 56:479-485.
Woolf NJ, Butcher LL. 1985. Cholinergic systems in the rat brain: II. Projections to the
interpeduncular nucleus. Brain Res Bull 14:63-83.
Wuttke W, Björklund A, Baumgarten HG, Lachenmayer L, Fenske M, Klemm HP. 1977.
De- and regeneration of brain serotonin neurons following 5,7-dihydroxytryptamine
treatment: effects on serum LH, FSH and prolactin levels in male rats. Brain Res
134(2):317-331.
104
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5-HT1B receptor in the suprachiasmatic nucleus of the common marmoset(Callithrix jacchus)
Jeferson S. Cavalcantea,∗, André L.B. de Pontesa, Rovena C.G.J. Engelbertha,Judney C. Cavalcantea, Expedito S. Nascimento Jr. a, Janaína S. Bordaa,Luciana Pinatob, Miriam S.M.O. Costaa, Claudio A.B. de Toledoc
a Laboratory of Chronobiology, Biosciences Center, Federal University of Rio Grande do Norte, 59072-970 Natal, RN, Brazilb Speech-Language and Hearing Therapy Department, São Paulo State University, 17525-900, Marilia, SP, Brazilc Laboratory of Neurosciences, Neuroscience Research Nucleus, City University of São Paulo, 03071-000 São Paulo, SP, Brazil
a r t i c l e i n f o
Article history:Received 30 April 2010Received in revised form 2 October 2010Accepted 28 October 2010
Keywords:Suprachiasmatic nucleusSerotonin receptorCallithrix jacchusPrimateCircadian timing systemSerotonin
a b s t r a c t
Serotonin (5-HT) is involved in the fine adjustments at several brain centers including the core of themammal circadian timing system (CTS) and the hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN). The SCNreceives massive serotonergic projections from the midbrain raphe nuclei, whose inputs are describedin rats as ramifying at its ventral portion overlapping the retinohypothalamic and geniculohypothala-mic fibers. In the SCN, the 5-HT actions are reported as being primarily mediated by the 5-HT1 typereceptor with noted emphasis for 5-HT1B subtype, supposedly modulating the retinal input in a presy-naptic way. In this study in a New World primate species, the common marmoset (Callithrix jacchus), weshowed the 5-HT1B receptor distribution at the dorsal SCN concurrent with a distinctive location of 5-HT-immunoreactive fibers. This finding addresses to a new discussion on the regulation and synchronizationof the circadian rhythms in recent primates.
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The circadian timing system (CTS) is a neural network responsiblefor the generation and modulation of the circadian rhythms. TheCTS of mammals comprises an encephalic circuitry, in the centerof which, the hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN) is con-ceived as the main circadian pacemaker. Along the last decades,the SCN has been investigated in respect to its major hodological,neurochemical, and molecular features [34,37].
The rhythms generated by the SCN are synchronized byenvironmental cues, of which the light/dark cycle is the major syn-chronizing agent. Three main pathways reach the SCN influencingits activity: (1) the retinohypothalamic tract (RHT), from the retinalglutamatergic ganglion cells [7,17,20,26]; (2) the geniculohypotha-lamic tract (GHT) [18], formed by neuropeptide Y-positive fibers[14] from the thalamic intergeniculate leaflet [15]; and (3) theserotonergic midbrain projections from the median raphe nucleus[16,22,25]. In rats, all of these pathways are described as ram-ifying in an overlapping way at the ventral portion of the SCN[16,26,25,35], even though that in a previous study of a New Worldprimate the common marmoset (Callithrix jacchus), serotonergic
∗ Corresponding author at: Department of Physiology, Biosciences Center, FederalUniversity of Rio Grande do Norte, 59072-970 Natal, RN, Brazil.Tel.: +55 84 3215 3409; fax: +55 84 3211 9206.
E-mail address: [email protected] (J.S. Cavalcante).
terminal plexus was described as reaching the most dorsal portionof the SCN in a complementary manner to the ventral RHT and GHTprojections [5,31].
The serotonergic pathway is functionally implicated in bothphotic and non-photic modulation of the SCN [13,23,27,25,28,29].The 5-HT actions are dependent on several serotonergic receptorsubtypes, which can be pre or post-synaptically positioned. To date,the main subtypes of 5-HT receptors found in the SCN, character-ized by biochemical and pharmacological approaches, belong tothe 5-HT1 family [26]. Also, in different species the subtype 5-HT1Bseems to prevail [12,30,33]. 5-HT1B receptors can be found in theaxon terminals of neurons (acting as a presynaptic modulator) orin the postsynaptic cellular membrane [21].
The presence of 5-HT fibers in the dorsal SCN of the marmoset[31] motivated us to search the presence of serotonergic receptorsubtypes in the same species, so that, the aim of this study was toidentify and map the 5-HT1B receptor distribution comparing withserotonergic and retinal innervations.
Four adult male marmosets (257–378 g) from the PrimatologyCenter of the Federal University of Rio Grande do Norte (IBAMAregister 1/24/92/0039-0), Natal, Rio Grande do Norte, Brazil, wereused in this study. The animals were housed under natural lighting,temperature, and humidity conditions, with food and water freelyavailable. The maintenance and minimal use of the experimentalanimals followed the guidelines of the Brazilian Society of Neuro-
0304-3940/$ – see front matter © 2010 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.doi:10.1016/j.neulet.2010.10.070
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science and Behavior under recommendations of the Guide for theCare and Use of Laboratory Animals in Research (in accordance withthe National Institutes of Health, NIH, USA).
The marmosets were deeply anesthetized with sodium thiopen-tal (Cristália, São Paulo, SP, Brazil, 40 mg/kg, i.p.), placed on asurgical table and received a topical application of tetracainehydrochloride in the cornea followed by a unilateral intraocularinjection of cholera toxin subunit B (CTb) (List Biological Lab-oratories, Inc., Campbell, CA, USA). A total of 80 �l of 1 mg/mlaqueous CTb solution containing 10% dimethylsulfoxide was pres-sure injected into the vitreous humor through a 30-gauge needlecatheter attached to a micropump, introducing the solution at arate of 1 �l/min. To minimize reflux and spread of the tracer tothe extraocular muscles and to avoid postoperative local infection,the ocular surface was continuously cleansed with saline duringsurgery. The ocular surface was then rewashed with saline andan antibiotic ointment (Dexafenicol, Alergon, Brazil) was appliedtopically. After 5–7 post-injection days, the marmosets were re-anesthetized with sodium thiopental and transcardially perfusedwith 500 ml of phosphate-buffered saline, pH 7.4, containing 500 IUof heparine (Parinex, Hipolabor, Brazil) followed by 700 ml of 4%paraformaldehyde in 0.1 M phosphate buffer (PB), pH 7.4. Thebrains were removed from the skull, postfixed for 2–4 h and trans-ferred to a solution containing 30% sucrose in PB.
Brain blocks from a point of a few millimeters anterior tothe optic chiasm through the midbrain were frozen and seriallysectioned in the coronal plane (30 �m) on a sliding microtome.Sections were sequentially collected and kept in PB in six sepa-rate compartments. To establish the limits of the SCN, one of thesix series of sections from each animal was stained with thioninand another was submitted to immunohistochemical reaction tocalbindin (CB), a calcium-binding protein, which is reported to be auseful marker for identifying the SCN boundaries in this species [6].Three other series were used for the immunohistochemical detec-tion of the CTb, 5-HT and 5-HT1B receptor. The remaining serieswere used to perform double labeling experiments combining 5-HT1B receptor and CB labels to analyze the arrangement of thisreceptor in relation to the SCN cells and nuclear architecture.
For the immunohistochemical detection of CTb, free floatingbrain sections of the injected animal were incubated for 18 h atroom temperature (ca. 24 ◦C) using goat anti-CTb IgG (List Biolog-ical Labs, Inc., Campbell, CA, USA), diluted at 1:5000, as primaryantibody and 2% of normal donkey serum in 0.4% Triton X-100in PB. The sections were then incubated with a biotinylated sec-ondary antibody (donkey anti-goat IgG, Jackson Labs, Westgrove,PA, USA) diluted at 1:1000 for 90 min. The sections were subse-quently incubated with an avidin–biotin–peroxidase solution (ABCElite kit, Vector Labs., Burlingame, CA, USA) for 90 min. They werethen reacted for peroxidase activity in a solution of diaminobenzi-dine tetrahydrochloride (DAB, Sigma, St Louis, MO, USA) and 0.03%H2O2 in PB. The sections were washed with PB (5 × 5 min) betweeneach step and at the end of the procedure. For detection of theCB, 5-HT and 5-HT1B receptor, the same general procedure wasadopted using as primary antibodies a mouse anti-CB (Sigma, StLouis, 1:5000), a rabbit anti-5HT (Immunostar, Hudson, WI, USA,cat # 20079, 1:5000), a guinea-pig anti-5HT1B (PharMinger, SanDiego, CA, USA, cat # 550470, 1:500) and the respective secondaryantibodies all raising in goat (Jackson Labs, Westgrove, PA, USA,1:1000). All of the incubations with primary antibody included 2%normal goat serum in 0.4% Triton X-100 in PB. Specificity tests andthe controls for the 5-HT label can be found at the company site(www.immunostar.com). The anti-5-HT1B was made in guinea pigusing a synthetic peptide conjugated with bovine thyroglobulincorresponding to amino acids 273–287 with homologue correspon-dence in rodents, canines and primates. As for control procedures,in some sections all the antibodies were used except the primary
antibody, which was substituted by normal serum or by incubationof the secondary antibody only.
For the double labeling experiments, the tissue was simultane-ously incubated with an antibody guinea pig anti-5-HT1B receptor(PharMinger, San Diego, CA, USA) and a mouse-anti-CB (SigmaChemicals, St Louis, MO, USA), both at a dilution of 1:250 during24 h. The labeling was developed using secondary anti-guinea pigfluorescein-labeled and anti-mouse rhodamine-labeled antibodiesall made in donkey (Sigma, St Louis, MO, USA) at a 1:100 dilutionin PB with 0.4% Triton X-100. Proper immunofluorescence con-trols were performed by the omission of the primary and producedlack of label. Material was examined under bright-field illumina-tion in an Olympus microscope for the single-label experimentsand in a Nikon E-800 epifluorescence microscope for the double-label experiments. The images were captured using a CCD camera(Optronics Magnafire, Goleta, CA, USA) and the composite imageswere mounted with the aid of Adobe Photoshop (Adobe Software).The distribution of labeled elements and staining intensity weresubjectively evaluated.
The SCN of the marmoset displays a triangular shape locatedover the optic chiasm bilateral to the third ventricle as evidencedin Nissl-stained coronal sections (Fig. 1A). The SCN CB-containingneurons exhibit a clear label with visible and well delimited cellbodies containing some apparent neuropil contrasting with adja-cent hypothalamic areas (Fig. 1B). Retinal CTb-immunoreactivefibers in the common marmoset SCN were visualized in an unam-biguous placement at its entire ventral portion with a noticeableenlargement in the middle portion (Fig. 1C). This pattern appearsto be consistent from rostral to caudal levels showing a slightdecrease in intensity as the SCN extends toward the caudal direc-tion. Fine 5-HT-immunoreactive fibers/terminals were identifiedin an apparently scattered distribution in the SCN of the mar-moset (Fig. 1D). However, a more detailed observation shows thatthese 5-HT positive fibers exhibit a preferential distribution medi-ally around the ventricle wall at the upper dorsal limit of the SCN(Fig. 1D). In general, the disposition of the CTb-containing fibersoverlap the 5-HT containing fibers on the ventral portion of theSCN, but the site of CTb exuberance coincides with the absence of5-HT in an apparent complementary position in relation to RHT.As for CTb, the 5-HT immunopattern appears to be constant fromrostral to caudal levels showing a slight decrease in intensity as theSCN moves toward the caudal position.
5-HT1B immunoreactive (5-HT1B-IR) neurons show a broad andapparent and homogeneous distribution in the hypothalamus ofthe marmoset (Fig. 2A). In the entire rostro-caudal SCN the distri-bution for the 5-HT1B-IR was more evident dorsally concentrated inthe medial contour near the ventricle wall, corresponding to higherconcentration of 5-HT innervation and letting an immunoreactivefree zone, which corresponds to the location of the bulk of RHTfibers (Fig. 2B and C). Most of the CB-positive neurons of the dorsaldistrict appear to be encircled by the dotted 5-HT1B label (Fig. 2Dand E).
The 5-HT1B immunoreactivity pattern in the SCN differs fromthat of midbrain, which resembles postsynaptic neurons or autore-ceptors since they appear to immunolabel the entire cell in thedorsal raphe nucleus used now as a positive control label (Fig. 3Aand B). No label was observed in the control experiments (Fig. 3Cand D). For all parameters evaluated the results were similar in allcases with only minor variations.
Evidences implicating 5-HT as a key neurotransmitter modu-lating the effects of light on circadian rhythmicity is recurrent. Forexample, the depletion of serotonergic input to the SCN of rodentsprovokes a change of the circadian rhythms with an elongationof the activity phase and disruption in constant light [22] and itwas proposed that this effect was mainly mediated by the 5-HT1Breceptor [30]. This subtype was observed to be associated with the
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Fig. 1. Digital images of coronal sections at hypothalamic level of the marmoset brain showing (A) the triangular shaped SCN at Nissl stained sections; (B) CB-immunostainedneurons filling all sectional area of the SCN; (C) distribution of CTb-retinal projections in the ventral portion (arrows) of the SCN; (D) 5-HT positive fibers ramifying in themedial and dorsal SCN, depriving the ventral area (arrows). The upper image in B (B′) is a detail of the CB-positive labeling in the SCN. Note the rounded nature of the smallneurons (average of 10 �m). 3v, third ventricle; oc, optic chiasm. Scale bar: 180 �m in A, 100 �m in B–D, 50 �m in B′ .
Fig. 2. Digital images of coronal sections of the marmoset brain at the SCN level showing (A) 5-HT1B-immunoexpression in all anterior hypothalamus, including the SCN;(B) higher magnification of A showing 5-HT1B-positive structures with the dorsal portion containing the richest labeling (arrows); (C) higher magnification of the regiondelimited by arrows in B showing the typical dot-like label pattern of 5-HT1B; (D) the merged exposure of CB-containing neurons visualized by TRITC-conjugated secondaryantiserum (red) and 5-HT1B-positive structures detected by FITC-conjugated secondary anti-serum (green); (E) higher magnification of the neurons indicated by arrows inD. APL, preoptic lateral area; APM, preoptic medial area. Scale bar: 200 �m in A, 100 �m in B, 70 �m in C and D, 15 �m in E. (For interpretation of the references to color inthis figure legend, the reader is referred to the web version of the article.)
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Fig. 3. Digital images of coronal sections of the marmoset brain showing 5-HT1B label in DRN neurons (A) delimiting the neuronal body better evidenced at high magnification(B). Absence of labeling was evidenced in control experiments at DRN (C) and SCN (D). AMe, mesencephalic aqueduct. Scale bar: 200 �m in A and C, 30 �m in B, 100 �m in D.
membrane of retinal terminals in the SCN suggesting that by thispresynaptic mechanism 5-HT can modify the response of the SCNto light [30,29]. More recently, 5-HT1B binding sites were massivelyidentified in nonretinal terminals in the SCN, and combined phar-macological and electrophysiological assays indicated that thesereceptors could be actually located on GABAergic terminals [3].Thus, the 5-HT1B influence on SCN neurons activity might be pro-vided by inhibition of a GABA release in an intrinsic circuitry, mostlikely in the vicinity of afferent retinal fibers.
Currently it is assumed that there be a correlation between 5-HTand RHT innervations with 5-HT1B in the ventral SCN, but in thisstudy we identified the occurrence of 5-HT1B receptors in the SCNof the common marmoset more concentrated in the dorsal portionconcurrent with the predominant location of 5-HT immunoreactiveterminals. Our present experimental approach does not allow us todetermine the precise elemental location of 5-HT1B receptors, butour data indicate that they could be acting as a presynaptic mod-ulator like in rodents. Thus, 5-HT1B immunoreactivity seeminglyaround the cell body together with the lack of cytosolic label andthe absence of membrane contour strongly suggest its presynapticposition. Furthermore, the dot-like appearance and the topogra-phy of the 5-HT1B immunoreactivity coincide with the presence of5-HT terminal fibers. We observed that, although scarce, 5-HT1B-immunoreactivity was also detected in the marmoset ventral SCN,and we speculate that they are connected with putative GABAer-gic ventral interneurons as reported in rodents [3]. However, itmust be pointed out that the predominant labeling of the non-retinorecipient dorsal SCN be a remarkable difference in our results.At this time we are unable to provide a definitive explanation forthis finding, however, it is possible that in the marmoset the 5-HTmodulates the SCN in an alternative way, in that we cannot dis-card a non-photic role. Pharmacological manipulation suggests theparticipation of the 5-HT1A and 7 subtypes in the phase advancein behavioral circadian rhythms in hamster [8,24] that was inde-pendent of light inputs. This also reinforces the participation ofadditional subtypes conveying the 5-HT transmission [2].
In addition to the median raphe nucleus (MRN)–SCN pathway,the dorsal raphe nucleus (DRN) projects to the IGL (DRN-IGL path-
way) and these two pathways appear to exhibit different functionalattributes in the mammal CTS. 5-HT fibers from the MRN facilitatingthe synchronization of the animal to the light–dark cycle and thedisruption of the DRN-IGL do not influence this response [22]. Thereception of photic information by the raphe mesencephalic com-plex through the retinal projections is well characterized and fullyrecognized in some species [9–11] attributing to this system a piv-otal role for 5-HT in circadian rhythmicity by indirect modulationin response to light [23,27,28]. Furthermore, some data show thatthe function of 5-HT in circadian rhythmicity goes beyond the lightresponse. This includes participation in sleep–wake cycle controland food synchronization suggesting that the serotonergic systemtakes part in the general organization of the photic-independentmechanism [13,29]. The well-known rhythmic discharge rate of theraphe neurons may have a tonic influence on the CTS, besides thelight influence. We also cannot visualize if the double shaped 5-HTinnervation in the marmoset SCN (present study) comes from dis-tinct raphe nuclei. Whereas we cannot provide a prompt responsefor that, it is already known that 5-HT receptors immunoreactivityshow a circadian rhythm in its expression in different rat brain areas[1], as well as the 5-HT levels as a neurotransmitter, verified both inthe raphe complex [32] and in the innervation over the SCN [4]. TheSCN also exhibits an inherent capability to respond to the light–darkcycle [36], which reinforces the power of intrinsic SCN circuitriesin order to maintain and adjust endogenous rhythmicity accordingto environmental clues, not always exclusively light-dependent.Lesions in the MRN and DRN or the use of serotonergic blockersproduce similar alterations in their targets, such as a loss of inhibi-tion and increased discharge of SCN neurons [3,30]. In agreementwith this, 5-HT1B knockout mice display altered photic synchro-nization and a reduced but not abolished light-induced phase shift[33].
Until now, the occurrence of 5-HT1B has been more linked toventral SCN serotonergic innervation, and in our data we showthat in the marmoset this receptor appears to be preferentially dis-tributed on CB-enriched neurons in the medio-dorsal portion of theSCN. Even though the functional significance remains unknown, ourdata imply that the 5-HT1B may influence the dorsal SCN seroton-
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ergic path, raising the possibility of a parallel feature in humans.The 5-HT1B has been the focus of clinical studies on psychoso-matic pathologies related to biological rhythms. An example is theseasonal affective disorder that affects patients living in short dayregions being consequently exposed to little sunlight [19]. Under-standing the functional attributes of 5-HT1B in the CTS seems tobe essential for investigation and possible future pharmacologicmanagement of these disorders.
Acknowledgements
This study was supported by CNPq, CAPES, PROPESQ-UFRN andFAPESP.
References
[1] J. Akiyoshi, H. Kuranaga, K. Tsuchiyama, H. Nagayama, Circadian rhythm ofserotonin receptor in rat brain, Pharmacol. Biochem. Behav. 32 (1989) 491–493.
[2] M.A. Belenky, G.E. Pickard, Subcellular distribution of 5-HT1B and 5-HT7 recep-tors in the mouse suprachiasmatic nucleus, J. Comp. Neurol. 432 (2001)371–388.
[3] J.R. Bramley, P.J. Sollars, G.E. Pickard, F.E. Dudek, 5-HT1B receptor-mediatedpresynaptic inhibition of GABA release in the suprachiasmatic nucleus, J. Neu-rophysiol. 93 (2005) 3157–3164.
[4] F.R.A. Cagampang, S.-I.T. Inouye, Diurnal and circadian changes of serotonin inthe suprachiasmatic nuclei: regulation by light and an endogenous pacemaker,Brain Res. 639 (1994) 175–179.
[5] J.S. Cavalcante, A.S. Alves, M.S.M.O. Costa, L.R.G. Britto, Differential distributionof afferents containing serotonin and neuropeptide Y within the marmosetsuprachiasmatic nucleus, Brain Res. 927 (2002) 200–203.
[6] J.S. Cavalcante, L.R.G. Britto, C.A.B. Toledo, E.S. Nascimento Jr., R.R.M. Lima, A.L.B.Pontes, M.S.M.O. Costa, Calcium-binding proteins in the circadian centers of thecommon marmoset (Callithrix jacchus) and the rock cavy (Kerodon rupestris)brains, Brain Res. Bull. 76 (2008) 354–360.
[7] M.S.M.O. Costa, U.R. Santee, J.S. Cavalcante, P.R.A. Moraes, N.P. Santos, L.R.G.Britto, Retinohypothalamic projections in the common marmoset (Callithrixjacchus): a study using cholera toxin subunit B, J. Comp. Neurol. 415 (1999)393–403.
[8] R.A. Cutrera, M. Saboureau, P. Pévet, Phase-shifting effect of 8-OH-DPAT, a5-HT1A/5-HT7 receptor agonist, on locomotor activity in golden hamster inconstant darkness, Neurosci. Lett. 210 (1996) 1–4.
[9] K.V. Fite, S. Janusonis, Retinal projections to the dorsal raphe nucleus in theChilean degus (Octodon degus), Brain Res. 895 (2001) 139–145.
[10] K.V. Fite, S. Janusonis, W. Foote, L. Bengston, Retinal afferents to the dor-sal raphe nucleus in rats and Mongolian gerbils, J. Comp. Neurol. 414 (1999)469–484.
[11] R. Frazão, L. Pinato, A.V. Silva, L.R.G. Britto, J.A. Oliveira, M.I. Nogueira, Evidenceof reciprocal connections between the dorsal raphe nucleus and the retina inthe monkey Cebus apella, Neurosci. Lett. 430 (2008) 119–123.
[12] M.L. Garabette, K.F. Martin, P.H. Redfern, Circadian variation in the activity ofthe 5-HT1B autoreceptor in the region of the suprachiasmatic nucleus, mea-sured by microdialysis in the conscious freely moving rat, Br. J. Pharmacol. 131(2000) 1569–1576.
[13] J.D. Glass, G.H. Grossman, L. Farnbauch, L. DiNardo, Midbrain raphe modula-tion of nonphotic circadian clock resetting and 5-HT release in the mammaliansuprachiasmatic nucleus, J. Neurosci. 23 (2003) 7451–7460.
[14] M.E. Harrington, D.M. Nance, B. Rusak, Neuropeptide, Y immunoreactivityin the hamster geniculo-suprachiasmatic tract, Brain Res. Bull. 15 (1985)465–472.
[15] M.E. Harrington, D.M. Nance, B. Rusak, Double-labeling of neuropeptide Yimmunoreactive neurons which project from the geniculate to the suprachias-matic nucleus, Brain Res. 410 (1987) 275–282.
[16] A. Hay-Schmidt, N. Vrang, P.J. Larsen, J.D. Mikkelsen, Projections from the raphenuclei to the suprachiasmatic nucleus of the rat, J. Chem. Neuroanat. 25 (2003)293–310.
[17] E. Hendrickson, N. Wagoner, W.M. Cowan, An autoradiographic and elec-tron microscopic study of retino-hypothalamic connections, Z. Zellforsch. 135(1972) 1–26.
[18] T.L. Hickey, P.D. Spear, Retinogeniculate projections in Hooded and Albino rats:an autoradiographic study, Exp. Brain Res. 24 (1976) 523–529.
[19] J. Lewy, R.L. Sack, L.S. Miller, T.M. Hoban, Antidepressant and circadian phase-shifting effects of light, Science 235 (1987) 352–354.
[20] R.F. Johnson, L.P. Morin, R.Y. Moore, Retinohypothalamic projections in thehamster and rat demonstrated using cholera toxin, Brain Res. 462 (1988)301–312.
[21] S.W. Johnson, N.B. Mercuri, R.A. North, 5-Hydroxytryptamine (1B) receptorsblock the GABA (B) synaptic potential in rat dopamine neurons, J. Neurosci. 12(1992) 2000–2006.
[22] E.L. Meyer-Bernstein, L.P. Morin, Differential serotonergic innervations of thesuprachiasmatic nucleus and the intergeniculate leaflet and its role in circadianrhythms modulation, J. Neurosci. 16 (1996) 2097–2111.
[23] J.D. Miller, C.A. Fuller, The response of suprachiasmatic neurons of the rathypothalamus to photic and serotonergic stimulation, Brain Res. 515 (1990)155–162.
[24] E.M. Mintz, C.F. Gillespie, C.L. Marvel, K.L. Huhman, H.E. Albers, Serotonergicregulation of circadian rhythms in Syrian hamsters, Neuroscience 79 (1997)563–569.
[25] L.P. Morin, Serotonin and the regulation of mammalian circadian rhythmicity,Ann. Med. 31 (1999) 12–33.
[26] L.P. Morin, C.N. Allen, The circadian visual system, 2005, Brain Res. Rev. 51(2006) 1–60.
[27] L.P. Morin, J. Blanchard, Depletion of brain serotonin by 5,7-DHT modifies ham-ster circadian rhythm response to light, Brain Res. 566 (1991) 173–185.
[28] G.E. Pickard, M.A. Rea, TFMPP, a 5HT1B receptor agonist, inhibits light-inducedphase shifts of the circadian activity rhythm and c-Fos expression in the mousesuprachiasmatic nucleus, Neurosci. Lett. 231 (1997) 95–98.
[29] G.E. Pickard, M.A. Rea, Serotonergic innervations of the hypothalamic suprachi-asmatic nucleus and photic regulation of circadian rhythms, Biol. Cell 89 (1997)513–523.
[30] G.E. Pickard, B.N. Smith, M. Belenky, M.A. Rea, F.E. Dudek, P.J. Sollars, 5-HT1B
receptor-mediated presynaptic inhibition of retinal input to the suprachias-matic nucleus, J. Neurosci. 19 (1999) 4034–4045.
[31] L. Pinato, W. Allemandi, L.K. Abe, R. Frazão, R.J. Cruz-Rizzolo, J.S. Cavalcante,M.S.M.O. Costa, M.I. Nogueira, A comparative study cytoarchitecture and sero-tonergic afferents in the suprachiasmatic nucleus of primates (Cebus apella andCallithrix jacchus) and rats (Wistar and Long Evans strains), Brain Res. 1149(2007) 101–110.
[32] L. Pinato, Z.S. Ferreira, R.P. Markus, M.I. Nogueira, Bimodal daily variation inthe serotonin content in the raphe nuclei of rats, Biol. Rhythms Res. 35 (2004)245–257.
[33] P.J. Sollars, A.M. Simpson, M.D. Ogilvie, G.E. Pickard, Light-induced Fos expres-sion is attenuated in the suprachiasmatic nucleus of serotonin 1B receptorknockout mice, Neurosci. Lett. 401 (2006) 209–213.
[34] H. Ukai, H.R. Ueda, System biology of mammalian circadian clocks, Annu. Rev.Physiol. 72 (2010) 579–603.
[35] N. Van Den Pol, K.L. Tsujimoto, Neurotransmitters of the hypothalamicsuprachiasmatic nucleus: immunocytochemical analysis of 25 neuronal anti-gens, Neuroscience 15 (1985) 1049–1085.
[36] H.T. VanderLeest, J.H.T. Rohling, S. Michel, J.H. Meijer, Phase shifting capacityof the circadian pacemaker determined by the SCN neuronal network organi-zation, PLoS One 4 (2009) e4976.
[37] D.R. Weaver, The suprachiasmatic nucleus: a 25-year retrospective, J. Biol.Rhythms 13 (1998) 100–112.
Psychology & Neuroscience, 2010, 3, 2, 217 - 228DOI: 10.3922/j.psns.2010.2.011
PSYCHOLOGY NEUROSCIENCE
Serotonin and circadian rhythmsAndré Luiz Bezerra de Pontes1, Rovena Clara Galvão Januário Engelberth1, Expedito da Silva Nascimento, Jr.1, Judney Cley Cavalcante1, Miriam Stela Maris de Oliveira Costa1, Luciana Pinato2, Claudio Antonio Barbosa de Toledo3 and Jeferson de Souza Cavalcante1
1- Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
2- Universidade Estadual Paulista., Marília, SP, Brazil
3- Universidade da Cidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brazil
AbstractAll mammal behaviors and functions exhibit synchronization with environmental rhythms. This is accomplished through an internal mechanism that generates and modulates biological rhythms. The circadian timing system, responsible for this process, is formed by connected neural structures. Pathways receive and transmit environmental cues to the central oscillator, the hypothalamic suprachiasmatic nucleus, which mediates physiological and behavioral alterations. The suprachiasmatic nucleus has three major inputs: the retinohypothalamic tract (a direct projection from the retina), the geniculohypothalamic tract (an indirect photic projection originating in the intergeniculate leaflet), and a dense serotonergic plexus from the raphe nuclei. The serotonergic pathway, a source of non-photic cues to the suprachiasmatic nucleus, modulates its activity. The importance of raphe nuclei in circadian rhythms, especially in photic responses, has been demonstrated in many studies. Serotonin is the raphe neurotransmitter that triggers phase shifts, inhibits light-induced phase-shifts, and plays a role in controlling the sleep-wake cycle. All data to date have demonstrated the importance of the raphe, through serotonergic afferents, in adjusting circadian rhythms and must therefore be considered a component of the circadian timing system. The aim of this paper is to review the literature addressing the involvement of serotonin in the modulation of circadian rhythm. Keywords: raphe, circadian timing system, serotonin, circadian rhythm, suprachiasmatic nucleus.
Received 15 October 2010; received in revised form 20 November 2010; accepted 20 November 2010. Available on line 28 December 2010
André Luiz Bezerra de Pontes, Rovena Clara Galvão Januário Engelberth, Expedito da Silva Nascimento Jr., Judney Cley Cavalcante, Miriam Stela Maris de Oliveira Costa, Jeferson de Souza Cavalcante, Laboratory of Chronobiology, Biosciences Center, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Natal, RN 59072-970, Brazil. Luciana Pinato, Speech-Language and Hearing Therapy Department, Universidade do Estado de São Paulo, Marilia, SP 17525-900, Brazil. Claudio Antonio Barbosa de Toledo, Laboratory of Neurosciences, Neuroscience Research Nucleus, City University of São Paulo, São Paulo, SP 03071-000, Brazil. Correspondence regarding this article should be directed to: Jeferson S. Cavalcante, Department of Physiology, Biosciences Center, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN 59072-970, Brazil. Tel: +55-84 3215-3409. Fax: +55-84-3211-9206. E-mail: [email protected]
Biological rhythms
Biological rhythms, which are endogenously generated, are sensitive to environmental information that allows live organisms to maintain a stable phase relationship with its environmental cycle, thereby adjusting the physiological variables needed for survival. When this relationship is established, the organism is considered synchronized to the environment (Marques, Golombeck, & Moreno,
2003). The circadian rhythms are the most widely known and studied biological rhythms in terms of generation and modulation. They exhibit 24 h cycles and maintain stable phase relationships with the light/dark cycle, such as the sleep/wake cycle, locomotor activity rhythm, and the secretion rhythm of various hormones (Rotenberg, Marques, & Menna-Barreto, 2003).
Circadian timing system
For an organism to establish an internal timing order, it must receive environmental information, process it, and send a response to such stimuli. These functions are performed by the circadian timing system (CTS), composed of a network of interconnected neural structures. The CTS is responsible for generating and modulating biological rhythms. The CTS of mammals has three main components: an afferent pathway (also called the primary synchronizing pathway, which receives information from the environment), a central clock responsible for generating circadian oscillations, and efferent pathways (through which the CTS communicates with behavioral and physiological effectors and through which the
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pacemaker regulates the expression of rhythms (Rusak & Zucker, 1979; Moore-Ede, Sulzman, & Fuller, 1982; Morin, 1994; Miller, Morin, Schwartz, & Moore, 1996; Moore, 1999; Cavalcante, Nascimento Jr., & Costa, 2006; Golombek & Rosenstein, 2010) (Figure 1).
Suprachiasmatic nucleusThe ventral hypothalamus contains a set of cells
bilateral to the third ventricle, dorsal to the optic chiasm, called the suprachiasmatic nucleus (SCN) (Fig. 2). Because of its hypothalamic location and pattern of inputs and outputs, the SCN functions as a central CTS pacemaker, widely known as a “biological clock,” in mammals. This term originated in studies from the 1970s when Moore and Lenn (1972) described the retinohypothalamic tract (RHT), which extends from the retina to the SCN, and in subsequent studies demonstrating the importance of this pathway for synchronization. The evidence discovered by Moore and Lenn (1972) showed that synchronization to the light/dark cycle occurred through the retina and was mediated by the SCN. Since then, the SCN has been the focus of continuing studies seeking to explain its function in synchronization mechanisms. These studies involved lesion techniques (Moore & Eichler, 1972; Stephan & Zucker, 1972), electrophysiology (Gillette, 1991), metabolism (Schwartz, 1991), and fetal tissue transplantation (Ralph, Foster, Davis, & Menaker, 1991), in addition to neurochemical (Costa et al., 1998; Ramanathan, Nunez, Martinez, Schwartz & Smale, 2006; Morin, 2007; Cavalcante et al., 2008; Nascimento Jr, Cavalcante, Cavalcante & Costa 2010; Nascimento et al., 2010) and molecular studies (Ukai & Ueda, 2010).
Studies that characterize neurochemical content show the existence of neuronal subpopulations within the SCN. A ventrolateral subpopulation receives direct projections from the retina through the RHT and from the thalamus through the geniculohypothalamic tract (GHT) and produces vasoactive intestinal polypeptide (VIP) as neurotransmitter.
The dorsomedial subpopulation, which receives very few fibers from the RHT and GHT, produces vasopressin (VP) (Moore, 1993). This neurochemical characterization exhibits phylogenetic conservation, and these subpopulations are found in nearly all of the species studied (Cassone, Speh, Card, & Moore, 1988; Wang et al., 1997; Costa et al., 1998; Goel, Lee, & Smale, 1999; Smale & Boverhof, 1999).
Intergeniculate leafletThe SCN was considered the central pacemaker of
circadian rhythmicity, but in the 1970s another component of the system was reported. Based on 3H-amino acid injection and autoradiographic development techniques, a number of laboratories described a thalamic projection to the SCN in rats and cats. This projection originates in the lateroventral geniculate nucleus (Swanson, Cowan, &
Figure 1. Illustrative schematic showing the main components and connections of the circadian system of mammals.
Figure 2. Digital images of coronal sections of Nissl staining of suprachiasmatic nuclei in the (A) mouse, (B) rat, (C) rock cavy, and (D) marmoset monkey. 3v, third ventricle; oc, optic chiasm. Scale bar = 150 µm in (A), (B), and (C). Scale bar = 80 µm in (D). Digital images made in the Neuroanatomy Laboratory, Federal University of Rio Grande do Norte.
Serotonin and circadian rhythms 219
Jones, 1974; Riback & Peters, 1975). Hickey and Spear (1976) used the retinal projection pattern to describe another structure in the lateral geniculate complex of the thalamus, the intergeniculate leaflet (IGL), a thin layer of cells located between the dorsal and ventral geniculate nucleus (Fig. 3). This study showed that the IGL receives bilateral retinal innervation. Neurochemical approaches have also been used to study the IGL. Other authors have reported that the IGL contains neuropeptide Y (NPY)-producing neurons that project to the SCN (Card & Moore, 1984; Harrington, Nance, & Rusak 1985, 1987). The phase advances observed after NPY microinjections in the SCN during the subjective day suggested that this peptide was related to rhythmicity modulation (Moore, Gustafson, & Card, 1984; Albers, Ferris, Leeman, & Goldman, 1984).
Synchronizing pathwaysFor the SCN to be able to generate or synchronize
circadian rhythms, environmental and physiological information uptake is necessary. This information is transmitted by synchronization pathways (afferent pathways). Three main synchronization pathways are characteristically found. One pathway, the RHT, originates in retinal ganglion cells, providing information on the light/dark cycle (Moore & Lenn, 1972; Moore, 1973; Johnson, Morin, & Moore, 1988; Levine, Weiss, Rosenwasser, & Miselis, 1991; Moga & Moore, 1997; Goel et al., 1999; Costa et al., 1999; Cavalcante, Alves, Costa, & Britto, 2002; Nascimento Jr., 2010). A second pathway, the GHT, which originates in the IGL, is the indirect conductor of photic information (Harrington et al., 1987; Moga & Moore, 1997), performing its function through NPY (Harrington et al., 1985). The third pathway originates in the mesencephalic nuclei of the raphe, exerting its action through serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) (Ueda et al., 1983; Moga & Moore, 1997; Cavalcante et al., 2002; Hay-Schmidt, Vrang, Larsen, & Mikkelsen, 2003). This last synchronizing pathway of the SCN is the main focus of the present paper. It is inferred from observing serotonergic terminals in the SCN (Moore, Halaris, & Jones, 1978; Ueda et al., 1983; van den Pol & Tsujimoto, 1985; Moore & Speh, 2004). Detailed studies of this projection were then conducted, starting with autoradiographic studies showing the dorsal and median raphe nuclei (Fig. 4) as being sources of this innervation (Azmitia & Segal, 1978; Moore & Speh, 2004). However, later studies show that the dorsal nucleus projects to the IGL (Moga & Moore, 1997; Hay-Schmidt et al., 2003). Serotonin released by these nuclei intermediates the photic information that enters the SCN.
Raphe and serotonin
The set of neuronal clusters occupying the median line of the brainstem extends rostrocaudally between the interpeduncular nucleus in the mesencephalon and the decussation of pyramids in the medulla. The
Figure 3. Digital images of coronal sections of Nissl staining of intergeniculate leaflet nuclei in (A) mouse and (B) rat (stippled line) and (C) pregeniculate nucleus in marmoset monkey (stippled line), the structural homolog to the IGL in rodents. cp, cerebral penducle; DGL, dorsal geniculate lateral nucleus; VGL, ventral geniculate lateral nucleus; IGL, intergeniculate leaflet; PGN, pregeniculate nucleus. Scale bar = 150 µm in (A) and (B). Scale bar = 230 µm in (C). Digital images made in the Neuroanatomy Laboratory, Federal University of Rio Grande do Norte.
term “raphe” derives from the French raphé, meaning suture, and illustrates well the location of these nuclei. The studies in this area began when Ramon and Cajal
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described the cells of the brainstem, such as large multipolar neurons, with uncertain projections (for review, see Jacobs & Azmitia, 1992). Interest increased when Dahlström and Fuxe (1964) described the presence of a monoaminergic neuronal system in the brainstem, showing a chain of catecholaminergic and serotonergic neurons. These authors suggested the designation of B1 to B9 in sequence caudal-rostral to the serotonergic nuclei. Further studies using immunohistochemical techniques allowed a better delineation of the raphe nuclei, detailing the serotonergic system (Brodal, Taber, & Walberg 1960a, b; Taber, Brodal & Walberg, 1960; Taber, 1961; Felten & Cummings, 1979; Törk, 1985).
Representatives of all animal phyla that possess a nervous system exhibit serotonergic neurons. Along the phylogenetic scale, this molecule can act as a neurotransmitter, neuromodulator, or neurohormone regulating different behaviors. Characterization of 5-HT function appears to be more easily established in invertebrate species, whereas this amine is involved in more complex processes in vertebrates.
In coelenterates, one of the simplest systems that exhibit a nervous system, 5-HT appears to be involved in sensitivity, thus aiding locomotion in the animal (Anctil, 1989; Umbriaco, Anctil, & Descarries, 1990). In platyhelminths, 5-HT-containing neurons are found in the central and peripheral nervous systems, controlling muscle contraction (Welsh, 1970; Halton, Maule, Johnston, & Fairweather, 1987; Maule, Halton, Allen, & Fairweather, 1989). One species of platyhelminths, Diclidophora merlangi, has gender-specific serotonergic innervation in the male reproductive system, suggesting the control of sexual behavior (Maule, Halton, Johnston, Shaw, & Fairweather, 1990). A nematode widely used as a model for studying the nervous system, Caenorhabditis elegans, shows two serotonergic groups of neurons which are known as pharyngeal neurosecretory motor neurons that act by controlling feeding, locomotor activity, and sexual behavior (Horvitz, Chalfie, Trent, Sulston, & Evans, 1982). The Aplysia californica, a mollusk species, has two large serotonergic groups of neurons in the cerebral ganglia that act on feeding behavior (Kupfermann & Weiss, 1981). Serotonin in A. californica also plays a role on defensive behavior by modulating the muscle contraction of the withdrawal reflex (Glanzman et al., 1989; Hawkins & Schacher, 1989). In annelids, serotonergic neurons project peripherally, acting as neurohormones controlling feeding behavior (Willard, 1981; Lent & Dickinson, 1984). In lobsters, representatives of arthropods, 5-HT acts on the modulation of aggressive behavior that establish the relationships of dominance and subordination in social groups of animals (Beltz & Kravitz, 1983). Serotonin also controls posture in lobsters and affects the circulatory system and digestive tract (Pasztor & Bush, 1987; Battelle & Kravitz, 1978). Serotonin is
also found in echinoderms. In sea urchins, for example, it is mainly found in the larval stages, controlling the contraction and therefore mobility of larva (Bisgrove & Burke, 1986; Gustafson, Lundgren, & Treufeldt, 1972). In chordates, serotonergic neurons are organized in clusters that project for the entire central nervous system and peripheral organs, controlling a multitude of behaviors and neuroendocrine and cognitive functions (Tork & Hornung, 1990). In this review, we focus on the role of 5-HT in biological rhythms in vertebrates.
A large proportion of neurons in the raphe system are 5-HT producers (Fig. 4). Nearly all 5-HT found in the central nervous system is produced in the raphe. Other neurotransmitters are produced in the raphe and may be co-localized with 5-HT. It also contains an extensive network of efferents, which explains why serotonergic terminals are found throughout the central nervous system, although this distribution varies for each area (Törk, 1985). The serotonergic system of the raphe is found in vertebrate species, although 5-HT is also found in invertebrates. The morphology of the raphe complex shows little variation in vertebrates (Törk, 1985). A wide variation in raphe nucleus terminology has been used over the years, but the system developed by Paxinos and Watson (1982) is currently used by most researchers.
The raphe and circadian rhythmicity
The raphe complex is considered a modulating component of circadian rhythmicity through serotonergic afferents sent to the SCN and IGL, whereas 5-HT is mainly responsible for CTS sensitivity to light.
Figure 4. Digital images of coronal sections showing 5-HT-immunoreactive neurons in the dorsal raphe nucleus in (A) rat, (B) median raphe nucleus in rat, (C) dorsal raphe nucleus in marmoset monkey, and (D) median raphe nucleus in marmoset monkey. DRN, dorsal raphe nucleus; MRN, median raphe nucleus; FLM, medial longitudinal fascicule. Scale bar = 150 µm in (A). Scale bar = 90 µm in (B), (C), and (D). Digital images made in the Neuroanatomy Laboratory, Federal University of Rio Grande do Norte.
Serotonin and circadian rhythms 221
This system must exhibit many characteristics to be considered a modulating component of rhythmicity, such as receiving retinal inputs, having connections with the SCN (and/or IGL), displaying circadian functions, and containing lesions that impair the maintenance of circadian rhythms. Ample evidence suggests that raphe nuclei are components of the CTS.
Retinal afferents to the rapheAlthough rarely studied, the retinal projection to
the DRN has been described since the 1970s in cats (Foote, Taber-Pierce, & Edwards, 1978). Anterograde tracers injected into the rat retina showed retinal terminals in the most rostral portion of the DRN (Kawano, Decker, & Reuss, 1996). Subsequent studies showed retinal terminals in the lateral portion of the DRN in rats (Fite et al., 1999). In gerbils (Meriones unguiculatus), extensive arborization of retinal terminals was observed in this nucleus (Fite, Janušonis, Foote, & Bengston, 1999). Data also showed that retinal ganglion cells projecting to the DRN are partially the same cells that project to the lateral geniculate complex of the thalamus (Fite, Birkett, Smith, Janušonis, & McLaughlin, 2003). In another rodent, Octodon degus, the retinal projection is concentrated in the dorsomedial and lateral portions of the DRN, with contralateral predominance (Fite & Janušonis, 2001). In Cebus apella, a New World primate, a direct retinal projection to the DRN was also described (Frazão et al., 2008). Information from the retina may act on serotonergic DRN neuronal activity. Although this issue is still unclear, recent studies have sought to clarify the function of this innervation. For example, photostimulation with low-frequency light led to reduced c-fos expression in the DRN of gerbils during the light phase of an artificial light/dark cycle (Fite, Wu, & Bellemer, 2005). These results illustrate the importance of the retinal pathway for DRN neuronal activity.
Connections with the SCN and IGLSeveral studies show efferent projections from
the raphe to the SCN. However, nearly all of these studies are based on descriptions of serotonergic terminals found in the SCN (Fig. 5). In most of the species studied, the serotonergic inputs in the ventral portion of the SCN overlap with retinal terminals (Card & Moore, 1984; van den Pol & Tsujimoto, 1985; Cassone et al., 1988; Moore & Speh, 2004). A New World primate (Callitrhix jacchus) shows a different serotonergic innervation pattern. This projection is concentrated in the dorsal portion of the SCN (Cavalcante et al., 2002; Pinato et al., 2007). The New World primate Cebus apella also does not exhibit well-defined organization of serotonergic terminals in the SCN (Pinato et al., 2007).
Reporting the presence of serotonergic terminals only partially solves the problem. The source of 5-HT found in the SCN must also be determined. After injection of Phaseolus vulgaris leucoagglutinin
Figure 5. Digital images of coronal sections showing 5-HT-immunoreactive fibers/terminals in suprachiasmatic nuclei in (A) mouse, (B) rat, and (C) marmoset monkey. 3v, third ventricle; oc, optic chiasm; SCN, suprachiasmatic nuclei. Scale bar = 150 µm in (A) and (B). Scale bar = 80 µm in (D). Digital images made in the Neuroanatomy Laboratory, Federal University of Rio Grande do Norte.
Pontes et al222
(PHAL), an anterograde tracer, into the median raphe nucleus (MRN), PHAL-immunoreactive (IR) fibers can be visualized in the ventral portion of the SCN (Meyer-Bernstein & Morin, 1996; Hay-Schmidt et al., 2003). When the cholera toxin B subunit (CTb) is injected into the SCN, CTb-IR neurons are observed throughout the MRN, as well as in cells in the MRN and nucleus raphe obscurus (NRO) (Hay-Schmidt et al., 2003). Furthermore, electrostimulation of raphe nuclei causes an increase in 5-HT content in the SCN and IGL (Dudley, Dinardo, & Glass, 1999).
Studies have also reported serotonergic projections to the IGL (Moore et al., 1978; Mantyh & Kemp, 1983). These findings were confirmed in later experiments using a neuronal tracing technique. After injection of PHAL into the DRN, PHAL-IR terminals were found in the IGL and ventral lateral geniculate nucleus. When this tracer was injected into the IGL, CTb-IR neurons were observed in the DRN (Meyer-Bernstein & Morin, 1996). The serotonergic projection that reaches the SCN clearly originates in the MNR, whereas the serotonergic terminals found in the IGL derive from the DRN (Meyer-Bernstein & Morin, 1996).
Circadian patterns in the rapheThe raphe also displays its own circadian
characteristics, such as tryptophan hydroxylase (TpH) concentration within the nucleus. This enzyme is a limiting factor in the formation of 5-HT. The peak expression of TpH is observed in the dark phase in animals maintained under an artificial light/dark cycle. The same profile is observed if animals are exposed to constant light conditions. Peak TpH activity in rats maintained in constant darkness occurs in the middle of the animal’s subjective night (Malek, Pevet, & Raison, 2004). Given the circadian variation of TpH, we would also expect a circadian variation in serotonergic content. This variation has been studied since the 1960s. A daily variation of 5-HT was found in different areas of the encephalon (Quay, 1968). Variations in 5-HT content have been reported in the anterior raphe nuclei and regions innervated by these nuclei, such as the SCN (Cagampang, Yamazaki, Otori, & Inouye, 1993; Cagampang & Inouye, 1994; Portas et al., 1996). Rats maintained in an artificial light/dark cycle show a bimodal pattern with two peaks in 5-HT concentration in all raphe nuclei, especially the DRN. One of the peaks is observed in the animals’ subjective night (Pinato, Ferreira, Markus, & Nogueira, 2004). This study showed that the level of 5-HT starts to increase immediately after the onset of the dark phase in all raphe nuclei. Therefore, the production of 5-HT is also synchronized to the environment. Comparison of these data with Malek et al. (2004) shows a correlation between TpH and 5-HT peaks, although methodological differences between two experiments must be considered. Some data show circadian variation in different regions
of the DRN in gerbils maintained under an artificial light/dark cycle, exhibiting higher peaks in the light/dark transition (Birkett & Fite, 2005).
Involvement of the raphe in circadian functions
The circadian functions attributed to the raphe have been widely studied in recent years, partially because of the unclarified issues from earlier studies, such as those showing the DRN as the efferent source of 5-HT to the SCN. Recently published studies suggest that serotonergic input from the raphe is an inhibitor of the light response. However, we found that the raphe has a function in the sleep/wake cycle.
The raphe and sleepThe first studies that reported the importance of 5-HT
in sleep control identified it as a “neurotransmitter of sleep.” After electrophysiological studies were conducted to measure neuronal activity in the raphe, 5-HT was reported as a “neurotransmitter of wakefulness.” In an experiment in which the brainstem of cats was sectioned at the pontine-mesencephalic level, a long period of insomnia (10 to 15 days) was observed in these animals (Jouvet, 1969). This was attributed to serotonergic terminal degeneration in the telencephalon. A correlation may also exist between MRN destruction and the reduced amount of slow-wave sleep and between paradoxical sleep (REM sleep) and the pontine raphe (PoRN) and magnum raphe (MaRN) nuclei (Jouvet, 1969). These experiments have been discredited because of the methodology used, given that a lesion of this magnitude causes serotonergic neuronal destruction, in addition to a large number of structures, such as blood vessels and fibers of passage. p-Chlorophenylalanine (PCPA) is capable of inhibiting TPH activity, which in turn impedes 5-HT synthesis. Thus, cats injected with PCPA showed total and prolonged insomnia (Koe & Weissman, 1966).
Electrophysiological experiments in the 1970s showed that 5-HT does not modulate sleep itself. The recording of DRN neurons in cats demonstrated that this nucleus was completely active during wakefulness and that their activity started to decrease during slow-wave sleep until becoming nearly completely silent during paradoxical or REM sleep (McGinty & Harper, 1976; Trulson & Jacobs, 1979; Cespuglio, Faradji, Gomez, & Jouvet, 1981). Dorsal raphe nucleus electrostimulation promotes wakefulness (Cespuglio et al., 1981). Cespuglio, Faradji, and Jouvet (1983) found that the volumetric signal of 5-hydroxyindolacetic acid increases in the cerebral cortex and thalamus during wakefulness and decreases during slow-wave sleep. Dorsal raphe nucleus activity in rats showed a gradual reduction in firing rate from wakefulness to REM sleep. This rate also diminished after systemic administration of 5-HT1A receptor agonists (Guzmán-Marín et al., 2000).
Serotonin and circadian rhythms 223
Serotonin reuptake inhibitors are drugs used in antidepressive treatment. Polysomnographs of depressive patients show reduced REM sleep latency and decreased amounts of deep sleep (delta wave sleep). These inhibitors cause a reduction in paradoxical sleep, confirming the hypothesis of serotonergic inhibition during sleep (Ursin, 2002).
The raphe and photic informationNumerous studies have investigated the function
of 5-HT in modulating the photic response of the SCN. These reports are based mainly on the manipulation of serotonergic transmission, in which 5-HT agonists or antagonists are used or specific serotonergic receptors are deactivated and the CTS response to photic information is measured. This modulation can be assumed if we consider that in most species, serotonergic terminals are co-localized with retinal terminals in the SCN. Some authors showed that light-induced phase shifts can be attenuated or even blocked by the injection of 5-HT agonists (Selim, Glass, Hauser, & Rea, 1993; Glass, Selim, & Rea, 1994; Rea, Glass & Colwell, 1994; Rea, Barrera, Glass & Gannon, 1995). Light-induced behavioral changes are not the only ones attenuated by 5-HT. Meyer-Bernstein & Morin (1999) demonstrated that the c-fos expression in the SCN is inhibited after electrical stimulation of the DRN and MNR.
In an experiment that destroyed serotonergic neurons in the MNR, Meyer-Bernstein, Blanchard and Morin (1997) showed an increased activity period in animals submitted to light-dark cycle when they received an injection of 5-7-dihydroxytryptamine (DHT), exhibiting phase advances at the onset of activity and delays at the end. When this lesion targeted serotonergic terminals in the SCN, the animals showed phase advances at activity onset. This study also shows that even a few serotonergic fibers in the SCN allow slight synchronization of the light/dark cycle. The authors reported that the activity period in the light/dark cycle is maintained by the MNR. Similar results were found by other researchers that treated hamsters and mice with DHT. Hamsters showed phase delays as a response to light pulses between circadian times (CT) 13 and 15. Mice exhibited phase delays upon receiving light pulses between CT 12 and 30 (Bradbury, Dement, & Edgar, 1997; Morin & Blanchard, 2001).
Serotonin agonists also cause a reduction in SCN neuronal firing rate, reducing their capacity to synchronize to the light/dark cycle. These effects appear to be mediated by specific receptors. The application of 8-OH-DPAT reduces the firing rate of action potentials in the SCN after optic nerve stimulation, inhibits the expression of Fos in the SCN, and dose-dependently attenuates phase shifts caused by an activity wheel (Rea et al., 1994). The inhibitory effects of 8-OH-DPAT occur in the SCN and are not only expressed through the 5-HT2 receptor, but also act through the 5-HT1A and
5-HT7 receptors (Weber, Gannon, & Rea, 1998). When quipazine, a 5-HT agonist, is applied in vitro to the SCN, it induces alterations in the firing rate of its neurons as well as 8-OH-DPAT application (Prosser, Miller, & Heller, 1990; Medanic & Gillette, 1992). Curiously, these effects are observed during the subjective day. The in vivo application of these same agonists caused phase advances in free-running locomotor activity in rats and hamsters (Tominaga, Shibata, Ueki, & Watanabe, 1992; Edgar, Miller, Prosser, Dean, & Dement, 1993; Cutrera, Ouarour, & Pevet, 1994).
Drug experiments have also demonstrated the function of 5-HT in the light response. Treatment with clorgyline, an antidepressant and 5-HT uptake inhibitor, attenuates light-induced phase shifts (Duncan, Johnson, & Wehr, 1998). Clomipramine, a drug causing depressive symptoms, provokes changes in circadian rhythms, resulting in less synchronization to the light/dark cycle and a reduced light response at the end of the subjective night (Yannielli, Cutrera, Cardinali, & Golombek, 1998).
Of the 5-HT receptors found in the SCN, 5-HT1B stands out for its location on retinal terminals, a topography that promotes the modulation of light entering the SCN. Bilateral enucleation reduces the number of 5-HT1B binding sites by 35% (Pickard, Weber, Scott, Riberdy, & Rea, 1996; Pickard et al., 1999). Activation of these receptors attenuates light-induced phase shifts (Pickard et al., 1996). The application of agonists from this receptor inhibits phase shifts and light-induced c-fos expression in the SCN (Glass et al., 1994; Pickard et al., 1996). 5-HT1B knockout mice have attenuated light-induced c-fos expression in the SCN at CT 16 and 23 (Sollars, Simpson, Ogilvie, & Pickard, 2006).
The raphe may be related to food synchronizationSerotonin is a derivative of tryptophan and as such
is affected by food restriction cycles, given that food is a source of tryptophan for the organism. Food deprivation leads to a reduction in serotonergic content in both the raphe and hypothalamic areas (Kang, Park, Ahn, & Huh, 2001). This serotonergic depression in the hypothalamus may be one of the causes of the behavioral alterations observed in animals subjected to a food restriction regimen. The synthesis of melatonin, a hormone derived from 5-HT, undergoes phase advances in rats subjected to food restriction (Challet, Pevet, Vivien-Roels, & Malan, 1997). In an experiment with rats subjected to food restriction and divided into three groups (one group that had no access to food but had olfactory and visual contact; one group that had food access for 30 min; and one group with food access for 2 h), an increase in c-fos expression was observed in the caudal raphe nuclei of the pallid raphe nucleus, nucleus raphe magnus, and nucleus raphe obscurus during the period of food exposure (Takase, Barone, & Nogueira, 2000).
Pontes et al224
Leptin is a product of adipocyte secretion, which is related to the control of body weight, metabolism, and reproduction (Friedman & Halaas, 1998). Leptin injection led to a reduction in food ingestion (Tang-Christensen, Havel, Jacobs, Larsen & Cameron, 1999). Finn, Cunningham, Rickard, Clifton and Steiner (2001) found leptin receptors in caudal linear nuclei (CLN), DRN, and MRN, which may confirm the importance of the raphe in food synchronization. With respect to this possible function, studies are scarce and their findings have been inconclusive. Nevertheless, this possibility cannot be excluded.
We already discussed that light is the most potent cue for the entrainment of the SCN. Temporally restricted feeding (i.e., limited duration of daily food access) is a strong synchronizer for rhythmic gene expression in peripheral oscillators (Damiola et al., 2000; Stokkan, Yamazaki, Tei, Sakaki, & Menaker, 2001). Under constant darkness conditions (but not in a light/dark cycle), temporally restricted feeding or a palatable diet in addition to regular food ad libitum is able to entrain the SCN clock (Mistlberger, 1994; Mistlberger & Holmes, 2000; Mendoza, Angeles-Castellanos, & Escobar, 2005).
The ability to entrain circadian rhythms to food availability is important for survival. Food-entrained circadian rhythms are characterized by increased locomotor activity in anticipation of food availability (food anticipatory activity). However, the molecular components and neural circuitry underlying the regulation of food anticipatory activity remain unclear.
Serotonin has been implicated in the control of eating behavior and body weight. Stimulants of this monoamine reduce food intake and weight gain and increase energy expenditure, both in animals and humans. This phenomenon is partially mediated by 5-HT receptors located in various medial hypothalamic nuclei, most notably the paraventricular nucleus (PVN), ventromedial nucleus (VMN), and SCN, and to a more variable extent, the dorsomedial nucleus (DMN). These nuclei are essential for the normal control of nutrient intake, and the presence of exogenous 5-HT as well as agents that enhance synaptic availability of endogenous 5HT in these areas has a suppressive effect on food intake (Weiss et al., 1991) and enhance energy metabolism (Sakaguchi & Bray, 1989). It also increases circulating levels of glucose and corticosterone (Scheurink, Leuvenink, & Steffens, 1993).
Serotonin plays a specific role in controlling the temporal aspects of feeding, producing a significant decrease in the size and duration of individual meals in association with a reduced rate of eating, but with no effect on meal latency or frequency (Leibowitz, Weiss, & Shor-Posner, 1988). The hypothalamic 5-HT system is within a negative feedback loop that controls eating behavior. The ingestion of carbohydrates stimulates the production of the monoamine, which then performs the
function of terminating the ingestion of this nutrient and producing satiety.
Can these actions of 5-HT help us understand its relationship to the modulation of non-photic stimuli, or can eating behavior, similar to a strong non-photic synchronizer, modulate 5-HT rhythm? Experiments indicate that a rhythm of serotonergic activity, with regard to feeding behavior, exists across the light/dark cycle, reflected by temporal shifts in responsiveness to medial hypothalamic 5-HT1 receptor stimulation and the release and utilization of endogenous 5-HT. The strongest serotonergic activity occurs at the beginning of the active feeding period at the transition between light and dark (Leibowitz et al., 1988; Weiss et al., 1991). Extracellular levels of 5-HT in the SCN are highest early in the night when locomotor behavior is activated by the dark phase in rats and hamsters (Shioiri, Takahashi, Yamada, & Takahashi, 1991; Cagampang & Inouye, 1994; Dudley, Di Nardo, & Glass, 1998). Moreover, 5-HT release at the level of the SCN is suppressed by novel wheel running activity late in the subjective night.
At the onset of the dark phase, the active phase for the freely feeding rat, serotonergic stimulation of the PVN or SCN is most effective in suppressing food intake and particularly carbohydrate ingestion (Weiss, Rogacki, Fueg, Buchen, & Leibowitz, 1990). Moreover, carbohydrate ingestion is most effective at the onset of the feeding period in enhancing 5-HT synthesis in the brain (Fernstrom & Fernstrom, 1995). Hypothalamic serotonergic control of feeding is expressed phasically primarily at the beginning of the natural feeding cycle when endogenous 5-HT activity peaks (Faradji, Cespuglio, & Jouvet, 1983; Hery, Faudon, Dusticier, & Hery, 1982; Martin, 1991; Pinato et al., 2004).
Therefore, 5-HT may be proposed to play a specific role in terminating meals by stimulating PVN satiety neurons (Sclafani & Aravich, 1983) and SCN neurons that determine this circadian rhythm (Faradji et al., 1983).
Some of the action of 5-HT may occur outside the SCN. The role of extra-SCN areas in setting the circadian phase is under investigation (Vansteensel et al., 2003), and one study suggests that the effects of novel wheel exposure involve extra-SCN processing (Yannielli & Harrington, 2000).
Effects of raphe lesions on circadian rhythmsThe connections between the raphe and central
components of the CTS are well established, but what would be the effect of raphe nucleus lesions on SCN or IGL activity and behavioral responses? The first studies that attempted to answer these questions showed that circadian rhythm amplitude decreases and synchronization to the light/dark cycle becomes less evident after raphe nuclei lesions. These results depend on the specific site where the lesion was applied. However, these animals still showed traces of synchronization and some circadian rhythms (Block
Serotonin and circadian rhythms 225
& Zucker, 1976; Kam & Moberg, 1977). Levine, Rosenwasser, Yanovski, and Adler (1986) conducted an experiment that assessed the effect of MRN lesions on the CTS during prolonged behavioral observation of synchronized or free-running rats. The results showed the importance of the DRN and MRN in the expression of free-running circadian rhythms. After being subjected to raphe lesions, rats kept in constant darkness showed shorter periods than when they were maintained in constant light. Free-running rhythm is expressed in the first few days after surgery, becoming increasingly less evident until there is no discernible rhythmic pattern of locomotor activity (Levine et al., 1986). In this study, the lesion was very large, encompassing other brainstem structures. Additionally, the destruction of serotonergic terminals in the SCN of animals kept under a light/dark cycle neither altered synchronization to this cycle nor impeded phase advances provoked by activity wheels (Bobrzynska, Vrang, & Mrosovsky, 1996).
Other neuropharmacological studies used methylenedioxymethamphetamine (MDMA, ecstasy) as a neurotoxin for serotonergic terminals. The results of these investigations showed a reduction in the phase advances of SCN neuronal firing as a response to the application of 8-OH-DPAT (Biello & Dafters, 2001; Colbron, Jones, & Biello, 2002).
The IGL also undergoes alterations after DRN lesion. After provoking electrolytic lesions in the DRN of rats, Blasiak and Lewandowski (2003) observed an increase in IGL neuronal firing rate. These investigators also found that electrostimulation of the DRN causes a transient and reversible decrease in IGL neuronal firing rate.
Final considerations
The raphe maintains a narrow anatomical and functional relationship with the central components of the CTS, taking part in important circadian functions, such as sleep/wake regulation or light/dark cycle synchronization, attributable to modulation of light information. The raphe is a complex that receives a range of sensory information, demonstrated in the organization of the afferents it receives, making it an important integrating center between the CTS and environment. Specific nuclear lesions lead to altered circadian rhythms. Pharmacological experiments show that the functions performed by the raphe in synchronization occur through 5-HT.
The literature shows that the main raphe nuclei involved in circadian functions are the DRN and MRN, based on the connections of these nuclei with the IGL and SCN, respectively. Lesions of these nuclei cause significant alterations in SCN and IGL activity. Stimulation of these raphe nuclei was also effective at revealing their participation in rhythmicity.
The literature also shows that the actions of 5-HT depend on the type of postsynaptic receptor. Interest
has focused mainly on the 5-HT1B receptor because of the apparent importance of this receptor in the light response. Many questions remain unanswered, such as the function of the raphe in food synchronization, the mechanisms by which the raphe acts in controlling the sleep/wake cycle, and whether receptors are involved in modulating non-photic responses. Researchers are actively seeking answers to these questions. According to the literature, we can confirm that the raphe has important functions in the CTS and that the absence of specific raphe or 5-HT nuclei hinders the maintenance of rhythms coordinated by the CTS.
Acknowledgements This study was supported by CNPq, CAPES,
PROPESQ-UFRN, and FAPESP.
ReferencesAlbers, H.E., Ferris, C.F., Leeman, S.E., & Goldman, B.D. (1984).
Avian pancreatic polypeptide phase shifts hamster circadian rhythms when microinjected into the suprachiasmatic region. Science, 223, 833-835.
Anctil, M. (1989). Modulation of a rhythmic activity by serotonin via cyclic AMP in the coelenterate Renilla köllikeri. Journal of Comparative Physiology B, 159, 491-500.
Azmitia, E.C., & Segal, M. (1978). An autoradiographic analysis of the differential ascending projections of the dorsal and median raphe nuclei in the rat. Journal of Comparative Neurology, 179, 641-667.
Battelle, B.A., & Kravitz, E.A. (1978). Targets of octopamine action in the lobster: cyclic nucleotide changes and physiological effects in hemolymph, heart and exoskeletal muscle. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 205, 438-448.
Beltz, B.S., & Kravitz, E.A. (1983). Mapping of serotonin-like immunoreactivity in the lobster nervous system. Journal of Neuroscience, 3, 585-602.
Biello, S.M., & Dafters, R.I. (2001). MDMA and fenfluramine alter the response of the circadian clock to a serotonin agonist in vitro. Brain Research, 920, 202-209.
Birkett, M., & Fite, K.V. (2005). Diurnal variation in serotonin immunoreactivity in the dorsal raphe nucleus. Brain Research, 1034, 180-184.
Bisgrove, B.W., & Burke, R.D. (1986). Development of serotonergic neurons in embryos of the sea urchin, Strongylocentrotus purpuratus. Development, Growth and Differentiation, 28, 569-574.
Blasiak, T., & Lewandowski, M.H. (2003). Dorsal raphe nucleus modulates neuronal activity in rat intergeniculate leaflet. Behavioural Brain Research, 138, 179-185.
Block, M., & Zucker, I. (1976). Circadian rhythms of rat locomotor activity after lesions of the midbrain raphe nuclei. Journal of Comparative Physiology, 109, 235-247
Bobrzynska, K., Vrang, N., & Mrosovsky, N. (1996). Persistence of nonphotic phase shifts in hamsters after serotonin depletion in the suprachiasmatic nucleus. Brain Research, 741, 205-214.
Bradbury, M.J., Dement, W.C., & Edgar, D.M. (1997). Serotonin-containing fibers in the suprachiasmatic hypothalamus attenuate light-induced phase delays in mice. Brain Research, 768, 125-134.
Brodal, A., Taber, E., & Walberg, F. (1960a). The raphe nuclei of the brain stem in the cat: II. Efferent connections. Journal of Comparative Neurology, 114, 239-259.
Brodal, A., Taber, E., & Walberg, F. (1960b). The raphe nuclei of the brain stem in the cat: III. Afferent connections. Journal of Comparative Neurology, 114, 261-281.
Cagampang, F.R.A., Yamazaki, S., Otori, Y., & Inouye, S.I.T. (1993). Serotonin in the raphe nuclei: regulation by light and an endogenous pacemaker. Neuroreport, 4, 49-52.
Cagampang, F.R.A., & Inouye, S.I.T. (1994). Diurnal and circadian changes of serotonin in the suprachiasmatic nuclei: regulation by light and an endogenous pacemaker. Brain Research, 639, 175-179.
Pontes et al226
Card, J.P., & Moore, R.Y. (1984). The suprachiasmatic nucleus of the golden hamster: immunohistochemical analysis of cell and fiber distribution. Neuroscience, 13, 415-431.
Cassone, V.M., Speh, J.C., Card, J.P., & Moore, R.Y. (1988). Comparative anatomy of the mammalian hypothalamic suprachiasmatic nucleus. Journal of Biological Rhythms, 3, 71-91.
Cavalcante, J.S., Alves, A.S., Costa, M.S.M.O., & Britto, L.R.G. (2002). Differential distribution of afferent containing serotonin and neuropeptide Y within the marmoset suprachiasmatic nucleus. Brain Research, 927, 200-203.
Cavalcante, J.S., Nascimento Júnior, E.S., & Costa, M.S.M.O. (2006). Componentes centrais do sistema de temporização circadiana: o núcleo supraquiasmático e o folheto intergeniculado. Neurociências, 3, 1-10.
Cavalcante, J.S., Britto, L.R.G., Toledo, C.A.B., Nascimento, E.S., Jr., Lima, R.R.M., Pontes, A.L.B., & Costa, M.S.M.O. (2008). Calcium-binding proteins in the circadian centers of the common marmoset (Callithrix jacchus) and the rock cavy (Kerodon rupestris) brains. Brain Research Bulletin, 76, 354-360.
Cespuglio, R., Faradji, H., Gomez, M.E., & Jouvet, M. (1981). Single unit recordings in the nuclei raphe dorsalis and magnus during the sleep-waking cycle of semi-chronic prepared cats. Neuroscience Letters, 24, 133-138.
Cespuglio, R., Faradji, H., & Jouvet, M. (1983). Voltammetric detection of 5-hydroxyindole cmpound present at the extracellular levels of the cell-bodies and the terminals of the serotoninergic system-fluctuations during the sleep-waking cycle in chronically implanted rats. Comptes Rendus De L Academie Des Sciences Serie III-Sciences De La Vie-Life Sciences, 296, 611-616.
Challet, E., Pévet, P., Vivien-Roels, B., & Malan, A. (1997). Phase-advanced daily rhythms of melatonin, body temperature, and locomotor activity in food-restricted rats fed during daytime. Journal of Biological Rhythms, 12, 65-79.
Colbron, S., Jones, M., & Biello, S.M. (2002). MDMA alters the response of the circadian clock to a photic and non-photic stimulus. Brain Research, 956, 45-52.
Costa, M.S.M.O., Moreira, L.F., Alones, V., Lu, J., Santee, U.R., Cavalcante, J.S., Moraes, P.R.A., ... Menaker, M. (1998). Characterization of the circadian system in a brazilian species of monkey (Callithrix jacchus): immunohistochemical analysis and retinal projections. Biological Rhythm Research, 29, 510-520.
Costa, M.S.M.O., Santee, U.R, Cavalcante, J.S., Moraes, P.R.A., Santos, N.P., & Britto, L.R.G. (1999). Retinohypothalamic projections in the commom marmoset (Callitrhix jacchus): a study using cholera toxin subunit B. Journal of Comparative Neurology, 415, 393-403.
Cutrera, R.A., Ouarour, A., & Pévet, P. (1994). Effects of the 5HT1A receptor agonist 8-OH-DPAT and other non-photic stimuli on the circadian rhythm of wheel-running activity in hamsters under different constant conditions. Neuroscience Letters, 172, 27-30.
Dahlström, A., & Fuxe, K. (1964). Evidence for the existence of monoamine-containing neurons in the central nervous system: I. Demonstration of monoamines in the cell bodies of brain stem neurons. Acta Physiologica Scandinavica Supplementum, 232, 1-55.
Damiola, F., Le Minh, N., Preitner, N., Kornmann, N., Fleury-Olela, F., & Schibler, U. (2000). Restricted feeding uncouples circadian oscillators in peripheral tissues from the central pacemaker in the suprachiasmatic nucleus. Genes and Development, 14, 2950-2961.
Dudley, T.E., Di Nardo, L.A., & Glass, J.D. (1998). Endogenous regulation of serotonin release in the hamster suprachiasmatic nucleus. Journal of Neuroscience, 18, 5045-5052.
Dudley, T.E., Dinardo, L.A., & Glass, J.D. (1999). In vivo assessment of the midbrain raphe nuclear regulation of serotonin release in the hamster suprachiasmatic nucleus. Journal of Neurophysiology, 81, 1469-1477.
Duncan, W.C., Jr., Johnson, K.A., & Wehr, T.A. (1998). Decreased sensitivity to light of the photic entrainment pathway during chronic clorgyline and lithium treatments. Journal of Biological Rhythms, 13, 330-346.
Edgar, D.M., Miller, J.D., Prosser, R.A., Dean, R.R., & Dement, W.C. (1993). Serotonin and the mammalian circadian system: II. Phase shifting rat behavioral rhythms with serotonergic agonists. Journal of Biological Rhythms, 8, 17-31.
Faradji, H., Cespuglio, R., & Jouvet, M. (1983). Voltammetric measurements of 5-hydroxyindole compounds in the suprachiasmatic nuclei: circadian fluctuations. Brain Research,
279, 111-119.Felten, D.L., & Cummings, J.P. (1979). The raphe nuclei of the rabbit
brain stem. Journal of Comparative Neurology, 187, 199-243.Finn, P.D., Cunningham, M.J., Rickard, D.G, Clifton, D.K., & Steiner,
R.A. (2001). Serotonergic neurons are targets for leptin in the monkey. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 86, 422-426.
Fite, K.V., Janušonis, S., Foote, W., & Bengston, L. (1999). Retinal afferents to the dorsal raphe nucleus in rats and Mongolian gerbils. Jounal of Comparative Neurology, 414, 469-484.
Fite, K.V., & Janušonis, S. (2001). Retinal projections to the dorsal raphe nucleus in the Chilean degus (Octodon degus). Brain Research, 895, 139-145.
Fite, K.V., Birkett, M.A., Smith, A., Janušonis. S., & McLaughlin, S. (2003). Retinal ganglion cells projecting to the dorsal raphe and lateral geniculate complex in Mongolian gerbils. Brain Research, 973, 146-150.
Fite, K.V., Wu, P.S., & Bellemer, A. (2005). Photostimulation alters c-Fos expression in the dorsal raphe nucleus. Brain Reserch, 1031, 245-252.
Foote, W.E., Taber-Pierce, E., & Edwards, L. (1978). Evidence for retinal projection to the midbrain raphe of the cat. Brain Research, 156, 135-140.
Fernstrom, M.H., & Fernstrom, J.D. (1995). Brain tryptophan concentrations and serotonin synthesis remain responsive to food consumption after the ingestion of sequential meals. American Journal of Clinical Nutrition, 61, 312-319.
Frazão, R., Pinato, L., Silva, A.V., Britto, L.R.G., Oliveira, J.A., & Nogueira, M.I. (2008). Evidence of reciprocal connections between the drosal raphe nucleus and the retina in the monkey (Cebus apella). Neuroscience Letters, 430, 119-123.
Friedman, J.M., & Halaas, J.L. (1998). Leptin and the regulation of body weight in mammals. Nature, 395, 763-770.
Gillette, M.U. (1991). SCN electrophysiology in vitro: rhythmic activity and endogenous clock properties. In D.C. Klein, R.Y. Moore, & S.M. Reppert (Eds.), Suprachiasmatic nucleus: the mind’s clock (pp. 43-125). Oxford: Oxford University Press.
Glanzman, D.L., Mackey, S.L., Hawkins, R.D., Dyke, A.M., Lloyd, P.E., & Kandel, E.R. (1989). Depletion of serotonin in the nervous system of Aplysia reduces the behavioral enhancement of gill withdrawal as well as the heterosynaptic facilitation produced by tail shock. Journal of Neuroscience, 9, 4200-4213.
Glass, J.D., Selim, M., & Rea, M.A. (1994). Modulation of light-induced c-fos expression in the suprachiasmatic nuclei by 5-HT1A receptor agonists. Brain Research, 638, 235-242.
Goel, N., Lee, T.M., & Smale, L. (1999). Suprachiasmatic nucleus and intergeniculate leaflet in the diurnal rodent Octodon degus: retinal projections and immunocytochemical characterization. Neuroscience, 92, 1491-1509.
Golombek, D.A., & Rosenstein, R.E. (2010). Physiology of circadian entrainment. Physiological Reviews, 90, 1063-1102.
Gustafson, T., Lundgren, B., & Treufeldt, R. (1972). Serotonin and contractile activity in the echinopluteus: a study of the cellular basis of larval behaviour. Experimental Cell Research, 72, 115-139.
Guzmán-Marín, R., Alam, M.N., Szymusiak, R., Drucker-Colín, R., Gong, H., & McGinty, D. (2000). Discharge modulation of rat dorsal raphe neurons during sleep and waking: effects of preoptic/basal forebrain warming. Brain Research, 875, 23-34.
Halton, D.W., Maule, A.G., Johnston, C.F., & Fairweather, I. (1987). Occurrence of 5-hydroxytryptamine (serotonin) in the nervous system of a monogenean, Diclidophora merlangi. Parasitology Research, 74, 151-154.
Harrington, M.E., Nance D.M., & Rusak, B. (1985). Neuropeptide Y immunoreactivity in the hamster geniculo-suprachiasmatic tract. Brain Research Bulletin, 15, 465-472.
Harrington, M.E., Nance, D.M., & Rusak, B. (1987). Double-labeling of neuropeptide Y-immunoreactive neurons which project from the geniculate to the suprachiasmatic nucleus. Brain Research, 410, 275-282.
Hawkins, R.D., & Schacher, S. (1989). Identified facilitator neurons L29 and L28 are excited by cutaneous stimuli used in dishabituation, sensitization, and classical conditioning of Aplysia. Journal of Neuroscience, 9, 4236-4245.
Hay-Schmidt, A., Vrang, N., Larsen, P.J., & Mikkelsen, J.D. (2003). Projections from the raphe nuclei to the suprachiasmatic nuclei of the rat. Journal of Chemical Neuroanatomy, 25, 293-310.
Hery, M., Faudon, M., Dusticier, G., & Hery, F. (1982). Daily variations in
Serotonin and circadian rhythms 227
serotonin metabolism in the suprachiasmatic nucleus of the rat: influence of oestradiol impregnation. Journal of Endocrinology, 94, 157-166.
Hickey, T.L., & Spear, P.D. (1976). Retinogeniculate projections in hooded and albino rats: an autoradiographic study. Experimental Brain Research, 24, 523-529.
Horvitz, H.R., Chalfie, M., Trent, C., Sulston, J.E., & Evans, P.D. (1982). Serotonin and octopamine in the nematode Caenorhabditis elegans. Science, 216, 1012-1014.
Jacobs, B.L., & Azmitia, E.C. (1992). Structure and function of the brain serotonin system. Physiological Reviews, 72, 165-229.
Johnson, R.F., Morin, L.P., & Moore, R.Y. (1988). Retinohypothalamic projections in the hamster and rat demonstrated using cholera toxin. Brain Research, 462, 301-312.
Jouvet, M. (1969). Biogenic amines and the states of sleep. Science, 163, 32-41.Kam, L.M., & Moberg, G.P. (1977). Effect of raphe lesions on the
circadian pattern of wheel running in the rat. Physiology and Behavior, 18, 213-217.
Kang, M., Park, C., Ahn, H., & Huh, Y. (2001). Ectopic expression of serotonin-positive neurons in the hypothalamus associated with a significant serotonin decrease in the midbrain of food restricted rats. Neuroscience Letters, 314, 25-28.
Kawano, H., Decker, K., & Reuss, S. (1996). Is there a direct retina-raphe-suprachiasmatic nucleus pathway in the rat? Neuroscience Letters, 212, 143-146.
Koe, B.K., & Weissman, A. (1966). p-Chlorophenylalanine, a specific depletor of brain serotonin. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 154, 499-516.
Kupfermann, I., & Weiss, K.R. (1981). The role of serotonin in arousal of feeding behavior of Aplysia. In B.L. Jacobs, & A. Gelperin (Eds.), Serotonin neurotransmission and behavior (pp. 255-287). Cambridge: MIT Press.
Leibowitz, S.F., Weiss, G.F., & Shor-Posner, G. (1988). Hypothalamic serotonin: pharmacological, biochemical, and behavioral analyses of its feeding-suppressive action. Clinical Neuropharmacology, 11( Suppl 1), S51-S71.
Lent, C.M., & Dickinson, M.H. (1984). Serotonin integrates the feeding behavior of the medicinal leech. Journal of Comparative Physiology A, 154, 457-471.
Levine, J.D., Weiss, M.L., Rosenwasser, A.M., & Miselis, R.R. (1991). Retinohypothalamic tract in the female albino rat: a study using horseradish peroxidase conjugated to cholera toxin. Journal Comparative Neurology, 306, 344-360.
Levine, J.D., Rosenwasser, A.M., Yanovski, J.A., & Adler, N.T. (1986). Circadian activity rhythms in rats with midbrain raphe lesions. Brain Research, 384, 240-249.
Malek, Z.S., Pévet, P., & Raison, S. (2004). Circadian change in tryptophan hydroxylase levels within the rat intergeniculate leaflets and raphe nuclei. Neuroscience, 125, 749-758.
Martin, K.F. (1991). Rhythms in neurotransmitter turnover: focus on the serotonergic system. Pharmacology and Therapeutics, 51, 421-429.
Mantyh, P.W., & Kemp, J.A. (1983). The distribution of putative neurotransmitters in the lateral geniculate nucleus of the rat. Brain Research, 288, 344-348.
Marques, N., Golombek, D., & Moreno, C. (2003). Adaptação temporal. In: N. Marques, & L. Menna-Barreto (Eds.), Cronobiologia: princípios e aplicações (pp. 55-98). São Paulo: Editora da Universidade de São Paulo.
Maule, A.G., Halton, D.W., Allen, J.M., & Fairweather, I. (1989). Studies on motility in vitro of an ectoparasitic monogenean, Diclidophora merlangi. Parasitology, 98, 85-93.
Maule, A.G., Halton, D.W., Johnston, C.F., Shaw, C. & Fairweather, I. (1990). A cytochemical study of the serotoninergic, cholinergic and peptidergic components of the reproductive system in the monogenean parasite, Diclidophora merlangi. Parasitology Research, 76, 409-419.
McGinty, D.J., & Harper, R.M. (1976). Dorsal raphe neurons: depression of firing during sleep in cats. Brain Research, 101, 569-575.
Medanic, M., & Gillette, M.U. (1992). Serotonin regulates the phase of the rat suprachiasmatic circadian pacemaker in vitro only during the subjective day. Journal of Physiology, 450, 629-642.
Mendoza, J., Angeles-Castellanos, M., & Escobar, C. (2005) A daily palatable meal without food deprivation entrains the suprachiasmatic nucleus of rats. European Journal Neuroscience, 22, 2855-2862.
Meyer-Bernstein, E.L. & Morin, L.P. (1996). Differential serotonergic innervation of the suprachiasmatic nucleus and the intergeniculate leaflet and its role in circadian rhythm modulation. Journal of
Neuroscience, 16, 2097-2111.Meyer-Bernstein, E.L., Blanchard, J.H., & Morin, L.P. (1997). The
serotonergic projection from the median raphe nucleus to the suprachiasmatic nucleus modulates activity phase onset, but not other circadian rhythm parameters. Brain Research, 755, 112-120.
Meyer-Bernstein, E.L., & Morin, L.P. (1999). Electrical stimulation of the median or dorsal raphe nuclei reduces light-induced Fos protein in the suprachiasmatic nucleus and causes circadian activity rhythm phase shifts. Neuroscience, 92, 267-279.
Miller, J.D., Morin, L.P., Schwartz, W.J., & Moore, R.Y. (1996). New insights into the mammalian circadian clock. Sleep, 19, 641-667.
Mistlberger, R.E. (1994). Circadian food anticipatory activity: formal models and physiological mechanisms. Neuroscience and Biobehavioral Reviews, 18, 171-195.
Mistlberger, R.E., & Holmes, M.M. (2000). Behavioral feedback regulation of circadian rhythm phase angle in light-dark entrained mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology, 279, R813-R821.
Moga, M.M., & Moore, R.Y. (1997). Organization of neural inputs to the suprachiasmatic nucleus in the rat. Journal of Comparative Neurology, 389, 508-534.
Moore-Ede, M.C., Sulzman, F.M., & Fuller, C.A. (1982). The clocks that time us: physiology of the circadian timing system. Cambridge: Harvard University Press.
Moore, R.Y. (1973). Retinohypothalamic projection in mammals: a comparative study. Brain Research, 49, 403-409.
Moore, R.Y. (1993). Organization of the primate circadian system. Journal of Biological Rhythms, 8 Suppl, S3-S9.
Moore, R.Y. (1999). Circadian timing. In: M.J. Zigmond, F.E. Bloom, S.C. Landis, J.L. Roberts & L.R. Squire (Eds.), Fundamental neuroscience (pp. 1189-1206). San Diego: Academic Press.
Moore, R.Y., & Eichler, V.B. (1972). Loss of circadian adrenal corticosterone rhythm following suprachiasmatic nucleus lesions in the rat. Brain Research, 42, 201-206.
Moore, R.Y., & Lenn, N.J. (1972). A retinohypothalamic projection in the rat. Journal Comparative Neurology, 146, 1-14.
Moore, R.Y., Halaris, A.E., & Jones, B.E. (1978). Serotonin neurons of the midbrain raphe: ascending projections. Journal of Comparative Neurology, 180, 417-438.
Moore, R.Y., Gustafson, E.L., & Card, J.P. (1984). Identical immunoreactivity of afferents to the rat suprachiasmatic nucleus with antisera against avian pancreatic polypeptide, molluscan cardioexcitatory peptide and neuropeptide Y. Cell and Tissue Research, 236, 41-46.
Moore, R.Y., & Speh, J.C. (2004). Serotonin innervation of the primate suprachiasmatic nucleus. Brain Research, 1010, 169-173.
Morin, L.P. (1994). The circadian visual system. Brain Research Reviews, 19, 102-127.
Morin, L.P. (2007). SCN organization reconsidered. Journal of Biological Rhythms, 22, 3-13.
Morin, L.P., & Blanchard, J.H. (2001). Neuromodulator content of hamster intergeniculate leaflet neurons and their projections to the suprachiasmatic nucleus or visual midbrain. Journal of Comparative Neurology, 437, 79-90.
Nascimento, E.S., Jr., Cavalcante, J.S., Cavalcante, J.C., & Costa, M.S.M.O. (2010). Retinal afferents to the thalamic mediodorsal nucleus in the rock cavy (Kerodon rupestris). Neuroscience Letters, 475, 38-43.
Nascimento, R.B.S., Borda, J.S., Engelberth, R.C.G.J., Medeiros, R.O., Frazão, R., Pinato, L., Pontes, A.L.B.,...Cavalcante, J.S. (2010). The presence of neuronal-specific nuclear protein (NeuN) in the circadian timing system of the capuchin monkey (Cebus paella). Sleep Science, 3, 36-39.
Pasztor, V.M., & Bush, B.M.H. (1987). Peripheral modulation of mechano-sensitivity in primary afferent neurons. Nature, 326, 793-795.
Paxinos, G., & Watson, C. (1982). The rat brain in stereotaxic coordinates. Sydney: Academic Press.
Pickard, G.E., Weber, E.T., Scott, P.A., Riberdy, A.F. & Rea, M.A. (1996). 5HT1B receptor agonists inhibit light-induced phase shifts of behavioral circadian rhythms and expression of the immediate-early gene c-fos in the suprachiasmatic nucleus. Journal of Neuroscience, 16, 8208-8220.
Pickard, G.E., Smith, B.N., Belenky, M., Rea, M.A., Dudek, F.E., & Sollars, P.J. (1999). 5-HT1B receptor-mediated presynaptic inhibition of retinal input to the suprachiasmatic nucleus. Journal of Neuroscience, 19, 4034-4045.
Pinato, L., Ferreira, Z.S., Markus, R.P., Nogueira, M.I. (2004).
Pontes et al228
Bimodal daily variation in the serotonin content in the raphe nuclei of rats. Biological Rhythm Research, 35, 245-257.
Pinato, L., Allemandi, W., Abe, L.K., Frazão, R., Cruz-Rizzolo, R.J., Cavalcante, J.S., Costa, M.S.M.O., & Nogueira, M.I. (2007). A comparative study of cytoarchitecture and serotonergic afferents in the suprachiasmatic nucleus of primates (Cebus apella and Callithrix jacchus) and rats (Wistar and Long Evans strains). Brain Research, 1149, 101-110.
Portas, C.M., Thakkar, M., Rainnie, D., & McCarley, R.W. (1996). Microdialysis perfusion of 8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin (8-OH-DPAT) in the dorsal raphe nucleus decreases serotonin release and increases rapid eye movement sleep in the freely moving cat. Journal of Neuroscience, 16, 2820-2828.
Prosser, R.A., Miller, J.D., & Heller, H.C. (1990). A serotonin agonist phase-shifts the circadian clock in the suprachiasmatic nuclei in vitro. Brain Research, 534, 336-339.
Quay, W.B. (1968). Differences in circadian rhythms in 5-hydroxytryptamine according to brain region. American Journal of Physiology, 215, 1448-1453.
Ralph, M.R., Foster, R.G., Davis, F.C., & Menaker, M. (1990). Transplanted suprachiasmatic nucleus determines circadian period. Science, 247, 975-978.
Ramanathan, C., Nunez, A.A., Martinez, G.S., Schwartz, M.D., & Smale, L. (2006). Temporal and spatial distribution of immunoreactive PER1 and PER2 proteins in the suprachiasmatic nucleus and peri-suprachiasmatic region of the diurnal grass rat (Arvicanthis niloticus). Brain Research, 1073-1074, 348-358.
Rea, M.A., Glass, J.D., & Colwell C.S. (1994). Serotonin modulates photic responses in the hamster suprachiasmatic nuclei. Journal of Neuroscience, 14, 3635-3642.
Rea, M.A., Barrera, J., Glass, J.D., & Gannon, R.L. (1995). Serotonergic potentiation of photic phase shifts of the circadian activity rhythm. Neuroreport, 6, 1417-1420.
Ribak, C.E., & Peters, A. (1975). An autoradiographic study of the projections from the lateral geniculate body of the rat. Brain Research, 92, 341-368.
Rotenberg, L., Marques, N., & Menna-Barreto L. (2003). História e perspectivas da cronobiologia. In: N. Marques & L. Menna-Barreto, (Eds.), Cronobiologia: princípios e aplicações (pp. 31-53). São Paulo: Editora da Universidade de São Paulo.
Rusak, B., & Zucker, I. (1979). Neural regulation of circadian rhythms. Physiological Reviews, 59, 449-526.
Sakaguchi, T., & Bray, G.A. (1989). Effect of norepinephrine, serotonin and tryptophan on the firing rate of sympathetic nerves. Brain Research, 492, 271-280.
Scheurink, A.J., Leuvenink, H., & Steffens, A.B. (1993). Metabolic and hormonal responses to hypothalamic administration of norfenfluramine in rats. Physiology and Behavior, 53, 889-898.
Schwartz, W.J. (1991). SCN metabolic activity in vitro. In: D.C. Klein, R.Y. Moore & S.M. Reppert (Eds.), Suprachiasmatic nucleus: the mind’s clock (pp. 144-156). Oxford: Oxford University Press.
Sclafani, A., & Aravich, P.F. (1983). Macronutrient self-selection in three forms of hypothalamic obesity. American Journal of Physiology, 244, R686-R694.
Selim, M., Glass, J.D., Hauser, U.E., & Rea, M.A. (1993). Serotonergic inhibition of light-induced fos protein expression and extracellular glutamate in the suprachiasmatic nuclei. Brain Research, 621, 181-188.
Shioiri, T., Takahashi, K., Yamada, N., & Takahashi, S. (1991). Motor activity correlates negatively with free-running period, while positively with serotonin contents in SCN in free-running rats. Physiology and Behavior, 49, 779-786.
Smale, L., & Boverhof, J. (1999). The suprachiasmatic nucleus and the intergeniculate leaflet of Arvicanthis niloticus, a diurnal murid rodent from East Africa. Journal of Comparative Neurology, 403, 190-208.
Sollars, P.J., Simpson, A.M., Ogilvie, M.D., & Pickard, G.E. (2006). Light-induced Fos expression is attenuated in the suprachiasmatic nucleus of serotonin 1B receptor knockout mice. Neuroscience Letters, 401, 209-213.
Stephan, F.K., & Zucker, I. (1972). Circadian rhythms in drinking behavior and locomotor activity of rats are eliminated by hypothalamic lesions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 69, 1583-1586.
Stokkan, K.A., Yamazaki, S., Tei, H., Sakaki, Y., & Menaker, M. (2001). Entrainment of the circadian clock in the liver by feeding. Science, 291, 490-493.
Swanson, L.W., Cowan, W.M., & Jones, E.G. (1974). An autoradiographic study of the efferent connections of the ventral geniculate nucleus in the albino rat and the cat. Journal of Comparative Neurology, 156, 143-163.
Taber, E. (1961). The cytoarchitecture of the brain stem of the cat: I. Brain stem nuclei of cat. Journal of Comparative Neurology, 116, 27-69.
Taber, E., Brodal, A., & Walberg, F. (1960). The raphe nuclei of the brain stem in the cat: I. Normal topography and general discussion. Journal of Comparative Neurology, 114, 161-187.
Takase, L.F., Barone, J.R., & Nogueira, M.I. (2000). Involvement of the caudal raphe nuclei in the feeding behavior of rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 33, 223-228.
Tang-Christensen, M., Havel, P.J., Jacobs, R.R., Larsen, P.J., & Cameron, J.L. (1999). Central administration of leptin inhibits food intake and activates the sympathetic nervous system in rhesus macaques. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 84, 711-717.
Tominaga, K., Shibata, S., Ueki, S., & Watanabe S. (1992). Effects of 5-HT1A receptor agonists on the circadian rhythm of wheel-running activity in hamsters. European Journal of Pharmacology, 214, 79-84.
Törk, I. (1985). Raphe nuclei and serotonin containing systems. In: G. Paxinos (Ed.), The rat nervous system (pp. 43-78). Sydney: Academic Press.
Törk, I., & Hornung, J.-P. (1990). Raphe nuclei and the serotoninergic system. In: G. Paxinos (Ed.). The Human Nervous System. (pp. 1001-1002). San Diego: Academic Press.
Trulson, M.E., & Jacobs, B.L. (1979). Raphe unit activity in freely moving cats: correlation with level of behavioral arousal. Brain Research, 163, 135-150.
Ueda, S., Kawata, M., & Sano Y. (1983). Identification of serotonin and vasopressin immunoreactivities in the suprachiasmatic nucleus of four mammalian species. Cell Tissues Research, 234, 237-248.
Ukai, H., & Ueda, H.R. (2010). System biology of mammalian circadian clocks. Annual Review of Physiology, 72, 579-603.
Umbriaco, D., Anctil, M. & Descarries, L. (1990). Serotonin-immunoreactive neurons in the cnidarian Renilla köllikeri. Journal of Comparative Neurology, 291, 167-178.
Ursin, R. (2002). Serotonin and sleep. Sleep Medicine Reviews, 6, 55-69.van den Pol, A.N., & Tsujimoto, K.L. (1985). Neurotransmitters of
the hypothalamic suprachiasmatic nucleus: immunocytochemical analysis of 25 neuronal antigens. Neuroscience, 15, 1049-1086.
Vansteensel, M.J., Yamazaki, S., Albus, H., Deboer, T., Block, G.D., & Meijer, J.H. (2003). Dissociation between circadian Per1 and neuronal and behavioral rhythms following a shifted environmental cycle. Current Biology, 13, 1538-1542.
Wang, Z., Toloczko, D., Young, L.J., Moody, K., Newman, J.D., & Insel, T.R. (1997). Vasopressin in the forebrain of commom marmosets (Callitrhix jacchus): studies with in situ hybridization, immunohistochemistry and receptor autoradiography. Brain Research, 768, 147-156.
Weber, E.T., Gannon, R.L. & Rea, M.A. (1998). Local administration of serotonin agonists blocks light-induced phase advances of the circadian activity rhythm in the hamster. Journal of Biological Rhythms, 13, 209-218.
Weiss, G.F., Rogacki, N., Fueg, A., Buchen, D., & Leibowitz, S.F. (1990). Impact of hypothalamic d-norfenfluramine and peripheral d-fenfluramine injection on macronutrient intake in the rat. Brain Research Bulletin, 25, 849-859.
Weiss, G.F., Rogacki, N., Fueg, A., Buchen, D., Suh, J.S., Wong, D.T., & Leibowitz, S.F. (1991). Effect of hypothalamic and peripheral fluoxetine injection on natural patterns of macronutrient intake in the rat. Psychopharmacology (Berl), 105, 467-476.
Welsh, J.H. (1970). Phylogenetic aspects of the distribution of biogenic amines. In: J.J. Blum (Ed.), Biogenic amines as physiological regulators (pp. 75-94). Englewood Cliffs, N.J.: Prentice-Hall.
Willard, A.L. (1981). Effects of serotonin on the generation of the motor program for swimming by the medicinal leech. Journal of Neuroscience, 1, 936-944.
Yannielli, P.C., Cutrera, R.A., Cardinali, D.P., & Golombek, D.A. (1998). Neonatal clomipramine treatment of Syriam hamsters: effect on the circadian system. European Journal Pharmacology, 349, 143-150.
Yannielli, P.C. & Harrington, M.E. (2000). Neuropeptide Y applied in vitro can block the phase shifts induced by light in vivo. Neuroreport, 11, 1587-1591.