PROJETO DE MESTRADO UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

Análise de biomarcadores renais em pacientes com Doença de Fabry

Aluna Marion Coting Braga1

Orientador

Profa. Dra. Vânia D’Almeida2

Colaboradores Prof. Dr. Fernando Luiz Affonso Fonseca3

Profa. Dra. Ana Maria Martins4

1Farmacêutica do Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo 2Professora Associada do Departamento de Psicobiologia da Universidade Federal de São Paulo 3Professor Adjunto da Disciplina de Hematologia e Responsável pelo laboratório de Análises Clínicas da Faculdade de Medicina da Fundação do ABC 4Professora Adjunto da Universidade Federal de São Paulo

São Paulo 2015

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RESUMO ESTRUTURADO

Fundamentação Científica

A Doença de Fabry é uma doença genética crônica, progressiva e

multissistêmica, causada pela deficiência da enzima alfa-galactosidade A

presente nos lisossomos, gerando acúmulo de globotriaosilceramida,

comprometendo principalmente o endotélio vascular de rins, fígado, coração,

baço e cérebro (Desnick et al., 2003; Muller et al.,2012).

Cistatina C é um biomarcador de função do glomérulo relacionado com a

taxa de filtração glomerular, enquanto beta-2-microglobulina, lipocalina

associada à gelatinase de neutrófilos (NGAL), α1-microglobulina, proteína

transportadora de retinol entre outros são biomarcadores para a função de

reabsorção tubular (Adiyanti, 2012).

Justificativa

Como na Doença de Fabry existe grande possibilidade de

comprometimento dos rins, a identificação de lesão ou perda de função deste

órgão torna-se fundamental para evitar a falência renal, mesmo para o paciente

sob tratamento de reposição enzimática.

Apesar de novos biomarcadores apresentarem maior sensibilidade e

especificidade na detecção de lesão renal, a falta de correlação com a clínica do

paciente impossibilita a substituição da dosagem de creatinina sérica como

principal ferramenta no diagnóstico e acompanhamento de lesão renal. Além

disso, é recomendado o uso, não apenas de um, mas de diferentes

biomarcadores devido à complexidade, heterogeneidade e ampla possiblidade

de disfunções renais (Adiyanti, 2012; Murray, 2014).

Hipótese

Os biomarcadores renais cistatina C, beta-2-microglobulina, NGAL

quantificados em amostras de sangue e urina de pacientes com Doença de

Fabry são mais sensíveis e específicos do que a creatinina sérica, atual

2

biomarcador renal dosado nesses pacientes, auxiliando no diagnóstico precoce

de alterações renais.

Objetivos

Objetivo Primário: avaliar biomarcadores renais em pacientes com

Doença de Fabry.

Objetivo Secundário: correlacionar os dados e exames de rotina dos

pacientes com os resultados das dosagens dos biomarcadores propostos.

Casuística e métodos

Cerca de 60 pacientes com Doença de Fabry, estando ou não em

tratamento de reposição enzimática e que respeitem os critérios de exclusão,

bem como o grupo controle, composto por dois indivíduos para cada paciente,

sendo ambos sem Doença de Fabry, entretanto um com e outro sem doença

renal, pareados por idade, sexo e IMC.

Sangue periférico e urina dos pacientes e controles serão coletados para

análise de urina Tipo I e quantificação dos biomarcadores por ELISA e

quimioluminescência. Será realizada análise estatística dos dados com nível de

significância de 5%.

Resultados esperados

Cistatina C, beta-2-microglobulina, NGAL quantificados em amostras de

sangue e urina de pacientes com Doença de Fabry sejam mais sensíveis e

específicos do que a creatinina sérica.

Palavras-chaves: Doença de Fabry, Insuficiência Renal, Biomarcador Renal

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1. INTRODUÇÂO

1.1. Biomarcadores renais

O rim tem a incrível capacidade de resistir a longos períodos de

perturbações sem sofrer injúria. O dano causado ao rim depende da

sensibilidade celular individual, que varia conforme o tipo, localização no néfron,

vascularização local e da causa primária da injúria. Disfunção, morte,

proliferação, inflamação e recuperação são os resultados dos processos os

quais as células renais respondem frente as ações do agente agressor (Adiyanti,

2012).

Segundo a Sociedade Brasileira de Nefrologia, a perda da função renal

pode ocorrer de forma rápida e geralmente reversível (aguda) ou lenta,

progressiva e irreversível (crônica) (Cabral, 2015). O termo insuficiência renal

aguda (IRA), que defini diminuição da função renal por retenção de resíduos

nitrogenados, tem sido substituído para lesão renal aguda (LRA) por englobar

não só a diminuição da taxa de filtração glomerular (TFG) medido através da

dosagem de creatinina sérica, como todos os aspectos clínicos que envolvem a

perda da função renal, uma vez que a creatinina sérica, apesar de sua fácil

obtenção, apresenta limitações na identificação de rápidas alterações na TFG.

Na busca por novas definições do termo IRA, dois novos critérios de

estadiamento foram criados: RIFLE (do inglês, Risk, Injury, Failure, Loss e ESRD

- End-Stage Kidney Disease para Risco, Lesão, Insuficiência, Perda e DRET -

Doença Renal em Estágio Terminal) e AKIN (Acute Kidney Injury Network), que

dividiu a LRA em três estágios (Tabela 1). Tanto RIFLE quanto AKIN possuem

embasamento na concentração sérica de creatinina e no fluxo urinário e ambos

são utilizados para avaliação funcional e estrutural dos rins. (KDIGO, 2012).

Tabela 1 | Comparação de critérios RIFLE e AKIN para diagnóstico e classificação de LRA.

AKIN Ambos RIFRE

Creatinina sérica Depuração da

urina Risco

Aumento ×1,5 de creatinina sérica ou diminuição na

TFG >25%

Estágio 1 ≥ 0.3 mg/dl ou ≥150% a 200% do valor basal

< 0,5 ml/kg/h por um período superior a 6

horas

Lesão

Aumento ×2 de creatinina sérica ou diminuição na

TFG >50%

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Estágio 2 >200% to 300% do valor basal

< 0,5 ml/kg/h por um período

superior a 12 horas

Insuficiência

Aumento ×3 de creatinina sérica

com aumento agudo >0,5 mg/dl ou diminuição na

TFG >75%

Estágio 3

> 300% do valor basal ou ≥ 4,0

mg/dl com aumento agudo de pelo menos

0,5 mg/dl ou em Hemodiálise

< 0,3 ml/kg/h por um período

superior a 24 horas ou anúria

por 12 horas

Perda

Falência Renal Aguda =

completa perda da função renal

>4 semanas

DRET >3 meses

O biomarcador ideal para LRA deve ser de quantificação rápida e pouco

onerosa, preciso e exato em seus resultados, com facilidade de coleta,

específico para o rim, além de ter seus níveis elevados logo nos primeiros

estágios de perda da alteração renal e, finalmente, ser capaz de definir a

severidade da disfunção renal (Adiyanti, 2012).

Cistatina C (CysC) é um biomarcador de função do glomérulo relacionado

com a TFG, enquanto beta-2-microglobulina, lipocalina associada à gelatinase

de neutrófilos (NGAL) e outros biomarcadores como α1-microglobulina, N-acetil-

beta-D-glicosamidase (NAG), proteína transportadora de retinol (RBP),

interleucina-18 (IL-18), Netrin-1, molécula de lesão renal-1 (KIM-1), clusterina,

isoforma do trocador sódio hidrogênio e fetuin A são biomarcadores para a

função de reabsorção tubular (Adiyanti, 2012).

Atualmente, apesar de novos biomarcadores apresentarem maior

sensibilidade e especificidade na detecção de LRA, a falta de correlação com a

clínica do paciente impossibilita a substituição da dosagem de creatinina sérica

como principal ferramenta no diagnóstico e acompanhamento de LRA. Além

disso, é recomendado o uso, não apenas de um, mas de diferentes

biomarcadores devido à complexidade, heterogeneidade e ampla possiblidade

de disfunções renais (Adiyanti, 2012; Murray, 2014).

1.2. Doença de Fabry

A Doença de Fabry é uma doença genética crônica, progressiva e

multissistêmica, causada pela deficiência da enzima alfa-galactosidade A

presente nos lisossomos, gerando acúmulo de globotriaosilceramida (Gb3), além

de outros glicosilesfingolipídeos relacionados, comprometendo principalmente o

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endotélio vascular de rins, fígado, coração, baço e cérebro (Desnick et al., 2001;

Desnick et al., 2003; Muller et al.,2012).

Essa doença de depósito lisossômico afeta cerca de 1:40.000 indivíduos

e, apesar de estar relacionada cromossomo X, acometendo predominantemente

os homens (homozigotos), as mulheres portadoras da mutação (heterozigotas)

também podem ter características clínicas presentes (Carrel, 2005; Whybra et

al., 2001; Desnick et al., 2003; Muller et al., 2012; Spada et al., 2006).

A forma clássica da doença, com nenhum resíduo de atividade

enzimática, possui caráter neurológico (dor), cutâneo (angioqueratoma), renal,

cardiovascular (cardiomiopatia, arritmia), cócleo-vestibular (alterações na

audição e equilíbrio) e cerebrovascular (isquemia, derrames), além de parestesia

de extremidades, distrofia da córnea e outras doenças vasculares oclusivas no

coração, rins e cérebro, levando à morte prematura (Germain, 2010; Muller,

2012; Waldek, 2014)

As alterações renais na Doença de Fabry são observadas pela presença

de proteinúria e redução da taxa de filtração glomerular, podendo progredir para

Doença Renal Crônica, seguida de falência renal e morte. O acompanhamento

da função e lesão renais são fundamentais para o prognóstico desses pacientes,

mesmo sob tratamento de reposição enzimática (Torralba-Cabeza, 2011)

2. OBJETIVO

2.1. Objetivo geral

O objetivo deste estudo é avaliar biomarcadores renais em pacientes com

Doença de Fabry.

2.2. Objetivo específico

Quantificar cistatina C, beta-2-microglobulina, NGAL e creatinina em

amostras de sangue e urina de pacientes com Doença de Fabry.

Correlacionar os dados e exames de rotina do paciente (proteinúria,

imagem renal, estatura, peso, taxa de filtração glomerular, pressão arterial e

avaliação clínica) com os resultados das dosagens dos biomarcadores

propostos.

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3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Pacientes

Serão convidados a participar do estudo pacientes com Doença de Fabry

maiores de 18 anos, sendo o diagnóstico comprovado por análise bioquímica

(dosagem enzimática) e/ou molecular (mutação presente em DNA), atendidos

regularmente no Centro de Referência em Erros Inatos do Metabolismo da

UNIFESP (sob coordenação da Profa. Dra. Ana Maria Martins), estando ou não

em tratamento de reposição enzimática (TRE).

Para cada paciente incluído no estudo serão recrutados um indivíduo

saudável e um indivíduo com doença renal semelhante, porém de etiologia

diferente à Doença de Fabry, sendo pareados por idade e sexo, para compor o

grupo controle.

Após receber todas as informações necessárias a respeito do projeto,

cada voluntário (ou seu responsável) que aceitar participar do estudo assinará o

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa.

Dentre os critérios de exclusão encontram-se os pacientes que possuem

morbidades sorológicas (HIV, HCV, Hepatite B), que estiveram internados nos

últimos seis meses por qualquer motivo ou causa que não a Doença de Fabry e

não forem do Centro de Referência em Erros Inatos do Metabolismo da

UNIFESP.

3.2. Biomarcadores

Sangue periférico (20 mL) dos pacientes e controles serão coletados por

punção venosa em tubos sem anticoagulante e contendo anticoagulante EDTA,

que serão centrifugados a 2000rpm/10min/4°C para separação de soro e

plasma.

Urina (cerca de 20.0 mL) dos pacientes e controle será coletada em frasco

coletor universal para determinação dos parâmetros contidos na avaliação de

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urina Tipo I (características macroscópicas, testes físico-químicos e

sedimentoscopia).

A análise dos biomarcadores será realizada por ELISA e

quimioluminescência.

Após as dosagens dos biomarcadores será feita a análise estatística dos

dados. O nível de significância considerado será de 5%.

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ANEXO I – Cronograma

1º semestre – recrutamento dos pacientes e controles; coleta de amostras e

dados

2º semestre – análise de amostras e dados

3º semestre – redação da publicação

ANEXO II - Infra-estrutura e apoio técnico

Os pacientes serão atendidos no Centro de Referência em Erros Inatos

do Metabolismo da UNIFESP.

O projeto será realizado nas dependências do Laboratório de Análises

Clínicas da Faculdade de Medicina do ABC e do Laboratório de Erros Inatos do

Metabolismo da Universidade Federal de São Paulo, que possuem os

equipamentos e apoio técnico necessários para a execução do presente

trabalho.

ANEXO III – Orçamento

Gasto estimando com reagentes em R$ 10.000,00, obtidos por recursos

próprios.

ANEXO IV - Patrocínio

Os pesquisadores não serão remunerados pela condução da pesquisa e

as despesas financeiras serão patrocinadas pelo Instituto de Genética e Erros

Inatos do Metabolismo.

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TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

“ANÁLISE DE BIOMARCADORES RENAIS EM PACIENTES COM DOENÇA DE FABRY”

I. INTRODUÇÃO

Você está sendo convidado a participar voluntariamente de uma pesquisa

para a dosagem de biomarcadores renais em pacientes com Doença de Fabry.

Biomarcadores são substâncias presentes no organismo as quais sua

presença ou dosagem indicam se há alteração no órgão relacionado. Um

biomarcador renal comumente utilizado é a creatinina sérica, porém outros

biomarcadores descritos na literatura possuem vantagens no monitoramento da

função renal e resposta ao tratamento.

Como a Doença de Fabry é uma doença genética crônica e progressiva

com grande possibilidade de comprometimento dos rins, a identificação de lesão

ou perda de função deste órgão torna-se fundamental para evitar a falência renal,

mesmo para o paciente sob tratamento de reposição enzimática.

Por gentileza, leia com atenção as informações a seguir. Em caso de

dúvidas, os pesquisadores estão à disposição para quaisquer esclarecimentos.

II. QUAL O OBJETIVO?

O objetivo deste estudo é avaliar biomarcadores renais em pacientes com

Doença de Fabry.

III. QUEM SÃO OS VOLUNTÁRIOS?

Serão convidados a participar do estudo pacientes com Doença de Fabry

maiores de 18 anos, sendo o diagnóstico comprovado por dosagem enzimática

e/ou mutação em DNA, atendidos regularmente no Centro de Referência em

2

Erros Inatos do Metabolismo da UNIFESP, estando ou não em tratamento de

reposição enzimática (TRE).

Para cada paciente incluído no estudo serão recrutados um indivíduo

saudável e um indivíduo com doença renal semelhante, porém de etiologia

diferente à Doença de Fabry, sendo pareados por idade e sexo, para compor o

grupo controle. Os voluntários para ambos os controles serão pacientes ou

funcionários provenientes da Universidade Federal de São Paulo, do Hospital

São Paulo, ambulatórios de vinculados à Faculdade de Medicina do ABC, do

Hospital Estadual Mário Covas, do Hospital de Ensino Anchieta, dos laboratórios

de Erros Inatos do Metabolismo e de Análises Clínicas da Faculdade de Medicina

do ABC.

Dentre os critérios de exclusão encontram-se os pacientes que possuem

morbidades sorológicas (HIV, HCV, Hepatite B), que estiveram internados nos

últimos seis meses por qualquer motivo ou causa que não a Doença de Fabry e

não forem do Centro de Referência em Erros Inatos do Metabolismo da

UNIFESP.

IV. O QUE SERÁ FEITO?

Serão consultados prontuário e histórico médico para a coleta de dados,

incluindo informações relacionadas à função renal. Amostras de sangue e urina

serão coletadas para a análise de beta-2-microglobulina, cistatina C, NGAL

(neutrophil gelatinase associated lipocalin) e creatinina sérica como

biomarcadores renais.

V. QUAIS SÃO OS DESCONFORTOS E RISCOS?

O desconforto está relacionado com a coleta de sangue, que será feita

por punção venosa periférica do antebraço, conforme realizado na maioria dos

exames de sangue e envolve risco leve. A urina será coletada conforme

procedimento padrão, com risco mínimo ao paciente.

O sigilo de todas as informações relacionadas ao paciente, bem como de

resultados está assegurada pelos envolvidos na pesquisa, sendo risco de

violação de sigilo classificado como mínimo.

3

VI. QUAIS SÃO OS BENEFÍCIOS?

Os pacientes poderão ser beneficiados com os desdobramentos deste

presente estudo, que inclui a avaliação renal, possibilitando a identificação

precoce de alteração renal, comumente ocasionada pela Doença de Fabry.

VII. GARANTIA DE ESCLARECIMENTOS EM CASO DE DÚVIDA

Todas as informações a respeito do andamento do serão comunicados

aos participantes e serão esclarecidas quaisquer outras dúvidas.

Caso existam dúvidas sobre o estudo ou tiver um problema relacionado

ao mesmo, entre em contato com o investigador principal, a farmacêutica Marion

Coting Braga, do Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo da UNIFESP,

localizado na Rua Napoleão de Barros, 925, 3º andar, São Paulo – SP, telefone

2149-0155 (ramal 283).

Haverá orientação da Profa. Dra. Vânia D’Almeida, coordenadora do

Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo da UNIFESP.

Haverá colaboração do Profº Dr. Fernando Luiz Affonso Fonseca, do

Laboratório de Análises Clínicas da Faculdade de Medicina da Fundação do

ABC, localizado na Av. Príncipe de Gales, 821, anexo 3, 2º andar, Santo André

–SP e da Profa. Dra. Ana Maria Martins, responsável pelo acompanhamento dos

pacientes do Centro de Referência em Erros Inatos do Metabolismo. O Instituto

de Genética e Erros Inatos do Metabolismo localiza-se na Rua Coronel Lisboa,

957, São Paulo – SP, telefone 5081-9620.

Se houver alguma consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa,

deve-se entrar em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da

UNIFESP: Rua Botucatu, 572 – 1º andar – cj. 14, fone: 5571-1062 e FAX: 5539-

7162, e-mail: cepunifesp@unifesp.br.

O Comitê de Ética é responsável pela avaliação e acompanhamento dos

aspectos éticos de todas as pesquisas envolvendo seres humanos, visando

assegurar a proteção, a dignidade, os direitos, a segurança e o bem-estar do

participante da pesquisa.

Após receber todas as informações necessárias a respeito do projeto,

cada voluntário (ou seu responsável) que aceitar participar do estudo assinará o

4

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa, disponibilizados em duas vias originais, sendo uma destinada ao

pesquisador e outra ao participante.

VI. POSSO DESISTIR?

A autorização para realização do estudo pode ser retirada a qualquer

momento sem que o participante deixe de receber orientação, tratamentos ou

resultados já obtidos.

VII. SEGURANÇA DO SIGILO

Toda a informação a respeito do participante e seus exames será mantida

em sigilo com o intuito de manter a privacidade do mesmo.

VIII. COMPROMISSO DE ATUALIZAR A INFORMAÇÃO

As informações serão fornecidas de maneira atualizada visando um maior

esclarecimento dos familiares e até uma eventual mudança de opinião em

continuar ou não participando do projeto.

IX. DISPONIBILIDADE DE TRATAMENTO MÉDICO

Todos os participantes receberão acompanhamento médico necessário,

assim como o direito de se manterem atualizados sobre os resultados parciais

da pesquisa ou de resultados que sejam de conhecimento dos pesquisadores.

Em caso de dano pessoal, diretamente causados pelos procedimentos ou

tratamentos propostos neste estudo, o participante tem direito a tratamento

médico na Instituição bem como às indenizações legalmente estabelecidas.

5

X. GASTOS

Todos os procedimentos médicos e de diagnóstico laboratorial pertinentes

à pesquisa serão pagos pela Instituição sem, portanto, qualquer gasto por parte

do participante.

XI. COMPROMISSO DO PESQUISADOR

O pesquisador responsável se compromete a utilizar os dados e o material

coletados somente para esta pesquisa.

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TERMO DE CONSENTIMENTO

Acredito ter sido suficientemente esclarecido a respeito das informações

que li ou que me foram lidas, descrevendo o estudo. Ficaram claros quais são

os propósitos desta pesquisa, os procedimentos a serem realizados, seus

desconfortos e riscos, as garantias de confidencialidade e de esclarecimentos

permanentes. Ficou claro também que a minha participação é isenta de

despesas e que tenho garantia de acesso a tratamento hospitalar quando

necessário. Concordo voluntariamente em participar deste estudo e poderei

retirar o meu consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo,

sem penalidades, prejuízo ou perda de qualquer benefício que eu possa ter

adquirido, ou no meu entendimento neste serviço.

Eu, ______________________________________________________,

portador(a) da Cédula de Identidade (RG) nº ____________________, e

inscrito(a) no CPF nº _________________________, nascido(a) em

___/___/_____, residente em ______________________________, na cidade

de ______________________ no Estado de _____, telefone: ( )___________,

do sexo ( ) feminino ( ) masculino, declaro que, após convenientemente

esclarecido pelo pesquisador e ter entendido o que me foi explicado, consinto

em participar do presente Projeto de Pesquisa: “Análise de biomarcadores

renais em pacientes com Doença de Fabry”

_____________________________ __________________________ data: __/__/__

Nome do participante da pesquisa assinatura

_____________________________ __________________________ data: __/__/__

Nome da testemunha assinatura

_____________________________ __________________________ data: __/__/__

Nome do pesquisador principal assinatura

Local: __________________________________

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