MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA E BIODIVERSIDADE

ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA EM ERVA BALEEIRA (Varronia curassavica Jacq.) BASEADA NO

MARCADOR ISSR

FABIANY DE ANDRADE BRITO

2016

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA E BIODIVERSIDADE

FABIANY DE ANDRADE BRITO

ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA EM ERVA BALEEIRA (Varronia

curassavica Jacq.) BASEADA NO MARCADOR ISSR Dissertação apresentada à Universidade Federal de Sergipe, como parte das exigências do Curso de Mestrado em Agricultura e Biodiversidade, área de concentração em Agricultura e Biodiversidade, para obtenção do título de “Mestre em Ciências”. Orientador Prof. Dr. Arie Fitzgerald Blank

SÃO CRISTÓVÃO SERGIPE – BRASIL

2016

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA SISTEMA DE BIBLIOTECAS UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

B862a

Brito, Fabiany de Andrade Análise da diversidade genética em erva baleeira (Varronia curassavica Jacq.)

/ Fabiany de Andrade Brito ; orientador Arie Fitzgerald Blank. – São Cristóvão, 2016.

25 f. : il.

Dissertação (mestrado em Agricultura e Biodiversidade)– Universidade Federal de Sergipe, 2016.

1. Agricultura. 2. Plantas - Conservação. 3. Diversidade vegetal. 4. Genética vegetal. 5. Varronia curassavica. I. Blank, Arie Fitzgerald, orient. II. Título.

CDU 633.88

FABIANY DE ANDRADE BRITO

ANÁLISE DA DIVERSIDADE GENÉTICA EM ERVA BALEEIRA (Varronia

curassavica Jacq.) BASEADA NO MARCADOR ISSR Dissertação apresentada à Universidade Federal de Sergipe, como parte das exigências do Curso de Mestrado em Agricultura e Biodiversidade, área de concentração em Agricultura e Biodiversidade, para obtenção do título de “Mestre em Ciências”.

APROVADA em 26 de Fevereiro de 2016.

Profa. Dra. Ana Veruska Cruz da Silva Muniz

EMBRAPA/UFS - PPGAGRI

Dra. Glyn Mara Figueira UNICAMP/CPQBA

Prof. Dr. Arie Fitzgerald Blank UFS

(Orientador)

SÃO CRISTÓVÃO SERGIPE – BRASIL

A todos que ajudaram na minha formação e no

desenvolvimento deste trabalho

Dedico

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, Aquele que me guia e protege todos os dias, me dando força e sabedoria na caminhada da vida, que não me abandona e não deixa desistir dos meus sonhos, pela saúde, oportunidades e pessoas grandiosas que coloca em meu caminho.

A Universidade Federal de Sergipe, pela formação desde a minha graduação em Engenharia Agronômica. Ao Programa de Pós-graduação em Agricultura e Biodiversidade, pela oportunidade e pelo título de mestre em Ciências. A todos os professores do PPGAGRI pela formação durante as disciplinas, em especial professor Arie Blank, Maria de Fátima, Marcelo Carnelossi, Renata Mann, Leandro Bacci e Ana Veruska.

A CAPES pelo apoio financeiro do projeto e concessão da bolsa. A minha querida, grande amiga, minha MÃE, que está ao meu lado em todos os

momentos, que me orienta e apóia em todas as minhas decisões, é infinita gratidão, meu amor e inspiração. Assim como meu PAI e meu irmão Gabriel, que estão comigo sempre em todos os momentos.

A toda minha família, que tanto torce por mim. Ao professor Arie pela orientação desde a graduação, paciência, dedicação,

competência e amizade durante toda minha formação, por todas as oportunidades e por se preocupar comigo e com meu futuro profissional, grande exemplo de dedicação a vida acadêmica.

A professora Ana Veruska, por ter me acolhido de braços abertos e me conduzido nos experimentos na EMBRAPA, bem que todos dizem “Ana Veruska é uma mãe”, e comigo não foi diferente, agora eu entendi o verdadeiro sentido dessa expressão com os orientados, por aliar amizade, carinho, competência e muita paciência. Qualidade em tudo que faz, sei que ganhei também uma grande amiga.

Ao professor Leandro Diniz, grande profissional, exemplo de competência e dedicação ao trabalho, muito obrigada por sempre me ouvir, pela paciência, pela prontidão em sempre esclarecer minhas dúvidas e principalmente pelos conselhos que levarei para toda vida, pode ter certeza que fizeram toda a diferença.

Ao pessoal do Laboratório de Biologia Molecular da EMBRAPA, técnico Silvio Gomes, pessoa de incalculável caráter e inteligência, jamais vou esquecer sua grande ajuda e amizade. Ao pessoal do laboratório: Ariane, Ciro, Tanísia (ahh meninaa), Trícia, Marília e Letícia, vocês fizeram os meus dias de trabalho mais leve, diante de toda correria e milhares de coisas para fazer, sempre com boas conversas, gargalhadas e claro, a tão esperada hora do “coffee” da tarde.

Ao pessoal do GPMACO, em especial Thiago, Elisangela, Mércia, Luiz Fernando, Bruna, Jéssika, Vanderson, Rosana, Camila, Larissa e Mariana, com eles não tem tempo ruim, nem cansaço, resumo-os na expressão “A união faz a força”, grandes amigos para toda vida. A Daniela Nizio que está comigo desde a Iniciação Científica, que se tornou uma grande amiga, obrigada pelos ensinamentos e por sempre me estender sua mão principalmente nas horas difíceis.

A Sheila Carvalho e professora Renata Mann, também as meninas do laboratório da UFS, Rafaela e Lícia, com elas eu comecei os primeiros passos na Biologia Molecular para o mestrado.

A professora Maria Zucchi, professor José Baldin, Glyn Figueira e Mariana Novello, por todo auxílio e atenção.

A todos os colegas de curso, em especial Fernando Araújo, Bruno Freitas, Juliana Lopes, Annie e Rafael Salomão. A Airles, grande amiga desde a graduação, obrigada por sempre me ouvir e acalmar nas horas complicadas, nem que fosse com um “Deixe de agonia que vai dar tudo certo, num instante você faz as coisas” pelos trabalhos de curso e algumas horas de estudo. A Tuca e Paulinho, pela torcida e companheirismo de sempre.

A todos meu muito obrigada, estão todos no meu coração para sempre...

SUMÁRIO

Página LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... i LISTA DE TABELAS .................................................................................................... ii LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS................................................ iii RESUMO ......................................................................................................................... iv ABSTRACT .................................................................................................................... v 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 1 2. REFERENCIAL TEÓRICO ........................................................................................ 2

2.1. Aspectos gerais da espécie medicinal Varronia curassavica Jacq. (Cordia

Verbenaceae DC) .........................................................................................................

2 2.2. Diversidade genética em Plantas Medicinais e Aromáticas ................................. 3

3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 6 3.1. Material Vegetal .................................................................................................. 6 3.2. Extração de DNA e amplificação PCR-ISSR ...................................................... 8 3.3. Análise de dados .................................................................................................. 9 4. RESULTADOS ............................................................................................................ 10

4.1. Diversidade genética ............................................................................................. 10 4.2. Análises de agrupamento e Componente Principal .............................................. 10

5. DISCUSSÃO ............................................................................................................... 17 6. CONCLUSÕES ........................................................................................................... 19 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 20

i

LISTA DE FIGURAS

Figura Página 1 Mapa do Estado de Sergipe identificando as regiões onde foram coletadas

estacas de Varronia curassavica para implantação do Banco Ativo de Plantas Medicinais e Aromáticas da Universidade Federal de Sergipe. ......... 7

2 Plantas do Banco ativo de germoplasma de Varronia curassavica da

Universidade Federal de Sergipe, localizado na fazenda experimental Campus rural da UFS, São Cristóvão/Sergipe ................................................ 8

3 Dendrograma gerado através do método UPGMA dos 28 acessos do Banco

Ativo de Germoplasma de Plantas Medicinais e Aromáticas de Varronia

curassavica da Universidade Federal de Sergipe. .......................................... 13 4 Subdivisão em grupos, dos 28 acessos de Varronia curassavica do Banco

Ativo de Germoplasma de Plantas Medicinais e Aromáticas da Universidade Federal de Sergipe através do marcador ISSR, com base na análise Bayesiana realizada utilizando o programa de Estruture (k = 2). Cada barra vertical representa um acesso, com as barras de mesma cor agrupadas .........

14 5 Análise de componente principal gerada através de software Statistic com

base nos 149 alelos identificados.. .................................................................. 15 6 Perfis eletroforéticos dos fragmentos de Inter Repetições de Sequência

Simples amplificados em gel de agarose utilizando os primers ISSR5, ISSR6, UBC811 dos 28 acessos de Varronia curassavica do Banco Ativo de Germoplasma da Universidade Federal de Sergipe ........................................ 16

ii

LISTA DE TABELAS

Tabela Página 1 Informações geográficas dos 28 acessos de Varronia curassavica do Banco

Ativo de Germoplasma de Plantas Medicinais e Aromáticas da Universidade Federal de Sergipe ...............................................................................................

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2 Primers ISSR, sequencia, temperatura de anelamento e amplificação dos

produtos usados para a análise de diversidade genética em Varronia

curassavica ......................................................................................................... 9 3 Matriz de similaridade de Jaccard dos acessos de Varronia curassavica do

Banco Ativo de Germoplasma de Plantas Medicinais e Aromáticas da Universidade Federal de Sergipe ......................................................................... 11

iii

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS BAG Banco Ativo de Germoplasma ISSR Inter Simple Sequence Repeat PCR Polimerase Chain Reaction DNA Ácido Desoxirribonucleico

iv

RESUMO BRITO, Fabiany de Andrade. Análise da diversidade genética em erva baleeira (Varronia

curassavica Jacq.) baseada no marcador ISSR. São Cristóvão: UFS, 2016. 25p. (Dissertação – Mestrado em Agricultura e Biodiversidade).* A erva baleeira (Varronia curassavica Jacq.) é uma planta medicinal e aromática nativa do Brasil, com importância econômica relevante. Estudos de diversidade genética em Bancos Ativos de Germoplasma são essenciais em programas de conservação e melhoramento genético. O objetivo do presente estudo foi analisar a diversidade genética dos acessos de V.

curassavica do Banco Ativo de Germoplasma de Plantas Medicinais e Aromáticas da Universidade Federal de Sergipe através do marcador molecular Inter Simple Sequence Repeat (ISSR). Foi extraído DNA de 28 indivíduos, através do método CTAB 2%. Foram testados 24 primers, onde 14 deles foram polimórficos e informativos, resultando em 149 bandas amplificadas com 97,98% de polimorfismo. O método de agrupamento da Média Aritmética Não Ponderada dividiu os acessos em dois Grupos, I e II. Na matriz de similaridade de Jaccard houve variação de 0,24 a 0,78. Os pares de acessos VCUR-001/VCUR-503, VCUR-001/VCUR-504 e VCUR-104/VCUR-501, apresentaram maior diversidade (0,24) e os pares VCUR-402/VCUR-403, apresentaram média diversidade (0,78). Houve a separação dos 28 acessos em três grupos distintos, de acordo com a análise do Structure. Conforme a Análise de Componente Principal (ACP), o componente principal primário representou 13,19% da variância total, e o componente principal secundário representou 9,38% da variância total. A diversidade genética do Banco Ativo de Germoplasma de erva-baleeira da UFS é de baixa a média, sendo necessária sua ampliação. O acesso VCUR-802 é o mais indicado para seleção em programa de melhoramento dessa espécie, por representar claramente toda diversidade presente no BAG. Palavras-chave: Varronia curassavica, conservação, diversidade, ISSR.

_________________

*Orientador: Arie Fitzgerald Blank - UFS.

v

ABSTRACT BRITO, Fabiany de Andrade. Genetic diversity analysis of Varronia curassavica Jacq. accessions by using ISSR markers. São Cristóvão: UFS, 2016. 25p. (Dissertation - Master of Science in Agriculture and Biodiversity).* Varronia curassavica Jacq. is a medicinal and aromatic plant from Brazil, with significant economic importance. Studies on genetic diversity in Active Germplasm Banks (AGB) are essential for conservation and breeding programs. The aim of this study was to analyze the genetic diversity of V. curassavica accessions of the Active Germplasm Bank of Medicinal and Aromatic Plants of the Federal University of Sergipe, using the Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) molecular marker. DNA was extracted from 28 individuals by the CTAB 2% method. Twenty-four primers were tested, and 14 of them were polymorphic and informative, resulting in 149 bands amplified with 97,98% polymorphism. The Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean divided the accessions into Cluster I and II. In the Jaccard similarity matrix, variation ranged between 0,24 and 0,78. The pairs of accessions VCUR-001/VCUR-503, VCUR-001/VCUR-504 and VCUR-104/VCUR-501 showed higher diversity (0,24), and the pair of accessions VCUR-402/VCUR-403 showed medium diversity (0,78). Twenty-eight accessions were divided into three distinct clusters, according to the Structure analysis. According to the Principal Component Analysis (PCA), the first principal component accounted for 13,19% of the total variance, and the second principal component accounted 9,38% of the total variance. The genetic diversity of the Active Germplasm Bank of UFS is low to medium, and it requires expansion. VCUR-802 accession is the most suitable for selection in breeding program of this species, since it clearly represents all the diversity present in the germplasm Bank. Key words: Varronia curassavica, conservation, diversity, ISSR ___________________

*Supervisor: Arie Fitzgerald Blank - UFS.

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1. INTRODUÇÃO

O Brasil é um país rico em diversidade de plantas, incluindo as espécies medicinais. O uso popular dessas espécies para o tratamento de enfermidades tem despertado cada vez mais o interesse da comunidade científica e do setor econômico. A Varronia curassavica, conhecida popularmente como erva-baleeira, é uma planta medicinal e aromática originária do Brasil, que possui importância econômica relevante, devido ao óleo essencial presente nas folhas. O óleo essencial apresenta atividade anti-inflamatória e é utilizado como matéria prima do primeiro medicamento fitoterápico totalmente desenvolvido no Brasil a partir de uma planta nativa. Apesar de existirem alguns estudos na literatura sobre a diversidade química do óleo essencial de V. curassavica, ainda são escassos estudos sobre a diversidade genética dessa planta, principalmente na região nordeste.

Conhecer a diversidade genética de uma espécie é de grande importância para a conservação de recursos genéticos em Bancos Ativos de Germoplasma. As plantas conservadas em bancos de germoplasma são úteis para utilização em programas de melhoramento, seleção de genótipos e identificação de indivíduos semelhantes. Essa conservação de espécies vegetais tem sido motivada cada vez mais, devido a perda da diversidade causada por devastação de áreas naturais, pragas introduzidas, contaminação de água e solo, mudanças climáticas, queimadas, expansão de monocultivos e construção civil.

O uso de marcadores moleculares de DNA em estudos de diversidade genética revelam resultados com confiabilidade e identificam regiões diretamente no genoma. Os resultados são relativamente rápidos e não sofrem interferência de fatores ambientais. Os marcadores diferenciam-se pela técnica e pelos tipos de primers que utilizam, por identificarem regiões específicas, como os marcadores ISSR (Inter Repetições de Sequência Simples), que tem custo relativamente acessível e não necessita do conhecimento prévio do genoma a ser avaliado.

A Universidade Federal de Sergipe (UFS) realiza estudos com erva-baleeira, e os recursos genéticos são conservados em um Banco Ativo de Germoplasma, implantado em 2012. Para viabilizar tal programa de melhoramento é de suma importância realizar o estudo da diversidade genética.

Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi analisar a diversidade genética dos acessos de V.curassavica do Banco Ativo de Germoplasma de Plantas Medicinais e Aromáticas da Universidade Federal de Sergipe através do marcador molecular ISSR, visando a seleção de acessos para melhoramento genético da espécie.

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2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 Aspectos gerais da espécie medicinal Varronia curassavica Jacq. (Cordia Verbenaceae DC)

A V. curassavica conhecida popularmente como erva-baleeira, é uma espécie medicinal e aromática originária do Brasil. Pode ser conhecida também por outros nomes populares, dependendo da região, tais como baleeira, catinga-de-barão, cordia, erva-balieira, erva-preta, maria-milagrosa, maria preta, salicinia, catinga-preta ou maria-rezadeira (LORENZI e MATOS, 2002; GASPARINO e BARROS, 2009). Ocorre espontaneamente em áreas litorâneas como dunas e praias da região nordeste à região sul do Brasil, porém não é difícil encontrá-la em regiões distantes da costa, como o interior dos Estados de São Paulo, Minas Gerais e Goiás, em terrenos pouco férteis e drenados. É amplamente utilizada na medicina popular, principalmente nas regiões litorâneas do Sudeste, considerada como antiartrítica, analgésica, cicatrizante e antiulcerogênica (LORENZI e MATOS, 2008).

Anteriormente possuía o nome científico Cordia verbenacea e pertencia a família Boraginaceae. Porém, devido a uma mudança de classificação, houve uma distinção mais detalhada entre os gêneros Cordia e Varronia através da morfologia polínica. O gênero Cordia possui grãos de pólen 3-colporados, colpos longos e endoaberturas alongadas, exina espinhosa a espículo-verrugosa e Varronia possui grãos de pólen 3-porados, poros com opérculos, exina reticulada, homorreticulada a heterorreticulada (GASPARINO e BARROS, 2009). Além disso, a família Boraginaceae é dividida em quatro subfamílias: Ehretioideae, Cordioideae, Helitropioideae e Boraginoideae (NOWICKE e MILLER, 1990; MILLER e GOTTSCHLING, 2007). Porém, estudos moleculares evidenciaram a elevação destas ao nível de famílias. Sendo assim Varronia curassavica (antes Cordia verbenacea) pertence à família Cordiaceae, que é considerada uma família monofilética, cosmopolita e a mais complexa das Boraginales, com aproximadamente 350 espécies (JUDD et al., 1999; GOTTSCHLING et al., 2001 e 2005; MILLER, 2001 e 2007; MILLER e GOTTSCHLING, 2007).

Suas inflorescências surgem nas extremidades dos ramos, em forma de espigas curvadas para baixo, com flores brancas e miúdas, visitadas por abelhas, moscas e borboletas e a dispersão das sementes ocorre por zoocoria, ou seja, através de animais. Os frutos maduros são vermelhos, medindo aproximadamente 0,4 cm, consumidos por pássaros de diversas espécies, que involuntariamente dispersam as sementes (MONTANARI JUNIOR, 2000; MARQUES e OLIVEIRA, 2005; MICHIELIN et al., 2009).

V. curassavica possui um óleo essencial composto de mono e sesquiterpenos, constituído quimicamente por α-pineno (29,69%), trans-cariofileno (25,27%), alo-aromadendreno (9,99%) e α-humuleno (4,64%) (CARVALHO JUNIOR et al., 2004). Nizio et al. (2015) analisando a diversidade química dessa espécie em cinco populações nativas do Estado de Sergipe, detectaram alta variabilidade química nos óleos essenciais. Estes autores identificaram um total de 53 compostos químicos e as plantas foram agrupadas em 5 grupos químicos.

Em 2004, a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), aprovou no Brasil o registro do primeiro fitoterápico tópico anti-inflamatório feito a partir do óleo essencial dessa planta, cujo ingrediente ativo é α-humuleno. Assim, houve o aumento da necessidade de pesquisa sobre esta espécie (FEIJÓ et al., 2014). Esse fitoterápico fabricado pelo Laboratório Farmacêutico Aché® possui em sua composição 2,3 a 2,9% de α-humuleno obtido exclusivamente do óleo essencial, indicado para o tratamento de tendinite crônica e dores miofasciais (QUISPE-CONDORI et al., 2008).

Além de sua ação contra o mosquito Aedes aegypti e atividade inibitória em bactérias gram-positivas, também é utilizada no controle cultural da broca dos citrus, como planta armadilha, para o inseto Cratosomus flavofasciatus (SERTIÉ et al., 1991; SCHROTH et al., 2000; ARAB e BENTO, 2006; MICHIELIN et al., 2009). Possui ainda propriedades anti-

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microbiana, anti-inflamatória, anti-alérgica e anti-tumoral (PASSOS et al., 2007; MICHIELIN et al., 2009; PARISOTTO et al., 2012). 2.2 Diversidade genética em Plantas Medicinais e Aromáticas

A diversidade genética pode ser definida como a distribuição da variabilidade entre e dentro de populações naturais, em que os alelos e os genótipos estão distribuídos de maneira heterogênea no ambiente. Esta variabilidade é uma condição para a manutenção de todos os níveis de biodiversidade e a base de programas de conservação e melhoramento genético. Ela consiste ainda na multiplicidade de frequências alélicas presentes em um grupo de indivíduos, que com ação do ambiente, expressam determinado fenótipo. Explorar a diversidade de espécies de importância econômica é essencial em todo programa de pesquisa agrícola (CARDONA, 2010; SANTANA et al., 2011). Amostras representativas da diversidade genética das espécies de plantas podem ter sua conservação genética melhor realizada em Bancos Ativos de Germoplasma.

A conservação genética tem sido coordenada desde 1974 pela EMBRAPA Recursos genéticos e Biotecnologia (CENARGEN), que iniciou as atividades de coleta de algumas plantas em 1975, e pode contar com o manuseio das mesmas in vitro, in sito ou ex situ

(RAMALHO et al., 2012). Tal conservação, principalmente a ex situ fornece um "seguro" importante contra a perda de recursos genéticos vegetais, essencial para a preservação das espécies dos programas de pesquisa, que pode ser feita fora do local de origem das espécies, nos referidos Bancos Ativos de Germoplasma (HAWKINS, 2008).

Um Banco Ativo de Germoplasma é um banco de alelos, formas alternativas de um gene, que caracteriza a maior parte da diversidade genética existente entre as plantas estudadas. Estas geralmente utilizam de menor espaço, com menor risco de perdas por introdução de patógenos, o que já consiste em uma grande vantagem. Sua função principal é a de armazenar, mas também executa atividades de prospecção, coleta dos materiais, introdução, intercâmbio, conservação, inspeção, multiplicação, regeneração e caracterização dos materiais coletados e inseridos no banco. A caracterização dos recursos genéticos armazenados nos bancos de germoplasma possibilita conhecer e preservar a variabilidade genética, identificar e selecionar acessos de interesse, que por meio de programas de melhoramento genético, pode servir de base para desenvolvimento de cultivares superiores. A finalidade desses bancos é obter materiais com características favoráveis, como no caso das plantas aromáticas, indivíduos com alto rendimento de óleos essenciais e/ou grande quantidade dos princípios ativos desejados (RAMALHO et al., 2012; BLANK, 2013).

Moraes Filho et al. (2013), avaliando a diversidade genética de 42 acessos do BAG de acerola (Malpighia emarginata) da Universidade Federal de Pernambuco, com marcador molecular RAPD, encontraram alta variabilidade genética, sem duplicatas. Indicando ainda o Estado da Bahia como local de maior diversidade dos acessos. Ao contrário de Costa et al. (2011) utilizando mesmo marcador no BAG de mangabeira (Hancornia speciosa Gomes) que observaram baixa diversidade genética e ainda alguns acessos que possivelmente são duplicatas. Vieira et al. (2014) observaram grande diversidade genética em espécies de bromélias do Estado de Sergipe. Os dados gerados a partir dos marcadores moleculares facilitaram a separação e identificação de acessos de bromélias do BAG.

Por séculos sucessivos, a partir do desenvolvimento e avanço das civilizações, foram identificadas as propriedades curativas de algumas plantas, denominadas de plantas medicinais, e assim, tal conhecimento foi transferido para as gerações seguintes. Atualmente, diversas espécies têm sido estudadas devido às suas propriedades medicinais, e paralelamente pesquisas voltadas para o uso sustentável são realizadas com o intuito de evitar a perda de seus recursos genéticos. Grande parcela da terapia tradicional envolve a utilização de plantas. Quando há pouco ou nenhum acesso a produtos farmacêuticos modernos, há uma forte preferência cultural pela medicina tradicional. Sendo assim, as plantas medicinais são fundamentais para o bem-estar de milhares de pessoas. A demanda por remédios tradicionais

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também aumentou nos chamados países desenvolvidos, bem como a consciência ambiental e um desejo para tratamentos através produtos naturais a base de plantas, já que, muitas pessoas também optam pelo uso de medicamentos para aliviar a dor e curar diferentes tipos de doenças (HAWKINS, 2008; PETROVSKA, 2012).

As plantas medicinais e aromáticas têm importância econômica relevante devido à presença de substâncias de composição química complexa, presente principalmente nas folhas, denominadas de metabólitos secundários. Esses metabólitos são os “compostos ativos” que conferem às plantas as mais diversas propriedades biológicas. Essas substâncias, são agrupadas de acordo com a sua composição química como alcalóides, terpenóides, flavonóides, glicosídeos, taninos e fenilpropanóides. As plantas medicinais são um recurso esgotável que não pode ser explorado de forma desordenada, necessitando cada vez mais de práticas voltadas para o uso sustentável dessas espécies. Devido à crescente demanda pelas plantas medicinais, seja para utilização in natura, folhas secas ou fonte de outras matérias primas como óleos essenciais e compostos bioativos, têm gerado a necessidade de pesquisas que visem a melhor conservação e multiplicação dessas espécies, bem como a eficácia e segurança para atender às necessidades de comercialização (PARAMANIK e CHIKKASWAMY, 2014; CHEN e WANG, 2015).

Celestino et al. (2015) em estudo de diversidade química e genética com marcador molecular AFLP observaram a divisão dos nove acessos do BAG de vetiver (Chrysopogon

zizanioides (L.) Roberty) da UFS em três grupos geneticamente distintos, que podem ser utilizados na seleção de programas de melhoramento genético desta cultura.

Nas espécies de plantas medicinais têm sido crescentes a associação do conhecimento da diversidade genética ao melhoramento e conservação, visando principalmente seu uso apropriado. Facanali et al. (2015), observaram em três populações nativas de elixir-paregórico (Ocimum selloi Benth), que há uma forte estrutura genética, ou seja, distribuição dos indivíduos entre as populações, possivelmente devido a pressões seletivas distintas, sistema reprodutivo e distribuição geográfica. Os resultados foram importantes para a conservação e preservação da espécie, também para o melhoramento genético e o uso do óleo essencial para aplicação comercial. Hu et al. (2014), observaram alta diversidade genética em Rheum

tanguticum (Lamiaceae), principalmente dentro das populações do que entre as populações naturais na China, importante na preservação desta espécie em face do declínio das populações selvagens.

Existem algumas famílias em que são encontradas grande número de espécies medicinais e aromáticas, como por exemplo, Verbenaceae e Lamiaceae. Alguns trabalhos relacionados à diversidade genética de espécies dessas famílias já foram relatados, tais como em alecrim-da-serra (Thymus caespititius, Verbenaceae) (TRINDADE et al., 2009), espécies de Lantana (Lamiaceae) (SENA FILHO et al., 2012) e Satureja bachtiarica (Lamiaceae) (SAIDI et al., 2013; HADIAN et al., 2014). Já para a antiga família da erva baleeira, Boraginaceae, já foram desenvolvidos alguns marcadores para o gênero Oreocarya (BRESOWAR e McGLAUGHLIN, 2014), assim como para a própria V. curassavica

(FIGUEIRA et al., 2010) e em Cynoglossum officinale como também estudo de sua diversidade genética (KORBECKA e WOLFF, 2004; WILLIAMS e FISHMAN, 2014). Para a família Cordiaceae, atual de V. curassavica, ainda não foram encontrados estudos detalhados de diversidade genética, porém existem cerca de 65 espécies no Brasil (TARODA e GIBBS, 1986) para futura utilização.

A contínua introdução de amostras nos bancos ativos de germoplasma, muitas vezes pode levar a um excesso de materiais para serem mantidos. Sendo assim, há uma maior probabilidade de ocorrer acessos duplicados ou muito similares. Os estudos de caracterização genética podem auxiliar na identificação e exclusão de acessos duplicados ou orientar a introdução de outros não representados no banco, com auxílio dos marcadores moleculares, que são eficientes para saber a variação genética total entre os acessos (RAMALHO et al., 2012).

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Os marcadores moleculares ISSR são baseados nos microssatélites, sem necessidade do conhecimento prévio do genoma. São dominantes, ou seja, não diferenciam os indivíduos heterozigotos dos homozigotos, porém tem a vantagem de analisar locus múltiplos em uma única reação. São baseados na amplificação da molécula de DNA através da PCR (Reação em Cadeia Polimerase) (GOULÃO e OLIVEIRA, 2001). Esta técnica consiste na amplificação de regiões (100-3000 pb) orientadas inversamente, espaçadas nas proximamente dos microssatélites oferecendo ampla cobertura de regiões neutras no genoma. É uma ferramenta importante para a caracterização de germoplasma, principalmente porque proporciona o chamado fingerprinting do DNA, ou seja, pode-se obter impressões digitais do DNA, em que é possível fazer estabelecimento da identidade das variedades e conhecer as fontes parentais em programas de melhoramento de plantas (CHARTERS e WILKINSON, 2000; REDDY et al., 2002).

Para uma melhor qualidade da reação PCR-ISSR, é essencial que o DNA genômico utilizado como molde seja de boa qualidade. Muitas vezes, há certa negligência quanto a essa observação. Vale lembrar que na extração do DNA, seguindo alguns métodos ou dependendo do tipo de amostra, pode ocorrer a presença de vestígios de detritos celulares e componentes que podem inibir as reações de PCR. Os produtos da reação são comumente separados em gel de agarose, de 1,5 a 2,0%. Após a visualização das bandas, é feita sua tabulação através de contagens, sendo necessário entender algumas terminologias básicas e estatísticas descritivas, tais como: (1) uma “banda” que foi marcada em um experimento também pode ser denominada de "locus”, independente da série de bandas ISSR que são geradas a partir da mesma PCR; (2) O número total de bandas, é o número total de diferentes tamanhos das bandas ISSR observada nas amostras em estudo; (3) O número de bandas polimórficas são ditas como aquelas responsáveis pela variação existente nas amostras em estudo (NG e TAN, 2015).

Os primers ISSR podem estar ancorados na extremidade 5’ ou 3’. Os alelos polimórficos ocorrem sempre que o genoma não apresentar a sequência repetida ou quando existir uma deleção ou inserção que modifique a distância entre as repetições. Quando os primers estão ancorados na posição 5’, polimorfismos ocorrem também devido às diferenças no comprimento do microssatélite, sequências de repetições e nucleotídeos ancorados são selecionadas aleatoriamente (GOULÃO e OLIVEIRA, 2001).

Gonçalves et al. (2014) em seu trabalho de caracterização genética com 40 indivíduos de mulungu (Erythrina velutina) através de marcadores ISSR de três localidades de Sergipe, obtiveram 149 locos a partir de 11 primers ISSR. Dentro de cada população, foram identificados ainda os genótipos mais divergentes, assim como aqueles sugeridos para trabalhos em melhoramento e programas de conservação. Bhattacharyya et al. (2015) analisando diversidade genética de orquídea com uso medicinal (Dendrobium nobile), detectaram com marcador ISSR alto grau de variabilidade genética (85,59% polimorfismos das bandas identificadas), com distância genética variando de 0,41–0,99 (coeficiente de Jaccard). Este estudo pode ajudar na taxonomia molecular reduzindo a demora nos estudos identificação taxonômica, facilitar na seleção de progênies, na conservação, bem como a utilização comercial e uso sustentável desta importante espécie medicinal.

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3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Material vegetal

Após sucessivas prospecções e coleta do material vegetal nos municípios de Graccho Cardoso, Tobias Barreto, São Cristóvão, Japaratuba, Tomar do Geru, Itabi, Cedro de São João e Itabaiana em Sergipe, e 5 acessos oriundos do intercâmbio de mudas com o Banco Ativo de Germoplasma do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) coletadas no Estado de São Paulo (TABELA 1), foi implantada a coleção de erva-baleeira (Varronia curassavica Jacq.) dentro do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de Plantas Medicinais e Aromáticas da Universidade Federal de Sergipe. O BAG está localizado na Fazenda Experimental “Campus Rural da UFS”, no município de São Cristóvão Estado de Sergipe, Brasil (latitude 11°00′S e longitude 37°12′W), implantado e conservado desde 2012, e possui 28 acessos.

Folhas frescas e jovens de cada acesso do BAG foram coletadas, envoltas em gaze esterilizada e acondicionadas em gelo, no momento da coleta para evitar oxidação. Em seguida foram congeladas a -80°C, até o momento da liofilização em aparelho LioTop modelo L101. Após a liofilização, as amostras foram conservadas em dessecador, contendo sílica gel até o momento da extração do DNA. TABELA 1. Informações geográficas dos 28 acessos de Varronia curassavica do Banco Ativo de Germoplasma de Plantas Medicinais e Aromáticas da Universidade Federal de Sergipe.

Código do acesso Origem (Município, Estado, País) Voucher do

Herbário da UFS Dados georreferenciados

VCUR-001

Doado pelo Centro Multidisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas da Universidade Estadual de Campinas, Campinas, Estado de São

Paulo, Brasil

30.913

-

VCUR-002 Ubatuba, São Paulo, Brasil 36.095 23°32’18.0”S; 45°03’73.4”W VCUR-003 Ilha Comprida, São Paulo, Brasil 36.096 25°02’44.0”S; 47°53’17.0”W VCUR-004 Mongágua, São Paulo, Brasil 36.097 24°08’00.0”S; 46°42’54.0”W VCUR-005 Ilha Comprida, São Paulo, Brasil 36.098 24°43’08.0”S; 47°30’36.0”W VCUR-101 Graccho Cardoso, Sergipe, Brasil 35.763 10°14’48.5”S; 37°12’52.8”W VCUR-102 Graccho Cardoso, Sergipe, Brasil 35.759 10°14’47.6”S; 37°12’52.8”W VCUR-103 Graccho Cardoso, Sergipe, Brasil 36.099 10°14’47.9”S; 37°12’52.2”W VCUR-104 Graccho Cardoso, Sergipe, Brasil 36.100 10°14’46.1”S; 37°12’52.8”W VCUR-105 Graccho Cardoso, Sergipe, Brasil 36.101 10°14’46.4”S; 37°13’26.6”W VCUR-201 Tobias Barreto, Sergipe, Brasil 33.470 11°03’54.2”S; 38°03’21.1”W VCUR-202 Tobias Barreto, Sergipe, Brasil 33.471 11°04’10.1”S; 38°04’03.4”W VCUR-301 São Cristóvão, Sergipe, Brasil 36.102 10°54’26.3”S; 37°11’53.1”W VCUR-302 São Cristóvão, Sergipe, Brasil 36.205 10°54’59.7”S; 37°11’16.3”W VCUR-303 São Cristóvão, Sergipe, Brasil 36.208 10°54’48.5”S; 37°11’50.3”W VCUR-401 Japaratuba, Sergipe, Brasil 36.227 10°38’05.4”S; 36°55’10.5”W VCUR-402 Japaratuba, Sergipe, Brasil 36.103 10°37’59.9”S; 36°55’16.1”W VCUR-403 Japaratuba, Sergipe, Brasil 36.104 10°37’39.0”S; 36°55’25.8”W VCUR-404 Japaratuba, Sergipe, Brasil 36.105 10°37’37.8”S; 36°56’00.0”W VCUR-501 Tomar do Geru, Sergipe, Brasil 36.106 11°21’12.0”S; 37°50’59.0”W VCUR-502 Tomar do Geru, Sergipe, Brasil 36.107 11°19’17.1”S; 37°52’02.4”W VCUR-503 Tomar do Geru, Sergipe, Brasil 36.239 11°19’05.2”S; 37°52’17.5”W VCUR-504 Tomar do Geru, Sergipe, Brasil 36.108 11°19’01.7”S; 37°52’25.0”W VCUR-505 Tomar do Geru, Sergipe, Brasil 36.109 11°19’04.0”S; 37°51’51.8”W VCUR-601 Itabi, Sergipe, Brasil 30.914 10°09’24.9”S; 37°08’27.0”W VCUR-701 Cedro de São João, Sergipe, Brasil 36.110 10°18’06.9”S; 36°53’27.7”W VCUR-801 Itabaiana, Sergipe, Brasil 36.111 10°50’27.6”S; 37°12’49.3”W VCUR-802 Itabaiana, Sergipe, Brasil 36.112 10°48’28.9”S; 37°15’48.6”W

7

FIGURA 1: Mapa do Estado de Sergipe identificando as regiões onde foram coletadas estacas de Varronia curassavica para implantação do Banco Ativo de Plantas Medicinais e Aromáticas da Universidade Federal de Sergipe.

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FIGURA 2: Plantas do Banco ativo de germoplasma de Varronia curassavica da Universidade Federal de Sergipe, localizado na fazenda experimental Campus Rural da UFS, São Cristóvão/Sergipe. Fotos: Fabiany Brito, 2015.

3.2 Extração do DNA e amplificação PCR-ISSR A extração do DNA foi realizada utilizando o método CTAB 2% (DOYLE e DOYLE,

1990) modificado por Alzate-Marin et al. (2005), no qual cerca de 1 g do material vegetal foi macerado, em contato com nitrogênio líquido e adicionados 750 μL de tampão CTAB 2%, juntamente com 2 μL de β-mercaptoetanol e 3 μL de proteinase K. Em seguida as amostras foram incubadas em banho-maria a 65º C por uma hora. Adicionou-se 500 μL de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1) agitando os tubos por 8 minutos e centrifugando por 10 minutos a 6900 rpm a 20º C.

O sobrenadante proveniente da centrifugação foi coletado e transferido para outro microtubo e adicionado 400 μL de isopropanol para precipitar os ácidos núcleicos. Em seguida o material foi armazenado por 1 hora em freezer (-20º C). Logo após, os microtubos foram centrifugados por 10 minutos a 10.000 rpm. Eliminou-se o sobrenadante, adicionando 500 μL de etanol a 70%, centrifugando por 5 minutos a 12.000 rpm. Descartou-se o etanol e repetiu-se mais uma vez a adição de 500 μL de etanol a 70%, centrifugando por 5 minutos a 12.000 rpm. O etanol foi eliminado e acrescentou-se 500 μL de etanol a 90%, centrifugando por 5 minutos a 12.000 rpm. Descartou-se o etanol deixando secar as amostras por 24 horas, posteriormente adicionou-se em 50 μL de TE (Tris-HCl 10 mM, pH. 8,0; EDTA 1 mM), para estoque e diluição das amostras trabalho de DNA.

A padronização após a diluição, e quantificação do DNA foi feita no aparelho NanoDrop da marca NanoDrop 2000c (Thermo Scientific®), nas faixas de 260 a 280 nm. Sua pureza foi calculada através da relação D260/D280. As amostras quantificadas foram diluídas em TE (Tris- HCl 10 mM, pH. 8,0; EDTA 1 mM), para a concentração de 10 ng. μL-1 e armazenadas à – 20º C para subsequente uso nas reações de PCR-ISSR.

Os primers ISSR que foram utilizados neste estudo foram das marcas Eurofins MWG Operon (Operon Technologies, EUA), IDT (Integrated DNA Technologies, Germany) e

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Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, EUA). Vinte e quatro primers foram testados para amplificação através da PCR. As reações por PCR foram realizadas em um volume total de 20 µL, contendo 1.0 µL de DNA genômico (10 ng/µL), 0.2 µL de Taq polimerase e 2 µL de buffer 10x (Sigma-Aldrich, Louis, MO-USA), 0.4 µL de DNTp, 1.0 µL do primer e 15.4 µL de água ultrapura autoclavada.

A amplificação por PCR foi feita em termociclador ProFlex PCR System programado com o seguinte protocolo: 5 minutos a 94°C; 45 ciclos de 40 segundos a 94°C, 30 segundos a uma variação de 50,4°C a 53°C de acordo com a temperatura de anelamento de cada primer utilizado (TABELA 2), e 1 minuto a 72°C; e um último passo de extensão final de 7 min a 72°C. Os produtos de amplificação foram sujeitos a eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado com brometo de etídio, visualizado sob luz ultravioleta e fotodocumentado. Os pesos moleculares foram estimados usando uma escala de DNA de 1 Kb da marca Ludwig (Ludwig Biotec, Brasil/RS) para cada primer testado. TABELA 2: Primers ISSR, sequencia, temperatura de anelamento e amplificação dos produtos usados para análise de diversidade genética em Varronia curassavica.

Nome do primer

Sequencia (5’-3’) Temperatura de anelamento (°C)

N° total de

bandas

N° de bandas polimórficas

% de Polimorfismo

ISSR1 CAC ACA CAC ACA GG 51.5°C 11 11 100.0 ISSR2 CTC TCT CTC TCT CTC TAC 51.5°C 13 13 100.0 ISSR3 CTC TCT CTC TCT CTC TTG 51.5°C 10 10 100.0 ISSR4 CAC ACA CAC ACA AC 51.5°C 7 7 100.0 ISSR5 CTC TCT CTC TCT CTC TGC 51.5°C 13 13 100.0 ISSR6 CAC ACA CAC ACA AG 51.5°C 12 11 91.7

UBC810 GAG AGA GAG AGA GAG AT 50.4°C 12 12 100.0 UBC811 GAG AGA GAG AGA GAG AC 53.0°C 6 6 100.0 UBC834 AGA GAG AGA GAG AGY T 52.8°C 11 11 100.0 UBC841 GAG AGA GAG AGA GAG AYC 52.0°C 11 11 100.0 UBC845 CTC TCT CTC TCT CTC TRG 51.5°C 12 12 100.0 UBC855 ACA CAC ACA CAC ACY T 53.0°C 17 17 100.0 UBC857 ACA CAC ACA CAC ACY G 53.0°C 9 7 77.8 UBC858 TGT GTG TGT GTG TGT GRT 53.0°C 5 5 100.00

3.3 Análise dos dados Para a análise e interpretação dos géis, somente as bandas consistentes foram usadas.

Os loci obtidos foram identificados quanto à presença (1) ou ausência (0) em cada acesso, com a construção de uma matriz de dados binários que foi usada para realizar as análises.

A matriz dos dados foi gerada e os coeficientes de similaridade foram calculados utilizando complemento aritmético do índice de Jaccard (JACCARD, 1908). O programa NTSYS-pc 2.0 (ROHLF, 2001) foi usado na construção do dendrograma utilizando o método de agrupamento da Média Aritmética Não Ponderada (UPGMA).

O software STRUCTURE v.2.3.3 foi utilizado para analisar a estrutura genética do BAG de erva-baleeira fundamentada no modelo de agrupamento bayesiano (HUBISZ et al., 2009). O conjunto de parâmetros foi estimado de acordo com o modelo “admixture” com frequências de alelos correlacionados, e suas simulações foram executadas em burn-in de 100.000 repetições. Os valores de k variaram de 2 a 6 agrupamentos. O número de agrupamentos (ΔK) foi determinado de acordo com STRUCTURE HARVESTER Evano (EARL e VONHOLDT, 2012).

A Análise de Componente Principal (ACP) das bandas foi estimada usando o software Statistica.

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4. RESULTADOS

4.1 Diversidade genética Neste estudo, foi possível verificar a confiabilidade dos marcadores ISSR para

detecção de polimorfismos entre os acessos de Varronia curassavica do Banco Ativo de Germoplasma de Plantas Medicinais e Aromáticas da Universidade Federal de Sergipe. Dos 24 primers ISSR testados, 14 geraram padrões de bandas informativas, com 149 bandas amplificadas, variando de 5 (primer UBC858) a 17 (primer UBC 855) e uma média de 10,64 bandas por primer (TABELA 2). Entre elas 146 foram polimórficas, o que corresponde a 97,98% de polimorfismo. O índice de Shannon (I) apresentou uma média considerada baixa (0,42), por ter sido abaixo de 0,5. Trata-se de um índice de diversidade genética que pode variar de 0 a 1 e que quanto mais o valor se aproxima de zero, menor a diversidade (SILVA et al., 2015). A heterozigosidade (He) que é uma medida de variabilidade genética de uma população, ou seja, probabilidade dos indivíduos serem heterozigotos (McMANUS et al., 2011) foi considerada baixa, com média de 0,27. O Conteúdo de Informação Polimórfica (PIC), descrito por Botstein et al. (1980), é o coeficiente que indica a qualidade do marcador em estudos genéticos. De acordo com tal descrição de classificação, valores de PIC superiores a 0,5 são considerados muito informativos, entre 0,25 e 0,50 mediamente informativos, e com valores inferiores a 0,25, pouco informativos. O presente estudo obteve uma média de 0,27, sendo considerado um PIC mediamente informativo. Já o “Marker Index” (MI), que estima a utilidade global de cada sistema de marcador molecular variou de 1,22 a 5,48, com uma média de 2,88.

4.2 Análises de agrupamento e Componente Principal

A matriz de similaridade dos acessos de V. curassavica foi calculada de acordo com o coeficiente de Jaccard, com base no método da Média Aritmética Não Ponderada (UPGMA). O coeficiente de similaridade utilizado para calcular a proximidade genética entre os 28 acessos de V. curassavica avaliados a partir dos marcadores ISSR variaram de 0,24 a 0,78 com uma média de 0,41 o que indica que o conjunto de acessos estudados apresenta diversidade genética significativa. Os acessos VCUR-402 e VCUR-403 apresentaram média diversidade genética com índice de similaridade de 0,78, ambos provenientes do município de Japaratuba/Sergipe, sendo assim os mais próximos geneticamente entre todos os pares de acessos avaliados. Já os pares de acessos VCUR-001 e VCUR-503, VCUR-001 e VCUR-504, VCUR-104 e VCUR-501, apresentaram maior diversidade, com índice de similaridade de 0,24. Observou-se 15 combinações de genótipos com diversidade genética média (valores de similaridade entre 0,60 a 0,78) e as demais combinações com diversidade genética alta, pois seus valores de similaridade no agrupamento foram inferiores a 0,6 (de 0,24 a 0,59) (TABELA 3). Para tal afirmação, os parâmetros de diversidade são definidos devido aos valores de proximidade, quanto maior valor do coeficiente, mais similar, menor diversidade, quanto menor valor do coeficiente, menos similar, maior diversidade. E, também com base na maioria dos trabalhos já relatados em espécies vegetais, porém ainda não há estudos com a família Cordiaceae utilizando tais parâmetros para comparação.

11 TABELA 3: Matriz de similaridade de Jaccard dos acessos de Varronia curassavica do Banco Ativo de Germoplasma de Plantas Medicinais e Aromáticas da Universidade Federal de Sergipe.

Acessos VCUR-

001 VCUR-

002 VCUR-

003 VCUR-

004 VCUR-

005 VCUR-

101 VCUR-

102 VCUR-

103 VCUR-

104 VCUR-

105 VCUR-

201 VCUR-

202 VCUR-

301 VCUR-

302 VCUR-

303 VCUR-

401 VCUR-

402 VCUR-

403 VCUR-

404 VCUR-

501 VCUR-

502 VCUR-

503 VCUR-

504 VCUR-

505 VCUR-

601 VCUR-

701 VCUR-

801 VCUR-

802

VCUR-001 -

VCUR-002 0.32 -

VCUR-003 0.32 0.59 -

VCUR-004 0.27 0.61 0.62 -

VCUR-005 0.27 0.54 0.53 0.55 -

VCUR-101 0.35 0.31 0.37 0.35 0.38 -

VCUR-102 0.35 0.31 0.31 0.34 0.34 0.44 -

VCUR-103 0.37 0.28 0.33 0.33 0.31 0.45 0.51 -

VCUR-104 0.25 0.25 0.29 0.28 0.27 0.35 0.38 0.51 -

VCUR-105 0.34 0.29 0.36 0.37 0.36 0.33 0.41 0.49 0.41 -

VCUR-201 0.44 0.35 0.34 0.38 0.35 0.44 0.39 0.45 0.38 0.36 -

VCUR-202 0.34 0.26 0.30 0.28 0.28 0.40 0.44 0.49 0.38 0.48 0.42 -

VCUR-301 0.32 0.30 0.28 0.30 0.29 0.40 0.29 0.38 0.30 0.48 0.32 0.37 -

VCUR-302 0.32 0.42 0.42 0.40 0.43 0.37 0.44 0.45 0.35 0.45 0.35 0.42 0.40 -

VCUR-303 0.30 0.38 0.40 0.43 0.42 0.37 0.40 0.42 0.28 0.45 0.33 0.36 0.41 0.68 -

VCUR-401 0.25 0.33 0.32 0.38 0.39 0.35 0.29 0.34 0.25 0.27 0.32 0.26 0.30 0.46 0.51 -

VCUR-402 0.31 0.43 0.44 0.49 0.43 0.41 0.39 0.44 0.33 0.49 0.38 0.35 0.40 0.59 0.62 0.50 -

VCUR-403 0.31 0.39 0.39 0.48 0.39 0.36 0.34 0.46 0.37 0.44 0.40 0.33 0.35 0.54 0.55 0.53 0.78 -

VCUR-404 0.33 0.35 0.35 0.38 0.38 0.34 0.35 0.43 0.34 0.42 0.39 0.33 0.35 0.53 0.58 0.50 0.60 0.62 -

VCUR-501 0.28 0.40 0.35 0.38 0.41 0.35 0.31 0.31 0.24 0.36 0.30 0.31 0.38 0.42 0.47 0.42 0.46 0.45 0.51 -

VCUR-502 0.29 0.35 0.38 0.38 0.36 0.42 0.33 0.39 0.35 0.37 0.37 0.30 0.36 0.48 0.51 0.51 0.55 0.57 0.53 0.52 -

VCUR-503 0.24 0.42 0.40 0.46 0.45 0.40 0.30 0.40 0.32 0.38 0.37 0.27 0.32 0.49 0.53 0.48 0.61 0.59 0.57 0.47 0.56 -

VCUR-504 0.24 0.41 0.43 0.45 0.42 0.43 0.31 0.35 0.29 0.35 0.38 0.27 0.31 0.43 0.50 0.45 0.47 0.48 0.53 0.43 0.48 0.61 -

VCUR-505 0.28 0.37 0.40 0.43 0.37 0.39 0.28 0.40 0.29 0.36 0.40 0.30 0.36 0.40 0.46 0.47 0.52 0.55 0.54 0.49 0.60 0.65 0.56 -

VCUR-601 0.32 0.53 0.46 0.48 0.52 0.40 0.38 0.40 0.33 0.39 0.36 0.33 0.35 0.58 0.51 0.47 0.57 0.52 0.50 0.46 0.52 0.62 0.57 0.55 -

VCUR-701 0.33 0.50 0.51 0.53 0.41 0.38 0.29 0.35 0.29 0.36 0.40 0.27 0.33 0.48 0.53 0.44 0.63 0.59 0.48 0.42 0.54 0.61 0.53 0.52 0.66 -

VCUR-801 0.28 0.42 0.44 0.47 0.48 0.36 0.28 0.36 0.30 0.36 0.38 0.30 0.29 0.47 0.50 0.49 0.54 0.55 0.51 0.40 0.43 0.53 0.58 0.52 0.53 0.52 -

VCUR-802 0.30 0.36 0.38 0.45 0.40 0.34 0.29 0.30 0.30 0.36 0.34 0.33 0.31 0.38 0.41 0.37 0.49 0.48 0.38 0.35 0.44 0.45 0.44 0.41 0.37 0.45 0.48 -

12

Notou-se no dendrograma uma divisão dos acessos em dois grandes grupos, Grupo I e Grupo II, ambos com dois subgrupos (FIGURA 3). O Grupo I (32,15% do Banco Ativo de Germoplasma) é constituído pelos acessos VCUR-001 e VCUR-201, do subgrupo 1, e VCUR-101, VCUR-102, VCUR-103, VCUR-104, VCUR-105, VCUR-202 e VCUR-301 do subgrupo 2. Esse grupo apresentou com índices de similaridade de Jaccard abaixo de 0,5, de acordo com o Eixo X do dendrograma. Já o Grupo II (67,85% do Banco Ativo de Germoplasma) foi o que apresentou índices de similaridade entre 0,4 a 0,78 e possui os acessos VCUR-302, VCUR-303, VCUR-401, VCUR-402, VCUR-403, VCUR-404, VCUR-501, VCUR-502, VCUR-503, VCUR-504, VCUR-505, VCUR-601, VCUR-701, VCUR-801 e VCUR-802, do subgrupo 3, e VCUR-002, VCUR-003, VCUR-004 e VCUR-005, do subgrupo 4. A diversidade genética dos acessos apesar de bem distribuída nos dois grupos do dendrograma ainda é considerada baixa.

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FIGURA 3: Dendrograma gerado através do método UPGMA dos 28 acessos do Banco Ativo de Germoplasma de Plantas Medicinais e Aromáticas de Varronia curassavica da Universidade Federal de Sergipe.

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O software STRUCTURE foi uma ferramenta eficiente na identificação do BAG de erva-baleeira, separando os 28 acessos em três grupos distintos e bem definidos: o de cor verde, de cor azul e de cor vermelho (FIGURA 4).

FIGURA 4: Subdivisão em grupos, dos 28 acessos de Varronia curassavica do Banco Ativo de Germoplasma de Plantas Medicinais e Aromáticas da Universidade Federal de Sergipe através do marcador ISSR, com base na análise Bayesiana realizada utilizando o programa de Estruture (k = 2). Cada barra vertical representa um acesso, com as barras de mesma cor agrupadas.

A Análise de Componente Principal (ACP) (FIGURA 5) foi realizada com base nas 149 bandas amplificadas pelos primers da Tabela 2. O componente principal primário representou 13,19% da variância total, sendo relacionado positivamente com as bandas A8 (r=0,827) e A15 (r=0,859) (primer UBC855), A50 (r=0,859) e A52 (r=0,750) (primer

UBC845) e A74 (r=0,782) (primer UBC834), e não esteve relacionado negativamente (r < -0,70) com nenhuma banda. Já o componente principal secundário representou 9,38% da variância total e foi relacionado positivamente somente com a banda A63 (r=0,731) (primer

UBC810). Sendo assim, as bandas A8, A15, A50, A52, A63 e A74 foram as mais importantes para validar o agrupamento dos acessos, e os primers UBC810, UBC834, UBC845 e UBC855 podem ser considerados os mais importantes para o agrupamento observado na Figura 3.

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FIGURA 5: Análise de componente principal gerada através de software Statistic com base nos 149 alelos identificados.

A visualização da localização das bandas pode ser feita através das imagens geradas

pela fotodocumentação dos géis de agarose (FIGURA 6).

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FIGURA 6: Perfis eletroforéticos dos fragmentos de Inter Repetições de Sequência Simples amplificados em gel de agarose utilizando os primers ISSR5, ISSR6, UBC811 dos 28 acessos de Varronia curassavica do Banco Ativo de Germoplasma da Universidade Federal de Sergipe.

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5. DISCUSSÃO

A diversidade genética total dos acessos de V. curassavica é de baixa a média, e pode ser afirmada devido aos valores dos parâmetros de diversidade avaliados e da divisão em apenas dois grandes grupos no dendrograma. Os resultados de diversidade genética deste trabalho contrastam com os resultados de diversidade química de cinco populações naturais de V. curassavica realizado por Nizio et al. (2015), que detectaram alta diversidade química, e a divisão em 5 grupos químicos. Essa comparação pode ser feita devido os autores afirmarem que um dos fatores que influenciam a diversidade química, é a diversidade genética. Isso indica que, o estudo com marcadores moleculares ISSR precisam ser ampliados para identificar esta maior variabilidade, pois ainda não foram suficientes conforme observado através das poucas bandas amplificadas que foram importantes para realização do agrupamento.

De acordo com o dendrograma, há uma tendência de agrupamento acordo com a origem do acesso, exceto para acessos de São Cristóvão/SE e São Paulo/SP que está presente nos dois grupos, I e II. O Subgrupo 1 do Grupo I possui apenas os acessos VCUR-001 e VCUR-201 oriundos de São Paulo/SP e Tobias Barreto/SE, o que indica sua grande proximidade genética mesmo sendo de origem geográfica distante. No Subgrupo 2 do Grupo I todas as amostras do município de Graccho Cardoso/SE estão agrupadas, junto com VCUR-202, do município de Tobias Barreto/SE. O Subgrupo 3 do Grupo II é o maior subgrupo de todos, com 15 acessos de várias origens, detentores de diversidade genética média e alta quando comparados aos pares, de acordo com o coeficiente de Jaccard. Por fim, o Subgrupo 4 do Grupo II é composto somente por acessos de São Paulo/SP, muito similares entre si, diferindo do acesso presente no Grupo I, mesmo sendo de mesma origem.

Na separação dos 28 acessos em três grupos distintos e bem definidos de acordo com o programa Structure foi possível perceber que tal agrupamento está afirmando os resultados obtidos de acordo com o dendrograma. O acesso VCUR-802 do município de Itabaiana/SE representa toda diversidade encontrada no BAG, por conter todas as cores observadas no agrupamento, e não está agrupado com nenhum outro acesso no dendrograma. Assim, é necessário o máximo de cuidado para evitar a perda desse acesso, pois pode ser o mais importante para estudos futuros visando melhoramento genético. A subdivisão de 10 acessos de patchouli do BAG de Plantas Medicinais e Aromáticas da UFS utilizando Structure, levou a formação de dois grupos específicos, identificando-os com eficiência como geneticamente distintos (SANDES et al., 2016), destacando a importância de tal método em estudos com BAGs de Planta Medicinais e Aromáticas.

Ainda não há relatos de estudos de plantas da família Cordiaceae utilizando marcadores ISSR. Porém, comparando o presente estudo com do Dresler et al. (2015) com relação a porcentagem de bandas por primer em viperina (Echium vulgare L., família Boraginaceae), foi observado um menor polimorfismo (93,15%,), uma média de 6 a 17 bandas por primer, PIC com média de 0,373, muito próximo do presente estudo e MI de 3,1.

Já Zhao et al. (2014), observaram alta diversidade genética avaliando germoplasma de 20 plantas do gênero Lilium, com uma média de 17 a 22 bandas amplificadas, porém com índice de Shannon inferior (0,35). Lopez et al. (2015) avaliaram diversidade genética em Omphalodes littoralis subsp. gallaecica (Boraginaceae) com marcador AFLP, também dominante, e observaram uma Heterozigosidade de 0,356 e diversidade genética moderada. Lembrando que foram utilizados indivíduos de populações naturais.

A diversidade genética auxilia no manuseio adequado de um Banco Ativo de Germoplasma, que é uma amostra da variabilidade genética ou alélica de uma espécie (RAMALHO et al., 2012). Em um programa de melhoramento, conhecer a diversidade genética entre os acessos estabelecidos é de fundamental importância. Para tanto, o uso de técnicas como os marcadores moleculares por acessar diretamente o genoma de espécie proporcionam informações precisas e de alta confiabilidade onde não há influência ambiental.

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De acordo com Celestino et al. (2015) as ferramentas moleculares são essenciais para a caracterização da diversidade genética de plantas aromáticas e medicinais, pois apesar de as características agronômicas e químicas distinguirem genótipos do grupo, a composição dos óleos essenciais pode ser alterada por fatores ambientais.

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6. CONCLUSÕES

A diversidade genética da coleção de erva-baleeira do Banco Ativo de Germoplasma da UFS é de baixa a média, sendo necessária sua ampliação incluindo mais acessos de outras localidades/regiões. O acesso VCUR-802 é o mais indicado para seleção em programa de melhoramento dessa espécie, por representar toda diversidade presente no BAG. Os resultados encontrados são importantes para conservação dessa espécie, sinalizando a necessidade de ampliação da diversidade do BAG e trazendo informações úteis para uso de acessos em programas de melhoramento.

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