anabela cardoso mariano - estudogeral.sib.uc.pt · em 1806 sertϋrner, um farmacêutico alemão,...

2010

Anabela Cardoso Mariano

DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIAS

ANALÍTICAS PARA A DETERMINAÇÃO DE METADONA,

BUPRENORFINA E SEUS PRINCIPAIS METABOLITOS

EM AMOSTRAS BIOLÓGICAS. APLICAÇÕES EM

CONTEXTO FORENSE.

Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra

para obtenção do Grau de Mestre em Medicina Legal

Trabalho experimental realizado no

Serviço de Toxicologia Forense da

Delegação do Centro do

Instituto Nacional de Medicina Legal, I.P.

“�Por isso eu tomo ópio. É um remédio.

Sou um convalescente do Momento.

Moro no rés-do-chão do pensamento

E ver passar a Vida faz-me tédio�”

Alvaro de Campos (Fernando Pessoa)

AGRADECIMENTOS

À Dra. Cláudia Margalho, minha orientadora, agradeço pela permanente

disponibilidade, apoio e orientação científica dispensadas durante o desenvolvimento deste

trabalho.

Ao Senhor Professor Doutor Francisco Corte-Real, meu co-orientador, agradeço o

incentivo e facilidades disponibilizadas para a realização deste trabalho de investigação.

Ao Dr. Miguel Franco, Director do Serviço de Toxicologia Forense, que possibilitou a

realização deste trabalho no serviço.

À técnica Alice Castanheira por me ter “aturado” e ajudado sempre que precisei.

Aos meus pais por todo o apoio, força, carinho e por todo o sacrifício que sempre

fizeram por mim, um muito obrigada.

Ao meu irmão e à minha tia Lurdes que também sempre estiveram presentes.

Ao Cláudio que desde o início desta caminhada sempre esteve ao meu lado, apoiando-

me e dando-me toda a força e carinho, sempre acreditando em mim.

Aos meus amigos que continuam a ter paciência para me aturar e que me têm apoiado

incondicionalmente.

SUMÁRIO

Índice de Figuras I

Índice de Tabelas II

Abreviaturas IV

I – Introdução 1

1. Justificação do Tema Escolhido 3

2. Objectivos 5

II – Revisão da Bibliografia 7

1. História do Ópio 9

2. Opiáceos e opióides 13

3. Metadona 17

4. Buprenorfina 21

5. Técnicas para Determinação da Metadona e da Buprenorfina 23

6. Extracção em Fase Sólida 27

7. Derivatização 33

8. Validação de Metodologias Analíticas 37

III – Parte Experimental 45

Materiais e Métodos 47

Resultados e Discussão 59

Conclusões 99

IV – Referências 103

I

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Papaver Somniferum 9

Figura 2. Papaver Bracteatum e Papaver Somniferum 10

Figura 3. Estrutura química da metadona 17

Figura 4. Estrutura química da buprenorfina 21

Figura 5. Coluna SPE 27

Figura 6. Etapas dos procedimentos de SPE 29

II

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Preparação das curvas de calibração para Metadona e EDDP 53

Tabela 2. Preparação das curvas de calibração para Buprenorfina e Norbuprenorfina 53

Tabela 3. Preparação dos CQI para Metadona e EDDP 54

Tabela 4. Preparação dos CQI para Buprenorfina e Norbuprenorfina 54

Tabela 5. Principais parâmetros analíticos da análise instrumental 56

Tabela 6. Sangues usados para construir as misturas ou pools 60

Tabela 7. Tolerância máxima para as áreas relativas dos iões diagnóstico 62

Tabela 8. Estudo da selectividade/especificidade referente à Metadona 63

Tabela 9. Estudo da selectividade/especificidade referente à EDDP 64

Tabela 10. Estudo da selectividade/especificidade referente à Buprenorfina 65

Tabela 11. Estudo da selectividade/especificidade referente à Norbuprenorfina 66

Tabela 12. Resultados obtidos no estudo da especificidade/selectividade 67

Tabela 13. Preparação das curvas de calibração referentes ao estudo dos 69

LD/LQ para a metadona e EDDP

Tabela 14. Preparação das curvas de calibração referentes ao estudo dos 70

LD/LQ para a Buprenorfina e Norbuprenorfina

Tabela 15. Resumo dos valores calculados para os limites de detecção e de 75

quantificação

II

Tabela 16. Resumo dos valores calculados para a eficiência de extracção da 77

Metadona/EDDP

Tabela 17. Resumo dos valores calculados para a eficiência de extracção da 78

Buprenorfina e Norbuprenorfina

Tabela 18. Estudo da linearidade para a metadona e EDDP 80

Tabela 19. Estudo da linearidade para a Buprenorfina e Norbuprenorfina 81

Tabela 20. Resumo dos resultados obtidos para a linearidade e gamas de trabalho 86

Tabela 21. Resumo dos resultados respeitantes à repetibilidade da metadona 87

Tabela 22. Resumo dos resultados respeitantes à repetibilidade da EDDP 88

Tabela 23. Resumo dos resultados respeitantes à repetibilidade da Buprenorfina 88

Tabela 24. Resumo dos resultados respeitantes à repetibilidade da Norbuprenorfina 89

Tabela 25. Curvas de calibração para o estudo da precisão intermédia e exactidão 90

da Metadona e EDDP

Tabela 26. Controlos para o estudo da precisão intermédia e exactidão da 90

Metadona e EDDP

Tabela 27. Curvas de calibração para o estudo da precisão intermédia e 91

exactidão da Buprenorfina e Norbuprenorfina

Tabela 28. Controlos para o estudo da precisão intermédia e exactidão da 91

Buprenorfina e Norbuprenorfina

Tabela 29. Tabela ANOVA (factor único) 92

Tabela 30. Cálculo das estimativas da precisão 93

Tabela 31. Resultados obtidos para a precisão intermédia da Metadona 94

III

Tabela 32 Resultados obtidos para a precisão intermédia do EDDP 94

Tabela 33. Resultados obtidos para a precisão intermédia da Buprenorfina 95

Tabela 34. Resultados obtidos para a precisão intermédia da 95

Norbuprenorfina

Tabela 35. Resultados obtidos para a exactidão da Metadona 97

Tabela 36. Resultados obtidos para a exactidão do EDDP 97

Tabela 37. Resultados obtidos para a exactidão da Buprenorfina 98

Tabela 38. Resultados obtidos para a exactidão da Norbuprenorfina 98

VI

ABREVIATURAS

ANOVA Analysis of Variance (Análise de Variância)

CV Coeficiente de Variação

FDA Food and Drug Administration

GC Gas Chromatography (Cromatografia de gases)

GC/MS Gas Chromatography – Mass Spectrometry (Cromatografia de gases

acoplada a Espectrometria de Massas)

ICH International Conference on Harmonisation

INML Instituto Nacional de Medicina Legal, I. P.

ISO International Standard Organization

IT-STF-C-008 Instrução para a avaliação de ensaios interlaboratoriais em vigor no

Serviço de Toxicologia Forense da Delegação do Centro

LC/MS Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (Cromatografia Líquida

acoplada a Espectrometria de Massas)

LLE Liquid-Liquid Extraction (Extracção Líquido-Líquido)

LLOQ Lower Limit of Quantification (Limite Inferior de Quantificação)

LOD Limit of Detection (Limite de Detecção)

LOQ Limit of Quantification (Limite de Quantificação)

MSTFA N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetamida

PE-STF-C-205 Procedimento de ensaio de confirmação de metadona e EDDP em vigor

no Serviço de Toxicologia Forense da Delegação do Centro

VI

PE-STF-C-206 Procedimento de ensaio de confirmação de buprenorfina e buprenorfina

em vigor no Serviço de Toxicologia Forense da Delegação do Centro

PE-STF-C-211 Procedimento de ensaio de quantificação de metadona e EDDP em vigor

no Serviço de Toxicologia Forense da Delegação do Centro

PE-STF-C-212 Procedimento de ensaio de quantificação de buprenorfina e

norburenorfina em vigor no Serviço de Toxicologia Forense da Delegação

do Centro

PO-STF-C-006 Procedimento operacional de validação de procedimentos de ensaio

rpm Rotações por minuto

SIM Selected Ion Monitoring (Monitorização Selectiva de Iões)

SNC Sistema Nervoso Central

SPE Solid Phase Extraction (Extracção em fase Sólida)

TMCS Trimetilclorosilano

I - INTRODUÇÃO

Justificação do Tema Escolhido

Anabela Cardoso Mariano Página 3

1. JUSTIFICAÇÃO DO TEMA ESCOLHIDO

A utilização de metadona e buprenorfina como tratamento de substituição na

terapia de reabilitação de toxicodependentes tem vindo a demonstrar-se eficaz e

segura. Existe no entanto a possibilidade da sua utilização ilícita ou interacção com

outras substâncias com possível ocorrência de mortes associadas ao consumo de doses

superiores às terapêuticas.

O interesse pela realização deste trabalho surgiu devido às solicitações para a

realização de análises toxicológicas para as substâncias referidas, e devido ao facto da

metodologia existente no Serviço de Toxicologia Forense da Delegação do Centro do

INML, não se encontrar validada.

Foi escolhida como matriz o sangue total devido a ser a amostra biológica mais

usual e frequentemente a única disponível em toxicologia forense, e por isso aquela

que se afigura como de maior importância. Por outro lado, após pesquisa e estudo

detalhado da bibliografia disponível, são escassos trabalhos em sangue total pos-

mortem.

Considerámos que os resultados obtidos no decurso do trabalho efectuado

justificaram a escolha da temática abordada.

Objectivos


2. OBJECTIVOS

Chega diariamente ao Serviço de Toxicologia Forense um elevado número de

amostras de sangue para pesquisa de substâncias eventualmente presentes,

verificando-se frequentes solicitações para pesquisa de metadona e buprenorfina.

Assim, e no sentido da dar uma resposta cuja interpretação dos resultados

analíticos seja de confiança, é de todo o interesse do serviço desenvolver e validar

metodologias sensíveis para a determinação do maior número de substâncias possível.

A metadona e a buprenorfina usadas cada vez mais para o tratamento de

substituição de drogas opiáceas são muitas vezes usadas de forma ilícita.

Tendo presentes estas situações, o objectivo fundamental do trabalho foi

validar o método em estudo, de modo a obter a máxima confiança na interpretação

dos resultados obtidos. Os parâmetros de validação estudados foram a selectividade,

linearidade, limites de detecção e de quantificação, precisão intermédia, exactidão e

recuperação do processo extractivo.

II – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

História do ópio


1. HISTÓRIA DO ÓPIO

Tão antiga quanto o homem é a busca pela felicidade, mesmo que esta dure

breves instantes. Talvez por isso a primeira droga a ser descoberta tenha sido o ópio. O

ópio é o sumo natural da papoila Papaver Somniferum, do qual 25% do seu peso são

alcalóides (1, 2, 3). É obtido através da realização de uma incisão na cápsula da

papoila, de onde sai um líquido de aspecto leitoso que solidifica com facilidade,

tornando-se acastanhado. Desde o período neolítico que é utilizado para o alívio de

dores e em cerimónias religiosas.

Fig. 1 – Papaver Somniferum

Viajando pelo mundo antigo, encontram-se relatos do uso do ópio em

praticamente todas as civilizações antigas: egípcios, mesopotâmicos, persas, gregos e

romanos. As referências ao seu uso já se encontravam nos escritos de Teofrasto, no

séc. III a.C. (1, 2) e Homero refere o seu uso por Helena de Tróia não só para anular as

dores como também para melhorar o humor. Os físicos arábicos eram especialistas no

uso do ópio, e foram precisamente os comerciantes arábicos que introduziram a droga

no oriente (2, 4). No Papiro de Ebers, o ópio era componente básico em cerca de 700

remédios (2).

História do ópio


Largamente conhecido pelos grandes médicos gregos, como Hipócrates e

Galeno, o ópio era recomendado para a cura de diversas doenças como: epilepsia,

bronquite, asma, pedra dos rins, febre, melancolia, disenteria, diarreia, gota, tétano,

insanidade e até ninfomania e também usado como sedativo e tranquilizante (4).

Para os romanos a papoila era ainda um poderoso símbolo de sono e morte,

utilizada como uma potente arma em suicídios e assassinatos. Em 183 a.C., Aníbal

suicidou-se ao ingerir uma pequena quantidade de ópio que se encontrava no seu anel

e anos mais tarde, Agripina a última mulher do imperador Cláudio, utilizou também o

ópio para envenenar o seu enteado, para que Nero assumisse o império (2, 4).

Na idade média, Avicena considerado o maior médico dessa época, descrevia

no seu livro remédios que misturavam o ópio com nozes, eufórbia e alcaçuz. Acabou

por morrer de overdose de ópio com vinho (4).

Numa família de 28 géneros de papoilas e 250 espécies, apenas 2 delas contêm

uma quantidade razoável de ópio: Papaver Bracteatum e Papaver Somniferum, esta

última cultivada na Ásia Menor.

Fig. 2 – Papaver Bracteatum e Papaver Somniferum

Em 1806 Sertϋrner, um farmacêutico alemão, descreveu o isolamento de uma

substância pura do ópio, a morfina (do grego Morpheus, o Deus dos sonhos) a qual já

tinha sido extraída em 1804 pelo francês Armand Seguin (3, 4).

A morfina é o alcalóide mais activo do ópio, com um teor de 10% do seu peso,

apresenta-se sob a forma de cristais solúveis e serve para a preparação de numerosos

derivados. A descoberta de outros alcalóides do ópio, como a codeína e a papaverina,

História do ópio


rapidamente se seguiu (1).

O ópio foi a única droga a ser motivo de guerra, quando em 1839 o imperador

chinês Ch’ung Ch’en proibiu o consumo desta no seu território, a qual era produzida

em Inglaterra, originando uma guerra de três anos, conhecida como a Guerra do Ópio

(5).

Em 1874 o farmacêutico inglês Alder Wright procurando uma alternativa tão

poderosa quanto a morfina, mas sem o inconveniente da dependência, aqueceu-a com

anidro acético até à ebulição, produzindo a diacetilmorfina, mais conhecida por

heroína (6).

Até 1920 o ópio e seus derivados foram utilizados livremente, no entanto,

devido ao seu uso abusivo e com o aumento de farmacodependentes, estes foram

proibidos em vários países e as convenções internacionais de 1925 e 1931 impuseram

medidas restritas à sua fabricação e exportação (3, 5).

Paralelamente aos efeitos terapêuticos surgiu o conhecimento dos efeitos

tóxicos o que veio estimular a pesquisa de analgésicos opióides sintéticos que tivessem

efeitos tóxicos menos acentuados, surgindo assim a metadona.

A metadona foi desenvolvida no final dos anos 30 na Alemanha Nazi, em

antecipação à possível falta de ópio e seus derivados, uma vez que durante a guerra a

função dos analgésicos é bastante importante para os militares e para a população

civil. A metadona foi testada por médicos profissionais do exército alemão em 1939-

40, mas verificou-se que era demasiado tóxica e com grandes possibilidades de causar

dependência após o seu uso prolongado (7). Em 1950 começou a ser prescrita para o

tratamento dos sintomas associados à dependência de heroína e opióides (8) e em

1964 estudos científicos demonstraram a sua importância no tratamento da

dependência de heroína ao contrariar a síndrome de abstinência e reduzir o consumo

de droga (9). Deste modo a metadona constituiu o primeiro tratamento de

substituição para a dependência crónica de drogas opiáceas.

Mais tarde surge a buprenorfina que foi comercializada pela primeira vez nos

Estados Unidos como analgésico e aprovada pela U.S. Food and Drug Administration

(FDA), em Outubro de 2002, para o tratamento de substituição de drogas opiáceas

(10). O perfil farmacológico da buprenorfina constitui uma alternativa atractiva à

metadona no tratamento da dependência de opióides (11).

Opiáceos e Opióides


2. OPIÁCEOS E OPIÓIDES

Como já referido anteriormente o ópio é o sumo extraído da papoila, do qual

25% do seu peso são alcalóides. Os alcalóides do ópio são de 2 grupos distintos: os

fenantrénicos que têm propriedades analgésicas (morfina, codeína, tebaína) e os

benzilisoquinoleicos que não possuem propriedades analgésicas (papaverina e

noscapina). O ópio e os seus derivados (sintéticos ou não) actuam por estimulação de

receptores opiáceos a nível do sistema nervoso central. As substâncias que possuem

este mecanismo de acção são denominadas por analgésicos opiáceos se forem de

origem natural, ou por analgésicos opióides se forem de origem semi-sintética ou

sintética.

O ópio foi utilizado durante muito tempo devido às suas propriedades

medicinais como analgésico, antitússico e antidiarreico (1).

O comité de taxonomia da Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP)

(126), conceitua a dor como : ‘Uma experiência sensorial e emocional desagradável,

que é associada ou descrita em termos de lesões teciduais.’

A dor pode ser assim definida como uma sensação desagradável, criada por um

estímulo nocivo que atinge o sistema nervoso central por meio de vias específicas.

A origem da dor pode ser central (Sistema nervoso central) ou periférica

(Sistema nervoso periférico). Nesta última são encontradas alterações nos distintos

subtipos de fibras nervosas, enquanto na dor central as alterações são mais complexas

e envolvem vias aferentes, diferentes circuitos cerebrais e a modulação descendente

(12, 13).

A dor é causada pela modificação das condições normais de um organismo

vivo. Esse organismo necessita de apresentar capacidade de resposta com reacções de

adaptação às modificações que ocorrem no meio ambiente.

Os principais processos envolvidos na experiência sensorial da dor são: a

percepção da dor e a reacção à dor.

A percepção da dor envolve mecanismos anátomo-fisiológicos, através dos

quais um estímulo nocivo capaz de gerá-la é criado e transmitido por vias neurológicas

desde os receptores da dor. Os elementos que captam os estímulos a serem

transmitidos ao sistema nervoso central, para uma análise e possível reacção, são



chamados receptores. Os receptores (do latim recipere = receber) são tecidos nervosos

especializados sensíveis a alterações específicas que se produzem no seu meio (1, 2,

12, 13).

As várias modalidades de sensação podem ser percebidas e distinguem-se

umas das outras devido a diferentes tipos de receptores. A pesquisa fisiológica

demonstrou que estímulos específicos são captados por receptores específicos e

assim, por exemplo, os receptores da dor somente respondem com a sensação de dor

a qualquer estímulo que atinja seu limiar de excitação.

Os receptores da dor são, histologicamente, pouco mais que terminações

nervosas livres. Pelo facto de estarem relacionados com estímulos capazes de causar

danos às células, têm importante valor protector, avisando sobre perigos iminentes ou

reais. Como qualquer agente capaz de causar dano é chamado nocivo; os receptores

da dor denominam-se também por nociceptores (1, 2, 12, 13).

A fisiologia da condução de um estímulo nervoso envolve quatro componentes

funcionais que podem transformar os sinais de entrada em libertação de

neurotransmissores (ex. bradicinina, prostaglândinas e substância P) (1, 2).

O primeiro componente funcional é um sinal de entrada (input) que, após fazer

contacto com um receptor dendrítico com suficiente intensidade, induz a geração de

um potencial receptor o que transforma um estímulo sensitivo doloroso em sinal

eléctrico local.

O segundo componente funcional é o sinal de integração. Como o potencial

receptor local não pode por si só gerar um potencial de acção, deve ser modificado por

uma transmissão activa adicional. Caso os potenciais do receptor desenvolvam uma

soma integrada suficientemente excitatória, será iniciado o potencial de acção. Se esse

potencial de acção não se gerar, o sinal de entrada dissipa-se sem que haja resposta

perceptível.

O terceiro componente funcional da condução nervosa é a propagação

continuada do potencial de acção para a medula espinhal. O axónio nervoso é o

componente anatómico do sistema nervoso responsável pela propagação do potencial

de acção.

O quarto componente funcional é a ascenção do estímulo às estruturas do

sistema nervoso central. O corno dorsal é a região da medula espinhal cujo propósito



principal é receber o estímulo aferente (proveniente da região onde ocorreu a lesão),

modificar o sinal de entrada de acordo com as influências descendentes dos centros

cerebrais superiores e transmitir a informação resultante aos centros cerebrais

superiores para continuar o processo de compreensão da dor e do local de lesão (1, 2).

A este sistema de condução ascendente corresponde um outro, descendente, com

origem em vários locais intracranianos e que exerce efeitos de modificação do sinal de

entrada (input) a vários níveis. É o sistema de antinocicepção ou analgesia.

Os opióides endógenos são os mediadores mais importantes da

antinocicepção/analgesia, actuando sobre receptores específicos. Na espécie humana,

são caracterizados 4 tipo de receptores opiáceos endógenos: o receptor µ, ĸ, δ e σ.

Estes receptores encontram-se localizados por todo o sistema nervoso, com diferentes

densidades e zonas de localização, havendo por vezes zonas comuns. Dependendo das

suas localizações assim serão os seus efeitos fisiológicos; por essa razão é que alguns

apresentam maior analgesia e dependência que outros (1, 2, 3).

Os mediadores endógenos dos receptores opiáceos são polipeptídeos de 3

famílias diferentes: encefalinas, endorfinas e dinorfinas, que apresentam afinidades

distintas para com os diferentes receptores. As encefalinas apresentam maior

afinidade para o receptor δ, enquanto as endorfinas β e as dinorfinas para o receptor µ

e receptor ĸ, respectivamente (1, 3). O receptor σ não é estimulado por nenhuma

família de ligandos endógenos conhecida, no entanto, ocorre estimulação por

substâncias exógenas (1). Como tal, são nestes receptores que os analgésicos

opiáceos/opióides actuam. Os efeitos farmacológicos dos opióides podem ser úteis ou

adversos, conforme a dose e a situação. Cada fármaco pode produzir efeitos de

intensidade diferente conforme a sua especificidade para uns ou outros receptores.

Deste modo, da estimulação dos receptores opiáceos pode resultar não só o efeito de

analgesia mas um conjunto de outros efeitos (por exemplo, euforia e estados

hipnóticos) aliados a uma forte componente de dependência física e psíquica. Os

opióides apresentam duas características que os tornam drogas de abuso

particularmente perigosas, produzem euforia e bem-estar, e a sua acção necessita de

doses cada vez maiores para manter o mesmo efeito -fenómeno de tolerância (1,3).

Actualmente o opióide de abuso mais usado é a heroína, um derivado da

morfina com praticamente os mesmos efeitos mas com maior solubilidade aquosa, o



que facilita o seu consumo abusivo.

O tratamento de substituição é, por definição, uma forma de tratamento

médico para os dependentes de opiáceos (em especial os da heroína) baseado na

utilização de uma substância com acção semelhante à droga normalmente consumida

(17).

A metadona e a buprenorfina são duas das substâncias que podem ser

utilizadas no tratamento de substituição, em pessoas dependentes de opiáceos (17).

As substâncias de substituição podem ser agonistas — substâncias que activam os

receptores de opiáceos, no cérebro, desencadeando o efeito do consumo de droga —

ou agonistas-antagonistas — substâncias que simultaneamente activam os receptores

de opiáceos, no cérebro, e limitam ou eliminam os efeitos de outros opiáceos ou

opióides.

Metadona


3. METADONA

a) Propriedades físico-quimicas

A metadona (6-dimetilamino-4,4-difenil-3-heptanona - C21H27NO) é o primeiro

opióide de síntese a perder o anel piperidínico; é usada sob a forma de cloridrato

racêmico porque possui dois isômeros: a L-metadona, responsável pela acção

analgésica e sedativa e a D-metadona que tem actividade antitússica. O isómero L-

metadona é o mais activo e é composto por 2 enantiómeros: R-metadona e S-

metadona (14, 15). Apresenta um peso molecular de 309.44 g/mol, um ponto de fusão

de 241ºC, é solúvel em água, álcool e clorofórmio, e é praticamente insolúvel em éter

e glicerol (16).

Fig. 3 – Estrutura química da metadona

b) Grupo Terapêutico e mecanismo de acção

A metadona é uma difenilpropilamina sintética usada em tratamentos de

desintoxicação e manutenção temporária da dependência de narcóticos e também no

tratamento da dor aguda e crónica. É um agonista dos receptores opióides µ, embora

também tenha efeito no receptor NMDA agindo aí como um antagonista do

glutamato, e parece bloquear a recaptação de serotonina e noradrenalina (18, 19, 20,

21). A metadona tem muitas das propriedades farmacológicas da morfina, sendo a sua

potência analgésica semelhante. Ao contrário da morfina, a administração repetida de

metadona provoca efeitos sedativos marcados devido à sua acumulação no organismo.

Metadona


c) Toxicocinética

A metadona é metabolizada pelas enzimas CYP3A4, CYP2B6 e CYP2D6 (14, 22,

25), as quais têm uma grande variabilidade entre indivíduos. A síndroma do desmame

da metadona é qualitativamente semelhante ao da morfina, diferindo no facto de ser

menos intensa e de se desenvolver de uma forma mais lenta, gradual e prolongada.

Por estas razões, a metadona é usada na gestão da dependência de narcóticos,

porventura eliminando a necessidade de drogas opiáceas ilícitas. É administrada

intramuscularmente para fins analgésicos e oralmente para terapia de manutenção. A

metadona é rapidamente absorvida ao nível do trato gastro-intestinal, aparecendo os

seus primeiros efeitos após 30 a 60 minutos. O tempo médio de pico plasmático é 2,5

horas para a metadona em solução e 3 horas para a metadona em comprimidos. Após

a sua administração repetida, a duração e a semi-vida aumentam em proporção (23).

Após ingestão este fármaco é bem absorvido pelo aparelho gastrointestinal, como já

referido, e largamente distribuído pelo fígado, pulmões, rins, baço, sangue e urina (18).

O facto da metadona se ligar em grande extensão às proteínas dos tecidos (86%) pode

explicar os seus efeitos cumulativos. A metadona tem um metabolismo lento e uma

elevada lipossolubilidade, fazendo com que o seu tempo de semi-vida seja longo.

Apesar desta longa semi-vida, o efeito analgésico geralmente dura de 6 a 8 horas. A

sua metabolização ocorre principalmente no fígado através de um processo de mono e

di-N-desmetilação e os metabolitos são inactivos (26, 27). Após ingestão, a metadona é

rapidamente metabolizada no seu metabolito primário, a normetadona. No entanto, a

normetadona raramente se detecta, por se desidratar rapidamente dando origem a

outro composto o 2-etilideno-1,5-dimetil-3,3-difenilpirrolidina (EDDP). O EDDP é

posteriormente desmetilado para formar a 2-etil-5-metil-3,3-difenil-1-pirrolina (EMDP)

(26).

d) Toxicidade

Devido à sua acumulação no organismo, a metadona tem efeitos mais

prolongados neste que a morfina, podendo originar uma maior depressão respiratória.

A sua toma contínua pode originar uma acentuada sedação.

Metadona


e) Doses terapêuticas e tóxicas

A concentração plasmática em doses terapêuticas é de 0,05 a 0,5 mg/L,

podendo chegar até 1 mg/L. A concentração plasmática analgésica é de 0,1 a 0,3 mg/L

e em terapêutica de substituição a concentração varia entre 0,2 a 0,75 mg/L. A

concentração tóxica para não consumidores será de 0,2 mg/L, para consumidores é

superior a 0,75 mg/L e a dose letal situa-se entre 0,2 e 1 mg/L (46).

Buprenorfina


4. BUPRENORFINA

a) Propriedades físico-quimicas

A buprenorfina (C29H41NO4) é um derivado semi-sintético da tebaína com

elevada lipofilia. Apresenta um peso molecular de 467.64 g/mol, um ponto de fusão de

218 ºC, é pouco solúvel em água, muito solúvel em acetona e solúvel em álcool (16).

Fig. 4 – Estrutura química da buprenorfina

b) Grupo terapêutico e mecanismo de acção

A buprenorfina actua como agonista parcial dos receptores opióides µ e como

antagonista dos receptores k.

A sua actividade no tratamento de manutenção da dependência dos opiáceos é

atribuída à sua ligação lenta e reversível aos receptores µ induzindo uma redução da

necessidade de consumo de drogas por parte do doente toxicodependente, durante

um período de tempo prolongado (10).

c) Toxicocinética

Esta substância é metabolizada no fígado em N-dialquilbuprenorfina

(norbuprenorfina) e metabolitos conjugados glucurónicos. O pico das concentrações

plasmáticas é atingido 90 minutos após a administração sublingual. A absorção da

Buprenorfina


buprenorfina é seguida de uma fase de distribuição rápida (semi-vida de distribuição

de 2 a 5 horas). Cerca de 96% da buprenorfina circulante é ligada às proteínas (2).

A buprenorfina é metabolizada por 14-N-desalquilação e glucuroconjugação da

molécula original e do metabolito desalquilado. Os dados clínicos confirmam que a

CYP3A4 é responsável pela N-desalquilação da buprenorfina (24).

A eliminação da buprenorfina é bi- ou tri-exponencial e a semi-vida plasmática

média é de 32 horas. A buprenorfina é eliminada nas fezes por excreção biliar dos

metabolitos glucuroconjugados (70 %), sendo a restante fracção eliminada na urina

(24).

d) Toxicidade

Tal como sucede com outros opiáceos potentes, pode ocorrer depressão

respiratória, mesmo com doses pertencentes aos limites terapêuticos recomendados.

A buprenorfina é metabolizada pelo fígado e a sua eliminação está relacionada com a

circulação sanguínea hepática. A redução do metabolismo do fármaco em indivíduos

com doença hepática grave pode potenciar os efeitos do fármaco, na dose terapêutica

recomendada (24).

e) Doses terapêuticas e tóxicas

A concentração plasmática em doses terapêuticas é de 0,001 a 0,01 mg/L. A

concentração plasmática tóxica é de 0,2 mg/L e a dose letal 1,1 mg/L (46).

Técnicas para determinação da metadona e buprenorfina


5. TÉCNICAS PARA DETERMINAÇÃO DA METADONA E BUPRENORFINA

Ao longo dos anos têm sido publicados diversos trabalhos que descrevem

diferentes metodologias para a determinação de metadona, EDDP, buprenorfina e

norbuprenorfina, em diversas matrizes biológicas. Na pesquisa bibliográfica realizada

não foi encontrado nenhum estudo que combine a análise em sangue total pos-

mortem, utilizando a técnica de extracção em fase sólida descrita neste trabalho e a

cromatografia de gases com detector de massas. Em Toxicologia Forense, sendo o

sangue total o tipo de matriz mais frequente e muitas vezes o único disponível, e a

extracção em fase sólida combinada com cromatografia de gases serem técnicas cuja

utilização é vantajosa devido à sua rapidez e eficácia, será de todo o interesse a

realização de um trabalho que combine estes três factores.

Os procedimentos sistemáticos para o estudo das substâncias em causa,

nomeadamente na monitorização e controlo de doses terapêuticas, no controlo de

adesão à terapêutica e na determinação das concentrações sanguíneas pos-mortem

são: a cromatografia de gases acoplada a espectrometria de massas (GC-MS) (73, 74,

78, 80-86, 91, 93, 96) por impacto electrónico (78, 89) ou por ionização química ião-

positivo (85), a cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS)

(77, 82, 88, 103-105), e técnicas de imunoensaios (75, 77, 86, 88).

Em relação às matrizes biológicas utilizadas elas são diversas, havendo

referências que incluem urina (45, 75-77, 80-83, 86-89, 93, 97, 99-101, 116, 118),

plasma (45, 47, 74, 79, 88, 91, 92, 110-114), cabelo (45, 88, 97, 102-104, 106-109),

sangue total (45, 73, 85, 87, 99, 102-105), suor (88, 95, 96), tendo sido também

encontrados alguns trabalhos em leite materno (13, 78, 88), placenta (84), fluido oral

(119) e cordão umbilical (74, 88). A amostra mais estudada é a urina sobre a qual

existem muitos trabalhos de screening (77, 84, 88, 89, 93, 102, 104) e alguns de

quantificação (79, 83, 85). No entanto existem também trabalhos de screening em

plasma (94) e quantificação em plasma (47,74,91,110,112) e cordão umbilical (88).

Foram também encontrados estudos farmacocinéticos em plasma de rato (91) e de

plasma humano (110-114).

Relativamente aos métodos extractivos usados para o isolamento das

substâncias da matriz biológica o resultado da pesquisa bibliográfica foi: a extracção



em fase sólida (SPE) e a extracção líquido-líquido (LLE) precedidas ou não por hidrólise

enzimática, no caso da buprenorfina e norbuprenorfina (75, 77, 86, 88). A hidrólise

enzimática tem sido aplicada a amostras de plasma e urina (47). A técnica extractiva

mais encontrada é a extracção em fase sólida (SPE) (74-76, 78, 80, 83, 84, 86-88) no

entanto a extracção líquido-líquido (LLE) (81, 95, 99, 101) geralmente também

consegue uma extracção bastante eficiente (48, 97). Em relação às técnicas extractivas

encontradas existem algumas que extraem a metadona, buprenorfina e respectivos

metabolitos em simultâneo, e existem trabalhos onde a técnica extractiva descrita é

utilizada apenas para uma das substâncias e respectivo metabolito. De acordo com as

técnicas extractivas descritas os solventes usados para a extracção dessas substâncias

em fluidos biológicos incluem: tampão carbonato e acetato de etilo (44),

clorofórmio/2-propanol/n-heptano (45), hidrogenofosfato de sódio e acetato n-butilo

(73), diclometano/metanol/hidróxido de amónia (78), metanol/hidróxido de amónia

(76), diclorometano/2-propanol/amónia (80), acetato de butilo (82),

clorofórmio/isopropanol (81, 95), diclorometano/isopropanol/hidróxido de amónia

(97); cloridrato de metileno/isopropanol/hidróxido amónia (83, 88, 92), cloridrato

metileno/2-propanol/hidróxido amónia (96), metanol/hidróxido amónia/isopropanol

(84), dietileter (85), acetato de etilo/hidróxido de amónia (86), metanol (87),

metanol/ácido acético (90), cloridrato de butilo (100), triclorometano (101).

Os adsorventes mais usados em SPE foram: troca catiónica com colunas OASIS®

MCX (76, 97); colunas de fase reversa Microsorb-MV C8 (89); octilo - colunas Bond Elut

C8 (87, 90); colunas C18 (Cat.No.1211-3024) (47); colunas mistas de troca catiónica-

resina hidrofóbica OASIS® HCX (74, 78, 83, 94); colunas Clean Screen® ZSDAU020 (96);

colunas poliméricas STRATATM-X-C (84, 88); ciclohexilo (89); colunas

hidrofílicas/lipofílicas OASIS® HLB (87); colunas troca de catiónica/resina lipofílica (87).

Segundo alguns estudos as colunas octilo C8 foram as que obtiveram melhores

resultados quando comparadas com as colunas OASIS® HLB que obtiveram

concentrações muito baixas dos analitos, com as colunas mistas de troca

catiónica/resina lipofílica nas quais foram encontradas interferentes severos, e por fim

com ciclohexilo com as quais surgiram interferentes e baixa concentração extraída de

padrão interno (87).



Após tratamento da amostra pelos diversos métodos usados, a técnica

cromatográfica mais utilizada para analisar a metadona, buprenorfina e respectivos

metabolitos é a análise por cromatografia de gases acoplada a detector de massas

(GC/MS), embora a cromatografia líquida acoplada a detector de massas (LC-MS)

também seja utilizada. A metadona e o EDDP quando analisados por qualquer um dos

métodos atrás referidos não necessitam de derivatização para serem

cromatografados. Quanto à buprenorfina e à norbuprenorfina, quando analisada por

cromatografia de gases acoplada a detector de massas (GC/MS) a derivatização torna-

se indispensável. Vários têm sido os procedimentos de derivatização estudados para

tornar as moléculas mais aptas para análise por cromatografia de gases, como seja o

caso da derivatização por alquilação, acilação e sililação (115-117, 119, 128).

Derivatização


6. EXTRACÇÃO EM FASE SÓLIDA

O processo extractivo dos analitos que estão presentes numa amostra é um dos

passos mais importantes no procedimento sistemático de análises toxicológicas. A

presença de interferentes na matriz pode dificultar, ou mesmo impedir a análise dos

componentes em estudo. Assim sempre que possível é necessário minimizar, ou

mesmo eliminar essas interferências. Os dois objectivos fundamentais na preparação

de amostras são: a purificação e a concentração dos extractos obtidos.

A purificação é necessária, tal como já foi referido, para que o analito em

estudo consiga ser analisado, e por outro lado, para que não prejudiquem o tempo de

vida das colunas cromatográficas.

Em relação à concentração da amostra, é frequente que os analitos em estudo

se encontrem nas amostras em baixos níveis de concentração, necessitando de ser

concentrados para que possam ser detectados.

Entre as várias técnicas usadas neste procedimento destacam-se como sendo

as mais comuns a extracção líquido-líquido (LLE), a centrifugação, a precipitação e a

extracção em fase sólida (SPE).

A extracção SPE surge nos anos 70 como uma técnica rápida e eficaz na

preparação de amostras para determinações analíticas. O conceito de SPE é similar à

cromatografia líquida de baixa pressão. Consiste em pequenas colunas de extracção

descartáveis com uma grande variedade de enchimentos (adsorventes) disponíveis.

Actualmente as colunas de SPE são de polipropileno ou de polietileno com material de

enchimento constituído por diferentes grupos funcionais, com partículas de cerca de

40 µm e poros de aproximadamente 60 Ǻ de diâmetro (50).

Fig. 5 – Coluna de SPE

Reservatório para amostra

Disco poroso

Camada adsorvente

Disco poroso

Derivatização


A SPE é cada vez mais uma técnica útil na preparação das amostras, onde

muitos dos problemas associados à extracção líquido/líquido tais como: separações de

fase incompleta, recuperações quantitativas menores, uso de material quebrável

(tubos de vidro) e utilização de grandes quantidades de solventes orgânicos poderão

ser evitados. A SPE é uma técnica mais eficiente, que tem associado um maior

rendimento quantitativo de extracção, mais fácil e rápida de executar, elimina a

ocorrência de emulsão dos extractos e tem possibilidade de automatização (51, 52).

Por outro lado esta técnica tem disponíveis inúmeros adsorventes que permitem

interacções intermoleculares do tipo: interacções polares, hidrofóbicas e iónicas;

enquanto a extracção líquido/líquido se limita a equilíbrios de partição na fase líquida

(50, 53).

A SPE é um processo de separação pela qual os compostos que estão

dissolvidos ou suspensos numa mistura líquida são separados nos restantes compostos

da mistura de acordo com suas propriedades físicas e químicas. A extracção em fase

sólida pode ser usada para isolar os analitos de interesse de uma grande variedade de

matrizes tais como: urina, sangue, tecidos biológicos, água, bebidas, solo e tecido

animal. É usada na maioria das vezes para preparar amostras líquidas e extrair analitos

voláteis ou semi-voláteis, podendo também ter como objectivo a concentração do

analito na amostra, como já foi referido anteriormente.

A extracção SPE utiliza a afinidade do soluto dissolvido ou suspenso num

líquido (fase móvel) para um sólido através do qual a amostra passa (fase estacionária)

para separar os diferentes componentes da mistura. A fracção que passa através da

fase estacionária é recolhida ou descartada, dependendo se contém os analitos

desejados ou indesejados. Se a fracção retida na fase estacionária incluir os analitos

desejados, estes podem ser removidos da fase estacionária através de uma etapa

adicional – a lavagem da fase estacionária com um eluente adequado.

Derivatização


Recolha do analito

Remoção de interferentes

Fig. 6 Etapas do procedimento de SPE

O processo de extracção em fase sólida envolve quatro etapas básicas: -

acondicionamento da coluna com um solvente não-polar ou ligeiramente polar

seguido de água ou de uma solução tampão que vai embeber a fase sólida e solvatar

os grupos funcionais das suas partículas constituintes. Assim o ar que se encontrava

entre as partículas da coluna é eliminado e substituído pelo solvente ocorrendo a

activação da coluna, permitindo os mecanismos de adsorção entre o adsorvente da

fase estacionária e a amostra aquosa (fase móvel). É fundamental não deixar secar o

adsorvente para que a recuperação não fique comprometida (51); - seguidamente a

amostra é adicionada à coluna e ao passar através da fase estacionária, os analitos da

amostra vão interagir com a coluna e ficar retidos (concentrados). Por vezes, é

necessário ajustar as características da matriz tratando previamente a amostra (ajuste

de pH, polaridade ou viscosidade); - a coluna é lavada com tampão ou solvente para

remover as impurezas retidas no adsorvente, sem no entanto remover o analito; por

fim, o analito é eluído com um solvente não-polar ou um tampão de pH adequado

capaz de romper as ligações entre o analito e o adsorvente resultando na sua eluição,

sem no entanto remover as outras substâncias que possam também estar retidas no

Metanol

H2O LAVAGEM AMOSTRA ELUIÇÃO

Derivatização


adsorvente (51).

A fase estacionária utilizada nestas colunas consiste normalmente em sílicas

com características de retenção modeladas por incorporação dum revestimento

superficial constituído por grupos de estrutura seleccionada que se unem por ligações

covalentes ao gel de sílica. Em função do mecanismo de retenção que proporcionam,

as fases quimicamente ligadas a este suporte podem agrupar-se em três grupos

principais: fase normal, fase reversa e troca iónica.

A fase normal é a fase padrão utilizada pela cromatografia líquida clássica. É

classicamente utilizada para separar os compostos orgânicos neutros, cuja natureza

varia de hidrofóbico a moderadamente polar. O mecanismo de retenção primário é

devido a interacções entre os grupos funcionais polares do analito e os grupos polares

na superfície do adsorvente. Estas, incluem ligações de hidrogénio, interacções dipolo-

dipolo e dipolo-dipolo induzido. Compostos adsorvidos por estes mecanismos são

eluídos por um solvente que perturba o mecanismo de ligação, geralmente um

solvente que é mais polar que o original da matriz da amostra. Os tipos de fases não

ligadas usadas neste modo de adsorção são a sílica (a mais usada), a albumina e o

silicato de magnésio. No entanto a utilização de sílicas de fases ligadas tem vindo a

aumentar uma vez que estas não formam locais de adsorção fortes e irreversíveis

induzidos pelos grupos silanol livres. A SPE em fase normal é tipicamente usada para

limpeza de extractos orgânicos, sendo também utilizada para isolamento de analitos

provenientes de líquidos orgânicos (51, 52).

A fase reversa em SPE separa analitos com base na sua polaridade. É

denominada por fase reversa por ser o oposto da fase normal. As separações em fase

reversa envolvem uma amostra polar (geralmente aquosa) ou moderadamente polar

(fase móvel) e uma fase estacionária apolar (52).

O processo de isolamento consiste em interacções não polares por forças de

Van der Waals, ou forças de dispersão ou de partição. O mecanismo de partição é um

processo de baixa energia sendo análogo à remoção de uma molécula a partir de uma

amostra de água por LLE. Esta partição consiste na interacção do analito com as

cadeias da fase estacionária ligada. Este processo depende da diferença de

solubilidade do analito nas duas fases, pelo que a sua polaridade assume um papel de

grande importância na estimativa da eficiência da fase sólida no isolamento do analito.

Derivatização


A eluição dos analitos é um processo simples, que consiste na escolha de um solvente

não polar capaz de romper as forças de Van der Waals que retêm o analito. Assim a

amostra pode ser eluída por lavagem da coluna com um solvente não-polar, que

interrompe a interacção do analito e a fase estacionária. Os solventes compatíveis com

os adsorventes usados na fase reversa são o metanol, o acetonitrilo e o acetato de

etilo, por serem capazes de estabelecer ligações de hidrogénio com os grupos silanol

livres da superfície da sílica. Estes solventes têm capacidade para dissolver a água

residual que se possa encontrar retida na fase ligada, rompendo assim facilmente as

interacções de Van der Waals. No entanto existem analitos hidrofóbicos que não são

eficientemente eluídos com estes solventes, nestes casos, utiliza-se uma mistura de

solventes, por exemplo, diclorometano e acetato de etilo (1:1).

A troca iónica consiste na separação de um analito com base em interacções

electrostáticas entre o analito de interesse e os grupos carregados positivamente na

fase estacionária. Para que ocorra a troca iónica, tanto a fase estacionária como a

amostra devem estar a um pH a que ambos se encontrem carregados. Uma solução

em que o pH neutralize os grupos funcionais do analito ou os grupos funcionais do

adsorvente é usada para eluir o analito de interesse. Quando um destes grupos

funcionais é neutralizado, a força electrostática que liga o analito e o adsorvente é

quebrada e o analito é eluído. Por outro lado uma solução que tenha elevada força

iónica ou que contenha espécies iónicas que desliguem o analito do adsorvente pode

ser usada para a sua eluição (52). Os adsorventes de troca iónica tanto podem ter

grupos funcionais aniónicos como catiónicos, fortes e fracos. Os adsorventes de troca

aniónica forte contêm grupos amina quaternários, que possuem uma carga positiva

permanente em soluções aquosas, e os adsorventes de troca aniónica fraca contêm

grupos amina primários, secundários e terciários nos quais o sítio trocador pode ou

não encontrar-se carregado dependendo do pH que se pode encontrar acima ou

abaixo do pKa. Os adsorventes de troca aniónica forte são úteis porque as impurezas

fortemente ácidas na amostra ligam-se ao adsorvente e, geralmente, não serão eluídos

com o analito de interesse.

Os adsorventes de troca catiónica forte contêm grupos de ácido sulfónico que

estão sempre carregados negativamente em solução aquosa, e os adsorventes de

troca catiónica fraca contêm ácidos carboxílicos cujos sítios de troca, tal como nos

Derivatização


adsorventes de troca aniónica fraca, estão dependentes do pH.

Verifica-se assim que a SPE tem um âmbito de aplicação muito alargado pelo

facto de dispormos de diversos adsorventes cujas características divergem bastante. A

selectividade dos procedimentos a usar para determinada extracção sólida é assim

determinada pela natureza do adsorvente e pelos solventes usados nos procedimentos

de adsorção, lavagem e eluição. Assim na escolha do procedimento é necessário ter

em consideração todas as características do analito em questão, para que o

procedimento escolhido seja o mais adequado e eficaz.

A técnica extractiva SPE tem um vasto campo de aplicação, nomeadamente, na

área das análises forenses, podendo ser utilizada na determinação de várias

substâncias em fluidos biológicos (54-77).

Derivatização


7. DERIVATIZAÇÃO

A derivatização é uma técnica usada em química que transforma um composto

químico num produto de estrutura química similar, derivado.

Existem compostos que devido ao facto de possuírem uma composição química

desfavorável à sua detecção por esta técnica analítica têm de ser modificados (por

exemplo, compostos pouco voláteis). Muitos materiais que sejam termicamente

instáveis nas condições da técnica utilizada também se enquadram nesta categoria. O

processo de derivatização química é assim um processo que modifica a estrutura dos

compostos em estudo de forma a que estes possam ser analisados através de GC-MS.

Geralmente, um determinado grupo funcional do composto participa na

reacção de derivatização e transforma o composto num produto derivado de

solubilidade, ponto de ebulição, ponto de fusão, estado de agregação ou composição

química diferente da que inicialmente tinha, o que permite que este seja devidamente

cromatografado por GC/MS. A análise directa de muitos compostos e misturas de

compostos é difícil devido às interacções entre os compostos e a coluna ou entre os

diferentes compostos da mistura. Estas interacções podem levar a uma resolução de

picos pobre e/ou a picos assimétricos, o que torna o pico desadequado para a

identificação do composto. Por outro lado a derivatização também é utilizada para

aumentar a detecção de compostos. Esta detecção pode ser reforçada através do

aumento do volume da substância ou pela introdução de átomos ou grupos funcionais

que interagem fortemente com o detector.

É pré-requisito para uma derivatização bem sucedida a formação rápida,

reprodutível e quantitativa de um único derivado.

No sangue temos os compostos inerentes à própria matriz que possuem grupos

polares e que, por essa razão, não permitem um comportamento cromatográfico

razoável sem derivatização. Existem muitos reagentes adequados para derivatizar

grupos funcionais polares tornando desta maneira a molécula adequada para

determinações por cromatografia de gases. Os grupos funcionais típicos existentes nos

compostos desta natureza, e que podem sofrer derivatização são os grupos hidroxilo,

as acetonas, os ácidos carboxílicos, as aminas e as amidas.

De um modo geral a derivatização analítica é usada por duas razões: permitir a

Derivatização


análise de compostos que são inadequados para a análise directa e para melhorar o

processo de análise (72)

Por outro lado a necessidade de cada vez mais se determinar pequenas

quantidades de composto nas amostras biológicas, torna importante o alargamento do

intervalo de detectibilidade dos compostos. Este aumento consegue-se através do

aumento do tamanho do composto e pela introdução de átomos ou de grupos

funcionais que interajam fortemente com o detector (121, 122).

Os derivados também são usados para estabilizar os iões formados no

espectrómetro de massas favorecendo a informação estrutural dos modos de

fragmentação molecular.

A maior parte das reacções de derivatização de análise química utilizados em

cromatografia gasosa (GC) são de cinco tipos: sililação, alquilação, acilação, formação

de derivados cíclicos e derivatização quiral (72, 90).

Os derivados silil (sililação) são provavelmente os mais amplamente utilizados

para aplicações de GC. São geralmente formados pela substituição dos protões activos

nos grupos –OH, -SH e –NH, por um grupo alquilsilil, sendo estes derivados mais

voláteis, menos polares e termicamente mais estáveis do que os compostos que lhes

deram origem. A trimetilsililação é a reacção mais usada no procedimento de

derivatização da sililação.

A reacção de sililação é a seguinte:

Amostra-OH + R3Si-X Amostra-O-SiR3 + HX

Este mecanismo caracteriza-se por um ataque nucleofílico sobre o átomo de

silício. No entanto a preparação destes derivados obedece a condições especiais como

seja a ausência de humidade.

A alquilação é usada em derivatização para GC, e consiste na substituição de

um hidrogénio activo por um grupo R-COOH, R-OH, R-SH, R-NH e R-NH2, com um

grupo alquilo ou por vezes arilo. Esta técnica é usada para modificar os compostos

contendo hidrogénios acídicos, tais como ácidos carboxílicos e fenóis. A principal

finalidade cromatográfica desta reacção é a conversão de ácidos orgânicos em ésteres

que produzem cromatogramas de melhor qualidade do que os ácidos livres. As

Derivatização


reacções de alquilação também podem ser usadas para preparar éteres, tioéteres e

tioésteres, N-alquilaminas, amidas e sulfonamidas. Como a acidez do hidrogénio

activo diminui, a força do reagente de alquilação deve aumentar. Como os reagentes e

as condições se tornam mais severas, a selectividade e aplicabilidade do método

torna-se mais limitada. Em geral, os produtos da alquilação são menos polares que as

matérias-primas, uma vez que o hidrogénio activo foi substituído por um grupo alquilo.

Provavelmente, a maior aplicação da alquilação na derivatização analítica é a

conversão de ácidos orgânicos em ésteres, em especial ésteres metílicos. Embora os

derivados de ácidos carboxílicos-TMS sejam facilmente formados, esses compostos

sofrem de estabilidade limitada. Por outro lado, os ésteres alquilo, oferecem

excelente estabilidade e podem ser isolados e armazenados por longos períodos, se

necessário.

A principal reacção na preparação deste tipo de derivados é a substituição

nucleofílica do tipo:

R’-X

Amostra-OH Amostra-O-R’ + HX

Base

Onde X representa um halogénio ou outro grupo de substituição. A alquilação

de grupos acídicos fracos necessita de catalisadores básicos fortes enquanto que

grupos mais acídicos necessitam de catalisadores básicos mais fracos.

A acilação é outra forma de derivatização utilizada em GC-MS e consiste

na conversão de compostos com hidrogénio activo em ésteres, tioésteres e amidas,

respectivamente e na adição de funcionalidades halogenadas. Estes derivados acil

formam-se com reagentes acil anidrido, acil halido e acil amidas activadas. Estes

reagentes são sensíveis à presença de humidade formando produtos ácidos os quais

necessitam de ser removidos imediatamente antes da análise por GC.

Na formação de derivados cíclicos os reagentes mais usados são os que

derivatizam um amplo espectro de grupos funcionais e os quais sejam muito selectivos

para grupos funcionais ou compostos específicos. A grande estabilidade destes

compostos em relação à fragmentação molecular origina espectros de massas com

Derivatização


massas mais elevadas e iões de maior abundância. Possuem como desvantagem a

possibilidade de formação de outros derivados indesejados devido a serem sensíveis à

humidade.

Em relação à derivatização quiral esta pode ocorrer por conversão em

diastereomeros por reacção com reagentes opticamente puros e separação em fases

cromatográficas aquirais; e por separação directa em fases estacionárias quirais sem

necessidade da derivatização quiral (72).

As reacções de derivatização analítica constituem uma forma de síntese em

química orgânica a qual tem como principal objectivo obter um rendimento próximo

dos 100% originando um único derivado e não permitindo reacções secundárias.

Validação


8. VALIDAÇÃO

A confiança na interpretação dos resultados analíticos obtidos é um aspecto

extremamente relevante na área da toxicologia forense. Assim torna-se imperativo

que os métodos utilizados sejam rigorosos e fiáveis, e para tal requerem a sua

validação. A validação de métodos é um aspecto vital da garantia da qualidade

analítica. Os métodos de ensaio usados para avaliar a conformidade dos resultados

com especificações estabelecidas devem atingir padrões adequados de exactidão,

precisão e confiabilidade. Assim a validação do método analítico é a confirmação por

análise e fornecimento de evidência objectiva de que os requisitos específicos para um

determinado uso pretendido são atendidos. A validação do método analítico permite

demonstrar que o método é adequado ao uso pretendido. Os procedimentos devem

ser claros, objectivos e completos. A escolha de uma metodologia analítica adequada é

de fundamental importância para o procedimento do controle de qualidade.

Num laboratório de toxicologia forense é de extrema importância que todos os

métodos sejam validados, ou pelos menos que estejam em fase de validação, uma vez

que se torna mais seguro apresentar resultados finais, visto que estão de acordo com

um conjunto de normas e critérios estabelecidos. Por outro lado, caso seja necessário

justificá-los em tribunal, existe um suporte de elevada confiança que os corrobora.

A validação de métodos analíticos desenvolvidos no laboratório é efectuada

após selecção, desenvolvimento e optimização dos métodos (45).

Baseando-nos em recomendações e critérios de organizações internacionais de

grande relevância científica (28, 99), os parâmetros considerados mais significativos e

que devem ser estudados num processo de validação de procedimentos analíticos para

determinações quantitativas de um ou mais analitos numa determinada matriz

biológica são: selectividade/especificidade, modelo de calibração, precisão, exactidão,

LOD e LOQ, estabilidade, recuperação e robustez (29-47).

Especificidade do método analítico refere-se à capacidade de determinar com

exactidão o analito de interesse em presença de outros componentes ou interferentes

que possam estar presentes na matriz da amostra. Diz-se que o método é específico

para determinado analito se for selectivo para esse analito na presença de outros. Para

estudar estes parâmetros utilizam-se amostras sem analito (amostras brancas) e

Validação


amostras às quais se adiciona analito em quantidades conhecidas dentro do intervalo

da gama de trabalho usada. Pelo menos, devem ser estudadas 6 amostras de origens

diferentes da mesma matriz (30, 31).

Escolher um modelo de calibração adequado é determinante para obter

quantificações fiáveis. Como tal, deve ser estudada a relação que existe entre a

concentração do analito da amostra e a resposta correspondente do detector. Este

estudo é feito a partir de amostras brancas fortificadas com calibradores em

concentrações que abranjam toda a gama de trabalho. As curvas obtidas são

posteriormente avaliadas através de métodos gráficos ou matemáticos.

Linearidade é a habilidade do método analítico de produzir resultados que são

directamente, ou por uma transformação matemática bem definida, proporcionais à

concentração do analito dentro de uma dada gama de trabalho.

Como gama de trabalho considera-se o intervalo de concentração do analito na

matriz, entre o valor mais baixo e o mais alto, para o qual se demonstrou que o

procedimento era preciso, exacto e linear. Este intervalo deve conter, no mínimo, seis

níveis de concentração equidistantes, no qual cada padrão de calibração deve ser

estudado em duplicado.

Precisão do método analítico é o grau de concordância entre resultados de

medidas independentes em torno de um valor central, efectuadas várias vezes numa

amostra homogénea, sob condições pré-estabelecidas. Precisão é expressa em termos

de desvio padrão e desvio padrão relativo. Este parâmetro pode ser avaliado através

da repetibilidade, precisão intermédia e reprodutibilidade. A repetibilidade ou variação

intra-dia, é efectuada no mesmo laboratório, mesmo analista, mesma instrumentação

em curtos intervalos de tempo. A precisão intermédia ou variação inter-dia, é feita em

dias diferentes, diferentes analistas e equipamentos, em sucessivas determinações. Já

a reprodutibilidade expressa a precisão entre diferentes laboratórios, sendo necessário

a sua avaliação se o método for para aplicar em diferentes laboratórios. A precisão de

um procedimento analítico é habitualmente expressa em termos de variabilidade,

desvio padrão ou coeficiente de variação de uma série de medidas:

CV = s/x

Sendo CV, o coeficiente de variação, obtido pela relação entre o desvio padrão

relativo (s) e a média (x).

Validação


Os valores de precisão calculados em cada nível de concentração não devem

exceder 15% do coeficiente de variação (CV), excepto para o LLOQ, onde não deve

exceder 20%. Os mesmos critérios devem ser aplicados a cada tipo de medição de

precisão (intra-ensaio, inter-ensaio) (28).

Exactidão do método analítico é o grau de concordância entre o valor médio

obtido de uma série de resultados e o valor de referência aceite, sendo afectada pelos

componentes do erro sistemático (bias) e do erro aleatório (28). Os valores médios do

bias devem situar-se dentro de ±15% relativamente ao valor real (valor teórico),

excepto para o valor mais baixo de quantificação (LLOQ) em que um valor de ±20% é

aceitável (28). Exactidão pode ser demonstrada pela comparação dos resultados

obtidos com material de referência certificado ou com outro método validado cujo

erro sistemático é sabidamente não significativo. Outra forma de investigação é

comparar a média dos resultados obtidos com a média obtida do programa inter-

laboratorial, ou ainda por meio de estudos de recuperação de quantidades conhecidas

do analito adicionado na matriz isenta de analito ou ainda na matriz da amostra. As

fortificações devem ser efectuadas, no mínimo em triplicado.

Limite de detecção (LD) é a menor concentração do analito numa amostra, que

pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, sob determinadas

condições experimentais. Existem muitos critérios para definição do limite de detecção

(26-29, 33-36, 39-41):

LOD = t x s

Onde t é um parâmetro estatístico que dá indicação da variabilidade de s para

determinados níveis de confiança e n-1 graus de liberdade e s é o desvio padrão

associado às varias leituras do padrão;

LOD = 3,3 x Sy/x/b

Onde Sy/x e b são respectivamente o desvio padrão residual e o declive da recta

de calibração; ou pode ser estimado a partir da concentração que dá origem a uma

resposta superior ao ruído cromatográfico,

LOD = 3 x Sinal/Ruído

Podendo também ser calculado pela média da abundância do ruído x e o

respectivo desvio padrão SD, pela seguinte fórmula

LOD = x + 3 SD

Validação


Limite de quantificação (LQ) do método analítico é a menor concentração do

analito que pode ser determinada e quantificada com precisão e exactidão, aceitáveis,

sob determinadas condições experimentais, podendo ser calculado de várias formas:

LOQ = padrão mais baixo da curva de calibração ou valor bastante aproximado,

que possa ser quantificado com uma percentagem de erro e coeficiente de variação

inferiores a 20%; ou através da fórmula,

LOQ = 10 x Sy/x/b

Onde Sy/x e b são respectivamente o desvio padrão residual e o declive,

da recta de calibração; ou pela razão entre o sinal e o ruído através da expressão,

LOD = 10 x Sinal/Ruído

Podendo ainda ser usada a média da abundância do sinal do ruído x e o

respectivo desvio padrão SD, pela seguinte fórmula,

LOQ = x + 6 SD

O analito na amostra biológica deve apresentar estabilidade em função das

condições e sistemas de armazenamento utilizadas, das propriedades químicas da

substância e da própria matriz. No estudo da estabilidade devem ser reproduzidas ao

máximo as condições de uma amostra real e analisadas em várias vertentes, desde a

colheita e manipulação, períodos de armazenamento longos e curtos períodos à

temperatura ambiente, até os ciclos de congelação e descongelação (31).

O rendimento da extracção é avaliado pelo parâmetro da recuperação, que

pode ser calculado através da relação percentual entre a resposta do detector obtida a

partir de uma quantidade de analito adicionada e posteriormente extraída da matriz

biológica, com a resposta do detector para uma concentração real da substância de

referência. No caso de haver derivatizações na amostra, o cálculo da recuperação

absoluta pode ser dispensado, uma vez que os derivados dificilmente se encontram

disponíveis como substâncias de referência.

A robustez do método é a medida de capacidade que o método apresenta em

se manter inalterável através de pequenas, mas deliberadas modificações nos seus

parâmetros e fornecer indicações de segurança durante o uso normal (49).

A validação é assim, um processo dinâmico e constante que começa nas fases

de selecção, desenvolvimento e optimização do método e na qualificação dos

instrumentos, materiais e pessoas e continua na fase experimental e de transferência

Validação


do método. Um processo de validação bem definido e documentado fornece evidência

objectiva de que o sistema e o método são adequados ao uso pretendido.

III – PARTE EXPERIMENTAL

MATERIAS E MÉTODOS

Material e Métodos


1. AMOSTRA BIOLÓGICA

Para a validação dos métodos analíticos foram usadas amostras biológicas

obtidas por vias institucionais junto do Instituto Português do Sangue, I.P. As referidas

amostras consistiam de sangue humano provenientes de bolsas de dadores cujo prazo

de validade já havia expirado.

Foram ainda usadas 75 amostras de sangue (relativas ao ano de 2004),

negativas para opiáceos após análise por ensaio imuno-enzimático. Estas amostras

resultaram de colheitas efectuadas em indivíduos vivos (obtidas no âmbito do Código

da Estrada e do Serviço da Clínica Forense) e no decorrer de autópsias (realizadas no

Serviço de Patologia Forense da Delegação de Centro e nos Gabinetes Médico-Legais

sob a sua dependência).

Todas estas amostras foram mantidas à temperatura de congelação (-20ºC) até

ao momento da sua utilização. Antes do procedimento extractivo foram retiradas do

congelador e deixadas atingir a temperatura ambiente.

2. REAGENTES E MATERIAL

2.1 Reagentes

2.1.1 2-Propanol (isopropanol) p.a.;

2.1.2 Água desionizada;

2.1.3 Amónia 25% p.a.;

2.1.4 Diclorometano p.a.;

2.1.5 Dihidrogenofosfato de potássio p.a.;

2.1.6 Metanol p.a.;

2.1.7 MSTFA (Sigma-Aldrich);

2.1.8 n-Hexano p.a.;

Material e Métodos


2.1.9 TMCS (Macherey-Nagel).

2.1.10 Ácido cloridríco p.a;

2.1.11 Acetato de etilo p.a;

2.1.12 2-propanol p.a;

2.2 Material

2.2.1 Balões volumétricos de 2, 5, 10, 250, 500 e 1000 mL;

2.2.2 Copos de vidro de 250 e 500 mL;

2.2.3 Colunas para extracção em fase sólida (Waters Oasis MCX®, 3 mL);

2.2.4 Frascos de vidro âmbar de 4 e 12 mL;

2.2.5 Frascos de vidro de 250 e 1000 mL;

2.2.6 Suporte para tubos;

2.2.7 Suporte para vials;

2.2.8 Tubos de plástico de 10 mL com tampa;

2.2.9 Tubos de vidro de 10 mL com tampa de rosca;

2.2.10 Vials de 300 µL.

2.3 Preparação de soluções

2.3.1 Diclorometano / 2-Propanol / Amónia (78:20:2, v/v/v)

Num frasco de volume apropriado juntar 78 mL de diclorometano, 20 mL de 2-

Propanol e 2 mL de amónia (25%). Agitar até homogeneizar.

Manter esta solução refrigerada (2-8ºC).

2.3.2 MSTFA/TMCS (95:5, v/v)

Num frasco de vidro âmbar juntar 9,5 mL de MSTFA e 0,5 mL de TMCS. Inverter

o frasco sucessivas vezes para homogeneizar. Manter esta solução refrigerada (2-8ºC).

Material e Métodos


2.3.3 Tampão fosfato 0,1M

Pesar 13,61 g de dihidrogenofosfato de potássio e dissolver em água desionizada

até perfazer um volume de 1000 mL.

2.3.4 Solução de ácido cloridríco 0,1M

Dissolver-se 2,47 mL de ácido cloridríco concentrado em água desionizada até

perfazer um volume de 250 mL.

2.3.5 Soluções de padrões primários a 1 mg/mL

Na forma líquida, transferir o conteúdo para frascos de vidro âmbar de 4 mL.

Na forma sólida, pesar 10 mg do padrão de referência e dissolver em metanol até

perfazer um volume de 10 mL.

2.3.6 Mistura de armazenamento de padrões primários a 100 µg/mL

Diluir em metanol 500 µL das soluções descritas em 2.3.5 até perfazer um

volume de 5 mL.

2.3.7 Mistura de armazenamento de padrões primários a 50 µg/mL


volume de 5 mL.

2.3.8 Mistura de trabalho de padrões primários a 5 µg/mL


volume de 5 mL.

Material e Métodos


2.3.9 Mistura de trabalho de padrões primários a 0,5 µg/mL


volume de 5 mL.

2.3.9 Solução de trabalho do padrão primário deuterado a 2 µg/mL


volume de 10 mL.

2.3.10 Mistura de trabalho de padrões primários a 5 µg/mL

Diluir em metanol 25 µL das soluções descritas em 2.3.5 e 250 µL das soluções

descritas em 2.3.6 até perfazer um volume de 5 mL.

2.3.11 Mistura de trabalho de padrões primários a 0,1 µg/mL


volume de 5 mL.

2.3.12 Solução de trabalho do padrão primário deuterado a 0,5 µg/mL

Diluir em metanol 50 µL das soluções descritas em 2.3.6 até perfazer um volume

de 10 mL.

Material e Métodos


3. EQUIPAMENTOS

3.1 Aparelhos de uso comum

3.1.1 Balança de precisão (resolução de 0,0001 g);

3.1.2 Banho seco;

3.1.3 Banho ultra sons;

3.1.4 Centrífuga;

3.1.5 Equipamento para capsular/descapsular vials;

3.1.6 Equipamento de extracção em fase sólida;

3.1.7 Evaporador de solventes (com azoto);

3.1.8 Homogeneizador de amostras;

3.1.9 Hotte (com filtros próprios para solventes);

3.1.10 Vortex.

3.2 Pipetas e doseadores

3.2.1 Pipetas automáticas de 20-200 µL;

3.2.2 Pipeta de volume fixo de 25 µL;

3.2.3 Pipeta automática variável de 1000 µL;

3.2.4 Doseador (e.g. Eppendorf Multipette 4780 com combitips de 50 mL)

3.3 Instrumentos analíticos

3.3.1 GC-MS

Componente Principais características

Injector automático Injecção em modo split/splitless

GC Coluna analítica: HP-5MS 30 m x 0,32 mm x 0,25 µm (Agilent

19091S-413, ou equivalente)

MS Quadrupolo

Material e Métodos


4. PROCEDIMENTO

4.1 Homogeneização das amostras primárias

As amostras primárias devem ser homogeneizadas através de agitação suave, até

atingirem uma temperatura próxima da ambiente.

4.2 Identificação das amostras de ensaio

Durante a realização do ensaio todas as amostras de ensaio devem estar

claramente identificadas (e.g. código interno da amostra).

4.3 Diluição das amostras de ensaio e adição de padrão interno

Para tubos de 10 mL adicionar:

� 500 µL de amostra;

� 8 mL de tampão fosfato (ver 2.3.3);

� 25 µL de solução de trabalho de padrão primário deuterado PI (2.3.9 ou 2.3.12).

Homogeneizar através de movimentos de rotação/inversão durante cerca de 10

minutos e centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos.

4.4 Preparação da curva de calibração

A curva de calibração permite calcular a concentração das substâncias cuja

presença nas amostras foi confirmada através da aplicação de um método de ensaio

de confirmação qualitativo.

Os calibradores são preparados tal como foi descrito no ponto 2.3 (utilizando

amostras brancas) e fortificados de acordo com a tabela 1 e 2.

Material e Métodos


Tabela 1. Preparação das curvas de calibração para metadona e EDDP

Mistura de trabalho*

0,5 µg/mL


5 µg/mL

Solução de PI

2 µg/mL

Calibrador 1 (25 ng/mL) 25 µL ― 25 µL



Calibrador 4 (400 ng/mL) ― 40 µL 25 µL



Tabela 2. Preparação das curvas de calibração para buprenorfina e norbuprenorfina


0,1 µg/mL

Solução de PI

0,5 µg/mL

Calibrador 1 (5 ng/mL) 25 µL 25 µL






* De cada uma das substâncias preparadas como descrito em 2.3.

Depois de preparadas, homogeneizar e centrifugar as amostras do controlo de

qualidade interno como descrito em 4.3.

Material e Métodos


4.5 Preparação do controlo qualidade interno

A análise de amostras controlo positivas permite avaliar, em cada série analítica,

a exactidão do método de ensaio. Os seus resultados também possibilitam a

elaboração de cartas de controlo, utilizadas para suportar critérios de

aceitação/rejeição de análises. As amostras controlo negativas permitem avaliar, em

cada sequência analítica, o efeito da matriz. Estas amostras devem ser preparadas e

analisadas em simultâneo com as amostras de rotina.

Preparar, de acordo com a tabela 3 e 4, alíquotas de 500 µL de amostra branca

previamente diluída com 8 mL de tampão fosfato. No branco de reagentes a amostra

branca é substituída por uma porção equivalente de água desionizada.

Tabela 3. Preparação dos controlos qualidade internos para metadona e EDDP


0,5 µg/mL


5 µg/mL

Solução de PI

2 µg/mL

Nível médio (100 ng/mL) 100 µL _ 25 µL

Nível alto (900 ng/mL) ― 90 µL 25 µL

Amostra branca ― ― 25 µL

Branco de reagentes ― ― 25 µL

Tabela 4. Preparação dos controlos de qualidade internos para a buprenorfina e

norbuprenorfina


0,1 µg/mL

Solução de PI

0,5 µg/mL

Controlo positivo (10 ng/mL) 50 µL 25 µL

Controlo positivo (50 ng/mL) 250 µL 25 µL

Amostra branca (0 ng/mL) - 25 µL

Branco de reagentes - 25 µL

Material e Métodos


* De cada uma das substâncias preparadas como descrito em 2.3.

Depois de preparadas, homogeneizar e centrifugar as amostras do controlo de

qualidade interno como descrito em 4.3.

4.6 Extracção em fase sólida

Através das colunas de extracção Waters Oasis MCX®, passar as seguintes soluções:

� 2 mL de metanol Acondicionamento

� 2 mL de água desionizada

� O sobrenadante obtido em 4.3 (cerca de 1 mL/min) Aplicação da

amostra

� 2 mL de água desionizada

Lavagem � 2 mL de HCl 0,1N

� 2 mL de metanol

� 2 mL de n-Hexano

� Secar as colunas sob vácuo (cerca de 15 min) 1 Secagem das

colunas

� 2 mL de diclorometano/2-Propanol/Amónia (78:20:2,

v/v/v) (7.3.1) Eluição

1Se necessário, este tempo deverá ser aumentado até à secagem total das colunas.

4.7 Derivatização química

� Recolher o eluído obtido em 4.6 para um tubo de vidro e secar sob corrente de

azoto a cerca de 40ºC;

� Adicionar ao extracto seco 60 µL de MSTFA/TMCS (2.3.2) e aquecer durante 30

min a cerca de 80ºC;

� Transferir o extracto derivatizado para um vial de 300 µL.

Material e Métodos


4.8 Análise instrumental (ver também 3.3, Instrumentos analíticos)

Tabela 5. Principais parâmetros analíticos da análise instrumental

Parâmetro Descrição

Modo e volume de injecção 3 µL, split 1:6

Fluxo inicial 0,9 mL/min

Temperatura/tempo inicial 150°C/5min

Gradiente 20°C/min

Temperatura/tempo final 270°C/2min

Modo de ionização/aquisição IE/SIM

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Resultados e Discussão


RESULTADOS E DISCUSSÃO

No presente estudo de validação foi aplicada a metodologia genérica

documentada no procedimento PO-STF-006 Rev00 (validação de procedimentos de

ensaio), tendo sido avaliados os parâmetros seguintes:

� Especificidade/Selectividade;

� Capacidade de Identificação;

� Linearidade/Gama de trabalho;

� Arrastamento (carryover);

� Limite de Detecção (LD) e Limite de Quantificação (LQ);

� Eficiência da Extracção;

� Repetibilidade;

� Precisão Intermédia;

� Exactidão;

� Robustez.

Especificidade/Selectividade

Utilizaram-se 40 amostras, escolhidas aleatoriamente do universo das 75 já

referidas. Das 40 amostras escolhidas misturaram-se, também de forma aleatória,

quatro a quatro amostras (2 mL de cada uma delas) constituindo-se assim 10 misturas

ou pools. Foram medidas 2 alíquotas de 500 µL de cada uma das misturas constituídas

conforme indicado na tabela 6. A um dos dois grupos de 10 alíquotas foram

adicionados, os padrões internos (metadona-d3, EDDP-d3; e buprenorfina-d4) e os

padrões das substâncias em estudo (metadona, EDDP, buprenorfina e

norbuprenorfina), a uma concentração de 100 ng/mL para a metadona e EDDP, e

concentração de 10 ng/mL para a buprenorfina e norbuprenorfina, ao outro grupo de

10 alíquotas nada foi adicionado. Foi aplicado o procedimento de ensaio a todas as

amostras.



Tabela 6. Sangues usados para constituir as misturas ou pools

Processo Proveniência Sexo Idade Origem

(causa de morte ou pessoa viva) Amostra Opiáceos

Misturas

ou

Pools

37 Tanatologia M 40 Desconhecida Sangue Neg 48 Leiria M 73 Desconhecida Sangue Neg 1 53 Leiria M 53 Desconhecida Sangue Neg 115 Leiria M 71 Enforcamento Sg. Periférico Neg 127 Tanatologia M 55 Desconhecida Sg. Cardíaco Neg 183 Viseu M 44 Acidente de viação Sangue Neg 2 340 Viseu M 14 Morte Súbita Sangue Neg 354 Leiria M 54 Desconhecida Sg. Periférico Neg 355 Leiria M 53 Desconhecida Sangue Neg 357 Leiria M 43 Desconhecida Sangue Neg 419 Leiria M 52 Desconhecida Sangue Neg 3 538 Tanatologia F 60 Desconhecida Sg. Cardíaco Neg 602 Leiria M 40 Acidente de trabalho Sangue Neg 650 Leiria F Desc. Vivo Sangue Neg 651 Leiria M 34 Acidente de viação Sangue Neg 4 652 Leiria M 31 Morte Súbita Sangue Neg 655 Leiria M 20 Acidente de viação Sangue Neg 657 Leiria M 34 Acidente de viação Sangue Neg 670 Fig. da Foz F 30 Suspeita de intoxicação Sangue Neg 5 676 Ponta Delgada M 41 Acidente de viação Sg. Femoral Neg 694 Viseu M 26 Desconhecida Sangue Neg 698 Viseu M 52 Desconhecida Sangue Neg 6 699 Viseu M 69 Enforcamento Sangue Neg 700 Viseu M 48 Morte Súbita Sangue Neg 910 Tanatologia M 22 Afogamento Sg. Torácico Neg 1004 Viseu M 52 Desconhecida Sangue Neg 1005 Viseu M 28 Morte Súbita Sangue Neg 7 1013 Guarda M 40 Acidente de trabalho Sg. Periférico Neg 1155 A. do Heroísmo M 37 Acidente de trabalho Sg. Periférico Neg 1202 Tanatologia M 33 Acidente de viação Sg. Torácico Neg 8 1283 Leiria M 55 Acidente de viação Sangue Neg 1307 Fig. da Foz M 61 Morte Súbita Sg. Femoral Neg 1625 GNR Fundão Vivo Sg. Periférico Neg 1783 GNR Viseu Vivo Sg. Periférico Neg 9 2409 GNR Mealhada Vivo Sg. Periférico Neg 2652 PSP Covilhã Vivo Sg. Periférico Neg 2663 PSP T. Novas Vivo Sg. Periférico Neg 2941 PSP Fig.Foz Vivo Sg. Periférico Neg 80 81

PSP P. Delgada Vivo Sg. Periférico Neg 10 GNR Pataias Vivo Sg. Periférico Neg

Foram usadas soluções de trabalho nas concentrações de 0,05, 0,1, 0,5, 1,0 e 5,0

µg/mL. Para a preparação dessas soluções utilizaram-se soluções de armazenamento a 1

mg/mL.

A positividade/negatividade das amostras foi avaliada com base nos critérios de

identificação de substâncias, documentados no procedimento operacional PO-STF-006 Rev00

(procedimento interno do Serviço de Toxicologia Forense da Delegação do Centro): tempo de



retenção relativo (TRR), relações iónicas dos iões estudados e razão sinal/ruído. Para o

controlo positivo fortificámos uma alíquota de 500 µL de sangue branco pertencente à pool

10, com 100 µL da solução de trabalho da mistura de padrões de metadona e EDDP 0,5 µg/mL,

no caso da metadona e com 10 µL da solução de trabalho do padrão de buprenorfina e

norbuprenorfina 0,1 µg/mL no caso da buprenorfina, e com 25 µL de metadona-d3 e EDDP-d3

a 2,0 µg/mL, no primeiro caso, e 25 µL de buprenorfina-d4 a 0,5 µg/mL no segundo caso.

Critério de Tempo de Retenção Relativo (TRR)

O TRR da substância pesquisada na amostra não deve diferir mais do que 1% ou ±0,2

minutos (o que for menor) do TRR da mesma substância na amostra controlo analisada

contemporaneamente e nas mesmas condições. Seguidamente apresenta-se a forma de

calcular a diferença relativa de TRR:

∆TRR=

TRRSubst.Pesquisada - Tempo de retenção relativo da substância pesquisada na amostra

TRRSubst.Controlo - Tempo de retenção relativo da substância na amostra controlo

∆TRR - Diferença relativa de TRR

Critério das relações iónicas dos iões

As áreas relativas dos iões diagnóstico da substância pesquisada na amostra devem

cumprir os critérios definidos na tabela 7, relativamente às áreas relativas dos mesmos iões

diagnóstico na amostra controlo.

TRRSubst.Pesquisada __TRRSubst.Controlo

TRRSubst.Controlo



Tabela 7. Tolerância máxima para as áreas relativas dos iões diagnóstico

Abundância relativa (% do pico base) Tolerância máxima

>50% ± 10% (absoluta)

> 25 % e <50% ± 20% (relativa)

<25% ± 5% (absoluta)

Critério do sinal/ ruído (S/N)

O valor da razão sinal/ruído para os três iões diagnóstico da substância pesquisada na

amostra deve ser superior a 3.

Seguidamente, apresentam-se os resultados obtidos na avaliação de cada um dos critérios de

positividade anteriormente descritos.



Tabela 8. Estudo da Selectividade/Especificidade referente à Metadona

A2 Metadona CONTROLO Critérios

ÁREA ABSOL ÁREA RELAT S/N TRA TRR ÁREA ABSOL ÁREA RELAT S/N TRA TRR Rel iónicas S/N TRR

m/z 178 28951 100,0 54,8 10.79 1,000 32977 100,0 40,8 10,79 1,000 >3 ≤1

223 2418 8,4 22,7 10.79 1,000 3037 9,2 12,5 10,79 1,000 >3 ≤1

294 2068 7,1 66,6 10.79 1,000 2469 7,5 60,7 10,79 1,000 >3 ≤1

B2 Metadona CONTROLO

ÁREA ABSOL ÁREA RELAT S/N TRA TRR ÁREA ABSOL ÁREA RELAT S/N TRA TRR

m/z 178 28782 100,0 48,7 10.79 1,000 32977 100,0 40,8 10,79 1,000 >3 ≤1

223 2476 8,6 21,6 10.79 1,000 3037 9,2 12,5 10,79 1,000 >3 ≤1

294 2013 7,0 41,4 10.79 1,000 2469 7,5 60,7 10,79 1,000 >3 ≤1

C2 Metadona CONTROLO


m/z 178 28962 100,0 33,2 10.78 1,000 32977 100,0 40,8 10,79 1,000 >3 ≤1

223 2793 9,6 23,7 10.79 1,000 3037 9,2 12,5 10,79 1,000 >3 ≤1

294 2388 8,2 73.2 10.79 1,000 2469 7,5 60,7 10,79 1,000 >3 ≤1

D2 Metadona CONTROLO


m/z 178 31365 100,0 41,3 10.78 1,000 32977 100,0 40,8 10,79 1,000 >3 ≤1

223 2951 9,4 22,5 10.78 1,000 3037 9,2 12,5 10,79 1,000 >3 ≤1

294 2365 7,5 74,1 10.79 1,000 2469 7,5 60,7 10,79 1,000 >3 ≤1

E2 Metadona CONTROLO


m/z 178 33692 100,0 58,6 10.78 1,000 32977 100,0 40,8 10,79 1,000 >3 ≤1

223 2867 8,5 25,8 10.79 1,000 3037 9,2 12,5 10,79 1,000 >3 ≤1

294 2318 6,9 252,4 10.80 1,000 2469 7,5 60,7 10,79 1,000 >3 ≤1

F2 Metadona CONTROLO


m/z 178 32589 100,0 93,2 10.78 1,000 32977 100,0 40,8 10,79 1,000 >3 ≤1

223 3373 10,4 24 10.79 1,000 3037 9,2 12,5 10,79 1,000 >3 ≤1

294 2563 7,9 83,8 10.79 1,000 2469 7,5 60,7 10,79 1,000 >3 ≤1

G2 Metadona CONTROLO


m/z 178 35767 100,0 92,6 10.78 1,000 32977 100,0 40,8 10,79 1,000 >3 ≤1

223 3268 9,1 21,2 10.79 1,000 3037 9,2 12,5 10,79 1,000 >3 ≤1

294 2715 7,6 131,5 10.79 1,000 2469 7,5 60,7 10,79 1,000 >3 ≤1

H2 Metadona CONTROLO


m/z 178 34031 100,0 78,2 10.78 1,000 32977 100,0 40,8 10,79 1,000 >3 ≤1

223 3410 10,0 27,2 10.79 1,000 3037 9,2 12,5 10,79 1,000 >3 ≤1

294 2665 7,8 88,5 10.79 1,000 2469 7,5 60,7 10,79 1,000 >3 ≤1

I2 Metadona CONTROLO


m/z 294 2007 100,0 62,9 10.80 1,000 2469 100,0 60,7 10,79 1,000 >3 ≤1

223 2156 9,9 19,6 10.80 1,000 3037 9,2 12,5 10,79 1,000 >3 ≤1

178 21765 9,2 98,6 10.79 1,000 32977 7,5 40,8 10,79 1,000 >3 ≤1

J2 Metadona CONTROLO


m/z 178 30242 100,0 117,7 10.78 1,000 32977 100,0 40,8 10,79 1,000 >3 ≤1

223 1839 6,1 18,4 10.80 1,000 3037 9,2 12,5 10,79 1,000 >3 ≤1

294 1515 5,0 84,9 10.80 1,000 2469 7,5 60,7 10,79 1,000 >3 ≤1



Tabela 9. Estudo da Selectividade/Especificidade referente ao EDDP

A2 EDDP CONTROLO Critérios


m/z 277 34778 100,0 232,5 10,21 1,000 36804 100,0 369,8 10,21 1,000 >3 ≤1

276 33791 97,2 201,4 10,21 1,000 35716 97,0 454,0 10,21 1,000 >3 ≤1

262 15183 43,7 137,9 10,21 1,000 16262 44,2 102,1 10,21 1,000 >3 ≤1

B2 EDDP CONTROLO


m/z 277 36142 100,0 34,6 10,21 1,000 36804 100,0 369,8 10,21 1,000 >3 ≤1

276 35166 97,3 59,6 10,21 1,000 35716 97,0 454,0 10,21 1,000 >3 ≤1

262 14807 41,0 87,9 10,21 1,000 16262 44,2 102,1 10,21 1,000 >3 ≤1

C2 EDDP CONTROLO


m/z 277 36082 100,0 133,3 10,21 1,000 36804 100,0 369,8 10,21 1,000 >3 ≤1

276 35195 97,5 70,4 10,21 1,000 35716 97,0 454,0 10,21 1,000 >3 ≤1

262 15598 43,2 126,0 10,2 1,000 16262 44,2 102,1 10,21 1,000 >3 ≤1

D2 EDDP CONTROLO


m/z 277 35367 100,0 125,2 10,21 1,000 36804 100,0 369,8 10,21 1,000 >3 ≤1

276 34816 98,4 178,4 10,21 1,000 35716 97,0 454,0 10,21 1,000 >3 ≤1

262 15695 44,4 98,6 10,21 1,000 16262 44,2 102,1 10,21 1,000 >3 ≤1

E2 EDDP CONTROLO


m/z 277 43414 100,0 84,1 10,21 1,000 36804 100,0 369,8 10,21 1,000 >3 ≤1

276 42392 97,6 107,8 10,21 1,000 35716 97,0 454,0 10,21 1,000 >3 ≤1

262 18869 43,5 151,8 10,2 1,000 16262 44,2 102,1 10,21 1,000 >3 ≤1

F2 EDDP CONTROLO


m/z 277 47574 100,0 117,8 10,21 1,000 36804 100,0 369,8 10,21 1,000 >3 ≤1

276 46393 97,5 262,7 10,21 1,000 35716 97,0 454,0 10,21 1,000 >3 ≤1

262 21111 44,4 197,2 10,21 1,000 16262 44,2 102,1 10,21 1,000 >3 ≤1

G2 EDDP CONTROLO


m/z 277 46076 100,0 163,0 10,21 1,000 36804 100,0 369,8 10,21 1,000 >3 ≤1

276 45432 98,6 228,1 10,21 1,000 35716 97,0 454,0 10,21 1,000 >3 ≤1

262 20765 45,1 104,2 10,2 1,000 16262 44,2 102,1 10,21 1,000 >3 ≤1

H2 EDDP CONTROLO


m/z 277 45538 100,0 381,0 10,21 1,000 36804 100,0 369,8 10,21 1,000 >3 ≤1

276 43395 95,3 197,4 10,21 1,000 35716 97,0 454,0 10,21 1,000 >3 ≤1

262 19348 42,5 190,7 10,2 1,000 16262 44,2 102,1 10,21 1,000 >3 ≤1

I2 EDDP CONTROLO


m/z 277 32127 100,0 302,7 10,21 1,000 36804 100,0 369,8 10,21 1,000 >3 ≤1

276 3089 96,1 125,3 10,21 1,000 35716 97,0 454,0 10,21 1,000 >3 ≤1

262 13740 42,8 119,1 10,21 1,000 16262 44,2 102,1 10,21 1,000 >3 ≤1

J2 EDDP CONTROLO


m/z 277 41371 100,0 221,7 10,21 1,000 36804 100,0 369,8 10,21 1,000 >3 ≤1

276 40231 97,2 240,1 10,21 1,000 35716 97,0 454,0 10,21 1,000 >3 ≤1

262 17463 42,2 200,2 10,21 1,000 16262 44,2 102,1 10,21 1,000 >3 ≤1



Tabela 10. Estudo da Selectividade/Especificidade referente à buprenorfina

A2 Buprenorfina CONTROLO Critérios


m/z 450 4365 100,0 27,8 10,45 1,000 5808 100,0 36,5 10,45 1,000 >3 ≤1

482 1307 29,9 10,5 10,45 1,000 1807 31,1 18 10,45 1,000 >3 ≤1

506 609 14,0 6,4 10,45 1,000 915 15,8 16,6 10,45 1,000 >3 ≤1

B2 Buprenorfina CONTROLO


m/z 450 7359 100,0 55,5 10,45 1,000 5808 100,0 36,5 10,45 1,000 >3 ≤1

482 1973 26,8 16,3 10,45 1,000 1807 31,1 18 10,45 1,000 >3 ≤1

506 1418 19,3 9,4 10,45 1,000 915 15,8 16,6 10,45 1,000 >3 ≤1

C2 Buprenorfina CONTROLO


m/z 450 4251 100,0 25,9 10,45 1,000 5808 100,0 36,5 10,45 1,000 >3 ≤1

482 1486 35,0 9,9 10,45 1,000 1807 31,1 18 10,45 1,000 >3 ≤1

506 851 20,0 4,9 10,45 1,000 915 15,8 16,6 10,45 1,000 >3 ≤1

D2 Buprenorfina CONTROLO


m/z 450 6085 100,0 46,3 10,45 1,000 5808 100,0 36,5 10,45 1,000 >3 ≤1

482 2010 33,0 19,6 10,45 1,000 1807 31,1 18 10,45 1,000 >3 ≤1

506 1031 16,9 8,6 10,45 1,000 915 15,8 16,6 10,45 1,000 >3 ≤1

E2 Buprenorfina CONTROLO


m/z 450 6660 100,0 58,3 10,45 1,000 5808 100,0 36,5 10,45 1,000 >3 ≤1

482 1821 27,3 17,2 10,45 1,000 1807 31,1 18 10,45 1,000 >3 ≤1

506 1348 20,2 8,3 10,45 1,000 915 15,8 16,6 10,45 1,000 >3 ≤1

F2 Buprenorfina CONTROLO


m/z 450 6326 100,0 62,2 10,45 1,000 5808 100,0 36,5 10,45 1,000 >3 ≤1

482 1900 30,0 14,3 10,45 1,000 1807 31,1 18 10,45 1,000 >3 ≤1

506 1123 17,8 8,5 10,45 1,000 915 15,8 16,6 10,45 1,000 >3 ≤1

G2 Buprenorfina CONTROLO


m/z 450 7162 100,0 54,7 10,45 1,000 5808 100,0 36,5 10,45 1,000 >3 ≤1

482 2033 28,4 22,1 10,45 1,000 1807 31,1 18 10,45 1,000 >3 ≤1

506 1210 16,9 10,4 10,45 1,000 915 15,8 16,6 10,45 1,000 >3 ≤1

H2 Buprenorfina CONTROLO


m/z 450 7206 100,0 44,6 10,45 1,000 5808 100,0 36,5 10,45 1,000 >3 ≤1

482 2325 32,3 21,9 10,45 1,000 1807 31,1 18 10,45 1,000 >3 ≤1

506 1191 16,5 13,5 10,45 1,000 915 15,8 16,6 10,45 1,000 >3 ≤1

I2 Buprenorfina CONTROLO


m/z 450 6644 100,0 63,9 10,45 1,000 5808 100,0 36,5 10,45 1,000 >3 ≤1

482 1937 29,2 19,8 10,45 1,000 1807 31,1 18 10,45 1,000 >3 ≤1

506 1351 20,3 9,1 10,45 1,000 915 15,8 16,6 10,45 1,000 >3 ≤1

J2 Buprenorfina CONTROLO


m/z 450 6414 1000,0 48,3 10,45 1,000 5808 100,0 36,5 10,45 1,000 >3 ≤1

482 1710 26,7 14,7 10,45 1,000 1807 31,1 18 10,45 1,000 >3 ≤1

506 1245 19,4 11,6 10,45 1,000 915 15,8 16,6 10,45 1,000 >3 ≤1



Tabela11. Estudo da Selectividade/Especificidade referente à norbuprenorfina

A2 Norbuprenor. CONTROLO Critérios


m/z 468 5577 100,0 53,8 8,64 1,000 6970 100,0 67,4 8,64 1,000 >3 ≤1

524 506 9,1 8,6 8,64 1,000 686 9,8 7,7 8,64 1,000 >3 ≤1

500 432 7,7 6,2 8,64 1,000 536 7,7 11,5 8,64 1,000 >3 ≤1

B2 Norbuprenor. CONTROLO


m/z 468 10445 100,0 81,3 8,64 1,000 6970 100,0 67,4 8,64 1,000 >3 ≤1

524 981 9,4 17,6 8,64 1,000 686 9,8 7,7 8,64 1,000 >3 ≤1

500 886 8,5 13,6 8,64 1,000 536 7,7 11,5 8,64 1,000 >3 ≤1

C2 Norbuprenor. CONTROLO


m/z 468 4889 100,0 36,4 8,64 1,000 6970 100,0 67,4 8,64 1,000 >3 ≤1

524 566 11,6 8,1 8,64 1,000 686 9,8 7,7 8,64 1,000 >3 ≤1

500 450 9,2 6,2 8,64 1,000 536 7,7 11,5 8,64 1,000 >3 ≤1

D2 Norbuprenor. CONTROLO


m/z 468 8771 100,0 104 8,64 1,000 6970 100,0 67,4 8,64 1,000 >3 ≤1

524 955 10,9 14,2 8,64 1,000 686 9,8 7,7 8,64 1,000 >3 ≤1

500 871 9,9 10,5 8,64 1,000 536 7,7 11,5 8,64 1,000 >3 ≤1

E2 Norbuprenor. CONTROLO


m/z 468 11832 100,0 92,3 8,64 1,000 6970 100,0 67,4 8,64 1,000 >3 ≤1

524 1155 9,8 10,7 8,64 1,000 686 9,8 7,7 8,64 1,000 >3 ≤1

500 1135 9,6 21,4 8,64 1,000 536 7,7 11,5 8,64 1,000 >3 ≤1

F2 Norbuprenor. CONTROLO


m/z 468 9346 100,0 87,9 8,64 1,000 6970 100,0 67,4 8,64 1,000 >3 ≤1

524 792 8,5 28,7 8,64 1,000 686 9,8 7,7 8,64 1,000 >3 ≤1

500 757 8,1 10,2 8,64 1,000 536 7,7 11,5 8,64 1,000 >3 ≤1

G2 Norbuprenor. CONTROLO


m/z 468 9443 100,0 73,4 8,64 1,000 6970 100,0 67,4 8,64 1,000 >3 ≤1

524 999 10,6 10,8 8,64 1,000 686 9,8 7,7 8,64 1,000 >3 ≤1

500 925 9,8 17,9 8,64 1,000 536 7,7 11,5 8,64 1,000 >3 ≤1

H2 Norbuprenor. CONTROLO


m/z 468 9682 100,0 60,6 8,64 1,000 6970 100,0 67,4 8,64 1,000 >3 ≤1

524 948 9,8 16 8,64 1,000 686 9,8 7,7 8,64 1,000 >3 ≤1

500 921 9,5 17,4 8,64 1,000 536 7,7 11,5 8,64 1,000 >3 ≤1

I2 Norbuprenor. CONTROLO


m/z 468 10395 100,0 95,5 8,64 1,000 6970 100,0 67,4 8,64 1,000 >3 ≤1

524 931 9,0 16,3 8,64 1,000 686 9,8 7,7 8,64 1,000 >3 ≤1

500 898 8,6 19,9 8,64 1,000 536 7,7 11,5 8,64 1,000 >3 ≤1

J2 Norbuprenor. CONTROLO


m/z 468 8559 100,0 61,9 8,64 1,000 6970 100,0 67,4 8,64 1,000 >3 ≤1

524 838 9,8 13,9 8,64 1,000 686 9,8 7,7 8,64 1,000 >3 ≤1

500 725 8,5 14,9 8,64 1,000 536 7,7 11,5 8,64 1,000 >3 ≤1

Foram cumpridos os três critérios de positividade (relações iónicas, sinal/ruído e

tempo de retenção relativo) para a metadona, EDDP, buprenorfina e norbuprenorfina nas

diferentes amostras de sangue analisadas.

A análise dos resultados confirmou que todas as amostras de sangue às quais não

foram adicionadas drogas evidenciaram resultados negativos. Nas amostras às quais foram



adicionadas as drogas em estudo, todas foram consideradas positivas. A percentagem de

falsos negativos e de falsos positivos é de 0%, o que está de acordo com os critérios de

confirmação definidos para o PE-STF-C-205 e PE-STF-C-206 (procedimentos internos do Serviço

de Toxicologia Forense da Delegação do Centro). Na tabela 12 apresentam-se os resultados

obtidos no estudo da especificidade/selectividade.

Tabela 12. Resultados obtidos no estudo da especificidade/selectividade

Análise das amostras negativas

Amostra Resultado

Pool 1 – A1 Negativo

Pool 2 – B1 Negativo

Pool 3 – C1 Negativo

Pool 4 – D1 Negativo

Pool 5 – E1 Negativo

Pool 6 – F1 Negativo

Pool 7 – G1 Negativo

Pool 8 – H1 Negativo

Pool 9 – I1 Negativo

Pool 10 – J1 Negativo

Falsos Positivos: 0%



Análise das amostras positivas

Amostra Resultado

Pool 2 – A2 Positivo

Pool 2 – B2 Positivo

Pool 3 – C2 Positivo

Pool 4 – D2 Positivo

Pool 5 – E2 Positivo

Pool 6 – F2 Positivo

Pool 7 – G2 Positivo

Pool 8 – H2 Positivo

Pool 9 – I2 Positivo

Pool 10 – J2 Positivo

Falsos Negativos: 0%

Capacidade de Identificação

Este parâmetro foi estudado com as amostras positivas, pools fortificadas com as

substâncias padrão, usadas na avaliação da especificidade/selectividade. Os procedimentos de

ensaio usados, PE-STF-C-205 (metadona e EDDP) e PE-STF-C-206 (buprenorfina e

norbuprenorfina), apresentam uma percentagem de falsos negativos inferior a 10%, o que

significa que cumpre os critérios de aceitação estabelecidos.

Limite de Detecção (LD) e Limite de Quantificação (LQ)

O estudo destes parâmetros foi estabelecido com a preparação de uma curva de

calibração com pontos equidistantes, perto do valor do limite de detecção esperado. A curva



de calibração foi construída por fortificação de volumes de 500 µL de amostras de sangue

branco, com volumes crescentes de uma mistura padrão (das substâncias em estudo) e o

respectivo padrão interno deuterado, de acordo com as tabelas 13 e 14.

Tabela 13. Preparação das curvas de calibração referentes ao estudo do LD / LQ para a

metadona e EDDP

Calibradores

(ng/mL)

Sangue Branco

(µL)

Mistura Padrão

(0,5 µg/mL)

(µL)

Padrão Interno

(2 µg/mL)

(µL)

2,5

500

2,5

25

5 5

10 10

15 15

25 25

40 40

50 50



Tabela 14. Preparação das curvas de calibração referentes ao estudo do LD / LQ para a

buprenorfina e norbuprenorfina

Calibradores

(ng/mL)

Sangue Branco

(µL)

Mistura Padrão

(0,05 µg/mL)

(µL)

Padrão Interno

(0,5 µg/mL)

(µL)

1

500

10

25

2 20

3 30

5 50

6 60

7 70

8 80

9 90

10 100

12 120

Uma vez construídas as curvas de calibração para cada uma das substâncias em estudo, os

limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) foram calculados através da aplicação das

seguintes equações:

LD = (3,3 x Sy/x)/b

LQ = (10 x Sy/x)/b



- Sy/x é o desvio padrão residual da curva de calibração

- b é o declive da recta

Seguidamente apresenta-se, para cada uma das substâncias, os valores obtidos para as áreas,

as curvas de calibração, o tratamento estatístico da regressão linear e os valores calculados

para o LD e LQ, para os aparelhos GC001 e GC003 respectivamente.

Limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) para a metadona:

Metadona Metadona-D3 Met/Met-D3

(ng/mL) 294 297 Ratio

2,5 265 10933 0,025 407 8924 0,0510 764 9140 0,0815 1271 10738 0,1225 2197 9853 0,2240 3453 9715 0,3650 5003 11182 0,45

SUMÁRIO DOS RESULTADOS

Estatística de regressão

R múltiplo 0,999295073Quadrado de R 0,998590643Quadrado de R ajustado 0,998308772Erro-padrão 0,006701926Observações 7 LD= 2

LQ= 7ANOVA

gl SQ MQ F F de significância

Regressão 1 0,159124027 0,159124027 3542,717719 2,53309E-08Residual 5 0,000224579 4,49158E-05Total 6 0,159348606

Coeficientes Erro-padrão Stat t valor P 95% inferior 95% superior

Interceptar -0,003848752 0,004064889 -0,946828161 0,387203515 -0,014297883 0,006600379Variável X 1 0,008980091 0,000150873 59,52073352 2,53309E-08 0,008592259 0,009367924

RESULTADO RESIDUAL

Observação Y previsto Residuais

1 0,018601477 0,0056370672 0,041051705 0,0045556463 0,085952162 -0,002363544 0,130852619 -0,0124879325 0,220653532 0,0023242416 0,355354903 7,48453E-057 0,445155816 0,002259673

y = 0,009x - 0,0038R² = 0,9986

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0 20 40 60

Met/Met-D3

Concentração (ng/mL)

LOD/LOQ Metadona

-0,0200,02

0 20 40 60Re

sid

uai

s

Variável X 1

Variável X 1 Desenho de residuais



Limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) para o EDDP:

EDDP EDDP-D3 EDDP/EDDP-D3

(ng/mL) 277 280 (Ratio)

2,5 454 11914 0,045 367 9212 0,0410 343 5393 0,0615 424 4592 0,0925 896 5373 0,1740 902 3319 0,2750 1681 5276 0,32




LQ= 16ANOVA


Regressão 1 0,077968924 0,077968924 751,8775553 1,20717E-06Residual 5 0,000518495 0,000103699Total 6 0,078487419


Interceptar 0,009119815 0,006176413 1,476555174 0,199827872 -0,006757161 0,024996791Variável X 1 0,006285989 0,000229245 27,42038576 1,20717E-06 0,005696696 0,006875283

RESULTADO RESIDUAL


1 0,024834788 0,0132716412 0,040549762 -0,0007104223 0,071979709 -0,0083787454 0,103409656 -0,0110751615 0,16626955 0,0004901746 0,260559392 0,0112092137 0,323419286 -0,0048067

y = 0,0063x + 0,0091R² = 0,9934

0,000,050,100,150,200,250,300,35

0 20 40 60

EDDP/EDDP-D3


LOD/LOQ EDDP

-0,0500,05

0 20 40 60Re

sid

ua

is

Variável X 1




Limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) para a buprenorfina:

Bup Bup-D4 BUP/BUP-D4

(ng/mL) 450 454 (Ratio)

1 355 9183 0,042 444 5224 0,083 1020 9072 0,115 1877 10165 0,186 2329 10546 0,227 2978 11274 0,268 2897 9531 0,309 3214 9262 0,3510 3742 9244 0,4012 4228 8589 0,49




LQ= 3ANOVA





RESULTADO RESIDUAL


1 0,03106985 0,0075885412 0,071504838 0,0134875053 0,111939827 0,0004940354 0,192809804 -0,008156585 0,233244793 -0,012402776 0,273679781 -0,009532197 0,31411477 -0,010159268 0,354549758 -0,007540479 0,394984747 0,009818369

10 0,475854724 0,016402815

y = 0,0404x - 0,0094R² = 0,9944

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0 5 10 15BUP/BUP_d4


LOD/LOQ Bup

-0,050

0,05

0 5 10 15

Re

sid

uai

s

Variável X 1




Limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) para a norbuprenorfina:

Nor-Bup Bup-D4 NorBUP/BUP-D4

(ng/mL) 468 454 (Ratio)

1 6166 9183 0,672 3444 5224 0,663 6343 9072 0,705 8218 10165 0,816 8692 10546 0,827 10016 11274 0,898 8717 9531 0,919 8720 9262 0,9410 8864 9244 0,9612 8970 8589 1,04




LQ= 5ANOVA




Interceptar 0,612021571 0,012497605 48,97110976 3,34573E-11 0,583202043 0,640841099Variável X 1 0,036350694 0,00174489 20,83265453 2,95597E-08 0,032326971 0,040374418

RESULTADO RESIDUAL


1 0,648372265 0,0230858642 0,68472296 -0,025458033 0,721073654 -0,021889354 0,793775043 0,014685365 0,830125738 -0,005926996 0,866476432 0,0219393927 0,902827127 0,0117673548 0,939177821 0,00230359 0,975528516 -0,01663626

10 1,048229905 -0,00387084

y = 0,0364x + 0,612R² = 0,9819

0,00

0,50

1,00

1,50

0 5 10 15Norbup/Bup-d4


LOD/LOQ NorBup

-0,1

0

0,1

0 5 10 15Re

sid

uai

s

Variável X 1




Na tabela seguinte encontra-se o resumo dos resultados obtidos para os limites de detecção e

de quantificação da metadona, do EDDP, da buprenorfina e da norbuprenorfina.

Tabela 15. Resumo dos valores calculados para os limites de detecção e de quantificação

Substância Equação r2 Erro padrão

(Sy/x )

LD LQ

(ng/mL)

Metadona Y=0,009x-0,0038 0,9986 0,0067 3 7

EDDP Y=0,0063x+0,0091 0,9934 0,0101 5 16

Buprenorfina Y=0,0404x-0,0094 0,9944 0,0116 1 3

Norbuprenorfina Y=0,0364x+0,612 0,9819 0,0188 2 5

Os valores apresentados para os LD e LQ, de cada uma das substâncias estudadas, são

adequados relativamente às gamas de trabalho do método.

Eficiência da extracção

O estudo deste parâmetro foi realizado em duas gamas de concentração (média e alta)

para cada uma das quatro substâncias estudadas: 100 ng/mL e 900ng/mL (para a metadona e

EDDP) e 10 ng/mL e 50 ng/mL (para a buprenorfina e norbuprenorfina). Foram preparados

dois conjuntos de amostras de sangue branco em quadruplicado, para cada uma das

concentrações referidas. Um dos conjuntos foi fortificado no início do procedimento de

preparação das amostras (antes da extracção) e o outro imediatamente antes da secagem do

extracto recolhido (após a eluição). Foram usadas misturas padrão a 0,5 e a 5 µg/mL para a

metadona e EDDP, e mistura de padrões a 0,1 µg/mL para a buprenorfina e norbuprenorfina,

preparadas em metanol. O padrão interno deuterado foi adicionado aos dois conjuntos de

amostras imediatamente antes da fase de secagem.



A eficiência da extracção calcula-se através da seguinte expressão:

% R = A rel método extractivo x 100

A rel sem extracção

onde:

A rel método extractivo – razão das áreas (substância/padrão interno) após aplicação do

método extractivo.

A rel sem extracção – razão das áreas (substância/padrão interno) sem aplicação do método

extractivo.

Os resultados obtidos referentes a este parâmetro analítico encontram-se apresentados nas

tabelas 16 a 17.



Tabela 16. Resumo dos valores calculados para a eficiência de extracção da metadona e

EDDP

Metadona 100 ng/mL

Met Met-D3 Ratios (Met/PI) Médias % Recuperação

RA1 8234 9397 0,876237097 0,90

RA2 7760 8317 0,933028736RA3 5427 5981 0,907373349RA4 4725 5397 0,875486381

RD1 9750 13013 0,749250749 0,90 99,9

RD2 15284 19062 0,801804637RD3 20535 18703 1,0979522RD4 15697 16588 0,946286472

Metadona 900 ng/mL

Met Met-D3 Ratios (Met/PI) Médias % Recuperação

RA5 72873 10597 6,876757573 7,39

RA6 52082 6896 7,5524942RA7 90303 12184 7,411605384RA8 90083 11686 7,708625706

RD5 143277 16309 8,785149304 8,12 91,0

RD6 142775 18063 7,904279466RD7 89761 11773 7,624309862RD8 145839 17844 8,172999328

EDDP 100 ng/mL

EDDP EDDP-D3 Ratios (EDDP/PI) Médias % Recuperação

RA1 2569 4090 0,628117359 0,69

RA2 2357 3408 0,691607981RA3 577 826 0,698547215RA4 521 721 0,72260749

RD1 22506 34642 0,649673806 0,67 102,5

RD2 35057 56536 0,620082779RD3 25226 40777 0,618633053RD4 31152 39700 0,784685139

EDDP 900 ng/mL

EDDP EDDP-D3 Ratios (EDDP/PI) Médias % Recuperação

RA5 27699 3758 7,370675891 6,00

RA6 58945 10487 5,620768571RA7 46667 8500 5,490235294RA8 77791 14098 5,517874876

RD5 340602 51042 6,672975197 6,55 91,6

RD6 342300 51323 6,669524385RD7 6310 984 6,412601626RD8 330007 51113 6,456420089



Tabela 17. Resumo dos valores calculados para a eficiência de extracção da buprenorfina e

norbuprenorfina

Bup 10 ng/mL

Bup Bup-D4 Ratios (Bup/PI) Médias % Recuperação

RA1 2148 3551 0,604900028 0,62 RA2 3687 5338 0,69070813 RA3 2552 4309 0,592248782RA4 4087 6863 0,595512167

RD1 3464 4560 0,759649123 0,62 100,1

RD2 4401 7184 0,612611359RD3 3578 6550 0,546259542RD4 2889 5128 0,563377535

Bup 50 ng/mL

Bup Bup-D4 Ratios (Bup/PI) Médias % Recuperação

RA5 7910 2512 3,14888535 2,90 RA6 4204 1157 3,633535004RA7 9809 4168 2,35340691 RA8 15847 6466 2,450819672

RD5 18115 5616 3,225605413 2,94 98,6

RD6 11167 3859 2,893754859RD7 13935 5278 2,640204623RD8 15929 5330 2,988555347

NorBup 10 ng/mL

NorBup Bup-D4 Ratios(NorB/PI) Médias % Recuperação

RA1 5301 3551 1,492818924 1,20 RA2 5647 5338 1,057886849RA3 4545 4309 1,054769088RA4 8179 6863 1,191752878

RD1 5901 4560 1,294078947 1,31 91,7

RD2 9515 7184 1,324471047RD3 9083 6550 1,386717557RD4 6276 5128 1,223868955

NorBup 10 ng/mL

NorBup Bup-D4 Ratios(NorB/PI) Médias % Recuperação

RA5 8874 2512 3,532643312 2,91 RA6 3240 1157 2,800345722RA7 11340 4168 2,720729367RA8 16738 6466 2,588617383

RD5 18476 5616 3,28988604 3,01 96,5

RD6 9199 3859 2,383778181RD7 15463 5278 2,929708223RD8 18416 5330 3,455159475



As percentagens de recuperação das substâncias estudadas situam-se entre 40 e 120%,

cumprindo os critérios em vigor, descritos no PO-STF-006 Rev00.

Linearidade/Gama de trabalho

Com o estudo da linearidade/gama de trabalho procura-se avaliar se, para um

determinado intervalo de concentrações, os sinais iónicos são directamente proporcionais às

concentrações usadas.

Foi preparada uma curva de calibração, de acordo com o PT-STF-C-211 para a

metadona e EDDP e de acordo com o PT-STF-C-212 para a buprenorfina e norbuprenorfina

(procedimentos internos do Serviço de Toxicologia Forense da Delegação do Centro), por

fortificação de alíquotas de 500 µL de sangue branco com soluções de trabalho a 0,5 e 5

µg/mL, entre 25 e 1000 ng/mL para a metadona e EDDP e com soluções de trabalho a 0,1

µg/mL, entre 5 e 50 ng/mL para a buprenorfina e norbuprenorfina. A todas as amostras foi

adicionado 25 µL de padrão interno a 2 µg/mL no caso da metadona e EEDP e a 0,5 µg/mL para

a buprenorfina e norbuprenorfina. Para os calibradores da recta de calibração foram

escolhidas concentrações equidistantes e distribuídas uniformemente entre o valor mais baixo

e o mais elevado do intervalo de concentrações de cada substância estudada (Tabela 18 e 19).



Tabela 18. Estudo da linearidade para a metadona e EDDP

Concentração

calibradores

(ng/mL)

Solução trabalho

0,5 µg/mL

(µL)

Solução trabalho

5 µg/mL

(µL)

Padrão interno

2 µg/mL

(µL)

Sangue branco

(µL)

25 25 __

25 500

50 50 __

100 __ 10

200 __ 20

300 __ 30

500 __ 50

600 __ 60

750 __ 75

900 __ 90

1000 __ 100



Tabela 19. Estudo da linearidade para a buprenorfina e norbuprenorfina

Concentração

calibradores

(ng/mL)

Solução trabalho

0,1 µg/mL

(µL)

Padrão interno

0,5 µg/mL

(µL)

Sangue branco

(µL)

5 25

25 500

6 30

7 35

8 40

9 45

10 50

12 60

20 100

30 150

40 200

50 250

Para avaliação do parâmetro da linearidade procedeu-se à análise das curvas de calibração,

após injecção das amostras. Os critérios de aceitação das curvas de calibração foram: a e a

análise dos gráficos dos valores residuais, considerando como pontos aberrantes aqueles cujo

desvio residual seja superior ao dobro do erro padrão estimado no estudo da regressão para

as curvas de calibração.

Seguidamente apresentam-se as tabelas e os gráficos dos valores obtidos para as áreas, assim

como as curvas de calibração e o tratamento estatístico de cada uma das substâncias

estudadas.



Tratamento estatístico – Linearidade/Gama de trabalho da Metadona

[L25-L1000] Metadona Metadona-D3 Met/Met-D3

(ng/mL) 294 297 (Ratio)

25,0 2197 9853 0,22

40,0 3453 9715 0,36

50,0 5003 11182 0,45

100,0 9769 11050 0,88

200,0 17554 9888 1,78

300,0 28459 10745 2,65

500,0 47487 11120 4,27

750,0 60553 9294 6,52

900,0 83914 10630 7,89

1000,0 88783 11208 7,92



R múltiplo 0,997789458Quadrado de R 0,995583802Quadrado de R ajustado 0,995031778Erro-padrão 0,221159311Observações 10

ANOVAgl SQ MQ F F de significância



Interceptar 0,07663675 0,103096665 0,743348486 0,478530122 -0,161104585 0,314378085Variável X 1 0,008323041 0,000195985 42,46778872 1,04189E-10 0,007871099 0,008774983

RESULTADO RESIDUAL


1 0,284712771 -0,0617349982 0,409558385 -0,0541286373 0,492788793 -0,0453733044 0,908940837 -0,0248684395 1,741244924 0,0340382476 2,573549011 0,0750317247 4,238157186 0,0322564838 6,318917404 0,1963612719 7,567373535 0,326699843

10 8,399677622 -0,47828219

y = 0,0083x + 0,0766R² = 0,9956

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

0,0 200,0 400,0 600,0 800,0 1000,0 1200,0

Met/Met-D3

Concentração ng/mL

Linearidade -Metadona

-101

0,0 500,0 1000,0 1500,0

Re

sid

uai

s

Variável X 1




Tratamento estatístico – Linearidade/Gama de trabalho do EDDP

[L25-L1000] EDDP EDDP-D3 EDDP/EDDP-D3

(ng/mL) 277 280 (Ratio)

25,0 896 5373 0,17

40,0 902 3319 0,27

50,0 1681 5276 0,32

100,0 3059 4750 0,64

200,0 3981 2950 1,35

300,0 5310 2494 2,13

500,0 13574 4110 3,30

750,0 35144 6528 5,38

900,0 36532 5432 6,73

1000,0 47126 6880 6,85








RESULTADO RESIDUAL


1 0,129182275 0,037577452 0,236440429 0,0353281763 0,307945864 0,0106667214 0,665473044 -0,0214730445 1,380527402 -0,0310358776 2,095581761 0,0335281037 3,525690477 -0,2230140788 5,313326374 0,0702520589 6,385907911 0,339423458

10 7,10096227 -0,251252967

y = 0,0072x - 0,0496R² = 0,9964

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

0,0 200,0 400,0 600,0 800,0 1000,0 1200,0

EDDP/EDDP-D3


Linearidade -EDDP

-1

0

1

0,0 500,0 1000,0 1500,0

Re

sid

uai

s

Variável X 1




Tratamento estatístico – Linearidade/Gama de trabalho da Buprenorfina

[L1-L50] Bup Bup-D4 BUP/BUP-D4

(ng/mL) 450 454 (Ratio)

5 1877 10165 0,187 2978 11274 0,268 2897 9531 0,309 3214 9262 0,3510 3742 9244 0,4012 4228 8589 0,4920 7379 8106 0,9130 5291 3783 1,4040 16910 9339 1,8150 20279 9398 2,16








RESULTADO RESIDUAL


1 0,186203155 -0,0015499332 0,277156622 -0,0130090263 0,322633355 -0,0186778414 0,368110088 -0,0211008035 0,413586822 -0,0087837066 0,504540288 -0,012282757 0,868354155 0,0419591938 1,323121488 0,0755039419 1,777888821 0,032797548

10 2,232656155 -0,074856623

y = 0,0455x - 0,0412R² = 0,9967

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

0 20 40 60Concentração ng/mL

Linearidade Buprenorfina

-0,200,2

0 20 40 60Re

sid

uai

s

Variável X 1




Tratamento estatístico – Linearidade/Gama de trabalho da norbuprenorfina

[L1-L50] Nor-Bup Bup-D4 BUP/BUP-D4

(ng/mL) 468 454 (Ratio)

5 8218 10165 0,817 10016 11274 0,898 8717 9531 0,919 8720 9262 0,9410 8864 9244 0,9612 8970 8589 1,0420 9310 8106 1,1530 5791 3783 1,5340 16551 9339 1,7750 20156 9398 2,14







Interceptar 0,671284542 0,021694356 30,94281906 1,29339E-09 0,621257266 0,721311817Variável X 1 0,028479804 0,000895956 31,78704658 1,04445E-09 0,026413725 0,030545883

RESULTADO RESIDUAL


1 0,813683563 -0,005223162 0,870643171 0,0177726533 0,899122976 0,0154715054 0,92760278 0,0138785425 0,956082584 0,002809676 1,013042193 0,0313168717 1,240880627 -0,0923486758 1,525678669 0,0051169969 1,810476711 -0,038231289

10 2,095274754 0,049436887

y = 0,0285x + 0,6713R² = 0,9921

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

0 20 40 60


Linearidade Norbuprenorfina

-0,20

0,2

0 20 40 60

Re

sid

uai

s

Variável X 1




A tabela 20 resume os resultados obtidos para a linearidade e gamas de trabalho das

substâncias estudadas.

Tabela 20. Resumo dos resultados obtidos para a linearidade e gamas de trabalho

Substâncias

Equações das

Rectas

r2 Erro padrão (Sy/x )

Intervalo de intercepção da

Ordenada na origem

95% inferior 95% superior

Metadona Y=0,0083x+0,0766 0,9956 0,2211 -0,1611 0,3143

EDDP Y=0,0072x-0,0496 0,9964 0,1726 -0,2351 0,1359

Buprenorfina Y=0,0455x-0,0412 0,9967 0,0437 -0,0931 0,0107

Norbuprenorfina Y=0,0285x+0,6713 0,9921 0,0421 0,6212 0,7213

O estudo da linearidade e gamas de trabalho permite concluir que o procedimento de ensaio

PE-STF-C-211 é linear na gama de trabalho estudada (25 - 1000 ng/mL para a metadona e

EDDP) e o procedimento de ensaio PE-STF-C-212 é linear na gama de trabalho estudada (5 - 50

ng/mL para a buprenorfina). As duas curvas de calibração apresentam valores de r2 superiores

a 0,99 e a ordenada na origem não é estatisticamente diferente do ponto zero.

Arrastamento (carryover)

O estudo da existência de fenómenos de arrastamento foi efectuado em conjunto com

os pontos.

Prepararam-se brancos de sangue que foram injectados após as amostras fortificadas

com a concentração 1000 ng/mL e 50 ng/mL de cada uma das substâncias estudadas

(metadona/EDDP; burenorfina/norbuprenorfina, respectivamente) com o intuito de detectar

uma possível contaminação.

A análise dos cromatogramas das amostras brancas evidencia a ausência de qualquer

contaminação. Pode-se concluir que os procedimentos de ensaio de confirmação qualitativa e

quantitativa de opiáceos, em amostras de sangue por GC/MS, não são afectados por



fenómenos de contaminação por arrastamento em concentrações iguais ou inferiores a 1000

ng/mL no caso da metadona e EDDP e a 50 ng/mL no caso da buprenorfina e norbuprenorfina.

Repetibilidade

Este parâmetro foi estudado através da análise de 8 replicados independentes,

preparados por fortificação de amostras de sangue branco nas gamas de concentração 100

ng/mL e 900 ng/mL para a metadona e EDDP e a 10 ng/mL e 50 ng/mL para a buprenorfina e

norbuprenorfina. Foi adicionado 25 µL de padrão interno deuterado, a todas as amostras.

Após aplicação do método foram obtidas as áreas relativas para cada substância em

cada replicado e calculou-se a média, o desvio padrão e o coeficiente de variação (C.V %).

Seguidamente apresentam-se as tabelas dos resultados obtidos para cada uma das

substâncias.

Tabela 21. Resumo dos resultados respeitantes à repetibilidade da metadona

Metadona 100 ng/mL

Met Met-D3 Ratios (Met/PI) Médias DesvPad CV %

Rep1 8234 9397 0,876237097 0,89 0,0216 2,4

Rep2 7760 8317 0,933028736Rep3 5427 5981 0,907373349Rep4 4725 5397 0,875486381Rep5 8840 10070 0,877855015Rep6 8928 10084 0,885362951Rep7 9770 10919 0,894770583Rep8 9669 11154 0,866863905

Metadona 900 ng/mL

Met Met-D3 Ratios (Met/PI) Médias DesvPad CV %

Rep9 72873 10597 6,876757573 7,37 0,3182 4,3




Tabela 22. Resumo dos resultados respeitantes à repetibilidade da EDDP

EDDP 100 ng/mL

EDDP EDDP-D3 Ratios (EDDP/PI) Médias DesvPad CV %

Rep1 2569 4090 0,628117359 0,63 0,0614 9,7


EDDP 900 ng/mL

EDDP EDDP-D3 Ratios (EDDP/PI) Médias DesvPad CV %

Rep9 24157 4988 4,843023256 5,47 0,2792 5,1


Tabela 23. Resumo dos resultados respeitantes à repetibilidade da buprenorfina

Bup 10 ng/mL

Bup Bup-D4 Ratios (Bup/PI) Médias DesvPad CV %

Rep1 2946 5424 0,543141593 0,62 0,0431 7,0


Bup 50 ng/mL

Bup Bup-D4 Ratios (Bup/PI) Médias DesvPad CV %

Rep9 11485 5287 2,172309438 2,43 0,2324 9,6




Tabela 24. Resumo dos resultados respeitantes à repetibilidade da buprenorfina

NorBup 10 ng/mL

NorBup Bup-D4 Ratios (Bup/PI) Médias DesvPad CV %

Rep1 5508 5424 1,015486726 0,92 0,0890 9,6


NorBup 50 ng/mL

NorBup Bup-D4 Ratios (Bup/PI) Médias DesvPad CV %

Rep9 10648 5287 2,013996595 2,25 0,2230 9,9


Verificou-se que todas as substâncias cumprem as especificações em vigor para a

repetibilidade do método, apresentando C.V (%) inferiores a 10% para as gamas baixas (100 e

10 ng/mL) e altas (900 e 50 ng/mL) para as substâncias em estudo, no que respeita às áreas

relativas.

Precisão intermédia

No estudo deste parâmetro foram contempladas as fontes de variabilidade que

simulam o normal funcionamento do laboratório (tempo, reagentes, curva de calibração,

temperatura e operacionalidade do equipamento). A precisão intermédia foi estudada através

da preparação de curvas de calibração em dias distintos. Simultaneamente com cada curva

foram preparados dois controlos a dois níveis de concentração e em triplicado, 100 e 900

ng/mL para metadona e EDDP, e 10 e 50 ng/mL para a buprenorfina e norbuprenorfina. A

preparação das curvas de calibração (calibradores e controlos) assim como as soluções de

trabalho usadas nas fortificações encontra-se resumida nas tabelas 27 a 30 como está descrito

nos procedimentos de ensaio PE-STF-C-211 e PE-STF-C-212.



Tabela 25. Curvas de calibração para o estudo da precisão intermédia e exactidão da

metadona e EDDP

Concentração

Calibradores

(ng/mL)

Solução trabalho

0,5 µg/mL

(µL)

Solução trabalho

5 µg/mL

(µL)

Sangue branco

(µL)

25 25 __

500

100 100 __

300 __ 30

500 __ 50

750 __ 75

1000 __ 100

Tabela 26. Controlos para o estudo da precisão intermédia e exactidão da metadona

e EDDP

Concentração

Controlos

(ng/mL)

Solução trabalho

5 µg/mL

(µL)

Sangue branco

(µL)

200 20

500

900 90



Tabela 27. Curvas de calibração para o estudo da precisão intermédia e exactidão da

buprenorfina e norbuprenorfina

Tabela 28. Controlos para o estudo da precisão intermédia e exactidão da buprenorfina e

norbuprenorfina

Uma vez aplicado o procedimento de ensaio os resultados deste estudo foram tratados por

aplicação da ferramenta ANOVA (factor único), através da qual podem ser extraídas

estimativas da repetibilidade e da precisão intermédia. As expressões usadas são as seguintes:

Concentração

Calibradores

(ng/mL)

Solução trabalho

0,1 µg/mL

(µL)

Sangue branco

(µL)

5 25

500

10 50

20 100

30 150

40 200

50 250

Concentração

Controlos

(ng/mL)

Solução trabalho

0,1 µg/mL

(µL)

Sangue branco

(µL)

10 50

500

50 250



Tabela 29. Tabela ANOVA (factor único)

Fonte Média Quadrática (MQ) Graus de liberdade

Entre grupos MSrun =

( )1

1

2

−

−∑=

p

xxnp

i

i

p-1

Dentro de grupo MSr =

)1(

)(1

2

1

−

−∑∑= =

np

xxp

i

iij

n

j

p(n-1)

Total

pn-1

Onde:

p é o número de sequências de análises para cada nível de concentração (uma sequência por

cada dia);

n é o número de replicados em cada sequência;

xij representa um replicado individual (replicado j) obtido na sequência i;

xi representa a média de n replicados obtidos na sequencia i ;

x é a média das médias de p sequências.



Tabela 30. Cálculo das estimativas da precisão

Precisão Expressão

Repetibilidade (Sr) Sr = SrM

Between-run precision

(Srun)

Srun = n

MSrMSrun −

Precisão intermédia (S1) S1 = ( ) ( )22

runrSS +

Foi estudado o comportamento do desvio padrão e do coeficiente de variação ao

longo das gamas de trabalho.

Se p desvio padrão for aproximadamente constante ao longo da gama de

concentração, pode ser estimado o desvio padrão como valor calculado por análise de todos

os resultados obtidos ao longo da gama de trabalho. É aplicado o teste F para avaliar a

homogeneidade de variâncias.

Se o coeficiente de variação for aproximadamente constante ao longo da gama de

trabalho, é aplicada a equação seguinte para calcular um coeficiente de variação ponderado:

CVpool =( ) ( )

( ) ( ) ...11

...11

21

2

22

2

1

+−+−

+−+−

nn

CVnCVn xx

Se, simultaneamente, o desvio padrão e o coeficiente de variação não forem constantes ao

longo da gama de trabalho, deve ser reportado, para cada gama de trabalho o respectivo

desvio padrão.

Seguidamente apresentam-se as tabelas dos resultados obtidos relativamente ao cálculo da

precisão intermédia para cada uma das substâncias individualmente.



Tabela 31. Resultados obtidos para a precisão intermédia da metadona

Data 20-05-2010 21-05-2010 22-05-2010 16-09-2010 11-10-2010

R2 0,9975 0,9961 0,9988 0,9969 0,9999

Declive 0,0093 0,0081 0,0095 0,0082 0,0390

Y0 0,0053 0,0928 0,0503 0,0783 0,0095

Gama Média 100 ng

Replicado 1 98,0 93,1 97,1 83,1 108,9

Replicado 2 105,5 107,1 110,0 81,9 102,3

Replicado 3 99,8 96,3 103,6 97,0 106,0

Media 101,1 98,8 103,6 87,3 105,7

Recuperação 101,1 98,8 103,6 87,3 105,7

Conc. Média 99,3

Recuperação média 99,3

Repetibilidade 6,2

Between Run 6,2

Precisão Intermedia 8,8

C.V 8,8%

Gama Alta 900 ng

Replicado 1 1020,0 1001,7 929,2 881,3 957,9

Replicado 2 1000,9 992,2 930,8 899,3 945,9

Replicado 3 1013,1 998,5 929,9 979,3 951,9

Media 1011,3 997,5 930,0 920,0 951,9

Recuperação 112,4 110,8 103,3 102,2 105,8

Conc. Média 962,1


Repetibilidade 24,0

Between Run 38,1


C.V 4,7%

Tabela 32. Resultados obtidos para a precisão intermédia do EDDP

Data 20-05-2010 21-05-2010 22-05-2010 16-09-2010 11-10-2010

R2 0,9955 0,9984 0,9940 0,9975 0,9999

Declive 0,0086 0,0070 0,0075 0,0068 0,0196

Y0 0,1902 0,0368 0,0641 0,0017 0,0080

Gama Média 100 ng

Replicado 1 96,9 93,0 97,5 83,5 103,5

Replicado 2 104,7 103,4 97,3 85,4 100,2

Replicado 3 105,0 96,4 106,2 95.7 94,2

Media 102,2 97,6 100,3 84,5 99,3

Recuperação 102,2 97,6 100,3 84,5 99,3

Conc. Média 96,8


Repetibilidade 5,7

Between Run 5,2


C.V 8,0%

Gama Alta 900 ng

Replicado 1 1043,8 855,0 873,3 827,2 903,8

Replicado 2 1035,8 852,6 867,2 826,6 908,4

Replicado 3 1030,4 869,8 879,4 919,2 938,6

Media 1036,7 859,1 873,3 857,7 916,9

Recuperação 115,2 95,5 97,0 95,3 101,9

Conc. Média 908,7


Repetibilidade 25,9

Between Run 73,9


C.V 8,6%



Tabela 33. Resultados obtidos para a precisão intermédia da buprenorfina

Data 15-05-2010 17-05-2010 21-05-2010 03-07-2010 04-07-2010

R2 0,9931 0,9958 0,9958 0,9912 0,9912

Declive 0,0473 0,0448 0,0571 0,0449 0,0498

Y0 0,0165 0,0116 0,0692 0,0202 0,0156

Gama Média 10 ng

Replicado 1 13,7 15.7 13,1 12,4 13,0

Replicado 2 11,7 15,5 12,5 13,3 12,1

Replicado 3 11,8 13,9 13,5 12,9 12,3

Media 12,4 14,7 13,0 12,9 12,5

Recuperação 124,0 147,0 130,3 128,7 124,7

Conc. Média 13,1


Repetibilidade 0,7

Between Run 0,8


C.V 8,3%

Gama Alta 50 ng

Replicado 1 68,9 64,3 69,6 67,8 67,3

Replicado 2 71,7 69,2 72,5 68,2 68,4

Replicado 3 66,9 69,5 73,9 66,9 67,0

Media 69,2 67,7 72,0 67,6 67,6

Recuperação 138,3 135,3 144,0 135,3 135,1

Conc. Média 68,8


Repetibilidade 2,0

Between Run 1,5


C.V 3,7%

Tabela 34. Resultados obtidos para a precisão intermédia da Norbuprenorfina

Data 15-05-2010 17-05-2010 21-05-2010 03-07-2010 04-07-2010

R2 0,9941 0,9921 0,9962 0,9906 0,9904

Declive 0,0386 0,0293 0,0313 0,0209 0,0228

Y0 0,8099 0,6365 0,5603 0,683 0,7873

Gama Média 10 ng

Replicado 1 11,6 10,7 10,0 11,2 11,6

Replicado 2 12,3 9,1 12,2 11,2 12,0

Replicado 3 10,6 9,6 10,8 10,8 12,6

Media 11,5 9,8 11,0 11,1 12,1

Recuperação 115,0 98,0 110,0 110,7 120,7

Conc. Média 11,1


Repetibilidade 0,8

Between Run 0,7


C.V 9,4%

Gama Alta 50 ng

Replicado 1 58,1 52,6 51,0 47,7 56,3

Replicado 2 63,8 50,0 56,1 54,8 56,1

Replicado 3 62,6 59,9 60,9 45,6 57,8

Media 61,5 54,2 56,0 49,4 56,7

Recuperação 123,0 108,3 112,0 98,7 113,5

Conc. Média 55,6


Repetibilidade 4,1

Between Run 3,7


C.V 9,9%



Exactidão

Neste parâmetro, a grandeza principal a determinar é o desvio entre o valor obtido e o

valor teórico aceite como exacto, de modo a investigar a existência de erros sistemáticos,

definir factores de correcção e se relevante estimar a incerteza associada à recuperação do

método U R como dado de entrada do procedimento de cálculo de incertezas. Através dos

resultados obtidos a partir da experiência de avaliação da precisão intermédia, pode-se

proceder ao cálculo de U R utilizando as seguintes equações:

Ri = Fortf

Obsi

C

C

R = p

Rp

i

i∑=1

tExp = RU

R

%

1−

U%R = P

SObs U R =

R

U R%

U R = R

)R -(1+)(U 22 R%

Onde,

Ri é a recuperação média de n replicados obtidos em condições de repetibilidade;

ObsS é o desvio padrão de p valores de Ri obtidos em condições de precisão intermédia;

tcrit é o valor valor crítico bi-caudal para p-1 graus de liberdade num intervalo de confiança de

95%.

Para cada nível foi aplicado um teste estatístico de forma a averiguar se a recuperação

média é significativamente diferente de 100%:

Se tExp < tcrit, então R não é significativamente diferente de 100% e U R é calculado de acordo

com a segunda equação. Neste caso, a incerteza é aumentada de forma a contemplar este

factor adicional de incerteza.

Nas tabelas seguintes apresenta-se os resultados obtidos relativos ao estudo da

exactidão.



Tabela 35. Resultados obtidos para a exactidão da metadona

Concentração Gama Média Gama Alta

Data 100 %Rec. 900 %Rec.

20-05-2010 101,1 101,1 1011,3 112,4

21-05-2010 98,8 98,8 997.5 110,8

22-05-2010 103,6 103,6 930,0 103,3

16-09-2010 87,3 87,3 920,0 102,2

11-10-2010 105,7 105,7 951,9 105,8

Média 99,3 106,9

Desvio padrão 7,19 4,52

CV(%) 7% 4%

N (nº de dias) 5 5

Incerteza de R% 3,2 2,0

Incerteza padrão rel. 0,032 0,019

Tabela 36. Resultados obtidos para a exactidão da EDDP



20-05-2010 102,2 102,2 1036,7 115,2

21-05-2010 97,6 97,6 859,1 95,5

22-05-2010 100,3 100,3 873,3 97,0

16-09-2010 84,5 84,5 857,7 95,3

11-10-2010 99,3 99,3 916,9 101,9

Média 96,8 101,0


CV(%) 7% 8%

N (nº de dias) 5 5





Tabela 37. Resultados obtidos para a exactidão da Buprenorfina



15-05-2010 12,4 124,0 69,2 138,3

17-05-2010 14,7 147,0 67,7 135,3

21-05-2010 13,0 130,3 72,0 144,0

03-07-2010 12,9 128,7 67,6 135,3

04-07-2010 12,5 124,7 67,6 135,1

Média 130,9 137,6


CV(%) 7% 3%

N (nº de dias) 5 5



Tabela 38. Resultados obtidos para a exactidão da Norbuprenorfina



15-05-2010 11,5 115,0 61,5 123,0

17-05-2010 9,8 98,0 54,2 108,3

21-05-2010 11,0 110,0 56,0 112,0

03-07-2010 11,1 110,7 49,4 98,7

04-07-2010 12,1 120,7 57,7 115,1

Média 110,9 111,4


CV(%) 8% 8%

N (nº de dias) 5 5



As substâncias estudadas apresentam recuperações médias estatisticamente diferentes de

100%, não havendo evidência de erros sistemáticos no método.

Robustez

Para estudar este parâmetro foi analisado o impacto das alterações que ocorreram

naturalmente durante a validação do ensaio:

� Estabilidade após derivatização

� Substituição do liner

� Substituição de coluna cromatográfica

� Equipamentos distintos (GC001 e GC003)

CONCLUSÕES

Conclusões


CONCLUSÕES

1. O procedimento para a obtenção de produtos derivados revelou ser bastante

apropriado, uma vez que obtivemos um derivado único e de formação rápida

não se tendo verificado reacções secundárias.

2. A metodologia analítica usada apresentou-se robusta.

3. O procedimento de validação adoptado na determinação das drogas de

substituição estudadas em sangue total, demonstrou ser eficaz uma vez que

obtivemos valores considerados aceitáveis em todos os parâmetros estudados.

4. O método desenvolvido mostrou-se adequado à determinação das substâncias

em estudo, tendo sido obtidos resultados aceitáveis (Z-Score <3) de acordo

com IT-STF-C-008, nas participações no programa de controlo de qualidade

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Referências elaboradas de acordo com:

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[documento online] [consultado em 2010 Set 7] Disponível em:

http://www.nlm.nih.gov/bsd/uniform_requirements.html

anabela cardoso mariano - estudogeral.sib.uc.pt · em 1806 sertϋrner, um farmacêutico alemão,...

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