vacinas gênicas

Vacinas gênicas

mrodrigues@ecb.epm.br

História

1774- Benjamin Jetsy / Fazendeiro The Dorset / England Imunizou seus 2 filhos e sua esposa com

“cowpox” a fim de evitar a varíola

1796- Edward Jenner / Médico Gloucestershire / England Imunizou uma criança chamada James

Phipps

Prevenção

Epidemiologia Patogênese

Imunologia Quimioterapia

Importância das vacinas no controle e erradicação de doenças infecciosas

Método preventivo Redução rápida da transmissão Relação benefício-custo alta Erradicação da varíola no mundo

Características de uma vacina efetiva

Segura Capaz de induzir altos níveis de proteção Induzir níveis de proteção duradouros Induzir anticorpos neutralizantes Induzir linfócitos T efetores Baixo custo Estabilidade Fácil administração Poucos ou nenhum efeitos colaterais

Efeito da vacinação contra poliomielite no Brasil

Anos (Ministério da Saúde)

1979 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989

Inci

dênc

ia d

e po

limie

lite

por

100.

000

habi

tant

es

0

20

40

60

80

100

Cob

ertu

ra d

a va

cina

(%)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Efeito da vacinação contra poliomielite no mundo

Composição químicas da vacinas existentes

- Vírus vivos atenuados- Vírus inativados- Bactérias vivas atenuadas- Bactérias mortas- Toxóides- Polissacarídeos- Componentes antigênicos- obtidos por engenharia genética

Vírus vivos atenuados

Anti-varíola Anti-febre amarela Anti-caxumba Anti-poliomielítica (Oral

Sabin) Anti-rubéola Anti-sarampo

Vírus inativados Anti-poliomielítica

injetável (Salk) Anti-rábica

Anti-Tuberculose (BCG)Bactérias vivas atenuadas

Bactérias mortas Anti-colérica Anti-coqueluche Anti-febre tifóide

Toxóides Anti-tétano Anti-diftérica

Polissacarídeos Anti-H. influenza do tipo b Anti-meningocócica Anti-pneumocócica

Componentes antigênicos obtidos por engenharia genética

Anti-hepatite B

Vantagens

Múltiplos antígenos Simples produção Baixo custo relativo

Desvantagens

Formulação antigênica complexa

Toxicidade Resposta imune complexa

Vacinas convencionais

Razões que dificultam a geração de uma vacina contra alguns microrganismos patogênicos

Ausência de cultura axênica

Necessidade de grande suprimento de células humanas para o crescimento in vitro

Alto custo

Alto risco

Possíveis soluções para a produção de antígeno vacinas sintéticas

Peptídios Sintéticos

Proteínas recombinantes

Microrganismos geneticamente modificados

Vacinas de DNA

RESEARCH PRIORITIES FOR PRODUCTION OF NEW AND IMPROVED VACCINES

hepatitis types A, B, C, and D enteric pathogens including rotavirus, shigella, and cholera sexually transmitted diseases (genital herpes, gonorrhea, and chlamydia) croup and pneumonia in infants and children caused by respiratory

syncytial virus AIDS respiratory diseases caused by pneumococcus group B streptococcus influenza malaria tuberculosis Ieprosy

Doenças

Vacina recombinante ideal

Múltiplos antígenos Antígenos expressos em diferentes fase

do parasito Composta de antígenos com um

polimorfismo limitado Capaz de induzir múltiplos tipo de

resposta imune protetora Alta eficácia e baixo custo

Direcionamento da pesquisa

Determinação dos mecanismos imunológicos de proteção

Isolamento dos genes que codificam para antígenos destes microrganismos

Identificação de epítopos relevantes e com baixa variação antigênica entre as cepas

E como foram definidos os mecanismos imunológicos de proteção?

Transferência passiva de imunidade

Anticorpos monoclonais Clones de linfócitos T CD4 ou CD8

PROTEÍNAS RECOMBINANTES

Sistemas de expressão de proteínas recombinantes

Procariotos (E.coli)

Eucariotos - Leveduras (S. cerevisae)

Baculovírus

Vacina contra hepatite B recombinante

Antígeno S

Purificação

Levedura

Plasmídio

Vacina

Gene ag S

Proteína

Antígeno S da Hepatite B

PartículaMembranosa

Anticorpos

Vacinas recombinantes contra a hepatite B

Engerix-B SmithKline Beecham/US

Recombivax HB Merck/US

GenHevac B Pasteur/France

• Mais de 1 bilhão de doses (1982-presente).

• Produzida em leveduras (S. cerevisiae)

VÍRUS RECOMBINANTES

Vacinas gênicas

VACINAS DE DNA

Vetores preparados para transferir genes

DNA

VírusSelvagem

Gene exógeno

Célula hospedeira

Proteína recombinante

VírusRecombinante

Vírus recombinantes

Geração de vírus recombinantes

Vírus utilizados

Vaccinia (vacina contra varíola) Influenza (vacina contra gripe) Adenovirus (vacina contra infecção por

adenovirus) Vírus da Pólio (vacina contra pólio) Vírus da febre amarela (vacina contra

febre amarela).

Estrutura dos flavivírus

Dímero da proteína doenvelope

Modelo estrutural de um dímero da proteína do envelope do vírus da Febre Amarela

Bonaldo et al. (2002) Epítopos exógeno

Estrutura do vírus influenza

hemaglutinina do vírus da influenza

Estrutura do vírus vaccinia

Estrutura do Adenovírus

Formas de inoculação

Sub-cutânea Intra-muscular Por via de mucosas

Propriedades adjuvantes

Interferons IL-6 Outros?

Imunização com vírus recombinantes

Anticorpos Linfócitos T CD4 TH1

Linfócitos T CD8

Vírus recombinante

• Já usado como vacina• Produção em larga escala • Diversos tipos de resposta

imune• Grande quantidade de

Informação (vírus de DNA)

• Limitação da quantidade a ser inoculada

• Limitação da quantidade de antígeno produzido

• Pouca antigenicidade

Vantagens Desvantagens

VACINAS DE DNA

Plasmídio vetor deexpressão

Geneexógeno

Promotor forteCitomegalovírus

Cauda Poli-A

Formas de inoculação

Sub-cutânea Intra-muscular Por via de mucosas

Micro-bombardeamento com partículas (“gene gun”)

Microenhancer array

Propriedades adjuvantes

Interferons IL-12 Outros?

Núcleo

ProteínaExógenaCélula hospedeira

Plasmídio epissomal

Injeção intra-muscular de DNA plasmidal marcado com rodamina

DNA plasmidial Núcleo Overlay

Expressão da proteína exógena após imunização intramuscular

b-galactosidase

Expressão da proteína exógena após injeção s.c.

GFP

b-galactosidase

Imunização com DNA

Anticorpos Linfócitos T CD4 TH1

Linfócitos T CD8

Vacinas de DNA

Sem proteína Grande quantidade de informação

genética Vários tipos de resposta imune Produção da proteína “in situ” Simples, estável e de baixo custo

relativo

Sistema novo e pouco conhecido

Possibilidade de integração do vetor de expressão no genoma

Vantagens Desvantagens

Immunização com DNA no homem?

Hepatitis B DNA vaccine induces protective antibody responses in human non-responders to conventional vaccination.

Rottinghaus ST, Poland GA, Jacobson RM, Barr LJ, Roy MJ.

Department of Internal Medicine, Mayo Clinic, 55905, Rochester, MN, USA

Vaccine. 2003. 21:4604-8.

Linfócitos T CD8 ab

Restritas por MHC classe I

1996

Nobel Prize of Medicine:

Peter C. Doherty and Rolf Zinkernagel

Citotóxicos para células infectadas por vírus

MCH classe I + peptídeo MCH classe II + peptídeo

Linfócitos T CD8 ab Linfócitos T CD4 ab

Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses.Foulds KE, Zenewicz LA, Shedlock DJ, Jiang J, Troy AE, Shen H. J Immunol. 2002 Feb 15;168(4):1528-32.

Linfócitos T CD8 proliferam e se diferenciam mais rápido que

linfócitos T CD4

107 linfócitos T CD8 específicos por baço

105 linfócitos T CD4 específicos por baço

Durante a infecção experimental por LCMV

Durante a infecção experimental por LCMV

Células CD8 de memória

Apoptose da célula alvo infectada

Mecanismos efetores mediados por linfócitos T CD8

Lise da célula alvo infectada

Secreção de linfocinas (Interferon-g, TNF, quimiocinas, etc.)

Vírus (HIV, etc)

Patógenos cuja a imunidade mediada por CD8 é crítica

Bactérias (M. tuberculosis, etc.)

Protozoários intracelulares (Plasmodium, T. cruzi, Toxoplasma)

Vírus HIV

GagPolGenoma viral

Env

Diferentes estratégias para a indução de linfócitos T CD8 específicos

Vírus Recombinante (DNA or RNA) DNA plasmidial Combinação (prime-boost heterólogo)

Rodrigues et al., 1994 and Miyahiara et al., 1995

ELISPOT for detection of peptide-specifc CD8 T cells.

Tetramer/Pentamer staining for detection of peptide-specifc CD8 T cells

D=DNA plasmidial V=Vaccinia A=Adenovírus

Prime-boost heterólogo e ativação de linf. T CD8

DNA plasmidial

Vaccinia recombinante : MVA

DNA plasmidial +CRL (adjuvante)

Adenovirus (Ad5) recombinante

DNA plasmidial +MPL (adjuvante)

DNA plasmidial +CRL / Ad5

DNA plasmidial +CRL / MVA

Vírus Recombinante (DNA)

DNA plasmidial

Combinação (prime-boost heterólogo)

Vacinação experimental de macacos contra a infecção por SHIV

DNA MVA

DNA+CRL Ad5

DNA+MPL

DNA+CRL / Ad5DNA+CRL / MVA

Freqüência de linfócitos T CD8 específicos

Céls. CD4 RNA Viral no Plasma

Controle

DNA

DNA+CRL

DNA+MPL

MVA

Ad5

Control

DNA+CRL/MVA

DNA+CRL/Ad5

DNA MVA SHIV DNA MVA SHIV

Carga viral (RNA no plasma) Contagem de CD4 no sangue

Controles

Controles

Desafio = intrarrectal

A Randomised, Double-Blind, Controlled Vaccine Efficacy Trial of DNA/MVA ME-TRAP Against Malaria Infection in Gambian AdultsVasee S. Moorthy, Egeruan B. Imoukhuede, Paul Milligan, Kalifa Bojang, Sheila Keating, Pauline Kaye, Margaret Pinder, Sarah C. Gilbert, Gijs Walraven, Brian M. Greenwood, Adrian S. V. Hill.

http://www.malaria-vaccines.org.uk/

Recombinant virus against malaria (Clinical trials = humans)

2005

http://www.vacinashiv.unifesp.br/

Conclusões

Conhecimento básico para o desenvolvimento de vacinas recombinantes

Conhecimento importante dos mecanismos imuno-protetores contra microrganismos patogênicos

Já existe várias vacinas comerciais contra hepatite B Existem várias vacinas recombinantes sendo testadas.

Os estudos para o desenvolvimento de vacinas recombinantes têm trazido: