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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
LAIS CRISTINA GUSMÃO FERREIRA PALHARES
UM DERMATAM SULFATO ANTITROMBÓTICO DO
CAMARÃO Litopenaeus vanammei INIBE A INFLAMAÇÃO
E ANGIOGÊNESE
NATAL
2016
LAIS CRISTINA GUSMÃO FERREIRA PALHARES
UM DERMATAM SULFATO ANTITROMBÓTICO DO
CAMARÃO Litopenaeus vanammei INIBE A INFLAMAÇÃO
E ANGIOGÊNESE
Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientadora: Suely Ferreira Chavante
NATAL
2016
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências
Palhares, Lais Cristina Gusmão Ferreira. Um dermatam sulfato antitrombótico do camarão Litopenaeus vanammei inibe a inflamação e angiogênese / Lais Cristina Gusmão Ferreira Palhares. – Natal, RN, 2016. 72 f.: il.
Orientadora: Profa. Dra. Suely Ferreira Chavante. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós Graduação em Bioquímica. 1. Trombose. – Dissertação. 2. Inflamação. – Dissertação. 3. Neovascularização. – Dissertação. I. Chavante, Suely Ferreira. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 616-005.6
LAIS CRISTINA GUSMÃO FERREIRA PALHARES
UM DERMATAM SULFATO ANTITROMBÓTICO DO
CAMARÃO Litopenaeus vanammei INIBE A INFLAMAÇÃO
E ANGIOGÊNESE
Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientadora: Suely Ferreira Chavante
Aprovado em: 29 de Março de 2016.
Dedico este trabalho
Ao meu pai, Raimundo Palhares. Porque o senhor merece uma página
só sua! O senhor nunca mediu esforços para que eu alcançasse todos os
sonhos, não importando o quão impossíveis pudessem parecer. Espero um dia
poder recompensar ao menos, um décimo do seu investimento em mim. Sem
seu apoio incondicional jamais estaria aqui realizando mais esta conquista. Te
amo mais que tudo.
AGRADECIMENTOS
À minha mãe, Sônia Andrade, que apesar da distância, foi alguém fundamental em minha
educação e bem-estar, sempre me confortando nos meus momentos de angústia.
Às minhas avós, Thereza Gusmão (in memoriam) e Maria do Socorro, que sempre acreditaram
e torceram por mim.
Aos meus irmãos, Sérgio Vasconcelos e Anderson Palhares que estiveram sempre ao meu lado,
mesmo distantes, e cuidaram de mim como se fossem meus pais.
À minha imensa e linda família que sempre foram carinhosos comigo e torceram pelas minhas
conquistas.
À professora Suely Chavante, por ter me dado a oportunidade de seguir o caminho que escolhi
me dando sempre oportunidades e acreditando no meu potencial. Obrigada pelos conselhos e
principalmente, pelo aprendizado diário. A senhora tem sido mais que uma orientadora, mas também
uma mãe em muitos momentos.
À minha amiga/orientadora Adriana Brito, sem a qual este trabalho não teria evoluído
tanto. Obrigada pela companhia, pelas conversas e pelos ensinamentos. Quando crescer, quero ser
igual à você.
Às professoras Giulianna Paiva e Fernanda Wanderley, pelo apoio e os ensinamentos ao
longo destes anos.
À professora Helena Nader e Mauro Sérgio Pavão, os quais me receberam em seus
laboratórios de braços abertos, permitindo que eu realizasse os experimentos cruciais, que tanto
agregaram valor ao meu trabalho.
À Ana Katarina, pela ajuda e ensinamentos do dia-a-dia do laboratório.
À Hilton Macêdo, meu companheiro de todos os momentos ao longo desta jornada, sempre me
trazendo paz e afastando tudo de ruim e pesado. Sem você tudo teria sido mais difícil.
Aos meus “maridos” da vida, Raphael Serquiz e Jefferson Duarte, por estarem sempre ao meu
lado, na saúde e na doença, na alegria e na tristeza, literalmente! Vocês são a família que criei aqui.
Obrigada por tudo!
Ao meu “marido” do mestrado, Vinícius Campelo por dividir as horas mais árduas, mas
também as mais divertidas diante desta batalha. Obrigada por sempre ouvir os desabafos e me
aconselhar.
Aos meus companheiros de turma, pelas longas conversas filosóficas no Bar do Thomas, (em
especial Juliana Gabriela rsrs), pela companhia na hora do café e por ter terem feitos as aulas e
apresentações de seminários muito mais divertidas.
À equipe do GAGs, que pra mim parece mais uma família. À Isabela Bonfim e Ramayana
Brito pela ajuda incondicional e pela oportunidade também, de poder ensinar o pouco que sei. Às
novas alunas, por terem paciência com meu jeito e tornarem o ambiente do laboratório tão
harmonioso.
À minha amiga Andressa Lira, que mesmo longe, foi minha companheira nas farras e nas
tristezas.
Às minhas amigas-irmãs, Lívia Lima, Vanessa Nascimento e Carla Dornelas, que mesmo
estando longe sempre torceram por mim e se fizeram presentes em minha vida de alguma forma, me
confortando nos momentos que mais precisei. Vocês são um presente de Deus em minha vida.
Ao meu gato Ben, por me fazer companhia durantes as longas madrugadas de estudo e
escrita.
Aos alunos, demais professores e funcionários do Departamento de Bioquímica da UFRN,
que sempre estiveram a postos para ajudar ou emprestar materiais e pelas conversas na copa.
Ao pessoal da Faculdade de Bioquímica Médica da UFRJ que me ajudaram a realizar os
experimentos que contribuíram para que meu trabalho se tornasse tão bonito. Vocês foram muito
receptivos e atenciosos comigo, me fazendo me sentir em casa.
Às demais pessoas não citadas que direta ou indiretamente contribuíram para a produção
deste trabalho.
“É melhor atirar-se à luta em busca de dias melhores, mesmo correndo o risco de perder tudo, do que permanecer estático, como os
pobres de espírito, que não lutam, mas também não vencem, que não conhecem a dor
da derrota, nem a glória de ressurgir dos escombros. Esses pobres de espírito, ao final
de sua jornada na Terra não agradecem a Deus por terem vivido, mas desculpam-se
perante Ele, por terem apenas passado pela vida.”
Bob Marley
RESUMO
A inflamação é composta de uma reação vascular e outra celular,
conferindo diferentes reações de tecidos e células, tanto do ambiente
intravascular, como o do ambiente extravascular. À medida que o processo
inflamatório ocorre, proteases da coagulação, em especial a trombina (FIIa),
são capazes de desencadear diversas respostas celulares na biologia vascular
e por isso, frequentemente é observada a ativação de outros sistemas
biológicos, levando à complicações durante um evento inflamatório, como a
trombose e a angiogênese. Assim, moléculas antagonistas desses eventos são
modelos interessantes para o desenvolvimento de novos fármacos anti-
inflamatórios. Neste contexto, destacam-se os glicosaminoglicanos (GAGs), os
quais interagem com diversas proteínas envolvidas em processos biológicos
importantes, incluindo inflamação e coagulação. Por essa razão, o presente
trabalho teve por objetivo avaliar os potenciais anti-inflamatórios,
antitrombótico, antiangiogênico, bem como anticoagulante de GAGs do tipo
dermatam sulfato (DS) extraídos do cefalotórax do camarão Litopenaeus
vannamei. O composto foi obtido após proteólise e purificação por
cromatografia de troca-iônica. Após total digestão por liases que digerem
compostos tipo DS (condroitinase ABC), sua natureza do tipo DS foi revelada,
sendo então denominado DSL. O composto do camarão mostrou reduzido
efeito anticoagulante pelo ensaio de TTPa, porém apresentou alta atividade
anti-IIa, diretamente e via Cofator II da heparina. Sobre a inflamação, o
composto apresentou significativo efeito inibitório com redução de citocinas
pró-inflamatórias. Potenciais inibitórios foram relatados no ensaio
antitrombótico e antiangiogênico, sendo este último dose-dependente. Quanto
à atividade anti-hemostática, o polissacarídeo não induziu efeito hemorrágico
significativo. Assim, os resultados exibidos pelo composto tipo DS isolado do
camarão, apontam este glicosaminoglicano como alvo biotecnológico com
perspectivas para o desenvolvimento de novas drogas multipotentes.
Palavras chaves: Anti-inflamatório. Neovascularização. Trombose. Trombina.
Coagulação. Glicosaminoglicano.
ABSTRACT
Inflammation is combined of a vascular and a cellular reaction, resulting in
different cells and tissue responses, both the intravascular and extravascular
environment. As the inflammatory process occurs, coagulation proteases, in
particular thrombin (FIIa), are able to initiate various cellular responses in
vascular biology and therefore is often observed activation of other biological
systems, leading to complications during an event inflammatory, such as
thrombosis and angiogenesis. Thus, antagonists molecules of these events are
interesting models for the development of novel anti-inflammatory drugs.
Thereby, it is worth stressing the glycosaminoglycans (GAGs), which are able to
interact with several proteins involved in important biological processes,
including inflammation and coagulation. Therefore, this study aimed to evaluate
the anti-inflammatory, antithrombotic and anti-angiogenic potentials, as well
anticoagulant of a dermatan sulfate-like GAG (DS) extracted from the
Litopenaeus vannamei cephalotorax. The compound was obtained after
proteolysis and purification by ion-exchange chromatography. After total
digestion by DS-like compounds digesting lyases (chondroitinase ABC), the DS-
like nature was revealed, and then called DSL. The shrimp compound showed
reduced anticoagulant effect by the aPTT assay, but high anti-IIa activity,
directly and through heparin cofactor II. On inflammation, the compound had a
significant inhibitory effect with the reduction of proinflammatory cytokines.
Potential Inhibitory were reported in the antithrombotic and anti-angiogenic
assay, the latter being dose dependent. As for anti-hemostatic activity, the
polysaccharides did not induced significant bleeding effect. Thus, the results
shown by the shrimp DS-like compound indicate this glycosaminoglycan as a
biotechnology target with prospects for the development of new multipotent
drugs.
Key-words: Anti-inflammatory. Neovascularization. Thrombosis. Thrombin.
Coagulation. Glycosaminoglycan.
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AT Antitrombina
CS Condroitim 4 e 6 sulfato
D4ST1 Dermatan 4- O -sulfotransferase 1
DEAE Dietilaminoetil acetato
DS Dermatam sulfato
DS-epi1 Dermatam sulfato epimerase 1
DS-epi2 Dermatam sulfato epimerase 2
EGF Fator de crescimento endotelial
F-0,5 Fração obtida após precipitação com acetona na proporção
de 0,5:1
F-0,7 Fração obtida após precipitação com acetona na proporção
de 0,7:1
F-1,0 Fração obtida após precipitação com acetona na proporção
de 1,0:1
F-2,0 Fração obtida após precipitação com acetona na proporção
de 2,0:1
F-3,0M Fração 3,0 molar
FIIa Fator dois ativado
FT Fator tecidual
FVa Fator cinco ativado
FGF Fator de crescimento fibroblástico
FXa Fator dez ativado
TGF-β Fator de crescimento tumoral beta
GAGs Glicosaminoglicanos
Glc Glicosamina
GlcA Ácido Glicurônico
HCII Cofator II da heparina
Hep Heparina
HL Heparinoide
HS Heparam sulfato
IdoA Ácido idurônico
IL-6 Interleucina-6
IL-8 Interleucina-8
IFN- β lnterferon beta
MPP Metaloproteinase de matriz
MTT [3-(4,5- Di-metiltiazol-2-il)-2,5- brometo difenil- tetrazolio)]
NF-κB Fator nuclear- ĸappaB
PAR-1 Receptor de ativação de proteases um
PAR-2 Receptor de ativação de proteases dois
PCI Proteína C inibitória
PDA 1,3- diaminopropano acetato
PG Prostaglandina
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
TSP-1 Trombospondina um
TSP-2 Trombospondina dois
TTPa Tempo de tromboplastina parcial ativa
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
Δ Presença de insaturação entre C-4 e C-5 do resíduo de
ácido urônico
ΔU,2S-GalNS Dissacarídeo insaturado dissulfatado
ΔU,2S-GalNS,6S Dissacarídeo insaturado trissulfatados
ΔU-GalNAc Dissacarídeo insaturado N-acetilado
ΔU-GalNAc,6S Dissacarídeo insaturado N-acetilado-6-sulfato
ΔU-GalNS Dissacarídeo insaturado N-sulfatado
ΔU-GalNS,6S Dissacarídeos insaturado N,6-dissulfatado
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 Recrutamento leucocitário e a participação de moléculas de
adesão e
quimiocinas......................................................................................
17
Figura 02 Respostas celulares mediadas através dos receptores PAR.................................................................................................. 22
Figura 03 Representação esquemática dos efeitos do sistema fisiológico anticoagulante e fibrinolítico na coagulação e inflamação........................................................................................
23
Figura 04 Estrutura típica de um Dermatam Sulfato e suas variações na sequência típica de unidade dissacarídica....................................................................................
28
Figura 05 Distribuição dos GAGs no reino animal..............................................................................................
30
Figura 06 Perfil eletroforético em sistema PDA dos compostos do camarão obtidos da F-1,0A por cromatografia de troca-iônica, em DEAE-Sephacel.......................................................................................... 42
Figura 07 A análise por cromatografia de troca aniônica HPLC dos dissacarídeos formados após digestão do DSL pela condroitinase ABC.................................................................................................. 43
Figura 08 Atividade anticoagulante dos compostos tipo DS e heparina, mensurados através do Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa).............................................................................................. 44
Figura 09 Atividade anti-IIa direta e mediada pelo Cofator II da heparina dos compostos tipo DS e heparina........................................................................................... 45
Figura 10 Atividade hemorrágica dos compostos tipo DS e heparina, mensurada pelo potencial de sangramento. ......................................................................................................... 46
Figura 11 Avaliação do efeito de compostos tipo DS sobre o recrutamento de células polimorfonucleares (PMN), em modelo de inflamação de peritonite induzida por LPS.............................................................. 47
Figura 12 Produção de IL-1β, IL-6 e TNF-α estimuladas por LPS em camundongos C57BL/6, após tratamento com compostos tipo DS, 4h após indução da inflamação........................................................................................
48
Figura 13 Atividade antitrombótica induzida por FeCl3 do composto tipo Dermatam sulfato obtido do camarão (DSL)................................................................................................ 49
Figura 14 Formação de estruturas capilares em matrigel após tratamento
com diferentes doses do composto do camarão ou na dose de
100 μg/mL da heparina....................................................................
50
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................ 16
2. OBJETIVO .................................................................................................. 34
2.1 Objetivo geral: ....................................................................................... 34
2.2 Objetivos específicos: ......................................................................... ..34
3. MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................... 34
3.1 Animais e cultura de células ................................................................. 35
3.2 Extração de glicosaminoglicanos e purificação dos compostos tipo DS
do camarão L. vannamei............................................................................. 35
3.3 Eletroforese ........................................................................................... 36
3.4 Despolimerização enzimática ............................................................... 36
3.5 Determinação do peso molecular ......................................................... 37
3.6 Atividade anticoagulante ....................................................................... 37
3.7 Inibição da trombina (fator IIa) .............................................................. 37
3.8 Inibição da trombina pelo Cofator II da heparina (HCII) ........................ 38
3.9 Efeito residual hemorrágico .................................................................. 38
3.10 Ensaio de formação capilar em membrana basal reconstituída
(Matrigel) ..................................................................................................... 40
3.11 Análise estatística ............................................................................... 40
4. RESULTADOS ........................................................................................... 41
4.1 Purificação do composto tipo DS a partir do camarão L. Vannamei. .... 41
4.2 Degradação enzimática ........................................................................ 43
4.3 Atividade anticoagulante ....................................................................... 44
4.4 Atividade anti-IIa direta e mediada pelo Cofator II da Heparina (HCII) . 44
4.5 Atividade hemorrágica .......................................................................... 45
4.6 Ensaio de peritonite aguda induzida por LPS ....................................... 46
4.7 Dosagem de citocinas ........................................................................... 47
4.8 Atividade antitrombótica por modelo de trombose arterial induzida por
FeCl3 ........................................................................................................... 48
4.9 Ensaio de formação capilar de células endoteliais em matrigel ............ 49
5. DISCUSSÃO ............................................................................................... 51
6. CONCLUSÃO ............................................................................................. 60
7. REFERÊNCIAS .......................................................................................... 61
16 Introdução
INTRODUÇÃO
A inflamação é um dos principais fenômenos fisiopatológicos
apresentados por um organismo, podendo ser causada por agentes físicos,
químicos ou biológicos. Estes indutores são responsáveis pela determinação
da área danificada, complexidade da patologia e o tipo de resposta imunológica
desencadeada (CORDEIRO, et al., 2007). A inflamação é caracterizada pela
resposta de um organismo lesado ao agente agressor, na intenção de eliminar
o mesmo e devolver à região seu estado original. Este processo de proteção
desenvolvido é caracterizado pelo recrutamento do sistema de defesa afim de
que o agressor seja identificado pelo organismo e os processos de defesa
comecem a ser desenvolvidos (GOTTE, 2003).
A principal característica do processo inflamatório é o recrutamento e
ativação de leucócitos, especialmente os neutrófilos polimorfonucleares (PMN)
(XIE, 1991; SLUITER, 1993; LAROUX, 2000), com o intuito de destruir
elementos estranhos, além de reparo e remodelagem do tecido inflamado
(JOHNSON, 1992). Os neutrófilos são as primeiras linhas de defesa do
organismo frente à patógenos invasores, como bactérias, e constituem de 40-
60% da população de células leucocitárias (HASHIMOTO, 2009). Os neutrófilos
se tornam ativados basicamente por partículas provenientes de agentes
infecciosos, citocinas ou quimiocinas, que os mobilizam para o sítio de
inflamação, onde são expostos à estímulos que culminarão na eliminação do
patógeno (HALLETT, 1995). O recrutamento dos leucócitos ocorrem em várias
etapas que, incluem o rolamento, seguido pela forte adesão ao endotélio e
transmigração para os tecidos lesados (Fig. 1). Tal mecanismo é possibilitado
pela presença de moléculas de adesão, como os membros da famílias das
selectinas (P-, E- e L-selectinas) (SPRINGER, 1994). Dentro de minutos que a
célula recebe o sinal ativador, ocorre a mobilização de grânulos intracelulares
que possuem receptores pré-formados para a membrana plasmática,
aumentando o número destes receptores na superfície do leucócito
possibilitando a ligação às selectinas, iniciando o processo de rolamento ou
transmigração (LEY, 2007).
17 Introdução
Fig. 1: Processo de recrutamento leucocitário e a participação de moléculas de adesão e
quimiocinas.
Figura adaptada: Eric J. Kunkel & Eugene C. Butcher, 2008.
A resposta inflamatória pode ainda ser classificada quanto à sua
complexidade, em dois tipos: resposta aguda ou crônica, distinguindo uma da
outra por período de instalação da resposta, bem como características clínicas
e laboratoriais (CONSOLARO, 2010). A inflamação aguda tem como resposta
inicial a migração neutrofílica e a secreção de mediadores inflamatórios,
caracterizando-se como uma resposta rápida do organismo com a duração de
alguns minutos à dias. Outro aspecto importante da inflamação aguda é a
ocorrência de sinais físicos com maior intensidade, sendo evidente o
aparecimento de vermelhidão (rubor), aumento da temperatura (calor), edema
(exsudação de líquido intersticial), e também de dor, sendo a perda da função
influenciada pelo tamanho e tipo de lesão (SANTOS JÚNIOR, 2003). Porém,
apesar de ser um mecanismo de defesa, a inflamação pode ser prejudicial ao
organismo por reações de hipersensibilidade ou lesionar tecidos e órgãos de
18 Introdução
maneira progressiva e permanente, caracterizando uma inflamação crônica. A
inflamação crônica tem por definição, a duração prolongada, sendo essa
duração de semana ou meses, onde a inflamação, a eliminação do agressor e
do tecido adjacente e também a tentativa de reparação do local agredido
acontecem de forma conjunta (FEGHALI; WRIGHT, 1997). Esse tipo de
resposta envolve, diferentemente da inflamação aguda, linfócitos e macrófagos
e frequentemente leva à formação de fibrose e angiogênese.
Independentemente do tipo de resposta, este fino processo é
desencadeado e sustentado através da expressão e secreção de quimiocinas,
as quais direcionam os leucócitos para o sitio de injuria, além de citocinas,
prostaglandinas e radicais livres. Citocinas são pequenos peptídeos liberados
por células que possuem um efeito especifico na interação e comunicação
entre determinadas células, podendo agir diretamente sobre as células que as
secretaram (sinalização autócrina), sobre células próximas (sinalização
parácrina), ou ainda sobre células distantes (sinalização endócrina). (ZHANG;
JIANXIONG, 2007). As citocinas podem ser produzidas por diversas
populações celulares, porém seus produtores principais são os linfócitos T
auxiliares e macrófagos, podendo ser divididas em duas classes: citocinas pró-
inflamatórias, que vão atuar induzindo a liberação de mediadores inflamatórios
como liberação de radicais livres (ROS), além de ativar células efetoras que
participam da inflamação; e as citocinas anti-inflamatórias, moléculas
imunorregulatórias que, em contrapartida, são capazes de controlar as
respostas pró-inflamatórias (WIESELER-FRANK, 2004).
Dentre as citonas pró-inflamatórias, as mais abundantes em eventos
inflamatórios são as IL-1β, IL-6 e TNF-α, as quais são responsáveis por induzir:
quimiotaxia e adesão leucocitária, ROS e enzimas bactericidas, retardo
apoptótico leucocitário e ainda produção de outros mediadores inflamatórios
(WRIGHT, 2010). Essas três citocinas são frequentemente secretadas em
conjunto e apresentam efeitos muitas vezes redundantes. Porém, a IL-1 é a
citocina central na resposta inflamatória, a qual possui efeitos diretos sobre o
recrutamento neutrofílico, ativação de linfócitos e indução de outros
mediadores inflamatórios (DINARELLO, 2009). Tanto a IL-1β (forma
19 Introdução
secretada), como a IL-1α (forma expressa na membrana) sinalizam através do
receptor IL-1RI, presentes em uma variedade de células, induzindo a
expressão de um arranjo de genes pró-inflamatórios tais como IL-6, TNF-α, IL-
8, IL-17 e a própria IL-1 (MILLS; DUNNE, 2009). Além disso, IL-1β é capaz de
provocar os sintomas clássicos da inflamação como dor e febre, e sua
produção excessiva está diretamente relacionada aos episódios de febre e
inflamação sistêmica, em certas doenças autoinflamatórias, ligadas a mutações
em genes que regulam a imunidade inata, tais como a síndrome de Muckle-
Wells e gota. Esta última, é uma doença em que IL-1β é induzida pelos cristais
de urato, causando resposta inflamatórias nas articulações (MASTERS et al.,
2010).
Outra citocina pirogênica (causa febre) é a IL-6, a qual é capaz de
induzir proliferação e diferenciação de células T, bem como a diferenciação de
células B para células secretoras de anticorpos e a diferenciação de linhagens
celulares mielóides em macrófagos (HIRANO, 1998). Essa interleucina é
secretada por macrófagos e monócitos em resposta à outras citocinas como IL-
11 e TNF- α e durante a resposta aguda apresenta um papel central em
restaurar a função hepática, sendo um dos principais fatores estimulantes na
produção de proteínas de fase aguda pelos hepatócitos (MICHALOPOULOS,
2007). A IL-6 induz a transcrição de fatores envolvidos em múltiplas vias
inflamatórias e parece ter um desempenho ativo também na inflamação
crônica, uma vez que o aumento nos seus níveis parece favorecer a
susceptibilidade a diabetes mellitus e artrite reumatoide juvenil
(RABINOVITCH, 1998; SRIRANGAN, S. E CHOY, 2015).
Por fim, o TNF-α é também responsável pela ativação de linfócitos, além
da estimulação da liberação de enzimas proteolíticas pelos macrófagos e
produção de outras citocinas inflamatórias como a IL-6 e IL-13 (FALEIRO;
ARAUJO; VARAVALLO, 2011). Embora os macrófagos sejam a fonte primária
de TNF-α, uma ampla variedade de tipos de células, incluindo linfócitos T
ativados, neutrófilos, queratinócitos e algumas células tumorais, podem
também sintetizar esta molécula (SIZOVA, 2008), justificando assim sua
atuação não só em doenças agudas, bem como em doenças inflamatórias
crônicas como o câncer e artrite reumatoide, doença na qual se encontra altos
20 Introdução
níveis dessa citocina nas articulações (FALEIRO; ARAUJO; VARAVALLO,
2011).
Deste modo, o papel que estes mediadores desempenham na
inflamação é apenas uma das partes de todo um conjunto necessário para que
ocorra o processo inflamatório, de fato. A reação inflamatória é composta de
dois componentes principais, sendo eles: uma reação vascular e outra celular,
que comportarão cada um deles diferentes reações de tecidos e células, tanto
do ambiente intravascular, como o do ambiente extravascular. (KUMAR;
ABBAS e FAUSTO, 2005; RUBIN et al., 2006). Por isso, frequentemente é
observada a ativação de outros sistemas biológicos, que levam à complicações
durante um evento inflamatório, como a trombose e a angiogênese.
À medida que o processo inflamatório ocorre, alterações na biologia
vascular são desencadeadas, dentre elas a ativação da coagulação e
angiogênese, tornado estes eventos totalmente interligados. Na tentativa de
eliminar o agente invasor, a resposta inflamatória acaba por lesar o tecido ou
órgão acometido por este agente e como consequência, frequentemente há a
exposição de moléculas capazes de desencadear a cascata da coagulação,
tais como o fator tecidual (FT), P-selectinas e fator de Von Willebrand (FvW). O
FT, também conhecido como fator III, é uma glicoproteína exposta em células,
com exceção de células endoteliais e sanguíneas, em reposta a injúria, bem
como a inúmeros estímulos extracelulares relacionados a resposta inflamatória
e tumoral incluindo LPS, TFN-α, IL-1, IL-2, IL-6 e IFN-γ (VERSTEEG et al,
2006). A exposição do FT, juntamente com a do colágeno, funciona como
estimulo pró-coagulante, onde então, uma complexa rede de serino-proteases,
atua como uma cascata amplificada, convertendo as pró-enzimas em suas
formas ativas, culminando na formação do coágulo. A trombina, também
conhecida como fator IIa, é a principal serino-protease da cascata da
coagulação que cliva o fibrinogênio em fibrina, o qual juntamente com as
plaquetas, constitui a base do coágulo (GRAY et al, 2012).
Apesar desta participação do FT na modulação da inflamação, o
principal mecanismo pelo qual a coagulação é capaz de desencadear
respostas celulares relacionadas à diversas patologias, é através da ativação
21 Introdução
de receptores ativadores de proteases (PAR), mediada pela trombina (CHU, et.
al., 2005). Receptores tipo PAR são receptores acoplados à proteína G que
possuem um mecanismo capaz de converter um evento de clivagem
proteolítica extracelular em um sinal transmembrana, modulando assim
respostas celulares. Existem quatro receptores PAR conhecidos; PAR-1, PAR-
2, PAR-3 e PAR-4, sendo apenas os subtipos -1 e -4 encontrados em
plaquetas humanas. Porém, apesar de os receptores PAR-1 and PAR-4 serem
sinalizados através das mesma família de receptores de proteína G-acoplada,
PAR-1 é capaz de se ligar à trombina com mais afinidade do que PAR-4,
mostrando assim a importância de PAR-1 nos eventos celulares mediados pela
trombina (NYLANDER, 2009).
Dentre os papéis celulares da trombina, o mais bem caracterizado é a
ativação plaquetária, no qual induz a alteração da forma das plaquetas e
liberação de ADP, serotonina e tromboxano A2, bem como quimiocinas e
fatores de crescimento. Além disso, mobiliza a molécula de adesão de P-
selectina e o Ligante de CD40 para a superfície plaquetária (SLUPSKY et. al.,
1998), ativando a integrina aIIb/B3, a qual se liga ao fibrinogênio e fator de von
Willebrand (vWF) para mediar a agregação plaquetária (HUGHES, 1998). A
ativação plaquetária por outro lado, desempenha um papel importante em
promover a geração de trombina que vai dar um suporte necessário para os
fatores pró-coagulantes interagirem com a fosfatidilserina carregada
negativamente (MONROE, 2002). Ademais, estudos recentes comportam
evidências de que exista uma comunicação cruzada significativa entre a
trombina e o ADP no contexto da ativação plaquetária e atividade pró-
coagulante (JIANG, 2013), corroborando assim com o potencial trombótico,
frequentemente observado, da trombina.
A ação direta da trombina não somente sobre as plaquetas, mas
também sobre diversos tipos celulares, conceitua uma ideia ainda pouco
estudada que vai além do seu papel sobre a coagulação. A ativação de
receptores PAR pela trombina, está relacionada com a expressão de uma
variedade de moléculas fisiopatológicas, tais como, interleucinas, moléculas de
adesão, fatores de crescimento e fatores angiogênicos, como demonstrado na
figura 2 (LEVI et al, 2003; ESMON et al, 2005 e TAYLOR et al, 2006).
22 Introdução
Cunningham e colaboradores demonstraram que a deficiência de PAR-1 na
glomerulonefrite mediada por anticorpo em modelo murino, apresenta um efeito
protetor sobre o desenvolvimento da inflamação. Tais evidências corroboram
crescentes estudos de que a inflamação é um potente ativador das vias da
coagulação e que mediadores inflamatórios são capazes de aumentar vários
fatores pró-coagulantes, inibir anticoagulantes endógenos e atenuar a resposta
fibrinolítica (VAN VEEN, 2007), mostrando a estreita relação existente entre
hemostasia e inflamação de forma bidirecional, uma vez que um evento pode
desencadear o outro e vice-versa.
Fig. 2: Respostas celulares mediadas através dos receptores PAR.
Fonte: Borensztajn, 2008. Interleucina (IL), fator tecidual (TF), proteína monócitica
quimioatraente-1 (MCP-1), molécula de adesão intercelular (ICAM), molécula de adesão
vascular (VCAM) e fator de crescimento de tecido conectivo (CTGF).
Além disso, durante a inflamação mecanismos anticoagulantes são
frequentemente comprometidos, como os mediados através da antitrombina
(AT), inibidor da via do fator tecidual (TFPI) e proteína C ativada, como
mostrado na figura 3. Os níveis de AT são consideravelmente baixos durante
23 Introdução
um processo inflamatório, muito em parte pelo seu consumo e degradação pela
elastase de neutrófilos (VARY, 1992), comprometendo o mecanismo
anticoagulante, uma vez que sua ativação resulta na inibição das principais
proteases da coagulação, incluindo FXa e trombina (LIMA et al., 2011). Quanto
ao TFPI, um estudo mostrou que a administração de um TFPI recombinante
bloqueia a geração de trombina mediada durante a inflamação em humanos,
sugerindo uma importante aplicação deste inibidor na inflamação mediada pela
coagulação (DE JONGE, 2000). O prejuízo é ainda mais importante no
comprometimento do sistema da proteína C durante a inflamação. A proteína C
ativada se liga à trombina, através da trombomodulina, e a impede de se ligar à
seus receptores situados na superfície de plaquetas e células inflamatórias,
gerando uma sinalização pró-trombótica e pró-inflamatória. Além disso, estudos
mostram que a proteína C é capaz de inibir a produção de IL-6, IL-8, IL-1β e
TNF-α em cultura de macrófagos (OKAJIMA, 2001). Assim, todas essas
evidências juntas apontam que a sinalização autócrina ou parácrina mediada
por PAR pelas proteases pode indicar um mecanismo inflamatório que seja
talvez mais importante, do que a clivagem de fibrinogênio em si (CHEN, 2009).
24 Introdução
Fig. 3: Representação esquemática dos efeitos do sistema fisiológico anticoagulante
e fibrinolítico na coagulação e inflamação.
Fonte: Levi, 2004.
Ainda, durante a evolução do processo inflamatório, ocorre injúria
vascular e tecidual e por isso, frequentemente o reparo tecidual é ativado. Para
tanto, diversos sinais químicos são ativados para iniciar e manter a resposta de
reparo do tecido injuriado. Dentre essas respostas, é desencadeada a
neovascularização ou angiogênese, fenômeno no qual há a formação de novos
vasos, através de uma sequência de eventos biológicos mediados por um dado
estímulo. Inicialmente este processo se dá através da produção de fatores
angiogênicos, ativação de metaloproteinases e consequente degradação da
matriz extracelular com rearranjo da matriz, em seguida (MASOOD et al, 2001).
Este estímulo pode ser gerado a partir de condições fisiológicas, como reparo
tecidual e embriogênese, ou de estados patológicos como doenças
angioproliferativas, inflamação, trombose e o câncer (DVORAK et al, 2005).
25 Introdução
Para tanto, existem fatores angiogênicos e antiangiogênicos que juntos
desempenham um importante papel no equilíbrio neovascular.
Dentre estes estão o VEGF (fator de crescimento endotelial vascular),
FGF (fator de crescimento fibroblástico), TGF-b (fator de crescimento tumoral
beta), IFN- β (interferon beta) e TNF-α (fator de necrose tumoral alfa). O VEGF
é o principal fator angiogênico e apresenta efeito proliferativo e migratório
através da interação com um dos seus receptores, o VEGFR-2 (DISTLER et al,
2003). O FGF-1 e FGF-2 são receptores do tipo tirosina-quinase e apresentam
ação mitogênica em células endoteliais, fibroblasto e outras células, além de
aumentar a expressão de VEGF e do fator ativador de plasminogênio. No
intuito de controlar a formação vascular e impedir sua manifestação
exarcebada, existem os fatores antiangiogênicos, como angiostatina,
endostatina e a trombospondina. Todos estes fatores juntos exercem um
controle do processo de neovascularização que pode ser desregulado por
inúmeras condições patológicas e levar à proliferação exarcebada de vasos
sanguíneos como acontece no câncer e em diversas doenças inflamatórias.
É amplamente aceito que a angiogênese é o resultado de um saldo
líquido entre as atividades exercidas por reguladores positivos e negativos. Tal
equilíbrio é conceitualmente muito semelhante ao do equilíbrio anti- e pró-
inflamatório, onde há mediadores que modulam uma adequada e específica
resposta inflamatória. De modo geral, os mediadores pró-inflamatórios são
capazes de promover a angiogênese, como por exemplo, IL–1β e TNF-α, que
atuam modulando efeitos pró-angiogênicos, estimulando a proliferação de
celulas endotelias, além de estimular a síntese de VEGF (WILSON, 2002). Os
monócitos/macrófagos e linfócitos T são descritos por participar ativamente no
processo angiogênico, secretando citocinas inflamatórias que podem controlar
a proliferação das células endoteliais, sobrevivência e apoptose, bem como sua
ativação e migração. Dentre estas, IL-1β, IL-6 e TNF-α são descritas como
moduladoras da proliferação de células endoteliais in vivo e IL-1β é ainda
limitante para o processo angiogênico (LINGEN, 2001).
26 Introdução
Além disso, estudos mostraram que monócitos quando expostos a
condições de hipóxia ou a doses de trombina, tiveram um aumento na
expressão de IL-1β (NALDINI, 2001). A IL-6 é capaz de estimular a secreção
do mais importante fator pró-angiogênico, VEGF, e é encontrada em altos
níveis em tumores em processo de neovascularização (HUANG, 2004;
QUTEBA 2006). Essas evidências consolidam a ideia de que a inflamação é na
verdade um processo multi sinalizador capaz de promover a coagulação,
angiogênese e até mesmo o câncer, e por isso, complicações além da questão
imunológica são frequentemente observadas durante sua manifestação clínica.
Dentro deste contexto, a trombina é capaz de modular a expressão de
moléculas importantes que participam da resposta inflamatória como, IL-6, IL-8
e IL-1β, os quais participam da liberação de micropartículas provenientes da
parede endotelial que são fatores-chaves envolvidos tanto na inflamação como
na coagulação e angiogênese (MARKIEWICZ et al., 2013). Além disso, através
de PAR-1, a trombina hiper-regula moléculas de adesão na superfície
endotelial como, MCP-1 (proteína quimioatraente monocitária-1), PDGF (fator
de crescimento derivado de plaquetas), ICAM-1 (molécula de adesão
intercelular-1) e P-selectina, e desencadeia a produção de autacóides e
quimiocinas que por sua vez ativam neutrófilos e monócitos. Tal mecanismo
leva à ligação, rolamento e à adesão de plaquetas e leucócitos à superfície
endotelial (CHEN, 2009; SPRONK, 2014), contribuindo para o mecanismo
inflamatório agudo.
De um modo geral, esses eventos fisiopatológicos descritos acima
apresentam como interseção o fato de serem ativados pela trombina. Assim,
biomoléculas capazes de inibir esses fatores, se tornam modelos interessantes
para o tratamento da inflamação, com efeitos diretos sobre suas complicações
como a angiogênese e trombose. Neste contexto, polissacarídeos sulfatos
obtidos de fontes naturais ganham destaque, uma vez que são capazes
interagir com uma gama de proteínas envolvidas nesses eventos (DREYFUSS,
et al. 2010).
27 Introdução
Dentre estes, destacam-se os glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs),
uma classe de polissacarídeos não ramificados apresentam repetições de
unidades dissacarídicas, constituídas por um resíduo de hexosamina
(glucosamina ou galactosamina) (ERNST et al., 1995) ligado a um açúcar não
nitrogenado (ácido idurônico, ácido glucurônico ou galactose). Assim, o tipo de
hexosamina e de açúcar urônico, a quantidade e posição de grupos sulfatos e o
tipo de ligação glicosídica (α ou β) (VOLPI; MACCARI et al., 2006) permitem
distinguir os diversos tipos de GAGs: condroitim 4 e 6 sulfato (CS-4 e CS-6),
dermatam sulfato (DS), heparam sulfato (HS), heparina e queratam sulfato
(DIETRICH; NADER; STRAUS, 1983; DIETRICH et al., 1999).
A capacidade de certos glicosaminoglicanos em interferir com a
coagulação sanguínea tem sido conhecida por mais de 100 anos (MCLEAN
1916), como demonstrado pela ampla utilização de heparina como agente
antitrombótico (RODEN, 1989). Durante anos, a heparina se tornou alvo de
pesquisa por seu vasto potencial biotecnológico, em especial no câncer e na
inflamação, bem como nas suas complicações como a angiogênese. Porém,
apesar de seu potencial na recessão de tumores e como um potente anti-
inflamatório, seu exacerbado efeito anticoagulante, alcançado pela
potencialização da AT, e suas complicações hemorrágicas limitaram seu uso
clinicamente. Deste modo, nos últimos anos diversos estudos foram voltados
para explorar e caracterizar outros GAGS frente aos seus efeitos
biotecnológicos, bem como elucidar suas peculiaridades estruturais.
Além da heparina, outro GAGS que apresenta algumas peculiaridades
estruturais em comum com estes compostos, e que vem ganhando destaque
devido ao seu papel em condições fisiopatológicas, é o DS. Esse
polissacarídeo é comumemte encontrado na pele, estimando-se entre 36 a
78% do conteúdo total de GAGS presente em amostras de fluidos de feridas
(PENC et al., 1998). Também conhecido como condroitim sulfato B (CS-B), o
DS é definido pela presença de N-acetil-galactosamina (GalNAc) e, assim
como heparina e HS também apresenta ácido idurônico (IdoA), caracterizando
assim sua unidade dissacarídica (TROWBRIDGE e GALLO, 2002).
28 Introdução
Durante a síntese de um GAG, enzimas específicas são necessárias,
para a formação das unidades dissacarídicas, como as transferases e
epimerazes (MALMSTROM et al., 2012). As cadeias de GAGs são ligada à
resíduos de serina em um core proteico por uma sequência tetrassacarídica de
GlcA-Gal-Gal-Xyl. O DS é sintetizado inicialmente como um CS, onde a
transferência do resíduo de GalNAc pela GalNAc I transferase para o
oligossacarídeo inicial é o primeiro passo para a polimerização da cadeia
(SILBERT; SUGUMARAN, 2002). A adição do resíduo de GalA é realizado pela
GalA I transferase, e a epimerização deste resíduo é alcançada pela liberação
do hidrogênio em C5 pela dermatam sulfato epimerase I, convertendo-o em
IdoA, finalizando assim o processo de formação da cadeia de DS
(MALMSTROM, 1984).
Uma vez formada a cadeia, as sulfotransferases são responsáveis por
adicionar grupamentos sulfatos nos resíduos da estrutura, tornando esses
compostos heterogêneos ainda quanto à posição e ao grau de sulfatação das
unidades dissacarídicas. As modificações de sulfatação podem ocorrer na
posição 2 do ácido idurônico (IdoA-2S) e/ou nas posições 4 e/ou 6 dos
resíduos de N-acetil-galactosamina (GalNac-4,6S). Assim, diferentes
combinações destes padrões de sulfatação, podem ser encontradas em
variadas fontes de DS, como mostrado na figura 4 (TAYLOR; RUDISILL;
GALLO, 2005).
Fig.4 Estrutura típica de um Dermatam Sulfato e suas variações na sequência típica de
unidade dissacarídica.
29 Introdução
Fonte: (AKATSU et al., 2011)
Nos tecidos, os GAGs encontram-se ligados covalentemente a um core
de proteínas, formando macromoléculas complexas, denominadas
proteoglicanos (PG) (VOLPI et al., 2005). Dessa forma, o dermatam sulfato é
frequentemente encontrado na matriz extracelular dos tecidos de vertebrados e
invertebrados como proteoglicano de dermatam sulfato (DSPG), participando
em diversos processos fisiopatológicos como a inflamação e a angiogênese
(PAVÃO et al., 1995). Há evidências na literatura de que DSPG é capaz de se
ligar à fibrilas de colágeno, participando assim no arranjo da matriz, sinalização
intercelular e integridade estrutural (ELEFTERIOU, 2001), além de se ligar à
fibronectina e trombospondina (WINNEMOLLER, 1992), participando ainda da
coagulação (MAIMONE; TOLLEFSEN, 1990).
De fato, essas cadeias de DS são capazes de interagir com uma gama
de proteínas ligantes de heparina (SUGAHARA et al. 2003), tais como fatores
de crescimento fibroblástico (FGF-2 e FGF-7), fator de crescimento hepático
(HGF) (Lyon, 2002) e cofator II da heparina (HCII) (PIKE, 2005). Interações
entre FGF e GAGs tem se mostrado estar associadas à respostas
biologicamente importantes como adesão celular, migração, proliferação e
diferenciação (TUMOVA, 2000). Juntamente com FGF-2 e HGF, o VEGF é um
importante mediador angiogênico e suas propriedades de ligante de GAGs tem
sido especialmente aplicadas como novas estratégias de tratamentos em
doenças com propriedades angioproliferativas (JOUNG, 2008).
Cadeias de DSPG também são descritas por interagirem em eventos
imunológicos, sendo capazes de se ligar à citocinas pró-inflamatórias,
quimiocinas e outros fatores pró-inflamatórios como TNF-α e IFN-γ (BROOKS,
2000). Quimiocinas, incluindo IL-8 e IL-6, são sintetizadas por células
endoteliais em reposta a citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-1β e TNF-α,
ou por células sub-endoteliais como macrófagos e tal aderência é mediada por
DS/HSPG presentes nas paredes do vaso os quais se ligam à GPCR´s dos
leucócitos (PARISH, 2006; COLDITZ, 2007).
30 Introdução
Estas evidências, juntamente com o fato de que a ocorrência de
compostos tipo DS pode ser observada a partir de Echinodermata dentro da
escala evolutiva do reino animal (Fig.5) (YAMADA; SUGAHARA; ÖZBEK,
2011), sugerem que a participação desde GAG esteja envolvida com processos
biológicos importantes relacionados ao desenvolvimento animal (PAVÃO et. al.,
1996). Esta participação muitas vezes pode estar relacionada com suas
características estruturais heterogêneas, como seus diferentes padrões de
sulfatação, obtidos após uma biossíntese complexa que ocorre de maneira
específica em diferentes tecidos e órgãos, bem como temporalmente durante o
crescimento e desenvolvimento embrionário (LIU; LINHARDT; ZHANG, 2014;
OHTAKE-NIIMI et al., 2010). Porém, quando se compara a complexidade
estrutural dos GAGS com a posição evolutiva pode-se observar que os animais
de maior escala evolutiva não necessariamente produzem GAGs mais
altamente sulfatados. Tem sido demonstrado que em animais como tubarões,
peixes-bruxa, caranguejos, lulas, moluscos, pepinos do mar, ascídias e
camarões há a presença de GAGs com alto grau de sulfatação (YAMADA;
SUGAHARA; ÖZBEK, 2011).
31 Introdução
Fig.5 Distribuição dos GAGs no reino animal.
Fonte: (YAMADA; SUGAHARA; ÖZBEK, 2011)
De um modo geral, os GAGS obtidos de invertebrados apresentam
peculiaridades estruturais, entretanto a maioria dos estudos referem-se aos
heparinoides, compostos tipo heparina e/ou heparam sulfato. Compostos tipo
HS de espécies de molusco da família Anomantidae mostraram conteúdos de
dissacarídeos com N-acetil-glucosamina pouco sulfatados e glucosamina 2-N-
sulfatada (FERREIRA; MEDEIROS; DIETRICH; NADER, 1993). Do camarão
Litopenaeus vanammei, um dos mais importantes produtos da carcinicultura do
país, foi isolado e caracterizado estruturalmente um composto com
características estruturais similares à heparina, com altos níveis de
glucosamina 3-O-sulfatada (CHAVANTE, 2014).
Já para compostos tipo DS, os principais estudos em invertebrados têm
sido realizados pelo grupo de Pavão e Colaboradores (PAVÃO et al., 1995,
1998; PEREIRA; MULLOY; MOURÃO, 1999; TOVAR et al., 2005; KOZLOWSKI
et al., 2011; PAVÃO, 2014). Os resultados desses estudos revelaram que DS
de diferentes espécies de tunicados apresentam um elevado conteúdo de
dissacarídeos dissulfatados. O DS obtido do corpo de ascídia da ordem
Phlebobranchia apresentou 53% de dissacarídeos dissulfatados, constituídos
principalmente pelas unidades IdoA(2S)-GalNAc(6S) (2,6-sulfatado), enquanto
que o DS obtido da ordem Stolidobranchia contém principalmente
dissacarídeos do tipo IdoA2S-GalNAc4S (2,4-sulfatado), que representam 76%
de suas unidades dissacarídicas (KOZLOWSKI et al., 2011).
Este padrão de sulfatação para DSs parece ser uma característica
conservada ao longo do filo Chordata, uma vez que dissacarídeos do tipo 2,4-
sulfatados são comumente presentes em diferentes tecidos como tendão,
cartilagem ou pele de vários animais (CHENG; HEINEGARD; MALMSTROM;
SCHMIDTCHEN; YOSHIDA; FRANSSON, 1994). E uma vez que uma das
habilidades de ascídias é a rápida regeneração vascular, a presença de DS,
juntamente com o fato de que em vertebrados este GAG está intimamente
32 Introdução
relacionado com processos de reparo tecidual, sugerem uma preservação
evolutiva do mesmo (PAVÃO, 1998).
Deste modo, tais evidencias estimularam o estudo dos potenciais
biotecnológicos do DS ao longo dos anos. A atividade antitrombótica do
dermatam sulfato foi demonstrada inicialmente, há 30 anos atrás, através do
modelo de estase sanguínea na veia jugular de coelho (FERNANDEZ et al.
1986). Apesar da atividade anticoagulante do DS ser relativamente baixa
quando comparado à heparina, sua atividade antitrombótica se apresenta
bastante significativa, com efeitos hemorrágicos reduzidos (PAVÃO, 2002);
DESNOYERS, 1989). Várias evidências apontam que a atividade
antitrombótica do DS parece estar principalmente relacionada com sua
capacidade de inibir a trombina, mediada pelo cofator II da heparina (HCII). O
HCII é uma serino-protease inibidora do plasma humano (serpina), homóloga à
antitrombina III (AT), que inibe especificamente a trombina. A especificidade
intrínseca de HCII pode ser uma vantagem, uma vez que sua deficiência não
parece aumentar o risco para trombose, porém ao mesmo tempo, seus níveis
no plasma previnem a trombose arterial (TOLLEFSEN, 2002; TAKAMORI,
2004). A interação do HCII com a trombina é aumentada cerca de 1000 vezes
na presença do DS ou heparina, formando um complexo ternário estável entre
a esta serpina e a protease (LIAW, 2001).
Diferentemente da heparina que se liga tanto à AT-III quanto ao HCII
para mediar sua atividade anticoagulante, o DS é capaz de inibir a trombina
exclusivamente através do HCII (PAVÃO, 2014), e por isso, tem-se relacionado
sua potente atividade antitrombótica à inibição da trombina via HCII. Uma alta
interação do DS com o HCII parece estar relacionada com motivos estruturais
específicos presentes nas cadeias de DS, como a presença de sulfatação no
C2 do IdoA e no C4 de GalNAc (MAIMONE E TOLLEFSEN, 1990), o que por
sua vez, pode refletir sua atividade antitrombótica. Um DS apresentando
dissacarídeos 2,4-sulfato obtido de P. nigra se mostrou eficaz em inibir a
trombina via HCII, ao passo que o DS do tipo 2,6-sulfato obtido de S. plicata
apresentou baixa atividade HCII (KOZLOWSKI et al., 2011). Porém, em um
estudo comparativo, estes dois DSs distintos estruturalmente obtidos de
ascídia, apresentaram significativo potencial antitrombótico, mesmo quando um
33 Introdução
destes polissacarídeos mostrava baixa atividade via HCII, porém habilidade de
inibir P-selectina, responsável por facilitar a interação entre plaquetas,
leucócitos e células endoteliais (KOZLOWSKI; PAVAO; BORSIG, 2011). Esta
evidência sugere outro mecanismo efetor antitrombótico, além da já descrita
relação de atividade via HCII e poder modulador da trombose para o DS.
Além disso, o conteúdo de IdoA em DSs sugere uma importância frente
à efeitos biológicos, uma vez que estudos sugeriram que as atividades de
inibição tumoral, trombótica e mesmo inflamatória estejam relacionadas com o
montante de IdoA na estrutura de DSs de fontes naturais distintas
(KOZLOWSKI; PAVAO; BORSIG, 2011). Estas interações sugerem que o DS
tenha uma participação na inibição da coagulação, além de promover a
estabilidade da matriz extracelular e reduzir a inflamação e angiogênese
(TROWBRIDGE AND GALLO 2002; SUGAHARA ET AL. 2003).
Deste modo, fontes alternativas de DS, sejam de origem sintética ou
natural, tem se tornado objeto de pesquisa. Apesar do estudo de DS obtidos de
diferentes espécies de invertebrados tenha sido ampliado nas últimas décadas,
ainda há poucos trabalhos que relatam a ocorrência de DS em fontes naturais,
bem como sua elucidação quanto aos seus potenciais biotecnológicos
(PAVÃO, 1995; MOURÃO 1998; CESARETTI et al. 2004; LUPPI et al. 2005;
VOLPI E MACCARI 2005, 2007). Em nosso laboratório, fomos capaz de isolar
um heparinoide (BRITO, et. al., 2008), bem como um GAG tipo condroitim
sulfato; (CAVALCANTE, 2015) do cefalotórax do camarão Litopenaeus
vanammei. Porém, pela primeira vez foi obtido um composto tipo DS, nunca
antes descrito em crustáceos (PALHARES, 2013). O L. vanammei é a principal
espécie da carcinicultura brasileira, uma atividade com grande relevância
econômica da região Nordeste, devido às suas condições ideais de cultivo
(QUAGLIA, 1993). O cafalotórax, conhecido popularmente como cabeça,
corresponde à aproximadamente 40% do peso total do camarão e, uma vez
que os camarões são descabeçados para exportação, durante a etapa de
processamento são geradas grandes quantidades de resíduos orgânicos
(GILDBERG; STENBERG, 2001). Esse lixo orgânico por sua vez, é enterrados
ou despejado em rios frequentemente, levando à graves problemas ambientais.
34 Introdução
Por isso, foi despertado o interesse em avaliar os potenciais anti-
inflamatório, antitrombótico e antiangiogênico, além de caracterizar a atividade
anticoagulante de um dermatam sulfato (DS), isolado do camarão branco do
Pacífico Litopenaeus vannamei.
34 Objetivos
OBJETIVO
OBJETIVO GERAL:
Caracterizar estruturalmente o composto tipo DS obtido do cefalotórax do
camarão Litopenaeus vannamei e avaliar seus potenciais anti-inflamatório,
antitrombótico e antiangiogênico bem como verificar sua interferência na
hemostasia.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Purificar os compostos tipo DS a partir do cefalotórax do camarão L.
vannamei;
Determinar a composição dissacarídica do composto tipo DS;
Verificar a atividade anticoagulante dos composto tipo DS;
Avaliar a atividade hemorrágica residual dos composto tipo DS;
Analisar o efeito antitrombótico in vivo do composto tipo DS;
Investigar o potencial anti-inflamatório do composto tipo DS
Avaliar o potencial antiangiogênico in vitro do composto tipo DS.
35 Materiais e métodos
MATERIAIS E MÉTODOS
1. Animais e cultura de células
Células endoteliais de aorta de Coelho (RAEC) foram cultivadas em
meio de cultura F12 (Invitrogen, San Diego,CA, USA), contendo 10% de soro
fetal bovino (Cultilab, Campinas, SP, Brazil) e 20 mM de bicarbonato de sódio.
Todas as culturas foram realizadas em placas de cultura (BD Falcon, San Jose,
CA, USA). Ratos machos da linhagem Wistar (entre 8 e 10 semanas de idade,
180-300 g) foram utilizados nos experimentos de hemorragia, enquanto que os
camundongos da linhagem C57BL/6 foram utilizados para os ensaios de
inflamação em modelo peritonite, ambos provenientes do biotério do
Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(UFRN). Todos os animais foram mantidos com livre acesso à água e
alimentos, em condições controladas de iluminação (ciclo de 12 horas
claro/escuro) e temperatura (25ºC). Os experimentos realizados com esses
animais foram previamente aprovados pela Comissão de Ética em Pesquisa da
mesma universidade (Protocolo Nº 044/2010).
2. Extração de glicosaminoglicanos e purificação dos compostos tipo DS
do camarão L. Vannamei.
O processo de extração de GAGs do camarão foi realizado de acordo
com a metodologia descrita por Brito et al. (2008). Brevemente, o material
biológico (8,2 Kg de cefalotórax do camarão) foi triturado e delipidado com
acetona. A massa obtida após o processo de delipidação foi seca e triturada
para formação de um pó, o qual foi homogeneizado com NaCl 1,0M e
submetido à proteólise por 24 horas, a 60°C. Em seguida, a mistura foi filtrada
e a suspensão obtida foi complexada com resina de troca-iônica (Lewatit), a
qual foi eluída com NaCl 3,0M, obtendo-se um pool de GAGs que foi
denominado de Fração 3,0M (F-3,0M). A partir dessa fração, foi realizado
fracionamento com acetona, adicionando volumes crescentes (0,5V; 0,8V;
36 Materiais e métodos
1,0V; 2,0V). Em seguida, o composto tipo DS foi purificado através da
cromatografia de troca-iônica em DEAE-Sephacel, eluída com NaCl nas
molaridades de 0,5, 0,8 e 1,0 M. Os eluatos foram analisados quanto a
presença de GAGs através da dosagem de ácido urônico por meio do ensaio
de Carbazol (Dische, 1947). O composto eluído com 1,0 M de NaCl foi
dessalado através de coluna de gel-filtração G-25, eluído com etanol 10%.
Após liofilização o composto purificado, DSL (40 mg) foi submetido à análises.
3. Eletroforese
O composto purificado foi avaliado por eletroferese em gel de agarose
(0,6%) em tampão Diaminopropano (PDA) 0,05 M, pH 9,0. O gel foi submetido
a 100 V em cuba refrigerada a 4°C utilizando-se como indicador de corrida o
vermelho de cresol. Após a corrida, o gel foi fixado com CETAVLON (0,1%) por
no mínimo 2 horas, seco sob corrente de ar quente e corado com azul de
toluidina 0,1%, em ácido acético 0,1% e etanol 50%. Depois de retirado o
excesso com solução descorante, o gel foi seco a temperatura ambiente.
4. Despolimerização enzimática
A digestão enzimática foi realizada como previamente descrito (LIMA,
HUGHES, et al., 2013). 100µg do composto tipo DS isolado do camarão foi
incubado com uma mistura de liases (heparinase, condroitinase AC e ABC de
Flavobaterium heparinum, liases que degradam compostos tipo
heparina/heparam sulfato, condroitim sulfato e dermatam sulfato,
respectivamente) tem um modo de a ( (2,5 mIU cada) e os dissacarídeos
produzidos foram submetidos à uma cromatografia de alta performance (HPLC)
do tipo 150×4,6 mm Phenosphere SAX (Phenomenex, Torrance, CA, EUA)
utilizando um gradiente de 0 à 1M de NaCl, durante 30 minutos com fluxo de
1mL/min e a detecção foi feita através de leitura de absorbância de UV à 232
nm.
37 Materiais e métodos
5. Determinação do peso molecular
O peso molecular do composto tipo DS foi determinado através do GPC-
HPLC em coluna BioSep SECTM S-2000 LC (Phenomenex, Torrance, CA,
USA) utilizando eluição isocrática (Fase móvel de Na2SO4 0,3 M) em taxa de
fluxo de 1mL/min e detectado em UV a 205 nm. A coluna foi previamente
calibrada com polissacarídeos de pesos moleculares conhecidos (1.7, 4, 10,16
e 20 kDa).
6. Atividade anticoagulante
O ensaio do tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa) foi realizado
de acordo com as instruções do Kit APTTest (LABTEST). Heparina não-
fracionada, DS de mamíferos e o composto obtido do camarão foram diluídos
em solução salina para as concentrações apropriadas (gerando um volume de
10μL) e incubados com 90μL de plasma a 37°C. Após 3 minutos, 100 µL de
cefalina foram adicionadas e a mistura foi incubada a 37°C por 3 minutos.
Depois da incubação, 100 µL de cloreto de cálcio pré-aquecido foram
adicionados e o tempo de coagulação foi medido no coagulômetro Quick Timer
(Drake Eletrônica Comércio Ltda., São Paulo) em segundos. Todos os ensaios
de TTPa foram realizados em duplicata.
7. Inibição da trombina (fator IIa)
O ensaio anti-IIa foi realizado em microplaca de 96 poços de acordo com
as instruções do kit Actichrome Heparin (Anti-FIIa) assay (Sekisui Diagnostics,
ref: 820). 50 μL de trombina foram incubadas a 37°C por 2 min na presença de
concentrações crescentes do composto do camarão, DS de mamífero e
Heparina não-fracionada, diluídos previamente em plasma humano citratado
fresco e novamente diluídos em AT. 50 μL de Fator IIa (trombina) bovino
purificado foram adicionados a cada poço, homogeneizados e incubados a
37°C por exatos 2 min. Em seguida, 50 μL do substrato cromogênico para FIIa
38 Materiais e métodos
foram adicionados, homegeneizados e incubados a 37°C por exatos 2 min.
Após incubação, 50 μL de ácido acético a 30% foram adicionados para
interromper a reação e a absorbância foi mensurada a 405 nm.
8. Inibição da trombina pelo cofator II da heparina (HCII)
O teste de inibição da trombina mediada pelo HCII na presença dos
GAGs foi realizado em microplaca de 96 poços com volume final de 100 µL de
acordo com Pavão, 1995. A concentração final dos reagentes incluídos foram:
70 nM cofator II da heparina (Sigma-Alderich, St Louis, MO, USA), 15 nM de
trombina (Seikisui Diagnostics, Stamford, CT), e 0–100 µg/ml do DS do
camarão, DS de mamíferos ou Heparina em 25 µl de 0.02 M Tris/HCl, 0.15 M
NaCl (pH 7.4) (TS/PEG). Em seguida, foi adicionado 25 µL de trombina e
incubados por 1 min a 37º C. Posteriormente, foi adicionado 25 µL do substrato
cromogênico N-benzoyl-Phe-Val-Arg-p-nitroamilidahydrochloride (100 mM) e a
mistura foi incubada por mais 1 min a 37°C. Após a incubação foi adicionado
25 µL de ácido acético a 30% para parar a reação. A absorbância foi lida a 405
nm. O branco da amostra foi feito utilizando os mesmos reagentes.
9. Efeito residual hemorrágico
O efeito residual hemorrágico dos compostos foi avaliado utilizado o
modelo de cauda escarificada (DIETRICH, 1967). Após anestesia com
quetamina e xilasina na proporção de 1:1 (v/v), uma leve escarificação na
cauda dos ratos foi provocada com auxílio de um bisturi. Posteriormente, a
cauda escarificada foi mergulhada verticalmente em um tubo com 2 mL de
solução salina e foi observado o processo de sangramento durante cinco
minutos. Em seguida, a cauda foi retirada da solução e submetida a um
esfregaço com uma gaze e mergulhada em uma nova solução salina. Após
cinco minutos o processo é repetido mais uma vez. Ao fim dos três estímulos
mecânicos a cauda foi mergulhada em solução salina contendo heparina não-
fracionada ou o composto isolado do camarão, em concentração de 100 e
39 Materiais e métodos
500µg/mL. Passados dois minutos a cauda foi retirada e lavada
abundantemente com solução salina e em seguida mergulhada. Foram
utilizados um total de 6 ratos por grupo e os resultados foram expressos como
a soma dos valores de proteína de cada tubo menos a quantidade de proteína
presente antes da exposição aos compostos.
10. Atividade antitrombótica em modelo de trombose arterial induzida por
FeCl3
50 µL de DSL (1 mg/kg-1) ou PBS foram injetados intravenosamente pela
veia caudal de 3 ratos Winstar para cada grupo, 10 minutos depois da indução
da trombose. Os ratos foram colados em posição de supino e a artéria carótida
comum (ACC) foi exposta. A trombose foi induzida sobrepondo um papel filtro
tipo Whatman saturado com 10% de FeCl3 sobre a ACC. Após 3 minutos, o
papel embebido em FeCl3 foi removido e a ACC foi irrigada com PBS
constantemente. O fluxo sanguíneo passou então a ser monitorado com um
probe de ultrassom (Transonic System, Ithaca, NY, USA) até completa oclusão
do vaso. (Kurz, 1990).
11. Ensaio de peritonite induzida por LPS
Camundongos da linhagem C57bl/6 foram injetados com 100 µL de
Lipopolissacarídeo (LPS) da cepa 055:B5 cepa (3,3 mg/Kg/animal) na cavidade
peritoneal. Após 5 minutos, foram injetados intravenosamente PBS, DS de
mamíferos ou DSL (1,5 mg/kg-1) 5. Decorridas 4h, os camundongos foram
eutanasiados e a cavidade peritoneal foi lavada com 2 mL de PBS contendo
0.5% soro de albumina bovina e 1 mM EDTA, afim de recuperar as células
presentes naquele espaço. Foram utilizados um total de 7 camundongos por
grupo. O Número total de celulas do lavado peritoneal foi contado em
hemocitômetro. A contagem diferencial dos leucócitos polimorfonucleares foi
determinado em preparações de cytospin, fixadas com eosina e hematoxilina.
40 Materiais e métodos
12. Dosagem de citocinas pro-inflamatórias
Os lavados peritoneal de cada grupo tratado foi coletado após 4 horas
da indução da inflamação com LPS e armazenados à -80ºC. Os níveis de
interleucina 1-β (IL-1β), interleucina 6 (IL-6) e fator de necrose tumoral-α (TNF-
α) foram mensurados utilizando kit de ensaio imunoenzimático (ELISA)
(eBioscience) de acordo com as instruções do fabricante. Cada amostra foi
calculada em triplicata e a densidade ótica de cada poço (ensaio realizado em
placa de 96 poços inserida no kit) foi determinada a 450 nm. Os resultados
obtidos foram submetidos à análise estatística.
13. Ensaio de formação capilar em membrana basal reconstituída
(matrigel)
Matrigel purificado a partir de cauda de rato foi descongelado a 4°C e
plaqueado em placa de 24 poços e mantido a 37°C por 16h para polimerização.
RAEC (105 células) foram adicionadas no matrigel em meio de cultura F12,
contento 10% de soro fetal bovino (Invitrogen, San Diego,CA, USA), na
ausência ou presença de diferentes concentrações de heparina não-fracionada
ou do composto do camarão, e incubadas à 37°C e 5% CO2 por 24h. Cada
dose foi realizada em triplicata. A formação tubular foi examinada em
microscópio inverso a 100x de aumento. Quatro imagens foram
randomicamente capturadas em difrentes áreas. As estruturas capilares
formadas no matrigel foram quantificadas e analisadas utilizando o software de
imagem Image J (NIH, Bethesda, MD, USA).
13. Análise estatística
Os dados foram apresentados quanto à sua significância e desvio
padrão para os números indicados de experimentos e avaliados por ANOVA
(Two-way e/ou One-way) e Tukey test para comparação das significâncias.
Foram considerados significativos estatisticamente os valores de P < 0,05.
41 Resultados
RESULTADOS
1. Purificação do composto tipo DS a partir do camarão L. vannamei
Os GAGs isolados do cefalotórax do camarão após proteólise e
complexação com resina de troca-iônica foram eluídos com NaCl 3,0M para
obtenção de um extrato bruto de polissacarídeos que foi denominado de fração
F-3,0M. Após o tratamento da F-3,0M com proporções crescentes de acetona,
obtiveram-se quatro populações polissacarídicas, as frações F-0,5A, F-0,8A, F-
1,2A e F-2,0A (Tabela 1). A F1,0A foi escolhida para posterior purificação, uma
vez que do cefalotórax do camarão Litopenaeus vanammei já foram isolados
um heparinoides da fração 0,5A (BRITO, et. al., 2008), bem como um GAG tipo
condroitim sulfato e um composto híbrido de hep/HS da fração 0,8A (BRITO, et.
al., 2014; CAVALCANTE, 2015). Além disso, a F-2,0A apresentou baixo
rendimento e não pôde ser utilizada.
A análise dessas frações por eletroforese em gel de agarose, no
sistema PDA, revela que todas apresentam uma banda com perfil de migração
semelhante à heparina/heparam sulfato (Hep/HS), indicando a presença de
heparinoides. Além da presença destes análogos de Hep/HS, as frações F-
1,0A e F-2,0A também apresentam compostos com um perfil de migração
semelhante a dermatam sulfato (DS) (Dados não mostrados).
Cabeças
(Kg)
Pó cetônico
(g) F-3,0M (g)
Frações Obtidas por
Tratamento com Acetona (mg)
F-0,5A F-0,8A F-1,2A
16,0 1.520,0 2,0353 85,0*
(13,38%)
358,0*
(56,35%)
192,3*
(30,27%)
Tabela 1: Rendimento das frações obtidas a partir da F-3,0M, após fracionamento com
acetona. *Os valores entre parênteses representam o rendimento percentual em relação ao total das
massas obtidas no fracionamento com acetona.
42 Resultados
Em um trabalho anterior, um estudo comparativo realizado previamente
(PALHARES, 2013) para separar os GAGs da fração F-1,0A, com diferentes
tipos de resina, foi estudado qual sistema de cromatografia de troca-iônica
apresentava maior eficácia na purificação dos compostos provenientes da F-
1,0A. E após análise, constatou-se que a eluição com NaCl em cromatografia
de troca-iônica DEAE-Sephacel foi a mais eficiente em separar os compostos e
assim, obter o composto em estudo. Durante o estudo, dosagem de urônico de
cada subfração foi realizada para quantificar os GAGs presentes em cada
subfração, sendo observado que a subfração eluída com NaCl 0,8M
representou 68,18% de rendimento, porém a subfração F1,0 (eluída com NaCl
1,0M) desta mesma cromatografia, foi a única que apresentou uma banda
eletroforética isolada (Fig. 6), caracterizando uma população de GAGs
aparentemente pura. O perfil de migração eletroforética entre HS e DS
apresentado pela subfração F1,0, despertou o nosso interesse em elucidar sua
composição dissacarídica e estudar alguns potencias desse GAG. Portanto, a
fração foi liofilizada e seu sal removido por meio de cromatografia de gel
filtração (Sephadex G-25) e submetido as análises subsequentes.
Fig. 6 Perfil eletroforético em sistema PDA dos compostos do camarão obtidos da F-1,0A por cromatografia de troca-iônica, em DEAE-Sephacel. Posteriormente os compostos foram dessalinizados em coluna de gel-filtração G-25 Sephadex. P- padrão contendo 5 µg de condroitim sulfato 4/6 (CS), dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS).
43 Resultados
2. Degradação enzimática
A composição dissacarídica do composto do camarão foi determinada
por despolimerização enzimática com uma mistura de liases (Heparinase e
condroitinase ABC). Quando submetido à heparinase o composto não sofreu
degradação, porém quando submetido à liase condroitinase ABC o composto
foi totalmente degradado à dissacarídeos. Uma vez que a condroitinase ABC
digere cadeias de GAGs do tipo DS, em sitio aleatórios, a natureza tipo
dermatam sulfato do composto foi revelada. Assim, a partir deste momento o
composto isolado do camarão passou a ser denominado DSL (DS-like). Os
produtos predominantes são dissacarídeos, que foram em seguida, analisados
em cromatografia de troca-iônica de alta performance (HPLC). A ação de
condroitinase ABC no DSL produziu apenas como produto dissacarídico o α-
ΔUA(2SO4)-1→3-GalNAc(4SO4).
Fig.7 A análise por cromatografia de troca aniônica HPLC dos dissacarídeos formados após digestão do DS de camarão pela condroitinase ABC. O padrão de dissacarídeo ΔUA(2SO4)-1→3-GalNAc(4SO4) (A) e do dissacarídeo formado pela ação exaustiva da condroitinase ABC sobre o dermatam sulfato de L. vanammei (B), foram aplicados a uma coluna 150x4.6 mm Phenosphere – SAX, ligado a um sistema de HPLC . A coluna foi eluída com um gradiente de NaCl tal como descrito sob "condições experimentais". O eluente foi monitorado por absorbância de UV a 232 nm.
44 Resultados
3. Atividade anticoagulante
A atividade anticoagulante do DSL foi investigada através do ensaio de
tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa), que avalia a via intrínseca da
cascata de coagulação. A heparina comercial é capaz de prolongar o tempo de
coagulação em mais de 240s ainda numa baixa concentração de 5 μg/mL,
enquanto que o mesmo efeito só ocorre na concentração de 30 μg/mL para o
composto do camarão (Fig. 8). Já o DS de mamíferos necessitou de uma
concentração de 50 μg/mL para mostrar um discreto aumento no tempo de
coagulação, sendo este praticamente irrelevante.
0.0 0.2 0.4 0.60
40
80
120
160
200
240Heparina
DS
DSL
Concentração (mg/mL)
Te
mp
o (
s)
Fig. 8 Atividade anticoagulante do composto do camarão, mensurados através do Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa). O tratamento tópico foi feito com DSL (▲); DS de
mamíferos (■) e heparina (●).
4. Atividade anti-IIa direta e mediada pelo cofator II da heparina (HCII)
Afim de investigar o mecanismo anticoagulante apresentado pelo DSL,
foram realizados os ensaios de inibição direta e via HCII sobre a trombina.
Tanto de forma direta, quanto indireta (via HCII) o DSL foi capaz de inibir a
trombina significativamente. A figura 9 mostra que o DSL perante o fator IIa, foi
capaz de atingir 80% no ponto de 1,0 μg/mL estabilizando sua atividade anti-
45 Resultados
IIa. Já através do HCII o DSL foi capaz de inibir cerca de 90% da atividade da
trombina em 100 μg/ml de concentração, enquanto DS de mamífero tem uma
CI50 para a inibição de trombina de 3,0 μg/mL.
A B
0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 1000
20
40
60
80
100
DS
DSL
Heparina
Concentração (g/mL)
Inib
ição
via
CH
II (
%)
0 1 2 3 4 50
50
100
150
Concentração (g/mL)
Inib
ição
da T
rom
bin
a (
%)
Fig. 9 Atividade anti-IIa direta (A) e mediada pelo Cofator II da heparina (B) mensurados utilizando substrato cromogênico como referido em métodos. Composto do camarão, DSL
(▲); DS de mamíferos (■) e heparina (●).
5. Atividade hemorrágica
Uma vez que o uso da heparina não-fracionada é capaz de levar a
disturbios na hemostasia, levando a eventos hemorrágicos, foi investigado o
efeito residual hemorrágico do DSL. Na concentração de 100μg/mL, foi
possível visualizar o potente efeito hemorrágico da heparina que apresenta
aproximadamente, o dobro da atividade hemorrágica do DS de mamíferos.
Diferentemente, o composto DSL, apresentou um insignificante potencial
hemorrágico, com praticamente ausência de atividade hemorrágica. Mesmo em
uma concentração 5 vezes maior (500 μg/mL), o DSL não mostrou mudança
significativa em seu efeito sobre o sangramento residual, quando comparado à
seu efeito na menor concentração (100 μg/mL), exibindo ainda menor atividade
que o DS de mamífero na concentração de 100μg/mL.
46 Resultados
0 10 20 30 40
0
1
2
3
4
5Heparina
Dermatam sulfato
DSL
DSL (500mg/mL)
Tempo (min)
Co
nc
en
tra
çã
o d
e p
rote
ína
(A
bs
)
Fig. 10 Atividade hemorrágica foi avaliada pelo tempo de sangramento. O tratamento foi feito pela administração tópica de solução salina contendo Heparina (100 µg/mL) (●); Dermatam Sulfato (100 µg/mL) (■); DSL (100 µg/mL) (▲); ou DSL (500 µg/mL) (▲). A potência de sangramento foi mensurada após 2 min seguida de lavagem com solução salina.
6. Ensaio de peritonite aguda induzida por LPS
Há inúmeras evidências de que a trombina é capaz de promover a
inflamação através da indução da expressão de citocinas pró-inflamatórias, e
moléculas de adesão, por ativação dos receptores PAR-1 e PAR-2
(BORENSZTAJN, 2008; LEVI et. al., 2003; ESMON et. al., 2005 E TAYLOR et.
al., 2006). Por isso, foi avaliada a eficiência do DSL em inibir o recrutamento de
leucócitos em modelo de peritonite induzida por LPS em camundongos. A
análise de leucócitos presentes na lavagem peritoneal mostrou um aumento de
cerca de três vezes no número de leucócitos totais nos camundongos tratados
com LPS em comparação com os controles (Fig. 11A). Dentro da contagem
diferencial, tanto o DSL quanto o DS de mamíferos foram eficazes em reduzir
significativamente o recrutamento de leucócitos, principalmente de PMNs,
chegando à aproximadamente 47% e 51% de inibição para o DSL e DS de
mamíferos, respectivamente (Fig. 11B).
47 Resultados
PBS c
ontrole
PBS
DS
DSL
0
2
4
6
*** ******
Nú
me
ro d
e c
élu
las d
o
lav
ad
o p
eri
ton
eal (x
10
6)
A B
PBS c
ontrole
PBS
DS
DSL
0
10
20
30
***
*** ***
PM
N n
o l
av
ad
o p
eri
ton
ea
l (%
)
LPS + LPS +
Fig.11 Recrutamento de células polimorfonucleares (PMN), em modelo de inflamação de peritonite induzida por LPS, é inibido pelo Dermatam sulfato de camarão (DSL). Os
camundongos foram injetados intraperitonealmente com 100 μL de LPS, 5 min antes da
injeção intravenosa de solução salina tamponada com fosfato (PBS), DSL ou DS de mamíferos (1,5 mg/kg-1). Após 4h, a lavado peritoneal foi avaliada quanto ao número total de células (A) e o percentual de PMN (B). PMNs foram identificados por coloração com hematoxilina e eosina.
A significância estatística foi determinada por ANOVA one-way ( *** P < 0,001 ). Barra: 20 μM.
7. Dosagem de citocinas
O lavado peritoneal dos animais utilizados no ensaio de peritonite foi, em
seguida, submetido à dosagem de citocinas pró-inflamatórias IL-1β, IL-6 e TNF-
α. Nos animais tratados com o DSL os níveis de IL-1β foram cerca de 60%
menor quando comparado aos animais controle (sem tratamento), enquanto
que para o TNF-α a inibição chegou à aproximadamente 74%. Para os níveis
de IL-6, o DSL mostrou-se eficaz em inibir em cerca de 40%, quando
comparado aos animais não-tratados. Para o DS de mamíferos foi observado
potencial de inibição das citocinas semelhante ao DSL.
48 Resultados
IL-1 IL
-6
TNF-
0.0
0.2
0.4
0.6PBS
DS
DSL
* *** ***
***
**Cit
ocin
as
(p
g/m
L)
Fig.12 Produção de IL-1β, IL-6 e TNF-α estimuladas por LPS em camundongos C57BL/6, após tratamento com DSL, DS de mamíferos ou sem tratamento (PBS), 4h após indução da inflamação. Os resultados representam as médias dos níveis de citocinas (pg/mL), bem como os desvios padrões entre os animais de cada grupo. *, ** e ***P-valores representam os
resultados de análise estatística (ANOVA Two-way).
8. Atividade antitrombótica por modelo de trombose arterial induzida por
FeCl3
Afim de determinar os efeitos do DSL sobre a trombose, foi realizado o
modelo de lesão induzida por FeCl3 na artéria carótida, onde o FeCl3 é capaz
de promover a formação de coágulos devido ao seu potencial de induzir a
formação de radicais livres pelas células endoteliais. Quando comparado com o
controle positivo (animais tratados com PBS), o tratamento com o DSL
provocou um aumento significante do tempo de oclusão do vaso, chegando a
prolongar em mais da metade o tempo de obstrução do vaso, e em alguns
casos foi observada apenas uma oclusão parcial do vaso, demonstrando um
potente efeito antitombótico.
49 Resultados
0 20 40 60 80
DSL
PBS
Tempo de oclusão (min)
Fig.13 Composto tipo Dermatam sulfato (DSL) reduz a trombose arterial induzida por FeCl3. Ratos foram injetados intravenosamente com PBS ou DSL (1,5mg/kg/por animal) e 5 min após, a formação dos trombos foi induzida por deposição de um papel de filtro embebido com 10% de FeCl3 na artéria carótida comum (ACC). Fluxo sanguíneo vascular foi monitorado com uma sonda de ultrassom até que a oclusão da ACC. O tempo de oclusão foi mostrado.
9. Ensaio de formação capilar de células endoteliais em matrigel
As células endoteliais são capazes de se organizar em redes
conectadas 2-D e formar capilares, nos estágios finais da angiogênese
(DREYFUSS et al., 2010). Deste modo, foi investigado se o DSL era capaz de
inibir a formação de capilares a partir de células endoteliais de coelho (RAEC),
em diferentes concentrações. A figura 14 mostra que em todas as doses
testadas, o DSL foi capaz de inibir a formação capilar, quando comparado ao
controle positivo (PBS), mostrando-se capaz de diminuir o número de
estruturas capilares, em todas as concentrações testadas, demostrando seu
potente efeito inibitório na formação de novos vasos de forma dose-
depentende, chegando a inibir 100% da formação capilar na maior
concentração testada (100 µg/mL).
50 Resultados
Fig. 14 Formação de estruturas capilares em matrigel após tratamento com diferentes doses do composto do camarão ou na dose de 100 μg/mL da heparina. A formação tubular foi examinada sob microscópio de luz invertida em objetiva de 100x (A). O número de estruturas capilares foi determinado através do softwere para análise de imagens (Image J). Meio de cultura F12 foi utilizado como controle positivo. P-valores representam os resultados
de análise estatística (ANOVA One-way).
51 Discussão
DISCUSSÃO
Dados da literatura revelam que a sinalização celular mediada pela
trombina, através de PAR, é capaz de estimular a produção de uma variedade
de moléculas biologicamente importantes tais como interleucinas, moléculas de
adesão, fatores de crescimento e fatores angiogênicos (LEVI et al, 2003;
ESMON et al, 2005, TAYLOR et al, 2006, ANGIOLILLO, 2010), que por sua vez
estão relacionadas com patologias como a inflamação e suas complicações
como a trombose e a angiogênese. Assim, estas evidências reforçam a ideia
de que a sinalização através das proteases de coagulação, como a trombina,
tem uma contribuição importante na resposta inflamatória (COUGHLIN, 2000),
e por isso, a identificação de novos alvos terapêuticos que possam atuar na
modulação simultânea destes eventos podem apresentar mais êxito do que
uma terapia alvo-específica (LEVI, 2009).
Neste trabalho, é relatado o efeito anti-inflamatório, antiangiogênico e
antitrombótico de um composto do tipo DS, obtido do camarão Litopenaeus
vannamei, com reduzido efeito hemorrágico. Em um trabalho prévio, o
composto foi isolado e apresentou características de migração eletroforética
com uma única banda metacromática migrando entre HS e DS (PALHARES,
2013). Apesar da semelhança de comportamento eletroforético com outros
heparinoides obtidos de crustáceos (DIETRICH et al., 1999; CHAVANTE et al.,
2000; VOLPI, 1993), esse GAG se mostrou resistente ao tratamento com liases
que degradam especificamente heparina e/ou heparam sulfato. Por outro lado,
o tratamento com a condroitinase ABC (liase que digere DS), liberou uma única
população dissacarídica, indicando que o composto obtido do camarão tratava-
se de um GAG tipo DS (DSL). Estas enzimas quebram a ligação glicosídica β
(1→4) entre os resíduos de N-acetilgalactosamina (4-sulfatada ou 6-sulfatada)
e ácido idurônico (sulfatado ou não na posição C-2) da molécula, liberando
principalmente dissacarídeos insaturados N-acetilado,4-sulfatado (UA-
GalNAc(4SO4) e/ou N-acetilado,6-sulfatado (UA-GalNAc(6SO4) (LINHARDT
et. al., 1986; TROWBRIDGE; GALLO, 2002)). A condroitinase ABC de
52 Discussão
Flavobaterium heparinum tem um modo de ação distinto das demais, liberando
dissacarídeos insaturados a partir do terminal redutor das moléculas.
No intuito de caracterizar a composição dissacarídica do DS de
camarão, o mesmo foi submetido à análise dos dissacarídeos predominantes
em cromatografia de alta performance (HPLC) e assim, apresentou como
produto principal o dissacarídeo dissulfatado α-ΔUA(2SO4)-1→3-
GalNAc(4SO4). Composição dissacarídica semelhante foi observada em um
DS obtido da ascídia Styela plicata (PAVÃO, 1998), que contem 70% de
unidades tipo α-ΔUA(2SO4)-1→3-GalNAc(4SO4) e o restante sendo composto
por dissacarídeos tipo α-ΔUA(2SO4)-1→3-GalNAc(6SO4) e α-ΔUA(SO4)-1→3-
GalNAc(4,6SO4). Comparado ao DS de mamíferos, que é constituído
principalmente por dissacarídeos monossulfatados tipo α-ΔUA-1→3-
GalNAc(4SO4), esses resultados sugerem um padrão peculiar de sulfatação
nas unidades dissacarídicas de DS de invertebrados marinhos, o que poderia
estar relacionado à sua evolução. Em ascídias, por exemplo, a estrutura do DS
varia entre gêneros diferentes, predominando dissacarídeos tipo α-ΔUA(2SO4)-
1→3-GalNAc(4SO4) para o DS obtido de Styela plicata (ordem
Stolidobranchia), ao contrário daquele obtido para ascídia Phallusia nigra
(ordem Phlebobranchia), cuja GalNAc apresenta predominantemente
sulfatação em C6 (α-ΔUA(2SO4)-1→3-GalNAc(6SO4)) (KOZLOWSKI, 2011).
Nesse trabalho, o autor também sugere que o aumento da atividade anti-
IIa via HCII, apresentado pelo DS de ascídia, esteja relacionado à ocorrência
do padrão de sulfatação do dissacarídeo α-ΔUA(SO4)-1→3-GalNAc(4SO4)
(KOZLOWSKI, 2011). Esses resultados corroboram com o fato de que
octassacarídeos e hexassacarídeos de DS, com regiões de sulfatação em C2
do IdoA e em C4 de GalNAc, ligam-se ao HCII com alta afinidade (MAIMONE e
TOLLEFSEN, 1990), reforçando a ideia de que a presença de 4-O-sulfatação
nos resíduos de N-acetil-β-D-galactosamina seja essencial para a atividade
anticoagulante do DS de mamíferos (MAIMONE e TOLLEFSEN, 1990; PAVÃO,
1998).
Apesar dessas evidências, o DS de camarão que também exibe um alto
conteúdo de N-acetilgalactosamina,4-O-sulfatada, inibiu cerca de 68% da
53 Discussão
atividade da trombina, via HCII, na concentração de 0,01ug/mL, ao contrário do
DS de mamífero que na mesma concentração atinge 90% de inibição.
Considerando que as cadeias do DSL são menores (12KDa) do que aquelas do
DS de mamífero (60KDa), supõe-se que essa diferença possa estar associada
ao tamanho necessário para que as cadeias de GAG se liguem ao HCII,
relação esta que já foi descrita por diversos autores (STUBBS, 1993). Há
também evidências na literatura de que esse cofator inibe de forma seletiva a
trombina através da formação de um complexo bimolecular de 1:1 e que requer
que a interação do GAG seja capaz de facilitar a exposição dos sítios de
ligação à trombina (O'KEEFFE, 2004). Por outro lado, o DSL (1,0 μg/mL) foi
capaz de atingir cerca de 80% de inibição direta sobre a trombina, atividade
que não é exibida pelos DS de mamíferos, mesmo numa concentração 4 vezes
superior.
Esses resultados indicam que o DSL tem vantagens potenciais sobre o
DS de mamíferos, pois além de inibir a trombina via HCII, é um inibidor direto
dessa protease e possivelmente seja capaz de impedir sua ligação com o
substrato. Essas evidências, somadas ao fato de que poucos DS descritos na
literatura (AKIYAMA, NOBUKO e YOSHIDA, 1982; MASCELLANI et. al., 1993;
MAAROUFI et. al., 2006; MONSOUR et.al., 2009) apresentam os dois
mecanismos de inibição da trombina, tornam o DSL capaz de produzir uma
resposta anticoagulante mais previsível do que muitos DSs.
Dentro desse contexto, também é importante destacar que o fato do DS
de ascídia apresentar unidades dissacarídicas dissulfatadas (2,4 sulfatado)
semelhante ao DSL, sem possuir potencial de inibição diretamente sobre a
trombina, sugere que outros requerimentos estruturais, além de uma sequência
dissulfatada específica sejam importantes na atividade anti-IIa.
No ensaio de TTPa, o DS do camarão apresentou atividade
anticoagulante significativamente maior do que a de DS de mamíferos, o qual
mostrou atividade quase insignificante. Porém, apesar de ser sugerido que a
presença de 4-O-sulfatação nos resíduos de N-acetil-β-D-galactosamina seja
essencial para a atividade anticoagulante do DS (MAIMONE e TOLLEFSEN,
1990; PAVÃO, 1998), quando comparado à heparina comercial, o composto do
54 Discussão
camarão necessitou de doses 6 vezes maiores para prolongar o tempo de
coagulação em mais de 240 s. O desempenho anticoagulante do DSL pode
ainda estar relacionado com outros fatores além do grau de sulfatação do
GAG, como diferenças de glicosilação da protease ligante de GAG
(HUNTINGTON, 2003) ou a conformação adquirida durante a interação GAG-
proteína e exposição de sítio ativo (AL DIERI, 2003; KAMP, 2001). Além disso,
ao contrário da heparina e seus miméticos que são capazes de se ligar não
somente ao HCII e trombina, mas também à AT e assim inibir proteases, em
especial os fatores Xa e IIa, a atividade anticoagulante de moléculas de DS é
exibida apenas através da inibição da trombina via interação com o HCII,
tornando-o uma molécula seletiva na coagulação (MAIMONE e TOLLEFSEN,
1990). Assim, esta especificidade de interação do DSL juntamente com o fato
de que a AT está presente no plasma numa concentração cerca de 2 vezes
maior que o HCII (MACINTOSH, JAKUBOWSKI e OWEN, 1984), favorecendo
a ação da heparina, sugerem uma justificativa para a menor atividade
anticoagulante comparada do DSL.
Além do papel da trombina na cascata da coagulação, sua habilidade
em agir como um dos mais potentes ativadores plaquetários, bem como
ativador de um dos principais reguladores da trombose, o inibidor fibrinolítico
ativado por trombina (TFPI) (RUSSELL et.al., 2003), corrobora seu potencial
pró-trombótico. Deste modo, moléculas capazes de atuar inibindo a trombina,
podem mostrar efeitos sobre a trombose. Por isso, foi realizado um ensaio de
trombose induzida por FeCl3 em modelo de lesão da artéria carótida, onde
observou-se que o DSL foi capaz de duplicar o tempo de oclusão do vaso
quando comparado ao grupo controle não tratado. Tal potencial antitrombótico
do DS do camarão parece estar coerente com sua potente atividade inibitória
da trombina, visto o papel desta protease na fisiopatologia da trombose.
Porém, apesar de a relação da atividade anti-IIa via HCII por DS ser descrita
como essencial para a atividade antitrombótica do mesmo (PAVÃO, 1998),
Kozlowski e colaboradores relataram um DS (2,6-sulfatado) obtido de ascídia
com baixa atividade via HCII, porém capaz de inibir P-selectinas, modulando
assim, o efeito trombótico. Esta evidência, levou os autores a sugerir outro
mecanismo para atividade antitrombótica de DSs, além da inibição via HCII da
55 Discussão
trombina, mas possivelmente também através da diminuição do acúmulo de
plaquetas no vaso mediado pelas P-selectinas.
Durante a trombose, devido ao constante estímulo vascular, pode-se
haver complicações levando ao surgimento de outras patologias. Existe uma
estreita relação entre trombose e inflamação e essa comunicação está
baseada na capacidade da trombina em induzir a expressão de uma ordem de
citocinas pró-inflamatórias (como IL-6 e IL8), quimiocinas (tais como MCP-1) e
moléculas de adesão celular, promovendo recrutamento de monócitos para o
vaso (LEVI et. al., 2004). Além disso, a ativação plaquetária pela trombina,
estimula a expressão de P-selectinas que são responsáveis por aderir as
plaquetas aos leucócitos e células endoteliais, além de estimular a expressão
de fator tecidual por monócitos, promovendo um ciclo de geração de trombina
(SHEBUSKI, 2002).
Por esta razão, foi testada a capacidade do DSL em modular o processo
inflamatório em modelo de peritonite aguda induzida por Lipopolissacarídeo
(LPS). Tanto o DS do camarão quanto o de mamíferos se mostraram eficientes
em reduzir, em mais da metade, o recrutamento leucocitário para o sítio de
injúria, em especial a população de leucócitos do tipo polimorfonucleares,
primeiros tipos celulares a migrarem em um processo inflamatório agudo, como
os neutrófilos (HALLETT; LLOYDS, 1995). Comportamento anti-migratório
semelhante foi observado para dois DSs obtidos de ascídias, que assim como
o DSL, apresentam em sua constituição dissacarídica unidades contendo 2-O
sulfatação do IdoA, diferindo entre eles apenas no padrão de sulfatação do
resíduo de GalNAc (4-O e 6-O sulfatados) (KOZLOWSKI; PAVÃO; BORSIG,
2011). Apesar destes dois DSs de ascídias serem capazes de se ligar a P- e L-
selectinas e inibir o recrutamento leucocitário, quando comparados ao DS do
camarão necessitam de uma dose cerca de três vezes maior (1,5 mg/kg-1 de
DSL versus 4,0 mg/kg-1 de DSs de ascídias) para promover um efeito anti-
migratório similar ao exibido pelo DSL, sugerindo que outras peculiaridades
estruturais estejam ainda relacionados à este efeito, e por isso estudos mais
aprofundados necessitam ser realizados.
56 Discussão
Além disso, sabe-se que diversos GAGs, incluindo DS presentes em
cadeias de PGs, são capazes de se ligar a citocinas e fatores de crescimento e
assim mediar respostas inflamatórias e progressão tumoral, respectivamente
(MULLOY, 2005). As citocinas têm sido descritas como alvos clínicos mais
utilizados para o diagnóstico e tratamento de doenças com caráter inflamatório
e imunológico. Dentre as diversas citocinas relacionadas com a resposta pró-
inflamatória (IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, IL-17, IFN-γ e TNF-α) as IL-1β, IL-6, e
TNF-α são as mais frequentemente descritas e avaliadas na resposta
inflamatória aguda, estando seus níveis relacionado com a gravidade da
inflamação (ZHANG; JIANXIONG, 2007). Por isso, o lavado peritoneal foi
submetido à dosagem destas citocinas pró-inflamatórias. Nesse estudo, foi
demonstrado que a administração do DS do camarão reduziu
significativamente os níveis de todas as citocinas testadas, sendo o maior
potencial de inibição observado para o TNF- α. O DS de mamíferos apresentou
potencial de inibição das citocinas semelhante ao DSL. Estes dados sugerem
um mecanismo importante pelo qual os compostos desempenhem seu efeito
anti-inflamatório em diversos pontos da inflamação, uma vez que as citocinas
atuam em várias etapas do processo inflamatório. Esta modulação pode ser
mediada pelos DSs tanto através do potente efeito inibitório sobre a trombina, a
qual é capaz de estimular citocinas, ou ainda por uma possível interação direta
com estes mediadores inflamatórios, ocasionado sua inibição.
Esta primeira ideia é reforçada por dados na literatura que descrevem o
papel inflamatório da trombina. A ligação da trombina à PAR-1 é capaz de
induzir a produção de diversas citocinas e fatores de crescimento e, juntamente
com o complexo FT-VIIa ativando PAR-2, é capaz de promover a expressão de
TNF-α, IL-1β e IL-6, além de hiperregular a infiltração neutrofílica e a resposta
inflamatória por macrófagos (CUNNINGHAM, 1999). A segunda hipótese, seria
que o composto do camarão possa estar funcionado com um inibidor
competitivo, impedindo assim que a citocina exerça seu papel biológico.
Possivelmente, o caráter polianiônico do DSL associado as suas peculiaridades
estruturais facilitem uma interação direta com as citocinas, o que poderia
impedir que estes mediadores se liguem aos seus respectivos receptores e
exerçam sua função pró-inflamatória. Dados da literatura revelam que há uma
57 Discussão
ordem de preferência na qual as citocinas se ligam aos diferentes GAGs:
heparina > DS > HS = CS (PROUDFOOT, 2001) e tem sido descrito que isto
pode estar relacionado à flexibilidade dos resíduos de IdoA presentes na
molécula. Um estudo comparativo sobre o efeito de DS e CS na interação com
as citocinas mostraram valores de IC50 bastante distintos (22 versus 1200
µg/mL, respectivamente) (KUSCHERT, 1999), corroborando o potencial de
modulação apresentado aqui. O papel das citocinas sobre o processo
inflamatório é crucial para o sucesso deste evento e assim, estes dados
sugerem pela primeira vez um mecanismo de ação de modulação da
inflamação por DS, além da interação com P-selectinas já descrito
(KOZLOWSKI, 2011).
Além destas características inflamatórias avaliadas no ensaio de
peritonite, foi observado que os animais em experimento pertencente ao grupo
tratado com os compostos tipo DS, não apresentaram piloereção, sinal clínico
característico da febre, enquanto os animais sem tratamento, mostraram-se
estáticos e com piloereção visível. As reações frequentemente observadas em
doenças inflamatórias como a febre são moduladas por citocinas, dentre estas
as interleucinas IL-1β e IL-6, as quais atuam como mediadores pirogênicos,
promovendo a febre durante patologias agudas e crônicas (ISHIHARA;
HIRANO, 2002; MASTERS et al., 2010), no intuito de eliminar o agente
agressor. Deste modo, o papel inibitório exibido pelo DSL sobre estas citocinas
especificamente, pode ainda sugerir um desempenho antipirético, atenuando
uma das mais recorrentes manifestações clínicas da inflamação, a febre.
Porém, outros experimentos precisam ser realizados para elucidar tal resposta.
Ainda durante a inflamação diversos mecanismos de resposta ao trauma
e/ou infecção executam um papel crucial, tais como a coagulação e fibrinólise,
ativação do sistema complemento e diferenciação de células T, além da
proliferação endotelial e angiogênese no reparo tecidual, entre outros (ESMON,
2003). Por conseguinte, o DS do camarão foi avaliado quanto ao seu efeito
sobre a angiogênese e mostrou potente capacidade inibitória na formação
capilar quando comparado ao controle positivo. Tal efeito foi dose dependente,
mostrando atividade antiangiogênica em todas as doses testadas, chegando a
uma total inibição na formação vascular na maior dose. O ensaio de
58 Discussão
toxicicidade avaliado por MTT (dados não mostrados), mostrou que nestas
concentrações o DS do camarão foi incapaz de apresentar efeito citotóxico
sobre as células endoteliais. No ensaio de MTT, a redução do tetrazólio em
cristal de formazam através das enzimas mitocondriais é possível apenas em
células viáveis. Assim, pode-se inferir que os compostos não apresentam o
potencial antiangiogênico, por inibir a viabilidade celular e que outros
mecanismos de inibição estariam envolvidos.
Apesar de se mostrar como um resultado preliminar, uma vez que se
trata de um único teste in vitro, o ensaio em matrigel pode sugerir que a
potente inibição da trombina mediada pelo DS do camarão, constitui um fator
positivo para a inibição da neovascularização. Esta protease é capaz de
modular mecanismos diretamente relacionados com a angiogênese, tais como:
a proliferação de células endoteliais, a ativação do principal fator pró-
angiogênico (VEGF), expressão dos receptores intimamente relacionados com
o estímulo angiogênico (KDR e flt-1) (MARAGOUDAKIS; TSOPANOGLOU;
ANDRIOPOULOU, 2002), bem como ativação plaquetária, a qual resulta na
liberação de grânulos que contêm fatores pró-angiogênicos (ITALIANO et al.,
2008). Não obstante, a trombina atua ainda estimulando a produção de
citocinas como, IL-1, IL-6, IL-8 e TNF-α, além de metaloproteinases de matriz
(MMPs) (DREYFUSS et al., 2010), as quais participam ativamente do processo
de remodelagem tecidual durante a angiogênese. Estas afirmações,
corroboram com os dados aqui demonstrados, uma vez que o DSL foi capaz de
inibir a produção tanto de IL-6, IL-1β, bem como de TNF-α, o que pode
contribuir para o expressivo efeito antiangiogênico do composto.
Outro mecanismo sugerido de atuação antiangiogênica para o DSL é
que este composto seja capaz de interagir diretamente com fatores
angiogênicos e/ou seus receptores, inibindo os efeitos mitogênicos
normalmente exercidos por esta interação, ao competir pela ligação dos fatores
aos seus respetivos receptores e promovendo assim seu efeito pró-
angiogênico. Outro GAG obtido do camarão L. vannamei, um heparinoide com
características estruturais peculiares, também mostrou potente efeito
antiangiogênico, através da interação com os fatores FGF-2, EGF e VEGF
(DREYFUSS et al., 2010), mediadores importantes do processo angiogênico.
59 Discussão
Apesar da correlação entre o potencial antiangiogênico e insignificante
conteúdo de grupos 2-O-sulfato descrita na literatura (COHEN et. al, 1995), o
potente efeito sobre a neovascularização mostrado pelo DS isolado da mesma
espécie, sugere que o conteúdo ou a posição de grupamentos sulfato, não seja
uma condição ditatória para este potencial biológico.
Além de todos os potenciais aqui reportados, o DSL do camarão
mostrou reduzido potencial de sangramento, quando comparado à heparina
padrão e até mesmo ao DS de mamíferos. O DSL chegou a apresentar
praticamente ausência de sangramento e mesmo em uma dose 5 vezes maior,
manteve o efeito hemorrágico menor do que o apresentado pelo DS de
mamíferos na concentração de 100μg/mL. A forte ligação da heparina a
receptores que foram expostos durante uma ferida, resulta em incontrolável
hemorragia, implicando uma limitação para os diversos e potentes atividades
biotecnológicas descritas para a heparina, inclusive a anti-inflamatória. Tem
sido descrito que este efeito está relacionado com a presença de sulfatação no
C6 dos resíduos de glucosamina (DIETRICH, 1979). Deste modo, a baixa
atividade hemorrágica apresentada pelos DSL é um indicativo de que esse
composto não se liga com o mesmo grau de afinidade aos referidos receptores.
A grande heterogeneidade estrutural dos GAGs podem afetar suas
afinidades de se ligarem a proteínas, fazendo assim, com que estas moléculas
possam promover efeitos biológicos e por sua vez, exibir potenciais
biotecnológicos. Por isso, novas pesquisas a cerca destes polissacarídeos
sulfatados, em especial aqueles com pouca elucidação sobre distribuição,
estrutura e interação biológica, se fazem imprescindíveis. Os resultados aqui
mostrados, sugerem que este DS isolado do camarão apresente propriedades
biológicas que favorecem seu uso como potentes candidatos no tratamento da
inflamação, bem como suas complicações como a trombose e angiogênese,
sem apresentar complicações hemorrágicas. Além disso, a composição
estrutural peculiar do composto tipo DS nunca antes descrito na literatura para
crustáceos, aponta esta molécula como um notável alvo biotecnológico com
perspectivas de aplicações a serem exploradas.
60 Conclusão
CONCLUSÃO
Com base nos dados obtidos neste trabalho, podemos concluir que:
O dermatam sulfato isolado do camarão L. vanammei é constituído
principalmente por dissacarídeos dissulfatados (2,4-sulfatado), estrutura
peculiar identificada pela primeira vez em crustáceos.
A atividade anticoagulante do DSL é mediada pela inibição da trombina,
principalmente via HCII.
O potencial do DSL em inibir a migração leucocitária pode estar
diretamente associada à sua capacidade de inibir a trombina e
consequentemente reduzir os níveis de algumas citocinas pró-
inflamatórias.
Experimentos in vivo mostram que o DSL apresenta atividade
antitrombótica.
O composto tipo DS inibe o processo de angiogênese in vitro.
O DSL exibe um reduzido efeito hemorrágico.
Esta molécula pode ser um alvo biotecnológico interessante para o
estudo de moduladores de processos fisiopatológicos nos quais a
trombina está envolvida como trombose, inflamação e angiogênese.
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