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Primeira página:
Universidade de Lisboa
Faculdade de Ciências
Departamento de Biologia Vegetal
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter
pylori
Andreia Durão Timóteo
Dissertação de Mestrado
Mestrado em Biologia Molecular e Genética
2013
Universidade de Lisboa
Faculdade de Ciências
Departamento de Biologia Vegetal
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter
pylori
Andreia Durão Timóteo
Dissertação de Mestrado
Mestrado em Biologia Molecular e Genética
Orientador Interno: Professor Mário Santos
Orientadora Externa: Professora Filipa Vale
2013
Citações
“A ciência é a inteligência do mundo; a arte, o seu coração"
Máximo Gorky
"Toda a ciência começa como filosofia e termina em arte"
Will Durant
"O conhecimento torna a alma jovem e diminui a amargura da velhice. Colhe, pois, a
sabedoria"
Leonardo Da Vinci
Dedicatória
Gostaria de dedicar este trabalho à minha família e ao meu namorado, que sempre me
apoiaram e acompanharam ao longo destes 2 anos de mestrado. Sem a vossa ajuda e
apoio teria sido muito mais difícil esta fase da minha vida.
Agradecimentos
Para a elaboração deste estudo contei com a disponibilidade, apoio e
colaboração de várias pessoas e Instituições. Para elas vai o meu reconhecimento e
agradecimento.
Quero começar por agradecer à minha orientadora externa Professora Filipa
Vale pela sua constante disponibilidade, pela sua extrema simpatia, pelos seus sábios
conselhos e orientações técnicas e científicas durante a realização desta tese.
Ao Professor Mário Santos pela simpatia e disponibilidade para ajudar que
sempre me demonstrou.
À Professora Filomena Caeiro, coordenadora do 1º ano do Mestrado por toda a
ajuda e por me ter apresentado este tema de que tanto gosto.
Sem as estirpes de Helicobacter pylori não teria sido possível realizar este
estudo. Assim, quero agradecer à Doutora Mónica Oleastro por me ter recebido no
Laboratório Nacional das Infecções Gastrointestinais do Departamento de Doenças
Infecciosas do Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge e pelas estirpes que me
disponibilizou. A partir desta fabulosa colecção de estirpes portuguesas, foi possível
reunir estirpes isoladas de doentes com diferentes patologias. Agradeço igualmente a
todos os outros colaboradores desta unidade pela ajuda prestada. Aos Doutores
Francis Mégraud e Philippe Lehours da Université Bordeaux Segalen (França) pelo
envio de uma colecção de estirpes de origem e patologias diversas e pela ajuda
prestada. Quero agradecer ao Dr. Tsachi Tsadok Perets (Head of Gastroenterology
Laboratory of Rabin Medical Center – Beilinson Hospital of Israel) pelo envio de
estirpes de origem asiática.
Agradeço à Stabvida o financiamento da minha inscrição no European
Helicobacter Study Group: XXVth International Workshop on Helicobacter and Related
Bacteria In Chronic Digestive Inflammation and Gastric Cancer (Eslovénia). Neste
congresso a apresentação intitulada “Screening of. Prophage Sequences Among
Helicobacter pylori Isolates”, obteve o prémio de Melhor Apresentação Oral, para a
Professora Filipa Vale pela apresentação de parte dos resultados da minha tese.
Agradeço à Comissão Organizadora e à Comissão Científica do XIV Congresso
Técnico de Anatomia Patológica o prémio, que me atribuiu, de melhor Comunicação
Oral pelo trabalho intitulado “Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de
Fagos de Helicobacter pylori.
Agradeço à Fundação para a Ciência e Tecnologia o financiamento deste
projecto (PTDC/EBB-EBI/119860/2010).
Desta tese resultou a publicação do artigo “Comparison of induction of B45
Helicobacter pylori prophage by acid and UV radiation” em Agosto de 2013 no volume
19 (suplemento S4) da revista Microscopy and Microanalysis no qual parte dos
resultados da dissertação foram incluídos.
Ao meu namorado, Rui Lopes, por todo o apoio que me deu, pela revisão da
tese e, principalmente, pela ajuda que me deu nas tabelas em Microsoft Excel que
utilizei ao longo do estudo, e apoio em formatações variadas.
Aos meus pais e irmão por serem os melhores do mundo, por sempre me
apoiarem, por estarem sempre presentes e disponíveis.
Aos meus avós que estão sempre presentes quando necessito.
Aos meus amigos com quem não tenho estado ultimamente, mas que me
apoiam incondicionalmente.
A todos o meu muito obrigado.
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo i
Resumo
A bactéria Helicobacter pylori infecta o estômago de aproximadamente metade da
população humana estando associada ao desenvolvimento de patologias como gastrite,
úlcera péptica e adenocarcinoma gástrico. Como principal terapêutica são utilizados dois
antibióticos e um inibidor da bomba de protões. No entanto, a terapêutica com antibióticos é
ineficaz em aproximadamente 20 a 30% dos pacientes, devido principalmente à resistência
aos antibióticos, tornando necessário o desenvolvimento de novas terapêuticas. A
terapêutica fágica consiste na utilização de bacteriófagos ou proteínas fágicas líticas para
provocar a lise celular, sendo um processo alternativo a fim de evitar a resistência aos
antibióticos.
Para explorar a terapia fágica contra H. pylori é essencial a identificação e
caracterização dos (pro)fagos desta espécie. Assim, este estudo tem como objectivos a
pesquisa por PCR do gene da integrase de fagos de H. pylori de forma a compreender a
prevalência de profagos nesta espécie e determinar a distribuição geográfica e/ou a
patologia associada a estirpes integrase positivas. Em estirpes positivas para o gene que
codifica a integrase foram pesquisados outros genes profágicos, primase e regulador de
transcrição (região do fim do fago).
Em 866 estirpes isoladas de doentes com origem e patologias diversas foi feita a
amplificação por PCR e sequenciação do gene da integrase de fagos de H. pylori. Às
estirpes positivas para o gene da integrase foi feita, também amplificação por PCR e
sequenciação do gene da primase e região do fim do fago. Para as sequências de DNA de
cada gene analisado fez-se a análise filogenética.
A pesquisa por PCR do gene da integrase do fago, mostrou uma prevalência de
19,3%. A análise filogenética da integrase demonstrou haverem clusters de estirpes de
acordo com a região geográfica, não ocorrendo, a mesma situação em relação às
patologias. Os resultados reforçam a abundância de sequências de profagos em H. pylori.
Palavras-chave
Helicobacter pylori, bacteriófagos
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo ii
Abstract
Helicobacter pylori is a bacterium that colonizes the human gastric mucosa. This
infection affects approximately half of the human population. H. pylori is associated with
several diseases, such as gastritis, peptic ulcer and gastric cancer. The therapy against H.
pylori is based on the administration of two antibiotics and a proton pump inhibitor. However,
antibiotic therapy fails in about 20% to 30% of the patients, mainly due to antibiotic
resistance making urgent the development of new therapeutic approaches. Phage therapy
uses bacteriophages or lytic proteins encoded by phages to cause cell lysis and may
become a new therapeutic approach against H. pylori.
To explore phage therapy against H. pylori the identification and characterization of this
(pro)phages is crucial. This study aim is to investigate the presence of the integrase
prophage gene and its association with disease and geographic diversity. In positive strains
for the integrase gene, it is investigated the presence of other prophage genes, the primase
gene and end of the phage.
In 866 strains isolated from patients from several geographic origin and presenting
diverse diseases a PCR strategy recurring to degenerated primers to screen H. pylori
prophages was used. A phylogenetic analysis of each DNA sequences was done.
PCR results show a prevalence of 19,3% positive strains for the integrase gene. The
phylogenetic analysis revealed clusters according to geographic region, but not according to
pathology. The results reinforce that the presence of prophage sequences in H. pylori is high.
Keywords
Helicobacter pylori, bacteriophages
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo iii
Abreviaturas
CDS – Coding DNA sequence
DNA - Deoxyribonucleic Acid
FCUL – Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa
FEUCP – Faculdade de Engenharia da Universidade Católica Portuguesa
g – gramas
mA – Miliamperes
MALT – Tecido Linfóide Associado a Mucosa
MHA - Mueller-Hinton Agar
mM - Milimolar
PCR – Polymerase Chain Reaction
RPM – Rotações Por Minuto
TSB - Tryptic Soy Broth
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo iv
Índice geral
Resumo i
Abstract ii
Abreviaturas iii
Índice Geral iv
Índice de Figuras v
Índice de Tabelas vi
Índice de Anexos vii
1 INTRODUÇÃO 1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2
2.1 HELICOBACTER PYLORI 2
2.1.1 Descrição de Helicobacter pylori 2
2.1.2 História 2
2.1.3 Variabilidade Genética e Evolução 3
2.1.4 Doenças associadas a H. pylori 4
2.1.5 Tratamento 4
2.2 BACTERIÓFAGOS 5
2.2.1 Descrição Morfológica 5
2.2.2 História 5
2.2.3 Mecanismos de Replicação 7
2.2.4 Morfogénese dos Bacteriófagos 8
2.2.5 Utilização de Bacteriófagos vs Utilização de Antibióticos 8
2.2.6 (Pro)fagos de Helicobacter pylori 9
3 MATERIAIS E MÉTODOS 10
3.1 ESTIRPES DE HELICOBACTER PYLORI 10
3.1.1 Extracção de DNA genómico 10
3.1.2 Pesquisa por PCR do Gene da Integrase de Fagos de H. pylori 11
3.1.2.1 Reacção de PCR 11
3.1.2.2 Electroforese em gel de agarose a 2% 13
3.1.3 Purificação e quantificação da reacção de PCR para sequenciação 13
3.1.4 Pesquisa por PCR do Gene da Primase e Fim do Fago de Fagos de H.
pylori 14
3.1.4.1 Reacção de PCR 15
3.1.5 Análise Filogenética das Sequências de H. pylori 15
3.1.6 Análise Estatistica das Sequências de H. pylori 15
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo v
4 RESULTADOS 16
4.1 PREVALÊNCIA DE PROFAGOS EM HELICOBACTER PYLORI 16
4.1.1 Integrase 16
4.1.2 Primase 17
4.1.3 Fim do fago 18
4.2 ANÁLISE FILOGENÉTICA DAS SEQUÊNCIAS DE H. PYLORI 19
4.2.1 Teste do Qui-quadrado e teste de Fisher 19
4.2.1.1 Associação estatística entre a patologia e a presença do gene da
integrase 19
4.2.1.2 Associação estatística entre a patologia e a presença do gene da
primase 20
4.2.1.3 Associação estatística entre a patologia e a presença do fim do
fago 20
4.2.1.4 Associação estatística entre a origem da estirpe e a presença do
gene da integrase 21
4.2.1.5 Associação estatística entre a origem da estirpe e a presença do
gene da primase 21
4.2.1.6 Associação estatística entre a origem da estirpe e a presença do
fim do fago 21
4.3 ANÁLISE FILOGENÉTICA DE PROFAGOS EM HELICOBACTER PYLORI 22
4.3.1 Análise Filogenética do Gene da Integrase 22
4.3.2 Análise Filogenética do Gene da Primase 23
4.3.3 Análise Filogenética do Gene da Região do Fim do fago 25
5 DISCUSSÃO E CONCLUSÃO 26
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 29
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo vi
Índice de Figuras
Fig.1 Ciclo Lítico e Lisogénico de Bacteriófagos. 7
Fig. 2 Organização genómica dos fagos de H. pylori. 9
Fig. 3 Alinhamento de genomas profágicos. # Gene da Integrase, Gene Primase
e ¥ Fim do Fago (adaptado de Lehours 2011). 11
Fig. 4 A) 1: Marcador 1kb DNA ladder NEB, 2: controlo positivo estirpe B45, 3:
estirpe B35, 4: estirpe negativa para o gene da integrase, 5: estirpe negativa
para o gene da integrase, 6: estirpe B44, 7: Controlo negativo (sem DNA).
Estirpes 3 e 6 positivas para o gene da integrase. B) 1: Marcador 100 bp DNA
ladder NEB, 2: controlo positivo estirpe B45, 3: estirpe negativa para o
gene da primase, 4: estirpe B101, positiva para o gene da primase e 5:
controlo negativo (sem DNA). C) 1: Marcador 1kb DNA ladder NEB, 2:
controlo positivo estirpe B45, 3: estirpe negativa para a região do fim do
fago, 4: estirpe C166, positiva para a região do fim do fago e 5: controlo
negativo (sem DNA). 14
Fig. 5 Árvore filogenética do gene da integrase (1000 réplicas) neighbor-joing
method, kimura two-parameter model31. Estirpes isoladas de pacientes com
diferentes patologias: C - Adenocarcinoma, G - Gastrite, M - Linfoma MALT
e U - Úlcera Péptica. 23
Fig. 6 Árvore filogenética do gene da primase (1000 réplicas), neighbor-joing
method, kimura two-parameter model. Estirpes isoladas de pacientes com
diferentes patologias: C – Adenocarcinoma, G- Gastrite, M – Linfoma MALT
e U- Úlcera Péptica. 24
Fig.7 Árvore filogenética da região do Fim do Fago (1000 réplicas), neighbor-joing
method, kimura two-parameter model. Estirpes isoladas de pacientes com
diferentes patologias: C – Adenocarcinoma, G- Gastrite, M – Linfoma MALT
e U- Úlcera Péptica. 25
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo vii
Índice de Tabelas
Tabela 1 Sequências dos primers degenerados integrase, primase e fim do fago
utilizados no estudo. 12
Tabela 2 Contagem de estirpes positivas para o gene da integrase de acordo com a
patologia. 16
Tabela 3 Contagem de estirpes positivas para o gene da integrase de acordo com a
localização geográfica. 17
Tabela 4 Contagem de estirpes positivas para o gene da primase de acordo com a
patologia. 17
Tabela 5 Contagem de estirpes positivas para o gene da primase de acordo com a
localização geográfica. 18
Tabela 6 Contagem de estirpes positivas para o gene do fim do fago de acordo com a
patologia. 18
Tabela 7 Contagem de estirpes positivas para o gene do fim do fago de acordo com a
localização geográfica. 19
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo viii
Índice de Anexos
Tabela 1 Contagens totais das estirpes estudadas de Helicobacter pylori. 33
Tabela 2 Contagem estatística entre patologia/origem e positividade para os genes
fágicos. 34
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo 1
1- Introdução
A bactéria Helicobacter pylori infecta o estômago de aproximadamente metade da
população humana e está associada ao desenvolvimento de gastrite, úlcera péptica,
adenocarcinoma gástrico e linfoma MALT (Tecido Linfóide Associado a Mucosa)
gástricos30. Como principal terapêutica são utilizados dois antibióticos e uma bomba
inibidora de protões39. No entanto, a terapêutica com antibióticos é ineficaz em
aproximadamente 20 a 30% dos pacientes, devido principalmente à resistência aos
antibióticos, o que preocupa a comunidade médica e torna necessário o desenvolvimento
de novos agentes terapêuticos41, 52.
A terapêutica fágica consiste na utilização de bacteriófagos ou proteínas fágicas
líticas (lisinas) para provocar a lise celular, sendo um processo alternativo a fim de evitar a
resistência aos antibióticos8. Os bacteriófagos de H. pylori têm sido descritos de forma
muito breve na literatura24, 44. Profagos remanescentes foram descritos na estirpe francesa
B38 isolada de um paciente com linfoma MALT49, na estirpe japonesa F16 proveniente de
paciente que apresentava gastrite28, nas estirpes Gambia 94/24 (Número de acesso
CP002332), H. pylori Shi112 (Número de acesso CP003474.1) e da estirpe proveniente da
Malásia UM037 (Número de acesso NC_021217.1).
Na estirpe B45 de H. pylori foi encontrado um profago completo34, bem como na
estirpe 1961P37, Cuz20 (Número de acesso CP002076) e Índia 7 (Número de acesso
CP002331). Foram também identificados genomas dos fagos KHP30 e KHP4051. A
utilização de indutores de fagos52 demonstrou que o profago B45 ainda pode ser induzido.
Neste sentido os objectivos desta dissertação são continuar o screening por PCR do
gene da integrase (utilizando isolados obtidos a partir de doentes com patologias diferentes
e de origens geográficas distintas), de forma a compreender a prevalência de profagos em
H. pylori e determinar a distribuição geográfica e/ou a patologia associada a estirpes
integrase positivas. Fazer, também, o screening por PCR de outros genes fágicos, primase
e fim do fago.
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo 2
2- Revisão de Literatura
2.1 - Helicobacter pylori
2.1.1 - Descrição de Helicobacter pylori
H. pylori é uma bactéria Gram-negativa de formato espiralado com 2 a 4 µm de
comprimento e 0,5 a 1 µ de largura. É uma bactéria que apresenta mobilidade por flagelos
(2 a 6) unipolares com 3µm de comprimento. Os flagelos são responsáveis pela morfologia
curvilínea da bactéria e pelo movimento polar, características que auxiliam a sua penetração
na camada de mucinas. Os mutantes de H. pylori sem flagelos não conseguem colonizar a
mucosa gástrica17. Em condições adversas apresenta forma cocóide, o formato cocóide
refere-se a bactéria morta ou forma metabolicamente activa da bactéria mas que não é
possível de cultivar in vitro, dependendo dos autores16.
Esta é uma bactéria pertencente à ordem Campylobacterales, família
Helicobacteraceae e género Helicobacter. Possui um crescimento óptimo com 2 a 5% de O2
e 5 a 10% CO2 em ambiente húmido. O crescimento óptimo ocorre a 37ºC. Apesar de poder
estar exposta brevemente a pH ácidos o seu pH óptimo é pH neutro32.
H. pylori tem como reservatório estômago humano mas também já foi isolado do
estômago de primatas, no entanto, outras espécies de Helicobacter já foram isoladas a partir
de outros animais32.
As vias de transmissão ainda não são totalmente conhecidas, sendo proposto
transmissão oral-oral, gastro-oral e fecal oral2, 32. A transmissão pode ser vertical, sendo
transmitida dos progenitores para os filhos ou através do contacto próximo entre pessoas,
ou horizontal pela ingestão de água ou comida contaminada, bem como através do contacto
com outras pessoas. A transmissão vertical é predominante em áreas mais urbanas como
acontece nos países desenvolvidos e a transmissão horizontal está associada a zonas mais
rurais como nos países em desenvolvimento53.
2.1.2 - História
Durante vários anos o estômago foi considerado um ambiente demasiado agressivo
para ser colonizado por bactérias apesar já terem sido encontrados organismos espiralados
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo 3
neste ambiente nos finais do século XIX. Entre 1979 e 1984 Robin Warren e Barry Marshall
conseguiram cultivar H. pylori e posteriormente demonstrar pela coloração de Gram que
esta era uma bactéria Gram-negativa. A primeira descrição de H. pylori em associação a
gastrite e úlcera péptica foi feita em 1983 por Warren e Marshall58. Foi uma associação
polémica pois o estômago era considerado ambiente estéril, mas em 2005 ganharam o
Prémio Nobel da Fisiologia ou Medicina pela sua descoberta53.
A International Agency for Research on Cancer (organismo da Organização Mundial
de Saúde) classifica H. pylori como carcinogénio do grupo I desde 199460.
2.1.3 - Variabilidade Genética e Evolução
No final dos anos 90 foi sequenciada a primeira estirpe de H. pylori com recurso ao
método de sequenciação aleatória do genoma, a partir de um paciente com gastrite50.
H. pylori apresenta uma grande variabilidade genética, que tem sido atribuída a uma
taxa de mutação elevada no seu genoma, à deficiente reparação do DNA, à existência de
recombinação frequente e à existência de plasmídeos4. Nas estirpes sequenciadas a
maioria dos genes são comuns entre si, sendo assim a variabilidade genética pode ser
aparente e como resultado de rearranjos no genoma14. Esta variabilidade é, frequentemente,
devida a mudanças na terceira base dos codões, inversões e translocações modificando o
DNA mas sem alterar as proteínas codificadas. Apenas 7% das proteínas eram especificas
de cada estirpe aquando da comparação entre duas estirpes com DNA já sequenciado1.
Devido a inserções, delecções, alterações na estrutura geral do genoma a
variabilidade genética é bastante elevada, o que levou à teoria de que a população de H.
pylori representaria uma “quasi-espécie”11, com população panmítica e recombinação livre 18,
43, 46. Tendo em conta a definição de população panmítica, esta bactéria não parece
pertencer verdadeiramente a este tipo de população, uma vez que existem linhagens clonais
diferentes de H. pylori29.
A distribuição geográfica da bactéria sugere que ocorreu evolução conjunta com o
Homem. Durante milhares de anos as comunidades viviam isoladas havendo possibilidade
de ocorrerem diminutas trocas genéticas. A espécie humana apresenta segregação genética
que difere nas diferentes regiões do globo. Durante a evolução do Homem é possível que
tenha ocorrido co-segregação dos genes de H. pylori12. Isolados de diferentes localizações
geográficas apresentam variabilidade genética que tiveram por base as migrações
humanas7, 12. Como exemplo, no Peru as estirpes de H. pylori possuem grande homologia
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo 4
com estirpes asiáticas, levando à associação de que a bactéria colonizou o hospedeiro
antes dos asiáticos terem chegado à América há cerca de 20 000 anos. As estirpes do Peru
apresentam a região Cag-PAI que, no entanto, é homologa da europeia, levando à
suposição de que esta ilha de patogenicidade apenas foi adquirida após a colonização
europeia da América, por volta do Século XVI13.
Os genes que aparecem na actualidade nas populações são derivados de
populações ancestrais. Uma vez que existe sobreposição de populações humanas com
genes distintos e de populações de H. pylori é proposta a hipótese de que a bactéria tem
como reservatório o estômago humano desde há pelo menos 100 000 anos, ou seja antes
das primeiras migrações humanas12.
As grandes populações modernas de H. pylori são hpAfrica1 e hpAfrica2 (África do
Sul), hpAsia Oriental, hpEuropa, hpAsia2 (Índia, Tailândia, Bangladesh e Filipinas) e
hpNEAfrica (Etiópia, Nigéria, Somália e Sudão) estabelecendo a saída de H. pylori de África
à 58 000 anos coincidindo com a migração humana19, 35. O afastamento migratório da África
Oriental (berço da Humanidade) leva a que seja observada diminuição da diversidade
genética, aumentando, no entanto a distância genética das estirpes35.
2.1.4 – Doenças associadas a H. pylori
Apesar da infecção por H. pylori na maioria dos indivíduos (aproximadamente 70%)
permanecer assintomática, 10 a 20% poderão vir a desenvolver úlcera péptica e 1 a 2%
cancro gástrico ao longo da vida32. Desde o aparecimento desta associação variados
aspectos da imunopatogénese têm sido estudados, as estirpes sequenciadas apresentam
ilhas de patogenicidade Cag-PAI e citotoxina A, consideradas factores de virulência e
patogenicidade associadas ao desenvolvimento de cancro gástrico42.
2.1.5 - Tratamento
A terapêutica utilizada, actualmente, é composta por dois antibióticos
(frequentemente amoxicilina e claritromicina) e um inibidor da bomba de protões, tendo o
tratamento uma duração de 7 dias32. No entanto, devido principalmente à existência de
bactérias multiresistentes a antibióticos, a terapêutica com antibióticos é ineficaz em
aproximadamente 20 a 30% dos pacientes41, 53. No sentido de fazer face a esta problemática
têm sido desenvolvidos esforços para encontrar terapias alternativas em caso de falha na
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo 5
abordagem com antibióticos. Uma das alternativas consiste na utilização de bacteriófagos,
que são vírus que infectam e se multiplicam em bactérias, levando à lise bacteriana, e
consequentemente, a eliminação da doença infecciosa por ela causada. Esta terapêutica foi
amplamente utilizada na década de 30 por d’ Hérelle, sendo posteriormente utilizada e
desenvolvida em países do Leste Europeu e Ex-União Soviética até ao aparecimento dos
antibióticos25. Os quais retiraram a atenção dos investigadores para os bacteriófagos
estando a sua investigação “adormecida”, voltando à ribalta devido ao aumento crescente
da resistência de bactérias aos antibióticos8, 20. Actualmente já existem referências à
utilização com sucesso de bacteriófagos em determinadas bactérias5, 10, 15, 26, 36, 45, 55, 57, 59
sendo que para a Helicobacter pylori ainda não existem investigações suficientes pois não
existe uma colecção de bacteriófagos disponível.
2.2 – Bacteriófagos
2.2.1 - Descrição morfológica
Os bacteriófagos são vírus cujo hospedeiro são bactérias, tendo sido considerados
parasitas intracelulares obrigatórios, uma vez que, necessitam de uma célula hospedeira
para a formação de novos bacteriófagos. Estão descritas 14 famílias de vírus que afectam
procariotas9.
A maioria dos fagos apresentam cadeia dupla de DNA, mas podem apresentar
cadeia simples e, também simples ou dupla cadeia de RNA. Cerca de 96% dos viriões
possuem cauda com estruturas de fixação e cabeça9.
Os bacteriófagos que infectam Helicobacter pylori pertecem à ordem Caudovirales. O
seu DNA é de cadeia dupla. Pertencem à família Siphoviridae, quando apresentam cauda
longa e não contráctil34 ou à família Podoviridae, se a cauda for curta e, também, não
contráctil37. Possui cabeça icosaedrica de aproximadamente 62,5 nm (≈7,3 nm) de diâmetro
e uma cauda de cerca de 92,4 nm (± 2, 97) ou 23 (± 1) de comprimento, respectivamente
cauda longa e curta.
2.2.2 - História
A primeira descrição conhecida de bacteriófagos (= fagos) foi feita por Félix d’Herelle
e Frederick Twort, de forma independente, na década de 20 do século XX. Foram descritos
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo 6
como vírus que infectam bactérias sendo causadores da lise bacteriana. Para d’Herelle
existia apenas um bacteriófago com várias espécies, Bacteriophagum intestinale9, 21.
A primeira descrição da utilização de fagos como terapêutica remonta a 1919 em
França8. Hérelle administrou preparações contendo fagos a pacientes com disenteria. O seu
laboratório produziu os primeiros cocktails fágicos comerciais. Sendo estes comercializados
em França até cerca de 197833.
Inicialmente os fagos eram utilizados para tipagem de estirpes bacterianas com
interesse médico. Na década de 40 Max Delbrück e Salvador Luria utilizavam os
bacteriófagos como elementos fundamentais de análise quantitativa em virologia. Nos anos
40 e 50 foram construídos os primeiros mapas genéticos. Os investigadores Hershey e
Chase descobriram que apenas o DNA viral era injectado em células bacterianas
permissivas à infecção21.
O estudo foi sendo abandonado com a introdução de antibióticos nos tratamentos
médicos, apesar de continuarem a ser estudados fagos em zonas com menor acesso a
antibióticos, como a União Soviética8.
Em 1962 Lwoff, Horne e Tournier propuseram que os vírus deveriam ser
classificados segundo o tipo de ácido nucleico, forma da cápside, presença ou ausência de
envelope e o número de capsomeros que possuíam. O comité de classificação de vírus foi
fundado em 1966 e classificou os vírus com base nas propriedades do virião e do seu ácido
nucleico9.
Em 1987 e 1989, respectivamente, descreveram pela primeira vez partículas
semelhantes a bacteriófagos em biópsias23, 40. Seguiu-se a observação de bacteriófagos de
H. pylori por isolamento do seu ácido nucleico24, 44 em 1990 e 1993. Apenas em 2007 surgiu
nova referência a estruturas semelhantes a fagos, após indução com mitomicina C3. A
presença de partículas semelhantes a vírus foi detectada por microscopia electrónica em
200852.
Em 2011 investigadores isolaram fagos selvagens líticos de H. pylori e testaram
contra H. pylori utilizando duas estratégias. Foi feita a adição do fago sozinho ou do fago
com uma estirpe de H. pylori previamente exposto a um suco gástrico artificial com o
objectivo de testar a sobrevivência do fago em suco gástrico. Verificou-se que era mais
eficiente a administração do fago com H. pylori, pois só assim se continua a observar a
formação de placas fágicas56.
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo 7
2.2.3 - Mecanismos de Replicação
A infecção por fagos inicia-se com a adsorção a receptores da superfície bacteriana.
Os fagos tendem a ligar-se a estirpes específicas injectando os seus ácidos nucleicos no
citoplasma do hospedeiro. Após este ponto pode seguir duas vias, o ciclo lítico ou o ciclo
lisogénico [Figura 1]. No ciclo lítico ocorre a replicação e produção de proteínas virais.
O DNA viral juntamente com as proteínas virais formam novos bacteriófagos
provocando a lise da célula hospedeira e libertando os recém formados bacterófagos. No
ciclo lisogénico os ácidos nucleicos são integrados no genoma utilizando a enzima integrase
e replicam utilizando a divisão natural da célula bacteriana infectada. Quando expostos a
condições adversas (exemplo: radiação ultravioleta e mitomicina C) podem ser induzidos a
entrar no ciclo lítico38. Após a integração do genoma fágico no genoma da bactéria, o fago
passa a ser designado profago e a bactéria de bactéria lisogénica.
Quando os vírus apresentam estes dois ciclos replicativos são designados fagos
temperados, no entanto se apenas conduzirem à lise bacteriana designam-se fagos líticos21.
Fig.1 Ciclo Lítico e Lisogénico de Bacteriófagos38.
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
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2.2.4 – Morfogénese dos Bacteriófagos
A multiplicação dos fagos é concluída com a lise da bactéria infectada e consequente
libertação, para o exterior, de novos fagos. Habitualmente esta multiplicação é mediada por
duas proteínas codificadas pelo genoma fágico, a lisina e a holina. A lisina é uma proteína
citoplasmática que está envolvida na degradação da parede celular bacteriana. Para que
ocorra saída da lisina citoplasmática para o exterior é necessário a formação de poros de
membrana na célula infectada. A formação destes poros membranares é mediada pela
holina, que é uma proteína hidrofóbica. A associação destas duas proteínas resulta no
aumento da fragilidade da parede celular da bactéria infectada tornando-se incapaz de
suster a pressão osmótica interna levando à sua lise, libertação de fagos para o exterior e
posterior infecção de novas células bacterianas21.
2.2.5 - Utilização de bacteriófagos vs Utilização de antibióticos
Quando a aplicação de vírus (bacteriófagos) específicos para determinada bactéria é
aplicada com o objectivo de reduzir ou eliminar o microorganismo designa-se por terapia
fágica33.
Os bacteriófagos são específicos para determinada bactéria diminuindo alterações
na flora natural do corpo humano, causada pela administração de antibióticos. Os fagos são
naturalmente estimuladores do sistema imunitário e conseguem atravessar barreiras
fisiológicas como a membrana hematoencefálica8. Têm a capacidade de desaparecer total
ou quase totalmente quando o agente patogénico já não está presente e vão aumentando o
seu número no decorrer do tratamento6, 33.
O grau de toxicidade é muito mais baixo em comparação com a toxicidade existente
nos antibióticos. Quando uma bactéria é infectada com um profago não consegue readquirir
a sua viabilidade, no caso da utilização de antibióticos a bactéria pode sobreviver ao
contacto e evoluir obtendo resistência6. No entanto, pode haver resistência de bactérias a
fagos (por exemplo alteração de receptores de ligação devido a uma delecção) o
bacteriófago deixa de conseguir detectar a bactéria como seu hospedeiro mas como os
fagos também evoluem, podem conseguir adaptar-se e superar a alteração; os antibióticos
possuem uma estrutura estática e imutável naturalmente não se podendo adaptar a
alterações na bactéria.
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2.2.6 – (Pro)fagos de Helicobacter pylori
O número de (pro)fagos em H. pylori é pequeno, no entanto, tem vindo a crescer
com o avançar das investigações.
Lehours em 2011 descreveu profago completo da família Siphoviridae na estirpe
francesa B45, retirada de um paciente com linfoma MALT, após um estudo de indução34 e
Lou descreveu o profago completo da família Podoviridae na estirpe 1961P de Taiwan, que ,
também poderia apresentar um ciclo lítico37 [Figura 2]. São profagos completos pois apesar
de estarem integrados no genoma da bactéria os autores demonstraram que poderia haver
a produção de um fago lítico. Por analogia, também a estirpe Cuz20 proveniente do Perú
(Número de acesso CP002076), a estirpe índia 7 proveniente da Índia (Número de acesso
CP002331) foram identificados como profagos completos. Foram também identificados
genomas profágicos nas estirpes KHP30 e KHP4051.
Profagos remanescentes foram descritos na estirpe francesa B38 isolada de um
paciente com linfoma MALT49, na estirpe japonesa F16 proveniente de paciente que
apresentava gastrite28, nas estirpes Gambia 94/24 (Número de acesso CP002332), H. pylori
Shi112 (Número de acesso CP003474.1) e da estirpe proveniente da Malásia UM037
(Número de acesso NC_021217.1), estes profagos são incompletos pois não apresentam a
sequência completa logo não serão capazes de entrar no ciclo lítico.
Fig. 2 Organização genómica dos fagos de H. pylori37.
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3 - Materiais e métodos
3.1 - Estirpes de Helicobacter pylori
Foram utilizadas 866 estirpes de H. pylori para pesquisa do gene da integrase de
fagos de H. pylori. As estirpes pertencem às colecções do Laboratório Nacional das
Infecções Gastrointestinais do Departamento de Doenças Infecciosas do Instituto Nacional
de Saúde Dr. Ricardo Jorge, da Université Bordeaux Segalen (França) e do Rabin Medical
Center do Beilinson Hospital (Israel).
A cultura inicial de H. pylori foi efectuada descongelando as estirpes que estavam
armazenadas a -80ºC em glicerol e TSB (Tryptic Soy Broth) a 20%. Foram utilizados meios
selectivos e não selectivo MHA (Mueller-Hinton Agar) com 5% de sangue (Biogerm,
Portugal) e incubadas em condições de microaerofilia 24h ou 48h dependendo do
crescimento bacteriano observado. A biomassa obtida foi suspensa em água destilada e
armazenada a -20ºC.
Na pesquisa por PCR do gene da integrase de fagos de H. pylori das 866 estirpes
isoladas de doentes de origem geográfica diferente, 686 eram de origem europeia, 60 de
origem africana, 119 de origem asiática e 1 de origem americana. Em relação à patologia
associada 218 provieram de doentes com úlcera péptica, 415 com gastrite, 76 com
adenocarcinoma gástrico, 63 linfoma MALT e em 94 não foi possível aceder à informação de
qual a patologia associada.
3.1.1 - Extracção de DNA genómico
Para a extracção de DNA genómico de H. pylori foi utilizado o mini kit QIAmp DNA
modificado (Qiagen). Após centrifugar a suspenção a 13 000 rpm durante 3 minutos foi
descartado o sobrenadante. Foi ressuspendido o pellet no vórtex. Seguindo-se, depois, com
o protocolo do kit, a recolha de DNA foi feita adicionando água destilada ultra pura aquecida
a 70ºC à coluna, deixando incubar 5 minutos à temperatura ambiente e centrifugando a
8000 rpm durante 1 minuto. Repetiu-se o passo anterior mas centrifugando durante 2
minutos, seguindo de uma nova centrifugação a 12000 rpm durante 1 minuto.
Foi feita uma diluição padrão de 1:10 do DNA obtido e armazenado a -20ºC.
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3.1.2 - Pesquisa por PCR do Gene da Integrase de Fagos de H. pylori
3.1.2.1 - Reacção de PCR
Os primers utilizados para a Integrase, primase e para a região do fim do fago foram
desenhados com base no alinhamento dos genomas de uma estirpe de Helicobacter
acinonychis, de H. pylori B45 e H. pylori B38. [Figura 3] Os genes pesquisados por PCR
foram os # para o gene da Integrase, para o gene Primase e ¥ para a região do Fim do
Fago. Na reacção de PCR foram utilizadas primers degenerados (Invitrogene) descritos na
[Tabela 1].
Fig. 3 Alinhamento de genomas profágicos. # Gene da Integrase, Gene Primase e ¥ Fim
do Fago (adaptado de Lehours 2011).
Na reacção de PCR para a pesquisa do gene da integrase foi utilizado tampão 5X
(Promega), dNTPs a 10μM (New England BioLabs), cloreto de magnésio a 1,5 mM
(Promega), primers a 3,2 μM (Invitrogene), Taq polimerase a 5U/μl (Promega), 1 μL de DNA
de H. pylori e a mesma mix mas sem adição de DNA como controlo negativo.
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Tabela 1 Sequências dos primers degenerados integrase, primase e fim do fago utilizados
no estudo.
Primers Sequência
Fragmento
(pb)
Integrase
(529 pb)34
Forward AAG-YTT-TTT-AGM-GTT-TTG-YG
529
Reverse CGC-CCT-GGC-TTA-GCA-TC
Primase
(327 pb)
Forward GCG-ATT-ACC-AAA-AAG-CCA-AC
327
Reverse WGG-SGW-YAA-AYA-ACG-CCT-TG
Fim do Fago
(487 pb)
Forward AAA-CGC-TRG-GCA-TGA-GCA-TC
487
Reverse TCT-TTG-CCA-AAC-AAG-CTM-AC
A desnaturação aconteceu durante 4 min a 94ºC, cada reacção foi amplificada em 35
ciclos: 30 segundos a 94ºC, 30 segundos de hibridização a 58ºC e 60 segundos a 72ºC. A
extensão continuou por 7 minutos, também, a 72ºC.
Após a reacção de PCR e para permitir a visualização dos resultados foi feita
electroforese em gel de agarose (Sigma Life Science) a 2%. Usando como controlo positivo
a estirpe B45, que é positiva para a integrasse, primase e fim do fago, e como controlo
negativo a mix de PCR mas sem a adição de DNA.
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3.1.2.2 Electroforese em gel de agarose a 2%
Para a electroforese em gel de agarose a 2% (Sigma Life Science) com tampão TBE
1x (Applichem) procedeu-se ao aquecimento da solução no microondas a 850W durante 1
minuto e 30 segundos. Após o gel solidificar foi feita a electroforese (Electrophoresis Power
Supply – EPS 601, GE Healthcare) durante 40 minutos, a 140 volts, 85 mA e 10 watts.
Os poços foram preenchidos colocando no primeiro poço o marcador 1kb DNA
ladder NEB ou 100 bp DNA ladder NEB (New England BioLabs), o controlo positivo seguido
das amostra e por fim o controlo negativo. A todas as soluções foi misturado Green GoTaq
Flexi Buffer (Promega) como tampão de amostra.
Após a electroforese, o gel foi colocado em banho com agitação com uma solução de
10 l de Gel Red (Biotium) e tampão TBE 1x (Applichem), seguido de banho com agitação
em água destilada, ambos com a duração de 10 minutos. Foi tirada uma fotografia utilizando
lâmpada de luz ultravioleta (Gel Logic 100 Imaging System, Kodak) [Figura 4].
Quando para a mesma estirpe resultava uma fotografia que apresentava várias
bandas, foi excisada a banda com a dimensão aproximada às que pesquisamos. Era
pesado o eppendorf e registado o seu peso. Com a lâmpada de luz ultravioleta ligada e um
bisturi estéril a banda com a dimensão aproximada foi excisada e colocada no eppendorf.
Foi pesado o eppendorf com a banda no seu interior. Foi feita a diferença entre os 2 pesos e
usado esse valor para a medida de volume para a purificação do DNA.
3.1.3 – Purificação e quantificação da reacção de PCR para sequenciação
As estirpes positivas para o gene da integrase foram purificadas e sequenciadas
(Stabvida, Portugal) em ambas as cadeias [Figura 4]. Para a purificação do produto de PCR
foi utilizada a resina (Spharyl S400 High Resolution, GE Healthcare), a preparação da resina
iniciou-se com a sua homogeneização, retirada de 20 mL para um tubo Falcon e adição de
água destilada ultra pura. Precedeu-se à sua centrifugação a 3000 rpm durante 5 minutos.
Foi decantado o sobrenadante e adicionado igual volume de água destilada. Repetindo as
lavagens 6 vezes.
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Fig. 4 A) 1: Marcador 1kb DNA ladder NEB, 2: controlo positivo estirpe B45, 3: estirpe B35,
4: estirpe negativa para o gene da integrase, 5: estirpe negativa para o gene da integrase, 6:
estirpe B44, 7: Controlo negativo (sem DNA). Estirpes 3 e 6 positivas para o gene da
integrase. B) 1: Marcador 100 bp DNA ladder NEB, 2: controlo positivo estirpe B45, 3:
estirpe negativa para o gene da primase, 4: estirpe B101, positiva para o gene da primase e
5: controlo negativo (sem DNA). C) 1: Marcador 1kb DNA ladder NEB, 2: controlo positivo
estirpe B45, 3: estirpe negativa para a região do fim do fago, 4: estirpe C166, positiva para a
região do fim do fago e 5: controlo negativo (sem DNA).
A purificação da amostra foi efectuada homogeneizando a resina e adicionando à
coluna (IllustraTM MicrospinTM columns, GE Healthcare) vazia, fez-se uma centrifugação de
3000 rpm durante 3 minutos. Todo o volume da reacção de PCR foi colocado na coluna.
Centrifugou-se a coluna durante 2 minutos a 3000 rpm.
Após a purificação procedeu-se ao controlo positivo da purificação fazendo uma
electroforese para confirmar a presença de DNA e enviar para sequenciação (Stabvida,
Portugal).
Foi feita a quantificação da concentração do DNA com o Qubit dsDNA HS Assay Kit
(Invitrogene).
Os resultados obtidos na sequenciação foram utilizados para análise filogenética de
das sequências de integrase obtidas.
3.1.4 Pesquisa por PCR do Gene da Primase e Fim do Fago de Fagos de H.
pylori
Todas as estirpes com a sequência de integrase positiva foram, também, testadas
quanto à presença de outros genes fágicos, primase e fim do fago.
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3.1.4.1 - Reacção de PCR
Na reacção de PCR para a pesquisa do gene da primase e da região do fim do fago
foi utilizado tampão 5X (Promega), dNTPs a 10 μM (New England BioLabs), cloreto de
magnésio a 1 mM (Promega), primers a 3,2 μM (Invitrogene), Taq polimerase a 5 U/μl
(Promega) e 1 μL de DNA de H. pylori.
A desnaturação aconteceu durante 4 min a 94ºC, cada reacção foi amplificada em 35
ciclos: 30 segundos a 94ºC, 30 segundos de hibridização a 63ºC e 60 segundos a 72ºC. A
extensão continuou por 7 minutos, também, a 72ºC.
Após a reacção de PCR e para permitir a visualização dos resultados foi feita
electroforese em gel de agarose (Sigma Life Science) a 2%. Usando como controlo positivo
a estirpe B45, que é positiva para a integrasse, primase e fim do fago, e como controlo
negativo a mix de PCR mas sem a adição de DNA. A fase seguinte foi fazer a purificação
dos produtos de PCR que eram positivos para os genes pesquisados, fazer a sua
quantificação, sequenciação e análise filogenética como descritos nos pontos 2.1.2.2 e
2.1.3.
3.1.5 Análise Filogenética das Sequências de H. pylori
Análise filogenética das sequências de integrase foi obtida utilizando o MEGA 5.05
software48, neighbor-joining method, on the basis of distances estimated using the Kimura
two-parameter model31.
3.1.6 Análise Estatística das Sequências de H. pylori
A análise estatística das estirpes estudadas foi feita utilizando o teste do Qui-
quadrado (disponível online em VassarStats: Website for Statistical Computation,
http://www.vassarstats.net/newcs.html) e o teste de Fisher (disponível online em Quantitative
Skills Consultancy for Research and Statistic,wednklewfnflkjrf jd v md fvj kd vjdjd f dj df
http://www.quantitativeskills.com/sisa/statistics/fiveby2.htm) este último quando os valores
esperados eram menores que 5.
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4 – Resultados
4.1 - Prevalência de Profagos em Helicobacter pylori
A pesquisa por PCR do gene da integrase do fago, mostrou uma prevalência de
19,3%. Nos resultados globais da amplificação por PCR, das 866 estirpes analisadas, 3,5%
foram positivas para a presença do gene da integrase e da primase, 2,9% foram positivas
para presença do gene da integrase e do fim do fago. Apenas 0,8% das estirpes foram,
simultaneamente, positivas para a presença dos 3 genes estudados, integrase, primase e
fim do fago
4.1.1 Integrase
Genes fágicos, em particular o gene da integrase, estão presentes em ≈ 20%
isolados clínicos de H. pylori34. Com o objectivo de estudar a prevalência de profagos em
genomas de H. pylori foram testadas 866 estirpes com diferentes origens geográficas e
patologias associadas diversas, utilizando primers degenerados. Verificou-se que 19,3%
(167/866) dos isolados eram positivos para o gene da integrase, uma percentagem
ligeiramente abaixo do anterior estudo que se situava nos 21,4% (73/341)34.
A presença do gene da integrase em diferentes patologias apresentou valores
semelhantes [Tabela 2], na ordem dos 20%, sendo que as úlceras pépticas apresentaram
uma percentagem ligeiramente maior (26,6%) e os linfomas MALT uma percentage menor
(15,9%).
A prevalência do gene da integrase em estirpes com origem geográfica diversa
também se manteve semelhante na ordem dos 20%, sendo que a proveniência de África
apresentou uma percentagem ligeiramente mais elevada (25%). [Tabela 3]
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Tabela 2 Contagem de estirpes positivas para o gene da integrase de acordo com a
patologia.
Integrase Positiva
Patologia Estirpes de H. pylori
positivas
% Positivas
Úlcera Péptica 58 26,6% (58/218)
Gastrite
74 17,8% (74/415)
Adenocarcinoma
15 19,7% (15/76)
Linfoma MALT
10 15,9% (10/63)
Sem dados
10 10,6% (10/63)
Tabela 3 Contagem de estirpes positivas para o gene da integrase de acordo com a
localização geográfica.
Integrase Positiva
Origem Estirpes de H. pylori
positivas
% Positivas
Europa 131 19,1% (131/686)
África 15 25,0% (15/60)
Ásia 21 17,6% (21/119)
América 0 0,0% (0/1)
4.1.2 Primase
As estirpes que apresentaram resultados positivos para o gene da integrase e que
foram testadas posteriormente para o gene da primase, verificou-se que 30% das estirpes
isoladas de paciente com úlcera péptica foram igualmente positivas para o gene da primase,
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tal como se verificou para 25% das estirpes isoladas de linfoma MALT, 20% de estirpes
isoladas de gastrite e 10% de estirpes isoladas de adenocarcinoma, também positivas para
o gene da primase [Tabela 4].
Tabela 4 Contagem de estirpes positivas para o gene da primase de acordo com a
patologia.
Primase Positiva
Patologia Estirpes de H. pylori
positivas
% Positivas
Úlcera Péptica 15 30% (15/50)
Gastrite 14 20% (14/70)
Adenocarcinoma 1 10% (1/10)
Linfoma MALT 1 25% (1/4)
A presença do gene da primase em estirpes com origem geográfica diversa
apresentou valores elevados nas estirpes de proveniência asiática (38%), de 23% para
estirpes europeias e 10% para estirpes africanas [Tabela 5].
Tabela 5 Contagem de estirpes positivas para o gene da primase de acordo com a
localização geográfica.
Primase Positiva
Origem Estirpes de H. pylori
positivas
% Positivas
Europa 25 23% (25/111)
África 1 10% (1/10)
Ásia 5 38% (5/13)
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4.1.3 Fim do Fago
As estirpes que apresentaram resultados positivos para o gene da integrase e que
foram testadas posteriormente para a região do fim do fago verificou-se que existiam 30%
de estirpes isoladas de úlcera péptica, 20% de estirpes isoladas de adenocarcinoma, 11%
de estirpes isoladas de gastrite e 10% de estirpes isoladas de gastrite foram igualmente
positivas para a região do fim do fago [Tabela 6].
Tabela 6 Contagem de estirpes positivas para o gene do fim do fago de acordo com a
patologia.
Fim Fago Positiva
Patologia Estirpes de H. pylori
positivas
% Positivas
Úlcera Péptica 15 30% (15/50)
Gastrite 8 11% (8/70)
Adenocarcinoma 2 20% (2/10)
Linfoma MALT 0 0% (0/4)
A percentagem mais elevada, correspondente à origem da estirpe, pertence a
estirpes de origem africana com 40%, já o valor mais baixo corresponde a estirpes
europeias. [Tabela 7]
Tabela 7 Contagem de estirpes positivas para o gene do fim do fago de acordo com a
localização geográfica.
Fim do fago Positiva
Origem Estirpes de H. pylori
positivas
% Positivas
Europa 17 15% (17/111)
África 4 40% (4/10)
Ásia 4 31% (4/13)
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4.2 - Análise Estatística das Sequências de H. pylori
4.2.1– Teste do Qui-quadrado e teste de Fisher
O teste do qui-quadrado é um teste não paramétrico que analisa o grau de
associação entre variáveis. No presente estudo este teste foi utilizado para tentar
compreender se existe associação entre a patologia e/ou origem e a positividade para o
gene da integrase, primase e fim do fago.
O teste de Fisher é utilizado quando os valores das variáveis são inferiores a 5.
4.2.1.1 – Associação estatística entre a patologia e a presença do gene
da integrase
No teste do qui-quadrado em que se testou a independência entre patologia
associada às estirpes de H. pylori testadas e presença do gene da integrasse [Tabela 2]
obteve-se um valor p=0,0479. Este resultado sugere que existe associação estatística entre
a úlcera péptica e a presença do gene da integrase.
A análise dos standardized residuals observa-se que o valor que mais parece
contribuir para esta associação é úlcera péptica (standardized residuals +2,06). A
percentage deviation e os standardized residuals são medidas dos graus que os valores de
qui-quadrado observados diferem dos valores esperados com base numa hipótese nula.
Quando os standardized residuals resultam em valores menores ou maiores que |1,96|,
como é um teste de independência, significa que não passou no teste logo existe
associação entre os dois factoresPestana, D. D. e Velosa, S.F. (2006) Introdução à Probabilidade e à Estatística, Vol. 1, Lisboa, Fundação Calouste Gulbenkian..
4.2.1.2 – Associação estatística entre a patologia e a presença do gene da
primase
No teste do qui-quadrado em que se testou a independência entre patologia
associada às estirpes de H. pylori testadas e presença do gene da primase [Tabela 4]
obteve-se um valor p= 0,4419, que é maior que 0,05 o que significa que não existe
associação estatística entre a patologia e a presença do gene da primase.
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4.2.1.3 – Associação estatística entre a patologia e a presença do fim do fago
No teste do qui-quadrado em que se testou a independência entre patologia
associada às estirpes de H. pylori testadas e presença da região do fim do fago [Tabela 6]
obteve-se um valor p= 0,0555 é maior que 0,05, no entanto é um valor muito próximo, o que
significa que com os dados que temos não existe associação estatística entre a patologia e
a presença da região do fim do fago. Nos standardized residuals o valor que mais parece
contribuir para esta aproximação ao valor limite de associação é úlcera péptica (+1,86).
Como existem valores esperados menores que 5 foi necessário fazer teste de Fisher (p= 0,
5475).
4.2.1.4 – Associação estatística entre a origem da estirpe e a presença do gene
da integrase
No teste do qui-quadrado em que se testou a independência entre a origem
geográfica das estirpes de H. pylori testadas e presença do gene da integrase [Tabela 3]
obteve-se um valor p= 0,6325, significa que não existe associação estatística entre a origem
e a presença do gene da integrase.
4.2.1.5 – Associação estatística entre a origem da estirpe e a presença do gene
da primase
No teste do qui-quadrado em que se testou a independência entre a origem
geográfica das estirpes de H. pylori testadas e presença do gene da primase [Tabela 5]
obteve-se um valor p= 0,2579, significa que não existe associação estatística entre a origem
e a presença do gene da primase.
4.2.1.6 – Associação estatística entre a origem da estirpe e a presença do fim
do fago
No teste do qui-quadrado em que se testou a independência entre a origem
geográfica das estirpes de H. pylori testadas e presença da região do fim do fago [Tabela 7]
obteve-se um valor p= 0,0789, este resultado significa que apesar de estar próximo do
limite, com os dados que temos não existe associação estatística entre a patologia e a
presença da região do fim do fago. Nos standardized residuals o valor que mais parece
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
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contribuir para esta aproximação ao valor limite para associação são as estirpes africanas
(+1,56).
Como existem valores esperados menores que 5 foi necessário fazer teste de Fisher
(p= 0,05312).
4.3 - Análise Filogenética de Profagos em Helicobacter pylori
4.3.1 – Análise Filogenética do Gene da Integrase
A análise filogenética das sequências dos produtos de PCR do gene da integrase
originou uma árvore filogenética de 4 clusters (grupos de sequências com semelhança entre
si) [Figura 5].
Foi feita comparação com sequências do gene da integrase presentes noutras
espécies de Helicobacter, como H. cetorum (mamíferos marinhos), que se encontram
situadas em posições mais extremas da árvore filogenética [Figura 5].
No cluster A encontram-se estirpes de origem europeia e africana. Neste cluster
existem 3 subgrupos designados A1 que corresponde a 100% de estirpes com origem no
Norte da Europa sendo que destas 72% são de origem Sueca, A2 mais de metade (56%)
das estirpes incluídas neste subgrupo são de origem senegalesa e 31% de origem
portuguesa, A3 50% das estirpes são senegalesas e 38% francesas. É neste cluster que se
localizam a maioria das estirpes de origem africana.
Metade das estirpes pertencentes ao cluster B são provenientes de Portugal e 30%
são francesas. No cluster C estão representadas estirpes maioritariamente (88%) de origem
asiática (Este Asiático) enquanto que o cluster D apresenta origem europeia diversa, sendo
que 44% são estirpes de origem portuguesa e 24% de origem francesa.
Na árvore filogenética o nome das estirpes termina com uma letra que designa a
patologia associada a essa estirpe. A análise filogenética do gene da integrase demonstrou
haverem clusters de estirpes de acordo com a região geográfica, não ocorrendo, a mesma
situação em relação às patologias.
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo 23
Fig. 5 Árvore filogenética do gene da integrase (1000 réplicas) neighbor-joing method,
kimura two-parameter model31. Estirpes isoladas de pacientes com diferentes patologias: C -
Adenocarcinoma, G - Gastrite, M - Linfoma MALT e U - Úlcera Péptica.
4.3.2 – Análise Filogenética do Gene da Primase
Tal como acontece para a região da integrase, também, no gene da primase seria
espectável encontrar maior número de estirpes, pois obtiveram-se 31 estirpes positivas para
a presença do gene da primase, isso não se verificou, uma vez que, houve alguma
dificuldade em obter sequências de DNA provenientes da sequenciação dos produtos de
PCR [Figura 6].
Foi estudado em que clusters estas estirpes, positivas para o gene da primase, se
localizam e se se localizavam nos mesmos clusters da árvore filogenética da integrase, ou
seja, se analisando um gene diferente os clusters se mantinham. Por exemplo,
relativamente às sequências de origem asiática KHP30, 1961 e KHP40 que estavam no
cluster C da árvore filogenética para análise do gene da integrase, também, na árvore
filogenética para a análise do gene da primase aparecem juntas, daí que nesta figura tenha
sido adoptada a mesma identificação de cluster C.
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo 24
De um modo semelhante as estirpes que nesta figura aparecem agrupadas e
identificadas com um B, significa que, também, estavam juntas na árvore filogenética para
análise do gene da integrase e pertenciam ao cluster B. O cluster B apresenta 3 estirpes
estudadas, duas delas de origem portuguesa e uma de origem sueca.
Fig. 6 Árvore filogenética do gene da primase (1000 réplicas), neighbor-joing method,
kimura two-parameter model31. Estirpes isoladas de pacientes com diferentes patologias: C
– Adenocarcinoma, G- Gastrite, M – Linfoma MALT e U- Úlcera Péptica.
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo 25
4.3.3 – Análise Filogenética da região do Fim do Fago
De um modo análogo também na região do fim do fago seria espectável encontrar
maior número de estirpes, pois obtiveram-se 8 estirpes positivas para a presença da região
do fim do fago, isso não se verificou, uma vez que, houve alguma dificuldade em obter
sequências legíveis provenientes da sequenciação dos produtos de PCR [Figura 7].
Foi, também, estudado em que clusters estas estirpes, positivas para a região do fim
do fago, se localizam e se se localizavam nos mesmos clusters da árvore filogenética da
integrase, ou seja se analisando um gene difererente os clusters se mantinham. Esta
verificou-se ser uma hipótese verdadeira. Sendo utilizado o mesmo esquema de anotação.
Fig.7 Árvore filogenética da região do Fim do Fago (1000 réplicas), neighbor-joing method,
kimura two-parameter model31. Estirpes isoladas de pacientes com diferentes patologias: C
– Adenocarcinoma, G- Gastrite, M – Linfoma MALT e U- Úlcera Péptica.
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo 26
5 – Discussão e Conclusão
Os resultados reforçam a informação, contida em estudos anteriores, da abundância
de sequências profágicas em H. pylori34. A maioria das sequências parece pertencer a
profagos remanescentes integrados no genoma bacteriano, uma vez que na maioria dos
casos as estirpes são positivas para um gene mas não o são para os restantes genes
fágicos. Apenas 0,8% das estirpes são, simultaneamente, positivas para a presença dos
genes da integrase, primase e fim do fago.
Na pesquisa por PCR pesquisou-se um gene do início, um gene do meio e a região
do fim do fago para que fosse possível ter uma ideia se o fago seria completo ou não. A
pesquisa destas 3 zonas do genoma é uma estratégia de selecção de estirpes que para
estudos posteriores. A certeza absoluta de que o profago é completo requer a sequenciação
completa do genoma.
Considera-se que um profago é completo quando é capaz de apresentar um ciclo
lítico, profagos completos descritos na literatura existem 2, no genoma da estirpe B45 onde
após um estudo de indução mostrou-se existir um profago designado phiHP33 da família
Siphoviridae34 e no genoma da estirpe 1691 onde o autor demonstrou que este profago
também poderia apresentar um ciclo lítico e era um fago da família Podoviridae37, como
descritos em 2.2.6. São profagos completos porque estão integrados mas os autores
demonstraram que poderia haver a produção de um fago lítico. Por analogia dos genomas
verifica-se que existem outros fagos completos por exemplo o Cuz20, India 7, KHP30 e
KHP4051.
Na literatura também há descrição de profagos incompletos tais como, descritos no
capítulo 2.2.6, estes profagos incompletos não têm a sequência completa, já não vão ser
capazes de ter um ciclo lítico, sendo designados profagos remanescentes. Como exemplo o
profago presente na estirpe B3849.
As sequências dos fagos são, tipicamente, pouco conservadas entre si, e dai que
seja muito difícil desenhar um par de primers que consiga detectar correctamente as
sequências a pesquisar. Existe uma diversidade muito grande, assim esse par ideal não
existe, e como tal para algumas das estirpes que foram classificadas como não tendo o
gene da primase só se pode ter certeza absoluta se for feita a sequenciação completa do
genoma. Sendo assim podem existir alguns resultados falsos negativos, uma vez que, existe
muita variabilidade e os primers não conseguem detectar a sequência. Da mesma forma
podem haver falsos positivos pois em alguns casos se no gel havia várias bandas e era
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo 27
necessário excisar-se a banda que tinha a dimensão aproximada e enviá-la para
sequenciar, se o resultado da sequenciação não correspondia ao gene da primase (ou fim
do fago), a sequência foi eliminada.
A análise filogenética mostrou existirem clusters de acordo com a origem geográfica
das estirpes, uma vez que nos clusters [Figura 5] pode-se observar que as estirpes de
origem asiática estão todas agrupadas e o mesmo se passa com as restantes diversas
origens geográficas.
As estirpes foram isoladas de doentes com diferentes patologias mas as diferentes
patologias aparecem distribuídas em todos os clusters, ou seja não existe agrupamento por
patologia. Apesar de filogeneticamente não se encontrar nenhuma discriminação de acordo
com a patologia, as estirpes que são provenientes de doentes que tinham úlcera péptica têm
mais frequentemente profagos integrados do que as estirpes provenientes de pacientes que
outras patologias. O que pode sugerir uma associação entre a presença do profago e o
desenvolvimento da úlcera péptica. Este aspecto é importante porque existem espécies de
bactérias em que a existência de profagos está associada à virulência (difteria, toxinas da
cólera e escarlatina), pois os fagos codificam factores de virulência que aumentam a
amplitude do hospedeiro e provem a invasão do sistema imunitário22.
A análise estatística mostrou haver associação entre o gene da integrase e úlcera
péptica. A associação entre região do fim do fago e úlcera péptica apresenta um valor p
limite, tal como acontece entre esta região e as estirpes de origem africana. Pode ser
esclarecida esta possível associação aumentando o número de estirpes testadas.
Houve conservação de clusters nos diferentes genes analisados. As sequências
obtidas estavam razoavelmente conservadas nas estirpes H. pylori das árvores da primase
e do fim do fago, as estirpes Helicobacter não-pylori encontravam-se nas posições mais
externas das árvores filogenéticas.
A falta de homologia entre os genes fágicos, principalmente entre a primase e o fim
do fago dificulta a amplificação e a sequenciação dos produtos de PCR esta ocorrência
explica o motivo pelo qual as árvores filogenéticas não apresentam tantas estirpes como
aquelas que foram testadas e consideradas positivas.
Foram sequenciadas 132 estirpes integrase positivas de um total de 167 estirpes
consideradas positivas por PCR para o gene da integrase, 3 positivas para o gene da
primase em 31 estirpes e 8 estirpes que possuíam a região do fim do fago num total de 25
estirpes, apenas as referidas foram incluídas na análise filogenética, as restantes
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo 28
sequências ou apresentaram qualidade insuficiente ou eram sequências demasiado
pequenas e não foram incluídas na análise filogenética.
Ainda assim parece existir uma grande conservação das sequências e isso
demonstra-se porque as estirpes que estão nestas árvores filogenéticas e que são comuns
às 3 árvores, tendem a aparecer em clusters idênticos, estando sempre na mesma posição
demonstrando que existe aqui alguma conservação, uma vez que usamos diferentes genes
mas chegamos à conclusão que as mesmas estirpes localizam-se nos mesmos clusters em
árvores diferentes.
Estudos futuros impõe a sequenciação completa de estirpes que foram positivas para
a presença do gene da integrase, primase e fim do fago numa tentativa de encontrar mais
profagos completos integrados no genoma de H. pylori, outro estudo possível será a
pesquisa de outros genes de origem fágica que apresentem uma conservação maior e seja
mais especifico o desenho de primers ou procurar genes que apresentem uma acção
terapêutica importante como por exemplo os genes das lisinas fágicas que podem ser
utilizados na terapia fágica.
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo 29
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Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
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Anexos
Tabela 1 Contagens totais das estirpes estudadas de Helicobacter pylori.
PCR Integrase % Primase % Fim de Fago % Primase + Fim Fago %
Positivos: 167 19,3% 31 23,1% 25 18,7% 8 6,0%
Negativos: 699 80,7% 103 76,9% 109 81,3% 86 64,2%
Total Testadas: 866 100,0% 134 80,2% 134 80,2% 134 80,2%
Falta Testar: 0 0,0% 0 0,0% 0 0,0%
Total Amostras: 866
64 25,8%
78 17,3%
15 19,7%
10 15,9%0 0,0%
UP: 248 184 74,2%
DNU: 450 372 82,7%
Adenocarcinoma: 76 61 80,3%
MALT: 63 53 84,1%Desconhecido: 29 29 100,0%
TOTAL: 866
15 30,0%
14 20,0%
1 10,0%
1 25,0%
0 #DIV/0!
UP: 50 35 70,0%
DNU: 70 56 80,0%
Adenocarcinoma: 10 9 90,0%
MALT: 4 3 75,0%
Desconhecido: 0 0 #DIV/0!
TOTAL: 134
15 30,0%
8 11,4%
2 20,0%
0 0,0%
0 #DIV/0!
UP: 50 35 70,0%
DNU: 70 62 88,6%
Adenocarcinoma: 10 8 80,0%
MALT: 4 4 100,0%
Desconhecido: 0 0 #DIV/0!
TOTAL: 134
131 19,1%
15 25,0%
21 17,6%
0 0,0%
0 0,0%
Europa 686 555 80,9%
África 60 45 75,0%
Ásia 119 98 82,4%
América 1 1 100,0%
Oceania 0 0 0,0%
TOTAL: 866
25 22,5%
1 10,0%
5 38,5%
0 0,0%
0 0,0%
Europa 111 86 77,5%
África 10 9 90,0%
Ásia 13 8 61,5%
América 0 0 0,0%
Oceania 0 0 0,0%
TOTAL: 134
17 15,3%
4 40,0%
4 30,8%
0 0,0%
0 0,0%
Europa 111 94 84,7%
África 10 6 60,0%
Ásia 13 9 69,2%
América 0 0 0,0%
Oceania 0 0 0,0%
TOTAL: 134
Integrase Positiva (DNU):
109
31
Primase Negativa (Europa):
TOTAL (Fim Fago Negativo):
167
Integrase Positiva (Ásia):
Integrase Positiva (Oceania):
25
TOTAL (Integrase Positiva):
TOTAL (Integrase Positiva):
Integrase Positiva (Europa):
Integrase Positiva (África):
Fim Fago Negativo (Desconhecido):
167
Contagens
Integrase Positiva (UP):
Integrase Positiva (América):
Integrase Positiva (Adenocarcinoma):
Integrase Positiva (MALT):Integrase Positiva (Desconhecido):
Fim Fago Negativo (UP):
Fim Fago Negativo (DNU):
Fim Fago Negativo (Adenocarcinoma):
Fim Fago Negativo (MALT):
Integrase Negativa (Europa):
Integrase Negativa (África):
Integrase Negativa (Ásia):
Integrase Negativa (América):
Testadas para Fim de Fago
Fim Fago Positivo (UP):
Fim Fago Positivo (DNU):
Fim Fago Positivo (Adenocarcinoma):
Fim Fago Positivo (MALT):
Fim Fago Positivo (Desconhecido):
TOTAL (Fim Fago Positivo):
Primase Negativa (DNU):
Primase Negativa (Adenocarcinoma):
Primase Negativa (MALT):
Primase Negativa (Desconhecido):
TOTAL (Primase Negativa): 103
Integrase Negativa (Oceania):
TOTAL (Integrase Negativa): 699
Integrase Negativa (UP):
Integrase Negativa (DNU):
Integrase Negativa (Adenocarcinoma):
Integrase Negativa (MALT):Integrase Negativa (Desconhecido):
TOTAL (Integrase Negativa): 699
31
Primase Negativa (UP):
Testadas para Primase
Primase Positiva (UP):
Primase Positiva (DNU):
Primase Positiva (Adenocarcinoma):
Primase Positiva (MALT):
Primase Positiva (Desconhecido):
TOTAL (Primase Positiva):Patologia
Testadas para Integrase
Testadas para Primase
Primase Positiva (Europa):
Primase Positiva (África):
Primase Positiva (Ásia):
Primase Positiva (América):
Primase Positiva (Oceania):
TOTAL (Primase Positiva):
Testadas para Integrase
Primase Negativa (África):
Primase Negativa (Ásia):
Primase Negativa (América):
Primase Negativa (Oceania):
TOTAL (Primase Negativa): 103
Fim Fago Negativo (América):
Fim Fago Negativo (Oceania):
Testadas para Fim de Fago
Fim Fago Positivo (Europa):
Fim Fago Positivo (África):
Fim Fago Positivo (Ásia):
Fim Fago Positivo (América):
Fim Fago Positivo (Oceania):
TOTAL (Fim Fago Positivo):
TOTAL (Fim Fago Negativo): 109
Origem
25
Fim Fago Negativo (Europa):
Fim Fago Negativo (África):
Fim Fago Negativo (Ásia):
Pesquisa e Análise Filogenética do Gene da Integrase de Fagos de Helicobacter pylori 2013
Andreia Durão Timóteo 34
Tabela 2 Contagem estatística entre patologia/origem e positividade para os genes fágicos.
Integrase Positiva Integrase Negativa Primase Positiva Primase Negativa Fim Fago Positivo Fim Fago Negativo
UP 64 184 15 35 15 35
DNU 78 372 14 56 8 62
Adenocarcinoma 15 61 1 9 2 8
MALT 10 53 1 3 0 4
Europa 131 555 25 86 17 94
África 15 45 1 9 4 6
Ásia 21 98 5 8 4 9
América 0 1 0 0 0 0
Estatísticas
Patologia
Origem
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