transformaÇÃo genÉtica em plantas luciano da silva pinto doutorando em biotecnologia...

TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA EMPLANTAS

Luciano da Silva Pinto

Doutorando em Biotecnologia

ls_pinto@hotmail.com

Definição

É a introdução controlada de ácidos nucléicos em um

genoma receptor, excluindo-se a introdução por

fecundação

Usos da Transformação de Plantas

• A. Testar a função de genes ou partes de genes

• B. Modificar a expressão de genes endógenos– Desligar genes– Aumentar a expressão– Modificar a expressão

• C. Mover genes entre organismos.

Aplicações • Resistência a insetos:

• uso de inibidores de proteinases,• toxinas bacterianas (gene Bt )-Milho, algodão, batata e soja

• Tolerância a herbicidas: • Soja Roundup Ready ,• Milho, Cana-de-açúcar e Eucalipto

• Resistência a vírus: • os gene da capa protéica ou capsídeo do próprio vírus foi

introduzido na planta, funcionando assim como uma espécie de "vacina".

• Alteração de coloração de flores:

• envolvidos de rotas bioquímicas

• Alteração da qualidade nutricional: • Empresa Calgene obteve óleos ricos e ácido esteárico, um

ácido graxo saturado,

• arroz que produz beta- caroteno, precursor de vitamina

• Produção de vacinas:• Batata, tabaco, banana e alface.

• PLANTICORPOS - Cuba

Possíveis Impactos no Meio Ambiente

Fluxo gênico: transgene população silvestre

Poluição genética ou contaminação gênica de espécies silvestres

Cultivos próximos de parentes silvestres Cevada, alface, arroz, aveia, batata, sorgo e trigo

• Reações alérgicas ou de hipersensibilidade

• Reações de intolerância – alterações fisiológicas, como reações metabólicas anormais e toxicidade

Etapas da Produção de Plantas Transgênicas

- Identificação e isolamento do gene;

- transferência do gene;

- seleção das células que contenham o gene transferido;

- regeneração de plantas;

- expressão do gene nas plantas adultas.

Isolamento de genes

• Busca de genes de interesse em bancos de dados;

• Construção de primers e amplificação por PCR;

• Quantificação e sequenciamento.

TGTGAACACACGTGTGGATTGG...

Cassete de Expressão

= região promotora = região terminadora

Promotores e terminadores mais utilizados

Promotores constitutivos– CaMV 35S : 35S do vírus do mosaico da

couve-flor– pNOS: Nopalina Sintetase do pTiC58 de A.

tumefaciens Promotores Orgão/ tecido específico

– Vicilina, glutenina: específicos para expressão em sementes

– pPATATIN : tubérculos de batata– RuBisCo: tecido clorofilado– pLECTINA: expressão em sementes de

feijão• Promotores induzidos

– phsp70 : "Heat shock gene" de milho

Terminadores

• 3'OCS: Octopina sintetase do pTiB6S3;

• 3'NOS:Nopalina sintetase do pTiC58;

• 3'G7 : Gene 7 do pTiAch5 

Estratégias mais utilizadas de transferência de DNA para plantas

Vetor biológico: •Agrobacterium (uma bactéria do solo com duas espécies importantes: A. tumefaciens e A. rhizogenes)•Vetores virais: O CaMV permite inserções de no máximo 0.8 Kb. POUCO USADO

Plantas intactas - Bombardeamento com micropartículas, de ouro ou tungstênio (com cerca de 1 μm de diâmetro)

Transferência direta: De protoplastos - A membrana celular é permeabilizada por choques eléctricos ou agentes permeabilizantes (como o polietilenoglicol) – eletroporação

Transformação via vetor natural

• Agrobacterium tumefaciensrhizogenes

Transferência naturalde DNA para plantas

Plasmídio Ti

1) injuriada e liberação de compostos fenólicos pela célula vegetal; 2) ligação de Agrobacterium à superfície da célula, mediada por proteínas bacterianas e vegetais; 3) interação de composto fenólico com a proteína VirA; 4) fosforilação da proteína VirG; 5) ativação da transcrição dos genes de virulência (genes vir); 6) formação da fita-T, ligada à proteína VirD2; 7) produção da proteína VirE2; 8) organização do complexo-T (fita-T, VirD2 e VirE2); 9) transferência do complexo-T para a célula vegetal; 10) entrada do complexo-T no núcleo celular; 11) integração do T-DNA ao genoma celular. (modificado de Sheng & Citovsky,1996).

Representação esquemática da interação Agrobacterium-planta

Representação esquemática de um plasmídeo Ti/Ri e da estratégia usada para a transferência

de genes no sistema de transformação via Agrobacterium com vetor binário

pTi, plasmídeo indutor de tumor de A. tumefaciens; pRi, plasmídeo indutor de rizogênese de A. rhizogenes; Região vir, região de virulência; Região-T, região (DNA) transferida; BD, borda direita da região-T; BE, borda esquerda da região-T.

Genótipo-específico (planta - bactéria)

AGROBACTERIUM - Desvantagens

Monocot X Dicot

Dependência do sistema de regeneração

MÉTODOS DIRETOS DE

TRANSFORMAÇÃO

Dois grupos:

• aqueles que se utilizam de células desprovidas de parede celular (protoplastos)

• e aqueles que possibilitam a transformação de células intactas ou tecidos.

Em ambos métodos, o gene de interesse juntamente com o marcador seletivo e/ou repórter são transferidos como constituintes de um pequeno

plasmídio de E. coli.

Obtenção de protoplastos

Um protoplasto é uma célula "nua": perdeu a parede, mantém a membrana e adquire aspecto circular. A perda da parede celular é conseguida pelo uso de enzimas capazes de a degradar (ex.: celulase).

MICROINJEÇÃO

Biobalística

EquipamentoProcesso

Micro partículas de ouro

Vantagens

Diversos protocolos de cultura de tecidos

Não exige vetores especializados

Transformação de organelas

Rapidez e simplicidade

Desvantagens

Equipamento especializado

Integração múltipla de transgenes

Variabilidade do processo

Genes de seleção de transformantes 

Genes marcadores para resistência a antibiótico. Os mais utilizados são:

•Gene neo: isolado do traposon Tn5 de Escherichia Coli, codifica para a enzima neomicina fosfotransferase II (NPT II). Resistência a canamicina•Gene hpt: codifica para a enzima higromicina fosfotransferase (HPT) foi isolado de Escherichia coli e confere resistência ao antibiótico higromicina.

•Gene csrl: codifica para uma forma alterada da enzima sintase do ácido acetohidroxil (AHAS), também conhecida como acetato sintase (ALS).•Gene aroA: foi isolado de Salmonela tyhimurium tratada com mutagênico e selecionada para a resistência ao herbicida glifosato.•Gene bar: clonado de Streptomyces hygroscopicus, codifica para a enzima fosfinotricina acetiltransferase (PAT), que inativa o herbicida fosfinonotricina (PPT).

Resistência a algum herbicida.Os mais utilizados são:

GENES REPÓRTERES

• genes nos e ocs: foram isolados do T-DNA de Agrobactérium e codificam para a síntese da neopalina (NOS) e para a síntese de octopina (OCS), respectivamente.

• Gene lacZ: foi isolado de Eschirichia coli e codifica para a B-galactosidase, más é pouca usado em plantas porque estas possuem uma alta atividade endógena de B-galactosidase, de difícil quantificação.

• Gene cat: codifica a enzima clorafenicol acetiltransferase (CAT), que não é encontrada normalmente em plantas. Bastante usado em plantas, apesar da utilização de radioatividade.

• Gene neo: O NPT II usado também como gene marcador de seleção. • Gene luc: codifica para luciferase de Photinus pyralis e tem sido usado

como gene repórter em plantas.• Gene uidA: este gene foi isolado de Escherichia coli e é o gene repórter

mais utilizado atualmente. Ele codifica para a B-glucuronidase GUS.• Gene gfp: foi isolado de Aequorea victória (medusa) e codifica para a

‘grenn fluorescent protein’ (GFP).

Epicótilo alongado cocultura

Formação pró-gemas

Multiformação de pró-gemas

Multibrotação

Gene uidAGene uidAGene uidAGene uidA

Tipos de transgênicos

Primeira geração – Características agronômicas

• São aqueles que já existem no mercado mundial, obtidos com o objetivo de melhorar características agronômicas como a resistência a insetos e doenças e a tolerância a herbicidas. Estes produtos, na maioria dos casos trazem muitos benefícios ao produtor, como por exemplo:– aumento de produtividade;– diminuição de custos de produção, por meio da

redução do uso de defensivos agrícolas e combustível;

– melhoria da qualidade do produto final, com menores índices de fungos e micotoxinas;

Segunda geração – Qualidade alimentar

• São aqueles que já estão sendo pesquisados e incluem os alimentos com maior qualidade (maior teor de nutrientes por exemplo) e que trazem benefícios também ao consumidor, tais como:– Alimentos com maior teor de proteínas e minerais (como o

ferro);– Óleos com teores mais elevados de ácidos graxos do tipo

ômega 3 (mais saudáveis).

Terceira geração – Produtos especiais

• Ainda em fase de desenvolvimento, são os produtos de utilização farmacêutica (vacinas, hormônios, proteínas humanas, biorretores) e industrial (plásticos biodegradáveis e lubrificantes).

Alguns exemplos de plantas geneticamente modificadas

- Tomate longa vida Flavr Savr, produzido pela companhia norte-americana Calgene, com o objetivo de obter frutos com maior conservação. Este tomate transgênico foi o primeiro produto liberado comercialmente para consumo nos Estados Unidos, em 1994.

- Tomate com maior teor de licopeno, pigmento que dá a cor avermelhada ao fruto, é uma substancia antioxidante, que atua no organismo contra vários tipos câncer.

• Arroz dourado, contendo alta concentração de pró-vitamina A.

• A proeza, realizada por pesquisadores da Suíça e Alemanha, foi possível pela introdução de três genes envolvidos na síntese de beta-caroteno (pigmento vegetal), encontrados em uma flor (o narciso-dos-prados), em plantas de arroz.

• Arroz contendo maior concentração de ferro nos grãos, para uso na alimentação humana e animal.

• Soja Roundup Ready (RR) da Monsanto, resistente ao herbicida glifosato. Esta soja traz benefícios ao produtor, pois reduz a aplicação de herbicidas e mão-de-obra, elimina as plantas competidoras, resultando num aumento de produtividade.

• Milho e algodão Bt, resistentes a insetos (certo tipo de lagarta). Estas plantas contém um gene proveniente da bactéria Bacillus thuringiensis, muito comum na natureza, e há muitas décadas usada como inseticida natural, principalmente na agricultura orgânica. Os principais benefícios ao agricultor são a redução do uso de inseticidas, o aumento da produtividade e a qualidade do produto final.

Tomate transgênico com altas doses de antioxidantes protegem contra o câncer

• Tomate com mais licopeno,

• Vacinas,

Produtos em desenvolvimento

• Quanto aos produtos que estão sendo pesquisados e desenvolvidos no Brasil, ainda em caráter experimental, tem-se:

– milho com maior teor de metionina no grão (EMBRAPA);– melão com maior potencial de conservação (UFPEL);– feijão resistente ao vírus do mosaico dourado (EMBRAPA/CENARGEN);– laranja resistente ao cancro cítrico (IAPAR);– batata resistente ao vírus do mosaico PVY (EMBRAPA Hortaliças,

CENARGEN e UFPEL); – soja brasileira resistente ao herbicida glifosato (Roundup) (EMBRAPA

Trigo); – mamão resistente ao vírus da mancha anelar (EMBRAPA/CENARGEN),

o qual foi recentemente liberado pelo Ministério do meio Ambiente para avaliação a campo.

A área plantada com transgênicos cresceu 12% em 2007, com valores globais chegando a 700 milhões de dólares. 

Área global histórica de cultivos transgênicos

Área global de cultivos transgênicos por característica genética

Cultivos com duas ou mais características genéticas transgênicas e são se tornando cada vez mais populares,

ganhando daquelas variedades que mostram apenas resistência a insetos.

Experimentos em campo com cultivos transgênicos na Europa

O número de experimentos em campo com transgênicos na União Européia aumentou discretamente (fonte: European Union, GMO Compass).

Em 2007 o Brasil ultrapassou os EUA em novas áreas de plantio. A Índia continuou seu rápido crescimento, seguida de perto pelo Paraguai, África

do Sul e Uruguai. Em oposição, na Austrália as áreas com cultivos transgênicos continuam em queda.

Área global de plantios transgênicos no mundo, por país.

Principais culturas

A vasta maioria do milho, da soja e de algodão plantado nos EUA é transgênico.

Empresas envolvidas na transformação genética de

plantas

Produtos produzidos em plantas

PGMs em testes

Herbicidas

Alfafa

Algodão

Batata

Beterraba

Canola

Chicória

Linho

Milho

Morango

Soja

Tabaco

Trigo

Insetos

Alfafa

Algodão

Batata

Batata-doce

Beringela

Café

Cana

Canola

Milho

Soja

Vírus

Abóbora

Arroz

Batata

Beringela

Mamão

Melão

Petúnia

Soja

Tomate

Tabaco

Qualidade

Banana

Batata

Café

Canola

Cravo

Crisântemo

Kiwi

Soja

Tomate

Nem tudo são Flores.....

http://www.ambientebrasil.com.br/composer.php3?base=./biotecnologia/index.html&conteudo=./biotecnologia/artigos/royal.html

http://www.ambientebrasil.com.br/composer.php3?base=./biotecnologia/index.html&conteudo=./biotecnologia/artigos/sementes.htmlRelatório britânico condena as sementes

transgênicas

Onde está a prova de que os alimentos transgênicos são, por natureza, inseguros?, pergunta a Royal

Society

Limitações

• Silenciamento de genes

• Especificidade de promotores

• Número de cópias

• Efeito posicional

• Presença de genes marcadores

• Diferenças entre espécies/genótipos