sequenciamento

Seqüenciamento

Prof. Rodrigo Niskier

biomedrodrigo.page.tl

rodrigoniskier@yahoo.com.br

Seqüenciamento

Técnica pela qual a ordem exata dos nucleotídeos em um segmento de

DNA pode ser determinada.

Método de Sanger-Coulson: nucleotídeos terminadores de cadeia

• Necessita de DNA fita simples

• Utiliza apenas um dos primers

• Utiliza dNTPs marcados radioativamente (32P ou 35S-dNTP)

• Utiliza didesoxinucleotídeos (ddNTPs)

Seqüenciamento automático de DNA

• Utilização de marcadores fluorescentes ligados a cada um dos ddNTPs

• Ocorre apenas uma reação de seqüenciamento como os 4 ddNTPs

• Moléculas terminadas com ddNTPs diferentes podem ser identificadas por meio de seus sinais fluorescentes distintos

Seqüenciamento automático de DNA

• A amostra pós-PCR é aplicada num gel ou em um capilar de poliacrilamida e então passado por um detector de fluorescência

• O detector identifica o sinal fluorescente emitido pelas bandas e transmite os dados para o computador

• O computador converte a informação na seqüência de DNA apropriada.

• A seqüência pode ser impressa para análise ou enviada para um arquivo para ser analisada por softwares específicos

Seqüenciamento automático de DNA

Análise do seqüenciamento

TAAAGTCCAGAGCCACCATCCTGGCCGCAGGTAGCCGCTGGTCTCCGGGGTCATCTAGCGTCCGACCTCGGAGCGTGCATCCCAGGACGGTGACACCCTCCCCTGAGCTTCGGCGGCCACACAACCTTCCAGGGAGCTACAATGGAAGAATCACAGGCAGAACTCAATGTGGAGCCCCCTCTGAGTCAGGAGACATTTTCCGACTTGTGGAACCTACTTCCTGAAAATAACCTTCTGTCCTCCGAGCTCTCCGCACCCGTGGATGACCTGCTCCCGTACACAGATGTTGCCACCTGGCTGGATGAATGTCCGAATGAAGCGCCCCAAATGCCAGAGCCTTCTGCCCCAGCTGCCCCGCCACCAGCCACCCCAGCACCAGCCACCTCCTGGCCCCTGTCGTCCTTTGTCCCCTCCCAGAAGACCTACCCTGGCAATTACGGTTTCCGTCTAGGGTTCCTGCAATCCGGAACAGCCAAGTCCGTGACCTGCACGTATTCCCCTTCCCTTAACAAGCTGTTCTGCCAGCTGGCCAAGACCTGCCCAGTGCAGCTGTGGGTCGACTCGCCACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGAAGTTGGAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGCGTTGTCCCCACCATGAGCGCTCCTCTGACTATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCACCTTATCCGGGTGGAAGGGAATTTACGCGCGGAGTATTTGGACGACCGGAACACCTTTAGACACAGTGTGGTGGTGCCCTATGAGTCCCCCGAGATCGACTCTGAGTGCACCACCATCCACTACAATTTCATGTGTAACAGCTCCTGCATGGGGGGCATGAACCGGCGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCTTGTGGTAACCTGCTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGCCGCACTGAGGAAGAAAATCTTCGCAAGAAGGGGCAGTCTTGCCCCGAGCCACCCCCTAGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCTACCAACACCAGCTCCTCTCCACAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGAGAGTACTTCACTCTTCAGATCCGTGGGTTTAAACGCTATGAGATGTTCCGAGAGCTGAATGATGCCTTGGAGCTGAAGGATGCTCTGGATGGAAGGGAACCAGGGGAAAGCAGGGCTCACTCTAGCCACCTGAAGTCTAAGAAGAGGCCTTCTCCCTCCTGCCATAAAAAACCAATGCTCAAGAGAGAGGGACCTGACTCAGACTGATGTCTTCTGCTTCCTGTCACCTGTTGACATCCCCACCCATATCCCCTGCTCCTTCCCTGGCATTTTTTAAGACTCAGGTGCTTAGACCTCTGCTTGGTGCAGGTGCGCCTTAGAAACCCCCTGGGAGTCTTCATCTGCTCAGCCTGTGGCTGTGCTAAAGAGGCAGACCTGCGCTCGTGGTTTCTGGGGATTTGGGGGGTGCTGGCGCTTTCCAGCTTAGCTTTCAAGGTTTTTACTGTGAGCCGTGTTCGGGAGAGGTCAGAATGTGTTCCTGCATGTGAGGAACATCTTATAACCAGCCATACACTGGGTTGGAAAACTCAGTCCTCTGCCATACTAGCCAGGGAAGCTATCTTAAGTTGTTCGATTTTCTCCTGACTTCATTGTTCACATCTATAAAAAACTGATAATCATACCTACCTCACGGGGGGTTTGTTGTGAGGGTTAATGAAATAATGTATGTCTGGCCCCAAAACCATTATTTGATTACATAATGTCTGGGACTTAGTGCCTTTTGTGGGTGCTGGTTCTTTGTCCCCCTGGGTGGATGATTTGACAGTTTCTGACTGAATGGCTGGTTAAAGGGAAGAAGTCTCCAAGTCCCTTCTCTCCTGGCCCTGCCAGATCATAACCCCTTGGTGAACCTCAGTGCCAAAGGGGAAAGCTCACCTTATCCTGGATCCCAGTGGCTTCCACCCCTGCTGTATCTGCCAGTACCTGTCTTATTTCCCCCAAATGCTTCCGCAGATTTCTTCTGTACTTTGCAAGGCACACCATGTCACCCACACCCCTCCTCTTCCCTTTTTATATCCCATTTTTTATATCAATTTCTTATTTTACAATAAAACTTTGCTACCAAAAAAAAAAAAAAAA

Análise do seqüenciamento

• Pesquisar cadeias abertas de leitura (ORF – open reading frames) = ATG

• Existem 6 possíveis ORFs

ATTHECATATETHERAT

5´ ATATGATATGATCGACTAGCATC 3´3´ TATACTATACTAGCTGATCGTAG 5´