seminário – dna e cromossomos - 02/07/2004 apresentação: gilka e gustavo

Seminário – DNA e Cromossomos - 02/07/2004

Apresentação: Gilka e Gustavo

Distrofia Muscular Tipo I (DM1):

• Doença autossômica dominante ligada a expansão de repetições CTG na região 3’ não traduzida do gene DMPK (DM protein kinase)

• Indivíduos normais: 5 a 37 repetições

• Indivíduos afetados: 50 a 5000 repetições

• Varias hipóteses são propostas para explicar o surgimento da doença

Expansão de regiões repetitivas:

Replicação desigual do microssatélite:

Nova Replicação:

CélulaNormal

CélulaCom

Expansão

Formação do grampo

Por que a expansão de CTG leva à

distrofia miotônica?

Perguntas sobre o possível efeito da expansão:

Transcrito funcional

Cinase DM

•Só a cinase que sofre e ela teria efeito pleiotrópico?

•A expansão do gene tornaria a cromatina instável?

Local da expansão

x

Hipótese dos autores:

RNA do gene mutante (expandido) se liga aos fatores básicos de transcrição (TFs),

sequestrando-os dos locais de onde eles deveriam atuar.

Se mRNA mutante seqüestra alguns TFs seletivamente, deve

haver um acúmulo dos TFs ligados ao mRNA mutante e

não a outros mRNAs.

Experimento 1• Para testar a premissa anterior foi realizada uma

imunoprecipitação de extratos nucleares com anticorpos contra:– NUP153 (proteína do complexo de poro)– CUG-BP1 (controle – alta afinidade pelo mutante)– PDGRF-â (proteína da membrana)– Sp1 (fator de transcrição) – Soro

• Seguida de RT-PCR do precipitado para verificar em qual destas proteínas o RNA mutante estava ligado e se outros RNAs estavam ligados a elas

Fatores de transcrição (TFs) ligam-se seletivamente ao RNA mutante em células

DM1:

Alelo selvagem

Alelo mutante

Para Sp1 Para RARã

A depleção leva a uma redistribuição dos TFs

dentro da célula afetada?

CROMATINA mRNA mutante

seqüestra os TFs RPN

Experimento 2:

• Extração do núcleo e separação dos componentes:– DNase I : isola fração da

cromatina– RNase : isola fração do

RNP

• Analise de western blot dos TFs (RARã, Sp1 e Sp3, STAT1 e STAT3) por 4,5 semanas para RARã e 3 semanas para os demais.

Miócito

Extrai o núcleo

DNaseICromatina

RNaseRNP

WESTERN

BLOT

Dinâmica da distribuição dos fatores de transcrição nos compartimentos nucleares em células normais

e em células DM1

Células normais Células DM1

Western blot de RARã:

Redistribuição dos TFs (RARã, Sp e STAT) em células afetadas (DM1):

Razão de RARã na cromatina/RNP em quatro

linhagens após 4,5 semanas em cel. Normais e DM1:

Para RARγ:

Redistribuição dos TFs das famílias Sp e STAT após 3 semanas (por

Western blot):

Crom. RNP Crom. RNP

Resultado não convincente

Repetir o procedimento com número fixo de células

Distribuição de RARã na cromatina durante o cultivo para um número fixo de células:

A retirada dos TFs dos seus locais específicos de atuação

diminuiria a expressão dos genes dependentes desses

fatores?

Experimento 3:• Para medir os níveis de mRNAs dos genes

escolhidos, realizou-se uma RT-PCR quatitativa, chamada análise de TaqMan: (“Com quantos ciclos a reação chega a tantos mols de replicons?...”).

• Além disso foi feita um Northern Blot de células antes da indução e depois da indução da expressão de DMPK

Northern Blot de mRNAs de genes específicos antes e depois da indução do gene DMPK:

Níveis relativos de mRNAs em células normais e DM1:

A expressão dos genes que codificam os TFs também é

diminuída, levando a uma maior diminuição da expressão dos genes dependentes desses

fatores.

xmRNA

TF

Levando a:

Baixa na transcrição de TFs

Baixa na transcrição dos genes dependentes dos

TFs

E a doença?

O gene CLCN1 codifica CIC-1,que é um canal de cloro dos músculos esquéleticos,no qual sua alteração implica em uma Distrofia miotônica do tipo 1.

Em células afetadas os níveis de mRNA deste gene é diminuído, devido provavelmente à diminuição de Sp1.

Será que é?

Quando se restabelece o nível de Sp1 na célula afetada (via transdução), o

nível de expressão de CLCN1 também é restabelecido?

Experimento 4:

• Foi feita uma transdução através de um plasmídio com alta expressão de Sp1 e Sp3 a fim de “reabastecer” a célula de Sp1para verificar se os níveis de expressão de CLCN1 aumentariam também.

Níveis de mRNA dos genes CLCN1 e FCGRT após expressão de TFs da família Sp:

Conclusões:

• Os resultados dos experimentos corroboram com a hipótese dos autores de explicação da relação entre a expansão de DMPK e o surgimento da distrofia miotônica do tipo I