seminário – dna e cromossomos - 02/07/2004 apresentação: gilka e gustavo
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Seminário – DNA e Cromossomos - 02/07/2004
Apresentação: Gilka e Gustavo
Distrofia Muscular Tipo I (DM1):
• Doença autossômica dominante ligada a expansão de repetições CTG na região 3’ não traduzida do gene DMPK (DM protein kinase)
• Indivíduos normais: 5 a 37 repetições
• Indivíduos afetados: 50 a 5000 repetições
• Varias hipóteses são propostas para explicar o surgimento da doença
Expansão de regiões repetitivas:
Replicação desigual do microssatélite:
Nova Replicação:
CélulaNormal
CélulaCom
Expansão
Formação do grampo
Por que a expansão de CTG leva à
distrofia miotônica?
Perguntas sobre o possível efeito da expansão:
Transcrito funcional
Cinase DM
•Só a cinase que sofre e ela teria efeito pleiotrópico?
•A expansão do gene tornaria a cromatina instável?
Local da expansão
x
Hipótese dos autores:
RNA do gene mutante (expandido) se liga aos fatores básicos de transcrição (TFs),
sequestrando-os dos locais de onde eles deveriam atuar.
Se mRNA mutante seqüestra alguns TFs seletivamente, deve
haver um acúmulo dos TFs ligados ao mRNA mutante e
não a outros mRNAs.
Experimento 1• Para testar a premissa anterior foi realizada uma
imunoprecipitação de extratos nucleares com anticorpos contra:– NUP153 (proteína do complexo de poro)– CUG-BP1 (controle – alta afinidade pelo mutante)– PDGRF-â (proteína da membrana)– Sp1 (fator de transcrição) – Soro
• Seguida de RT-PCR do precipitado para verificar em qual destas proteínas o RNA mutante estava ligado e se outros RNAs estavam ligados a elas
Fatores de transcrição (TFs) ligam-se seletivamente ao RNA mutante em células
DM1:
Alelo selvagem
Alelo mutante
Para Sp1 Para RARã
A depleção leva a uma redistribuição dos TFs
dentro da célula afetada?
CROMATINA mRNA mutante
seqüestra os TFs RPN
Experimento 2:
• Extração do núcleo e separação dos componentes:– DNase I : isola fração da
cromatina– RNase : isola fração do
RNP
• Analise de western blot dos TFs (RARã, Sp1 e Sp3, STAT1 e STAT3) por 4,5 semanas para RARã e 3 semanas para os demais.
Miócito
Extrai o núcleo
DNaseICromatina
RNaseRNP
WESTERN
BLOT
Dinâmica da distribuição dos fatores de transcrição nos compartimentos nucleares em células normais
e em células DM1
Células normais Células DM1
Western blot de RARã:
Redistribuição dos TFs (RARã, Sp e STAT) em células afetadas (DM1):
Razão de RARã na cromatina/RNP em quatro
linhagens após 4,5 semanas em cel. Normais e DM1:
Para RARγ:
Redistribuição dos TFs das famílias Sp e STAT após 3 semanas (por
Western blot):
Crom. RNP Crom. RNP
Resultado não convincente
Repetir o procedimento com número fixo de células
Distribuição de RARã na cromatina durante o cultivo para um número fixo de células:
A retirada dos TFs dos seus locais específicos de atuação
diminuiria a expressão dos genes dependentes desses
fatores?
Experimento 3:• Para medir os níveis de mRNAs dos genes
escolhidos, realizou-se uma RT-PCR quatitativa, chamada análise de TaqMan: (“Com quantos ciclos a reação chega a tantos mols de replicons?...”).
• Além disso foi feita um Northern Blot de células antes da indução e depois da indução da expressão de DMPK
Northern Blot de mRNAs de genes específicos antes e depois da indução do gene DMPK:
Níveis relativos de mRNAs em células normais e DM1:
A expressão dos genes que codificam os TFs também é
diminuída, levando a uma maior diminuição da expressão dos genes dependentes desses
fatores.
xmRNA
TF
Levando a:
Baixa na transcrição de TFs
Baixa na transcrição dos genes dependentes dos
TFs
E a doença?
O gene CLCN1 codifica CIC-1,que é um canal de cloro dos músculos esquéleticos,no qual sua alteração implica em uma Distrofia miotônica do tipo 1.
Em células afetadas os níveis de mRNA deste gene é diminuído, devido provavelmente à diminuição de Sp1.
Será que é?
Quando se restabelece o nível de Sp1 na célula afetada (via transdução), o
nível de expressão de CLCN1 também é restabelecido?
Experimento 4:
• Foi feita uma transdução através de um plasmídio com alta expressão de Sp1 e Sp3 a fim de “reabastecer” a célula de Sp1para verificar se os níveis de expressão de CLCN1 aumentariam também.
Níveis de mRNA dos genes CLCN1 e FCGRT após expressão de TFs da família Sp:
Conclusões:
• Os resultados dos experimentos corroboram com a hipótese dos autores de explicação da relação entre a expansão de DMPK e o surgimento da distrofia miotônica do tipo I