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PROPAGAÇÃO CLONAL DO EUCALIPTO Aplicações Biotecnológicas

ALOISIO XAVIER Professor Associado

Departamento de Engenharia Florestal Universidade Federal de Viçosa - BRASIL

Campinas/SP – BrasilAbril - 2011

Microestaquia

Micropropagação

Estaquia

1970

1980

1990

A

I

PR

OP

AG

AÇ

ÃO

CL

ON

AL

DO

EU

CA

LIP

TO

Fonte: Campinhos 2010

Micropropagação - Rejuvenescimento

Microestaquia

Miniestaquia

Minijardim Clonal

Estruturas de Viveiro

Micropropagação (?)

2000

2011

PR

OP

AG

AÇ

ÃO

CL

ON

AL

DO

EU

CA

LIP

TO

Principais Aplicações da Micropropagação em Eucalyptus

(1) Rejuvenescimento/revigoramento de clones selecionados na fase adulta;selecionados na fase adulta;

(2) Embriogênese somática;

(3) Limpeza clonal (Ex.: eliminação de patógenos - Ralstonia solanacearum)

(4) Base para outras técnicas biotecnológicas (ex.: transgênicos).

(5) Intercâmbio de material genético (clone)

ESTRUTURAS

ESTRUTURAS

Fase de Isolamento e

Laboratório de Cultura de Tecidos

A

CB D E

REJUVENESCIMENTO DE CLONES DE Eucalyptus Micropropagacão pela Proliferação de Gemas Axilares

Fase de Alongamento

Fase de Multiplicação

Isolamento e Indução

FGHI

87,5

65,6

93,8

59,4

84,4

90,693

,8

81,2 80

100

78,1

56,3

50

65,668

,8

65,6

80

CLONE CM1 CLONE CM1 CLONE CM2

Enraizamento de MINIESTACAS e MICROESTACASde clones híbridos de Eucalyptus grandis

59,4

37,5

65,6

53,1

81,2

28,1

0

20

40

60

80

Sob

85 (

%)

MN MC MN MC MN MC

0

2000

AIB (ppm)

28,1

18,8

9,4

65,6

28,1

68,8

34,4

65,6

0

0

20

40

60

Sob

85 (

%)

MN MC MN MC MN MC

0

2000

AIB (ppm)

20 dias 25 dias 30 dias

PERMANÊNCIA EM CV

20 dias 25 dias 30 dias

PERMANÊNCIA EM CV

20 dias 25 dias 30 dias

PERMANÊNCIA EM CV

Sobrevivência das mudas aos 85 dias de idade. Fonte : Xavier et al., 2001.

95,8

89,6

100,

0

100,

0

92,7

66,7

87,5

90,6

94,0

86,7

100,

080

100

SOB

50 (%

)

Enraizamento de MINIESTACAS e MICROESTACASde clones híbridos de Eucalyptus grandis

91,7

81,3

100,

0

97,9

89,7

69,8 91

,7

88,5

93,2

84,4

0

20

40

60

SOB

50 (%

)

CC1 Micro

CC1 Mini

CC8 Micro

CC8 Mini

CC11 Micro

CC11 Mini

CC12 Micro

CC12 Mini

MC M

icroM

C mini

21

28

Clones

Dia

s

Sobrevivência das mudas aos 50 dias de idade. Fonte : Titon, 2001.

MICROPROPAGAÇÃO DE HÍBRIDOS DE

Eucalyptus globulus

Teses de mestrado: Borges (2009) e Oliveira (2011)

Dificuldades encontradas na micropropagação dehíbridos de Eucalyptus globulus

Explantereativo

Explantenão reativo

Fonte: Borges (2009)

reativo não reativo

Explantecom bactéria

Explantecom fungo

Explante com oxidação

Hiper-hidricidade

Dificuldades encontradas na micropropagação dehíbridos de Eucalyptus globulus

Oxidação do meio de cultura

Reduzido vigor vegetativo

Fonte: Oliveira (2011)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Tax

a de

mul

tipl

icaç

ão

C01 C04 C16

8,0T

axa

de m

ulti

plic

ação

C26 C29 C30

Micropropagação de clones híbridos de Eucalyptus globulus

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Tax

a de

mul

tipl

icaç

ão

Número de subcultivos

Número médio de tufos de brotações produzidas por explante em cadasubcultivo (taxa de multiplicação) dos clones de Eucalyptus urophylla x E.

globulus (C01, C04 e C16) (A) e Eucalyptus grandis x E. globulus (C26, C29 eC30) (B), em meio MS na fase de multiplicação in vitro, em 25 subcultivos.

Fonte: Oliveira (2011)

Porcentagem de miniestacas (A) e microestacas (B) enraizadas (PME), em dois clones de Eucalyptusurophylla x E. globulus (C04 e C16) e dois de Eucalyptus urophylla x E. globulus (C26 e C30), em

função do tempo após o estaqueamento. (FONTE: OLIVEIRA, 2011)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 7 14 21 28 35

PM

E (%

)

A

YC04 = 54,1312/(1 - 10477 e -0,9658T) R2 = 0,99YC16 = 65,0310/(1 - 155,52 e -0,2351T) R2 = 0,98YC26 = 51,4620/(1 - 14524 e -0,6224T) R2 = 0,99YC30 = 32,2545/(1 + 91369 e -0,6953T) R2 = 0,99

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 7 14 21 28 35

PM

E (

%)

YC04 = 66,5321/(1 - 43305 e -0,7035T) R2 = 0,99YC16 = 58,6702/(1 - 41321 e -0,4733T) R2 = 0,99YC26 = 60,3818/(1 - 11725 e -0,8916T) R2 = 0,99YC30 = 55,0698/(1 - 24017 e -0,6759T) R2 = 0,99

B

MICROESTACAS MINIESTACAS

Dias após o estaqueamento

C04 C16 C26 C30

Dias após o estaqueamento

C04 C16 C26 C30

MINIESTAQUIA

MICROESTAQUIA

Tempo Eficiência

Custos Aplicabilidade

MicropropagaçãoVia EmbriogêneseVia Embriogênese

Somática

Eucalyptus grandis (Fonte: TITON, 2005)

Calo friável de Eucalyptus grandis X E. urophylla (Fonte: Alves 2007)

Fig. 1A-K: Somatic embryogenesis and plant regeneration in Eucalyptus globulus. (A) Aspect of the explant three weeks after induction (B) Embryogenic callus with primary somatic embryos produced on a cotyledon of a zygotic embryo explant. (C) Cluster of primary somatic embryos. (D) and (E) Examples of Cotyledon- stage primary somatic embryos. (F) Emblings from primary somatic embryo conversion. (G) Cluster of secondary somatic embryos. (H) Shoot elongation. (I), (J) and (K) Emblings from secondary somatic embryos in different steps of acclimatization.

FONTE: PINTO et al.; 2010.

ESPÉCIE REFERÊNCIA

Eucalyptus citriodora Muralidharan e Mascarenhas (1987)

Eucalyptus grandis Watt et al., (1991)

Titon (2005)

Alves (2007)

Eucalyptus dunnii Termignoni et al., (1996)

Eucalyptus nitens Ruad et al., (1997)

Embriogênese somática em Eucalyptus

Bandyopadhyay et al., (1999)

Bandyopadhyay e Hamill (2000)

Eucalyptus urophylla Tibok et al., (1995)

Arruda et al., (2000)

Eucalyptus globulus Nugent et al., (2001)

Bandyopadhyay et al., (1999)

Pinto et al., (2008)

Eucalyptus tereticornis Prakash e Gurumurthi (2005)

MICROPROPAGAÇÃO MICROPROPAGAÇÃO DE CLONES DE DE CLONES DE EucalyptusEucalyptus EMEMBIORREATORES DEBIORREATORES DE IMERSÃO TEMPORÁRIAIMERSÃO TEMPORÁRIA

BIORREATORES: Equipamentospara cultivo sob imersão temporária oupermanente de células, gemas, embriões ouqualquer tipo de propágulo que possa serutilizado na micropropagação.

BIORREATORES

RITA®

RECIPIENTE DE IMERSÃO TEMPORÁRIAAUTOMATIZADA RITA®

PESQUISA COM BIORREATOR PESQUISA COM BIORREATOR –– Clones de Clones de EucalyptusEucalyptus

OLIVEIRA, Mila Liparize de, M. Sc., Universidade Federal de Viçosa, setembro de 2009.Micropropagação de clones de Eucalyptus grandis x E. urophylla em biorreatores de

imersão temporária. Orientador: Aloisio Xavier. Coorientadores: Ricardo Miguel Penchel Filho, João Batista Teixeira e Wagner Campos Otoni.

PESQUISA EM ANDAMENTO: Micropropagação de clones híbridos de Eucalyptus globulusem biorreatores de imersão temporária. (CORREIA, Anne Caroline Guieiro, M. Sc., Universidade em biorreatores de imersão temporária. (CORREIA, Anne Caroline Guieiro, M. Sc., Universidade Federal de Viçosa, 2011. Propagação clonal de híbridos de Eucalyptus globulus. Orientador: Aloisio Xavier, Coorientadores: Wagner Campos Otoni e Miranda Titon).

CAPÍTULO 1 - Efeitos do meio de cultura e da relação bap/ana na multiplicação in vitro de clones de Eucalyptus grandis x E. urophylla em biorreator de imersão temporária.

CAPÍTULO 2 - Influência da relação N(NO3 -):N(NH4+) na multiplicação in vitro de Eucalyptus

TESE DE MESTRADO – UFVOLIVEIRA, Mila Liparize de, M. Sc., Universidade Federal de Viçosa, setembro de 2009.Micropropagação de clones de Eucalyptus grandis x E. urophylla em biorreatores de

imersão temporária. Orientador: Aloisio Xavier. Coorientadores: Ricardo Miguel Penchel Filho, João Batista Teixeira e Wagner Campos Otoni.

CAPÍTULO 2 - Influência da relação N(NO3 -):N(NH4+) na multiplicação in vitro de Eucalyptusgrandis x E. urophylla em biorreator de imersão temporária.

CAPÍTULO 3 - Efeito da frequência de imersão e de injeção adicional de ar namultiplicação in vitro de Eucalyptus grandis x E. urophylla em biorreator de imersão temporária.

CAPÍTULO 4 - Alongamento in vitro de multibrotações de Eucalyptus grandis x E. urophyllaem meio semissólido e em biorreatores de imersão temporária.

3:1 2:1 1:1 1:2 1:3

Relações (NO3-/NH4

+)

Influência da relação N(NO3 -):N(NH4+) na multiplicação in vitro de Eucalyptus grandis x E. urophylla em biorreator de imersão

temporária (RITA®).

FONTE: OLIVEIRA, 2009.

0 dias

14 dias

ÁGAR

BiorreatorRITA®

Padrão de brotos produzidos na relação2:1 de N(NO3-):N(NH4+), nos doissistemas de cultivo, ágar e biorreatorRITA®, aos 0,14, 28 e 42 dias de cultivo

28 dias

42 dias

RITA®, aos 0,14, 28 e 42 dias de cultivodo clone de Eucalyptus grandis x E.

urophylla (C1).

FONTE: OLIVEIRA, 2009.

Explantes alongados aos 28 dias da cultura em biorreator de imersão temporária RITA® (A) e diversidade no padrão de alongamento dos brotos (B) do clone de Eucalyptus

grandis x E. urophylla (C1).

FONTE: OLIVEIRA, 2009.

OLIVEIRA, Mila Liparize de, M. Sc., Universidade Federal de Viçosa, setembro de 2009.Micropropagação de clones de Eucalyptus grandis x E. urophylla em biorreatores de imersão temporária. Orientador: Aloisio Xavier. Coorientadores: Ricardo Miguel Penchel Filho, João Batista Teixeira e Wagner Campos Otoni.

PRINCIPAIS PRINCIPAIS DESAFIOSDESAFIOS

Hiper-hidricidade

Calo

Estresse dos explantes

Condição de aclimatação e enraizamento

MICROPROPAGAÇÃO - Tendências

• Automatização dos sistemas de cultura – BIORREATORES;

• Micropropagação em condições fotoautotrópicas.

Acessível;Simplicidade;

Economicamente viável;Operacionalidade em larga escala.

MICROPROPAGAÇÃO MINIESTAQUIA

PROPAGAÇÃO CLONAL DO EUCALIPTO

Aloisio Xavierxavier@ufv.br

Universidade Federal de ViçosaCentro de Ciências Agrárias

Departamento de Engenharia Florestal

Departamento de Engenharia Florestal Viçosa / MG - Brasil