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Everson MorettiRenato Massaharu Hassunuma

Patrícia Carvalho GarciaSandra Heloísa Nunes Messias

PROCESSAMENTOGuia Visual de

HISTOLÓGICO

Everson MorettiBiomédico

Renato Massaharu HassunumaProfessor Titular do Curso de BiomedicinaUniversidade Paulista – UNIPCampus Bauru

Patrícia Carvalho GarciaCoordenadora auxiliar do Curso de BiomedicinaUniversidade Paulista – UNIPCampus Bauru

Sandra Heloísa Nunes Messias Coordenadora Geral do Curso de Biomedicina Universidade Paulista – UNIP

1ª. Edição / 2019Bauru, SP

PROCESSAMENTOGuia Visual de

HISTOLÓGICO

© Renato Massaharu Hassunuma.

Conselho Editorial

BIOMÉDICA KELLY COLUSSI PINHEIRO PRECIPITO

Especialista em Reprodução Humana Assistida pela Associação Instituto Sapientiae

PROFA. DRA. MICHELE JANEGITZ ACORCI VALÉRIO

Universidade Paulista – UNIP, campus Bauru

PROFA. DRA. MARJORIE DE ASSIS GOLIM

Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho“ – UNESPCampus Botucatu

Capa

Everson Moretti. Área de ossificação endocondral em osso longo corada em Hematoxilina e Eosina obtida em microscópio binocular da marca Nikon® modelo E200, uma câmera fotográfica de 5 megapixels da

marca Tucsen®, programa de captura ISCapture® versão 3.5, Notebook da marca Acer® com sistema operacional Windows 7 Home® em objetiva de aumento de 40 vezes.

DesignRenato Massaharu Hassunuma

Créditos das imagens Todas fotos apresentadas no livro foram capturadas por Everson Moretti e Renato Massaharu Hassunuma no Laboratório Anatomed – Laboratório de Anatomia Patológica e Citopatologia de Bauru.

CIP – Brasil. Catalogação na Publicação

M845gGuia visual de processamento histológico /

Everson Moretti, Renato Massaharu Hassunuma, Patrícia Carvalho Garcia, Sandra Heloísa Nunes Messias. – Bauru. Canal 6, 2019.

Inclui bibliografia39 f. : il. color

ISBN: 1. Histologia. 2. Técnicas Histológicas. 3. Obras

pictóricas. I. Moretti, Everson. II. Hassunuma,Renato Massaharu. III. Garcia, Patrícia Carvalho.IV. Messias, Sandra Heloísa Nunes. V. Título

CDU: 591.8

ISBN 978-85-7917-557-2

Nossos agradecimentos ao Prof. Aziz Kalaf Filho, Diretor da Universidade Paulista - UNIP, campus Bauru e Prof. Dr. PaschoalLaércio Armonia, Diretor do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Paulista - UNIP, por todo apoio fornecido ao Curso deBiomedicina da Universidade Paulista - UNIP, campus Bauru no desenvolvimento de eventos, publicações e projetos de extensão.

Agradecemos também a toda equipe do Laboratório Anatomed – Laboratório de Anatomia Patológica e Citopatologia de Bauru,pela sua generosa contribuição ao permitir a utilização do espaço, material e equipamentos, viabilizando a produção das fotosapresentadas neste livro.

Também agradecemos a Biomédica Kelly Colussi Pinheiro Precipito, Profa. Dra. Michele Janegitz Acorci Valério e Profa. Dra.Marjorie de Assis Golim, por suas valiosas considerações na revisão deste material.

Biomédico Everson MorettiProf. Dr. Renato Massaharu Hassunuma

Profa. Dra. Patrícia Carvalho GarciaProfa. Dra. Sandra Heloísa Nunes Messias

Agradecimentos

Apresentação ............................................................................................................................................................................................ 71. Fixação da peça ..................................................................................................................................................................................... 92. Desidratação da peça ............................................................................................................................................................................ 103. Diafanização da peça ............................................................................................................................................................................ 114. Embebição, inclusão e emblocamento .................................................................................................................................................. 125. Posicionamento do bloco histológico no micrótomo ........................................................................................................................... 136. Microtomia ........................................................................................................................................................................................... 147. Separação dos cortes histológicos ........................................................................................................................................................ 158. Pesca do corte ....................................................................................................................................................................................... 169. Distensão em água aquecida ................................................................................................................................................................. 1710. Pesca do corte ..................................................................................................................................................................................... 1811. Desparafinização em estufa ................................................................................................................................................................ 1912. Desparafinização em xilol ...................................................................................................................................................................2013. Hidratação .......................................................................................................................................................................................... 2114. Lavagem .............................................................................................................................................................................................. 2215. Coloração com hematoxilina .............................................................................................................................................................. 2316. Lavagem .............................................................................................................................................................................................. 2417. Diferenciação rápida ........................................................................................................................................................................... 2518. Lavagem .............................................................................................................................................................................................. 26

Sumário

19. Banho em água amoniacal .................................................................................................................................................................. 2720. Lavagem .............................................................................................................................................................................................. 2821. Banho em álcool a 95% ....................................................................................................................................................................... 2922. Coloração com eosina ......................................................................................................................................................................... 3023. Banho em álcool a 100% ..................................................................................................................................................................... 3124. Diafanização ....................................................................................................................................................................................... 3225. Separação do material de montagem .................................................................................................................................................. 3326. Montagem ........................................................................................................................................................................................... 3427. Limpeza ............................................................................................................................................................................................... 3528. Secagem e identificação ...................................................................................................................................................................... 36Referências e sugestões de leitura............................................................................................................................................................. 37

Este livro apresenta uma sequência de fotos que ilustram as etapas que compõem o processamento histológico de rotina. A propostadeste livro foi desenvolver um material de apoio pedagógico na área de Histologia que possa ser utilizado por professores e alunospara explicar de forma breve e simples a produção de uma lâmina histológica em sala de aula.

Foram usados frascos de tamanho relativamente pequenos para representar os líquidos utilizados nas etapas para facilitar as tomadasfotográficas. Mas a representação simbólica destas soluções em nada diminui a importância deste material pedagógico sobre umassunto tão escasso na literatura brasileira.

O tempo gasto em cada etapa descrita no texto e a quantidade de banhos são apenas uma sugestão para um procedimento de rotina.Estes valores podem ser alterados de acordo com a técnica utilizada, natureza do material a ser processado, produtos utilizados, entreoutros fatores.

Apresentação

Guia visual de processamento histológico 7

PROCESSAMENTOGuia Visual de

HISTOLÓGICO

1. Fixação da peça

▪ Material: formol a 10%

▪ Objetivos: preservar o material, evitar a autólise, impedir a ação de microrganismos, endurecer os tecidos e aumentar a afinidade pelos corantes

▪ Procedimento: um banho de tempo variável (de acordo com o tamanho e composição da peça processada)

Guia visual de processamento histológico 9

2. Desidratação da peça

▪ Material: álcoois em concentrações crescentes (70%, 80%, 90% e 100%)

▪ Objetivo: remover o formol a 10% da peça

▪ Procedimento: um banho de uma hora em cada álcool e dois banhos de uma hora no álcool a 100%

Guia visual de processamento histológico 10

3. Diafanização da peça

▪ Material: xilol

▪ Objetivo: remover o álcool da peça e preparar o material para receber a parafina

▪ Procedimento: dois banhos de uma hora

Guia visual de processamento histológico 11

4. Embebição, inclusão e emblocamento

▪ Material: parafina derretida em estufa a 56-60 oC

▪ Objetivo: infiltração da parafina a peça

▪ Procedimento: dois banhos de duas a três horas

Guia visual de processamento histológico 12

5. Posicionamento do bloco histológico no micrótomo

▪ Material: micrótomo

▪ Objetivo: fixação do bloco no micrótomo

▪ Procedimento: remoção do excesso de parafina e posicionamento correto do bloco no micrótomo

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6. Microtomia

▪ Material: micrótomo e navalha de aço

▪ Objetivo: obtenção de cortes histológicos

▪ Procedimento: utilização do micrótomo para obtenção da fita de cortes histológicos por meio do corte com navalha descartável de aço

Guia visual de processamento histológico 14

7. Separação dos cortes histológicos

▪ Material: pinça e água em temperatura ambiente

▪ Objetivo: separação dos cortes histológicos

▪ Procedimento: deposição do corte histológico na superfície da água e isolamento de um corte histológico da fita

Guia visual de processamento histológico 15

8. Pesca do corte

▪ Material: lâmina de vidro histológica

▪ Objetivo: posicionar o corte histológico na lâmina de vidro

▪ Procedimento: encostar a lâmina de vidro junto ao corte histológico na superfície da água. Pescar o corte histológico tracionando a lâmina para fora da água

Guia visual de processamento histológico 16

9. Distensão do corte em água aquecida

▪ Material: água aquecida em banho maria a uma temperatura de cerca de 44 oC

▪ Objetivo: remoção das dobras do corte histológico

▪ Procedimento: deposição do corte histológico na superfície da água e observação da distensão do corte

17Guia visual de processamento histológico

10. Pesca do corte

▪ Material: lâmina de vidro histológica

▪ Objetivo: posicionar o corte histológico na lâmina de vidro

▪ Procedimento: encostar a lâmina de vidro junto ao corte histológico na superfície da água. Pescar o corte histológico tracionando a lâmina para fora da água

18Guia visual de processamento histológico

11. Desparafinização em estufa

▪ Material: suporte de madeira e estufa a 68 oC

▪ Objetivo: remover o excesso de parafina do corte histológico e favorecer a aderência do corte histológico na lâmina de vidro

▪ Procedimento: deixar a lâmina posicionada verticalmente no suporte de madeira dentro da estufa por quarenta minutos

19Guia visual de processamento histológico

12. Desparafinização em xilol

▪ Material: xilol

▪ Objetivo: remover o excesso de parafina do corte histológico

▪ Procedimento: dois banhos de cinco minutos cada

20Guia visual de processamento histológico

13. Hidratação

▪ Material: álcoois em concentrações decrescentes (álcool 100%, 90%, 80%, 70%)

▪ Objetivo: remover o xilol do corte histológico e prepará-lo para a coloração

▪ Procedimento: de cinco a dez mergulhos em cada álcool

21Guia visual de processamento histológico

14. Lavagem

▪ Material: água

▪ Objetivo: remover o álcool do corte histológico e prepará-lo para a coloração

▪ Procedimento: lavar abundantemente em água

22Guia visual de processamento histológico

15. Coloração com hematoxilina

▪ Material: corante hematoxilina

▪ Objetivo: corar estruturas ácidas dos tecidos

▪ Procedimento: um banho de aproximadamente um minuto, sendo o tempo variável de acordo com a temperatura do ambiente

23Guia visual de processamento histológico

16. Lavagem

▪ Material: água

▪ Objetivo: remover o excesso de hematoxilina

▪ Procedimento: lavar abundantemente em água

24Guia visual de processamento histológico

17. Diferenciação rápida

▪ Material: solução de álcool ácido a 1%

▪ Objetivo: aumentar o contraste dos núcleos celulares

▪ Procedimento: um mergulho rápido no diferenciador

25Guia visual de processamento histológico

18. Lavagem

▪ Material: água

▪ Objetivo: remover o excesso de diferenciador

▪ Procedimento: lavar abundantemente em água

26Guia visual de processamento histológico

19. Banho em água amoniacal

▪ Material: solução de água amoniacal a 0,5%

▪ Objetivo: aumentar a tonalidade azulada dos núcleos celulares

▪ Procedimento: um mergulho em água amoniacal

27Guia visual de processamento histológico

20.Lavagem

▪ Material: água

▪ Objetivo: remover o excesso da solução de água amoniacal

▪ Procedimento: lavar em água abundantemente

28Guia visual de processamento histológico

21. Banho em álcool a 95%

▪ Material: solução de álcool a 95%

▪ Objetivo: remover a água do corte e preparar para a coloração com eosina

▪ Procedimento: um banho rápido de dois a três segundos

29Guia visual de processamento histológico

22. Coloração com eosina

▪ Material: corante eosina

▪ Objetivo: corar estruturas básicas dos tecidos

▪ Procedimento: um banho de aproximadamente um minuto, sendo o tempo variável de acordo com a temperatura do ambiente

30Guia visual de processamento histológico

23. Banho em álcool a 100%

▪ Material: álcool a 100%

▪ Objetivo: remover o excesso de eosina

▪ Procedimento: três a cinco mergulhos em três banhos de álcool absoluto

31Guia visual de processamento histológico

24. Diafanização

▪ Material: xilol

▪ Objetivo: remover o álcool a 100%

▪ Procedimento: cinco a dez mergulhos em dois banhos de xilol

32Guia visual de processamento histológico

25. Separação do material de montagem

▪ Material: meio de montagem, xilol, lamínula, lenço de papel, pinça

▪ Objetivo: organizar a bancada para montagem da lâmina

▪ Procedimento: separação do material

33Guia visual de processamento histológico

26. Montagem

▪ Material: meio de montagem, xilol, lamínula, lenço de papel, pinça

▪ Objetivo: inserção da lamínula sobre o corte histológico, utilizando o meio de montagem

▪ Procedimento: depositar uma gota do meio de montagem sobre a lamínula e verter a lâmina sobre a lamínula

34Guia visual de processamento histológico

27. Limpeza

▪ Material: lenço de papel

▪ Objetivo: eliminar excesso de meio de montagem

▪ Procedimento: utilizar um lenço de papel para remover o excesso de meio de montagem

35Guia visual de processamento histológico

28. Secagem e identificação

▪ Material: caneta, lápis ou etiqueta

▪ Objetivo: aguardar a secagem do meio de montagem e identificar a lâmina histológica

▪ Procedimento: aguardar 24 horas para secagem do meio de montagem e identificar a lâmina histológica com caneta, lápis ou etiqueta

36Guia visual de processamento histológico

Gartner LP, Hiatt JL. Tratado de histologia em cores. 3ª ed. Rio de Janeiro: Elsevier; 2007. Capítulo 1, Introdução à histologia e técnicas de histologia básicas; p. 1-10.

Geneser F. Histologia. 3ª ed. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana S.A.C.F.; 2003. Capítulo 2, Métodos histológicos; p. 16-41.

Junqueira LC, Carneiro J. Biologia celular e molecular. 9ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 2012. Capítulo 2, Tecnologia da Biologia Celular e Molecular: alguns exemplos; p. 19-39.

Junqueira LC, Carneiro J, Abrahamsohn P. Histologia básica. 13ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 2017. Capítulo 1, Métodos de estudo em Histologia; p. 1-20.

Patraquim AC. Controlo de qualidade do processamento histológico em histotecnologia: a realidade de 12 hospitais portugueses [dissertação]. Lisboa: Instituto Politécnico de Lisboa, Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Lisboa; 2015 [acesso em 2019 mai04]. Disponível em: https://repositorio.ipl.pt/bitstream/10400.21/5659/1/Controlo%20de%20qualidade%20do%20processamento%20hitol %C3%B3gico%20em%20histotecnologia.pdf.

Prophet EB, Mills B, Arrington JB, Sobin LH. Métodos Histotecnológicos. 1ª ed. Washington: Instituto de Patologia de las Fuerzas Armadas; 1995. Capítulo 9, Hematoxilina y Eosina; p. 55-9.

Referências e Sugestões de Leitura

Guia visual de processamento histológico 37

Randi MAF, Davidson MW. Microscopia de luz. Ribeiro CAO, Reis Filho HS, Grötzner SR. Técnicas e métodos para utilização prática em microscopia. 1ª ed. São Paulo: Santos; 2012. p. 117-163.

Ribeiro CAO. Fixação biológica. Ribeiro CAO, Reis Filho HS, Grötzner SR. Técnicas e métodos para utilização prática em microscopia. 1ª ed. São Paulo: Santos; 2012. p. 1-39.

Ribeiro CAO. Visualização do material: corantes e contrastes. Ribeiro CAO, Reis Filho HS, Grötzner SR. Técnicas e métodos para utilização prática em microscopia. 1ª ed. São Paulo: Santos; 2012. p. 65-84.

Ribeiro CAO, Grötzner SR, Ortolani-Machado CF, Rios FS. Pré-microscopia. Ribeiro CAO, Reis Filho HS, Grötzner SR. Técnicas e métodos para utilização prática em microscopia. 1ª ed. São Paulo: Santos; 2012. p. 41-64.

Ribeiro CAO, Rabitto IS, Mendes ERN, Reis Filho HS , Grötzner SR. Demonstração prática da ação de fixadores, corantes e contrastrantes. Ribeiro CAO, Reis Filho HS, Grötzner SR. Técnicas e métodos para utilização prática em microscopia. 1ª ed. São Paulo: Santos; 2012. p. 85-116.

Ross MH, Pawlina W. Histologia: texto e atlas. 5ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 2008. Capítulo 1, Métodos; p. 1-21.

Guia visual de processamento histológico 38

Este livro apresenta uma breve sequência de fotos que ilustram as etapas que compõem um processamento histológico de rotina.

O objetivo deste livro é servir como ferramenta de apoio pedagógico na área de Histologia, fornecendo um material visual que professores e alunos possam utilizar em sala de aula para explicar a produção de uma lâmina histológica.