producciÓn de invertasa de cellulomonas flavigena y ...€¦ · unidad profesional...
Post on 24-Feb-2021
2 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Munguía Verdi Lorena Página 1
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA UPIBI
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA CINVESTAV
PRODUCCIÓN DE INVERTASA DE Cellulomonas flavigena Y AVANCES EN
LA SINTESIS QUIMICA ENZIMATICA DE IMINOAZÚCARES
Tesis que presenta:
Munguía Verdi Lorena
Para obtener el grado de:
“MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOPROCESOS”
Director interno:
Dr.Marco Augusto Brito Arias
Director Externo:
Dr. Maria del Carmen Montes Horcasitas
México DF Septiembre del 2010
Munguía Verdi Lorena Página 2
ÍNDICE
RESUMEN
1. INTRODUCCIÓN
1.1 INHIBIDORES DE α-GLICOSIDASA
1.2 MECANISMO DE INHIBICIÓN DE LAS GLICOSIDASAS
1.3 PREPARACIÓN DE IMINOAZUCARES
1.4 SINTESIS QUÍMICO ENZIMÁTICA CABOHIDRATOS
1.5 SACAROSA E INVERTASA
1.6 FUENTES DE AISLAMIENTO DE LA INVERTASA
1.7 CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS DE LA INVERTASA
1.8 MECANISMOS DE HIDRÓLISIS DEL ENLACE O-GLICOSIDICO
2. JUSTIFICACIÓN
3. HIPÓTESIS
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
5. MATERIALES Y MÉTODOS
6. METODOLOGÍA
6.1 MICROORGANISMO
6.1.2 PREPARACION DEL INOCULO
6.1.3 OBTENCION DE LA ENZIMA
6.1.4 AISLAMIENTO DE LA ENZIMA
6.1.5 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
1
3
3
5
7
8
10
11
12
14
17
18
19
19
19 20
21 21
21
22
22
23
Munguía Verdi Lorena Página 3
6.2 CARACTERIZACIÓN ENZIMÁTICA
6.2.1 EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA DE INCUBACION SOBRE LA
ACTIVIDAD ENZIMATICA
6.2.3 DETERMINACION DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS (KM Y VMAX
6.2.4 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD HIDRÓLITICA DE LA INVERTASA DE
C.FLAVIGENA SOBRE EL INTERMEDIARIO.
)
6.2.5 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD HIDRÓLITICA DE LA INVERTASA
COMERCIAL DE SACHAROMYCES CEREVISAE SOBRE LOS INTERMEDIARIOS
OBTENIDOS EN LA RUTA SINTÉTICA.
6.2.4 TERMO ESTABILIDAD
6.3 OBTENCIÓN DE LOS AMINO AZÚCARES
7. DESARROLLO EXPERIMENTAL
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
8.1 PRODUCCIÓN
8.2 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA
8.2.1 PH Y TEMPERATURA ÓPTIMA
8.3 TERMO ESTABILIDAD
8.4 PARAMÉTROS CINÉTICOS
8.5 OBTENCIÓN DE LOS IMINOAZÚCARES
9. EVALUACIÓN ENZIMÁTICA
10.CONCLUSIONES
12. BIBLIOGRAFÍA
23 23
24
24
24
25
25
31
35
35
37
41
43
44
42
59
63
65
Munguía Verdi Lorena Página 4
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Figura 2. Figura 3. Figura 4. Figura 5. Figura 6. Figura 7. Figura 8. Figura 9. Figura 10. Figura 11. Figura 12. Figura 13. Figura 14. Figura 15. Figura 16. Figura 17.
Algunas glicoresinas aisladas de plantas del género Ipomoea tricolor
Desconexión entre la subunidad disacárida macrocíclica de la Tricolorina A
I.- Representación ORTEP de una de las conformaciones de la tricolorina
A en estado sólido; II.-Representación gráfica de la celda unitaria. Las
moléculas de la tricolorina A se indican como Mol1-Mol4 y las de agua
como W1-W18
Método de Michael
Método de Fischer
Método de Koenigs-Knorr
Síntesis de O-glicosil-α-tricloroacetimidato
Estrategia general para inducir la formación de enlaces O-glicosídicos
Esquema de la secuencia de la metodología.
Aproximación sintética para la obtención del disacárido D-Fuc-D-Glc (1-6)
lactonizado y condiciones de reacción
Aproximación sintética para la obtención del disacárido D-Fuc-D-Glc (1-4)
lactonizado y condiciones de reacción
Espectro de RMN de 1H en cloroformo deuterado (CDCl3
Espectro de RMN de
) de penta-
acetato de glucosa. 1
Espectro de RMN de
H en cloroformo deuterado del intermediario 1 1
Espectro de RMN de
H en cloroformo deuterado del intermediario 3 1
Espectro de RMN de
H en cloroformo deuterado del intermediario 4 1
Espectro de RMN de
H en cloroformo deuterado del intermediario 7 13
C del intermediario 7
Munguía Verdi Lorena Página 5
1. RESUMEN
La diabetes es una enfermedad que representa un problema de salud de alto
impacto debido a su incidencia y mortandad. Aunque existen diversas estrategias
terapéuticas que permiten controlar este padecimiento, se observan
complicaciones como la falta de respuesta en la producción de insulina por parte
del páncreas, o bien efectos indeseables asociados a tratamientos con estos
agentes hipoglucemiantes. En la búsqueda de alternativas terapéuticas más
eficientes y con mínimos efectos indeseables se plantea la obtención de
iminoazúcares empleando una aproximación quimioenzimática. Este proyecto
plantea en su primera etapa la obtención de la enzima invertasa a partir de una
cepa diferente a las ya reportadas de Cellulomona flavigena que será empleada
en el paso crítico de hidrólisis de los derivados de aminosacarosa 7, 17 para
generar los iminoazúcares 10 y 20 de potencial actividad hipoglucemiante.
La primera etapa del proyecto consistió en obtener invertasa de una fuente
diferente a las ya reportadas (cepa de Cellulomona flavigena) mediante un cultivo
por lote en un reactor tipo tanque agitado, caracterizando la enzima (pH,
Temperatura, parámetros cinéticos y termo estabilidad), seguido del desarrollo de
intermediarios de iminoazucares a partir de sacarosa planteados en tres diferentes
esquemas, los cuales difieren en que el primero y tercero plantean la
incorporación de un grupo amino a la posición 4’ de fructosa y la segunda a la
posición 6 de glucosa de la sacarosa. La estrategia general propone la protección
selectiva de algunas posiciones hidroxílicas del disacárido y posterior secuencia
de tosilación, intercambio por azida y posterior reducción y desprotección para
generar los correspondientes derivados de sacarosa 7 y 17. Una vez instalado el
Munguía Verdi Lorena Página 6
grupo amino en las posiciones antes mencionadas se propone la hidrólisis
enzimática de los derivados de sacarosa modificados para lo cual se emplea
invertasa comercial y aislada de Cellulomona flavigena.
1. INTRODUCCIÓN
Munguía Verdi Lorena Página 7
1.1 SACAROSA E INVERTASA
Todos los organismos vivos (desde microorganismos hasta el hombre) dependen
de miles de diferentes enzimas que catalizan gran cantidad de diferentes
reacciones en las células, su uso ha nivel industrial se ha incrementado durante
los últimos 20 años aplicándose en alimentos, detergentes, métodos analíticos,
medicina,etc.
Las enzimas son catalizadores naturales que al desnaturalizarlas provoca perdida
de sus propiedades catalíticas cuando se exponen a altas temperaturas, alta
acidez o alcalinidad o a solventes orgánicos .
Las fuentes de aislamiento pueden ser de origen vegetal, animal o de algún
microorganismo y actualmente se procura producir enzimas de microorganismos
por disponibilidad, flexibilidad y economía
La sacarosa es un disacárido abundante y accesible que se obtiene de la caña de
azúcar y México ocupa el sexto lugar como productor a nivel mundial y de donde
se extrae del 8 al 15% de sacarosa a partir de la zafra de la caña de azúcar
(www.perafan.com).
La sacarosa es hidrolizada enzimáticamente por la invertasa. El nombre oficial de
la invertasa es β-fructofuranosidasa fructohidrolasa (E.C. 3.2.1.26) también
conocida como beta-fructosidasa o sacarasa. Actúa sobre el enlace 0 - glicosídico
de la sacarosa produciendo una mezcla equimolar de los monosacáridos
α-D-glucopiranosa y α-D-fructofuranosa en cantidades equivalentes (figura 3). Su
nombre se debe a que producto de su hidrólisis cambia su rotación óptica de la
Munguía Verdi Lorena Página 8
sacarosa [+ 66.5] a una rotación negativa, que es promedio de la rotación de la
glucosa [+52.7] y de la fructosa [-92.4].
O O
O OH
OH
OH
HO
HO
OH
OH
OHInvertasa O
OH
HO OH
OH
OH
O OH
HO
HO
OH
OH
+
Sacarosa α-D-glucopiranosa α-D-fructofuranosa
Figura 4. Reacción de hidrólisis de sacarosa por la enzima invertasa.
1.2 FUENTES DE AISLAMIENTO DE LA INVERTASA
La invertasa puede ser extraída tanto de plantas como de microorganismos. En
plantas se ha estudiado en arroz (Oryza Sativa), Bamboo (Chia-Chen Liu, 2005),
pera (Hiroshi Hashizume, 2003), Durazno (Moriguchi, 1991), Papa (Burch, 1992) y
zanahoria (Isla, 1996).
Ha sido aislada de diferentes microorganismos como: Zymomonas mobillis,
Neuroespora crasa, Aspergillus nidulans, Aspergillus Níger, Aspergillus phicum,
Sacharomyces cerevisia, Candida utilis, Fusarium oxyporum, Cellulomonas
flavigena, entre otros.
Munguía Verdi Lorena Página 9
1.3 CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS DE LA INVERTASA
La invertasa puede estar presente en diversas isoformas, las cuales desempeñan
la misma función de hidrólisis; pero, difieren en tamaño, propiedades bioquímicas
y localización celular. Por su localización subcelular, la invertasa puede
clasificarse en: extracelular; intracelular, peri plasmática ò vacuolar, en el caso de
plantas (www.brenda.unikoeln.de).
Las invertasas dependiendo de su pH óptimo se pueden clasificar en: acidas,
básicas o neutras. El rango de pH óptimo reportado en la literatura es de 3.5-7.8;
su temperatura óptima se encuentra entre 50-60ºC. (www.brenda.unikoeln.de).
Tanto en bacterias como hongos la invertasa puede ser intracelular o extracelular.
En Saccharomyces cerevisiae la enzima extracelular tiene un peso molecular
aproximado de 270 KDa y la intracelular es de 60 KDa (jee-Songy col. 1996).
La diferencia que existe en el peso molecular se debe a que la invertasa
extracelular es una glicoproteína que tiene asociada a su cadena polipeptídica
monosacáridos. El porcentaje de estos monosacáridos con respecto a la proteína
total se le conoce como grado de glicolisación que en el caso de la invertasa
puede variar entre 20 y 45%. El grado de glicolisación depende de la fuente de y
localización celular. Estos monosacáridos son generalmente galactosa, N-acetil
Munguía Verdi Lorena Página 10
glucosamina, glucosa, manosa, este ultimo es el mas abundante en algunos tipos
de invertasa (jee-Song y col.1996).
En la siguiente tabla se muestran datos acerca del pH óptimo para las invertasas
provenientes de hongos, bacterias y plantas; su temperatura óptima, la afinidad
por el sustrato para sacarosa, (www.brenda.unikoeln.de).
Tabla 2. Características Bioquímicas de invertasas provenientes de bacterias, hongos
levaduras y plantas
Esta enzima presenta generalmente inhibición por metales pesados. El mercurio
tiene un fuerte efecto inhibitorio para muchas enzimas; sin embargo algunas son
menos sensibles, la invertasa proveniente de Aspergillus niger a concentración
1mM puede conservar entre un 62 a 72% de su actividad enzimática (Hocine y col.
2000)
1.4 MECANISMOS DE HIDRÓLISIS DEL ENLACE O-GLICOSIDICO
Bacterias Intracelulares y Extracelulares Hongos y Levaduras Plantas
Intracelular Extracelular Vac. y
Extarcelular Citosol
pH 3.5 - 5.5 4.5 - 5.5 4.5 - 5.5 4.5- 5 7 - 7.8
Temp(ºC) 40 - 60 50 - 60 50 - 60
Peso molecular 45 - 60 45 - 60 50 - 60 55 - 70 54 -65 Inhibición por metales pesados Si Si Si No
Munguía Verdi Lorena Página 11
Las glicosilhidrolasas son definidas como (EC 3.2.1.x), donde los tres primeros
dígitos indican la propiedad de hidrolizar el enlace O-glicosídico, y el cuarto (x)
indica el tipo de substrato. La hidrólisis del enlace glicosídico catalizada por las
distintas variedades de glicosilhidrolasas está mediada por la acción de dos
residuos catalíticos presentes en el centro activo, uno de los cuales actúa como
donador de protones y el otro como nucleófilo o base. En la mayor parte de los
casos son dos residuos carboxílicos. El enlace glicosídico puede hidrolizarse de
dos formas distintas, atendiendo a cual sea la configuración del carbono
anomérico resultante de la hidrólisis. Una primera posibilidad es que la
configuración anomérica cambie. A la reacción hidrólitica que se desarrolla de esta
forma se la designa como mecanismo de inversión (Figura 2A). La posibilidad
alternativa es que la configuración anomérica se mantenga. Es lo que se
denomina mecanismo de retención (Figura 2B). En las glicosidasas que operan
mediante inversión, la distancia de separación de los dos carboxilos catalíticos es
de aproximadamente 10 Å, mientras que en las enzimas que retienen la
configuración del enlace, la separación es alrededor de 5 Å. El mecanismo de
inversión tiene lugar en una sola etapa, mediante un proceso catalítico ácido-base.
Uno de los dos residuos catalíticos opera como base, facilitando el ataque de una
molécula de agua al carbono anomérico y el otro, como ácido, asistiendo la
separación del oxígeno. El mecanismo de retención tiene lugar mediante un doble
desplazamiento. En este proceso tiene lugar el ataque del residuo nucleófilo al
carbono anomérico. Como resultado tiene lugar la formación transitoria de un
enlace covalente entre la enzima y el glicósido. Este enlace es lo suficientemente
Munguía Verdi Lorena Página 12
estable como para permitir la separación del centro activo de la parte liberada y su
reemplazamiento por una molécula de agua, con asistencia de un segundo
residuo catalítico ácido/base que actúa en la primera etapa como ácido,
protonando el oxígeno glicosídico, y como base en la segunda, sustrayendo un
protón de una molécula de agua que deshace el enlace covalente transitorio y
regenera a la enzima (Flores, 2004).
Munguía Verdi Lorena Página 13
Figura 5. Mecanismos de hidrólisis del enlace glicosídico. El esquema representa la
reacción que ocurre en el sitio catalítico de las glicosil hidrolasas que operan mediante: A,
mecanismo de inversión .B, Mecanismo de retención. Adaptado de Rye and Withers.
Munguía Verdi Lorena Página 14
1.5 INHIBIDORES DE α-GLICOSIDASA
Los inhibidores de α-glicosidasa son compuestos de naturaleza glicosídica que
contienen en su estructura nitrógeno intra o extracíclico. Estos derivados han
cobrado una gran importancia en la terapéutica debido a que al inhibir α-
glicosidasa producen un efecto hipoglucemiante y por consiguiente son de gran
utilidad en el control de glucosa sanguínea en pacientes con diabetes mellitus.
Actualmente el pseudotetrasacárido Acarbosa y el iminoazúcar Miglitol el cual es
un derivado de 1-desoxynojirimicina, son 2 inhibidores de α -glicosidasa
aprobados para su uso en pacientes con diabetes tipo II (Jacob, 1995). Otros
candidatos que se encuentran en fase clínica avanzada son castanopermina,
swainsonina, kifunensina, y desoximanojirimicina entre otros representados en la
figura 1.
N
OH
HOHO
HO
castanospermina
NHOH
HOHO
HO
desoximannonojirimicina
NHO
NHO
HOOH
swainsonina
NH
OO
OHOH
HO
kifunensina
Munguía Verdi Lorena Página 15
OHHOHO
OH
NH
O
OH
OHHO
O O
OH
OHHO
O O
OH
OHHO
OHAcarbosa
N
OH
OH
HO
OH
OH
Miglitol
Figura 1. Estructura de inhibidores de α-glicosidasa usados en el tratamiento de diabetes
mellitus tipo II.
1.6 MECANISMO DE INHIBICIÓN DE LAS GLICOSIDASAS
Las glicosidasas son enzimas que desempeñan un papel importante en el
procesamiento de varias glicoproteínas y glicolípidos, y se ha postulado que el
mecanismo de inhibición procede a través de un estado de transición de media
silla cargado positivamente que interactúa con los residuos de ión carboxilato y
GDP (Guanin Difosfato) en el sitio activo de la enzima como se observa en la
figura 2 (Ichikawa, 1992).
BH
O
NH2
OHHO
OHOH
PO
O
O
O P
O
O
O
O
G OH
OH
Figura 2. Mecanismo de inhibición de iminoazúcares en el sitio de acción de
α-glucosidasa.
Munguía Verdi Lorena Página 16
Asimismo, como se observa en la figura 3 se han determinado las posiciones
dentro de la secuencia glicosídica sobre los cuales los inhibidores de α-
glucosidasa ejercen su actividad inhibitoria (Wong and Kajimoto, 1995).
Glc Glc Glc Man Man Man
Man
Man
ManMan
ManMan
GlcNAc GlcNAc Asn
castanosperminadesoxinojirimicina
N-metildesoxinojirimicina
glucosidasa I
desoxinojirimicinaglucosidasa II
desoximannonojirimicina
mannosidase I
desoximannonojirimicina
mannosidase Imannosidase II
swainsoninakifunensina
Figura 3. Sitios de acción de inhibidores de glicosidasa en la biosíntesis de proteínas.
Munguía Verdi Lorena Página 17
1.7 PREPARACIÓN DE IMINOAZUCARES
El desarrollo de métodos de síntesis asimétrica tanto químicos como enzimáticos
para la obtención de iminoazúcares ha tenido un significativo desempeño y
potencial, generando una importante variedad de sustancias activas en el
tratamiénto del HIV, diabetes, enfermedad de Gaucher, y cáncer. (Brito-Arias,
2006). Algunas de las rutas sintéticas descritas con éxito incluyen aproximaciones
tipo azida a partir de monosacáridos (Ichikawa, 1998; Roy, 2006), así como por
síntesis enantioselectiva de tipo química y enzimática. Para el primer caso se ha
reportado la síntesis enantioselectiva en presencia de (S)-Prolina como
organocatalizador (Liao, 2006), y para el segundo de aldolasas (Gijsen, 1996) y
lipasas (Look, 1993) a partir de diversos sustratos donantes entre los que se
mencionan 2-azido aldehídos (Hung, 1991), epoxidos (Kanerva, 1993),
cinamaldehido (Wong, 1995), y dihidroxi acetona fosfato (DHAP), seguido por
aminación reductiva.
Munguía Verdi Lorena Página 18
1.8 SINTESIS QUÍMICO ENZIMÁTICA DE CABOHIDRATOS
La síntesis químico enzimática de sustancias de potencial uso terapéutico es una
poderosa herramienta combinatoria ya que aprovecha los beneficios de ambas, es
decir a través de la síntesis orgánica se pueden preparar una amplia variedad de
precursores de manera accesible, y a través de la biocatálisis enzimática para
llevar a cabo
transformaciones con una elevada estéreo especificidad y estéreo selectividad. El
uso de enzimas para llevar transformaciones químicas ha tenido un desarrollo
notable principalmente en la síntesis asimétrica y la resolución cinética de mezclas
racémicas. Recientemente, la desimetrización entendiéndose como la
modificación enzimática que elimina uno o más elementos de simetría como
estrategia para obtener sustancias óptimamente puras, se revela como otra
estrategia de gran potencial (García-Urdiales, 2005).
La síntesis enzimática de carbohidratos requiere principalmente del uso de
aldolasas. Estas enzimas generan hexosas a partir de componentes de tres
carbonos a través de una condensación aldólica. Existen alrededor de 30
aldolasas identificadas y aisladas siendo estas clasificadas en aldolasas tipo 1 y
tipo 2 dependiendo del mecanismo involucrado. Desde el punto de vista sintético
las aldolasas se clasifican en 5 grupos dependiendo del donante y el producto
formado (H.M. Gijsen y colaboradores (1996): Dihidroxiacetona fosfato aldolasa,
Munguía Verdi Lorena Página 19
Piruvato aldolasa, 2-Desoxiribosa 5-fosfato aldolasa, Glicina aldolasa y Otras
aldolasas.
Para el desarrollo de la alternativa química enzimática con la que se desarrollo
este proyecto, se produjo invertasa a partir de una bacteria llamada Cellulomonas
flavigena, la cual es una bacteria gram positiva, sus colonias son de color marfil y
tienen forma de bastón. Posteriormente se probo su actividad hidrólitica en los
intermediarios del sustrato modificado partiendo de sacarosa, que conducen a la
obtención de un iminoazúcar de posible potencial efecto inhibitorio.
Munguía Verdi Lorena Página 20
Tabla 1. Substratos naturales para aldolasas
Munguía Verdi Lorena Página 21
2. JUSTIFICACIÓN
Debido al papel central que tiene la invertasa en la liberación de fructosa y glucosa
a partir de sacarosa se buscan métodos alternativos de purificación de esta
enzima a partir de cepas alternativas a las ya reportadas. Asimismo, su
purificación servirá para llevar a cabo estudios de reconocimiento enzimático
empleando derivados de aminosacrosa los cuales son sintetizados y
caracterizados espectroscópicamente y serán a su vez evaluados como posibles
agentes hipoglucemiantes a través de la inhibición de alfa glucosidasa.
Munguía Verdi Lorena Página 22
3. HIPÓTESIS
La invertasa obtenida de C. flavigena ejercerá su actividad hidrólitica sobre el
enlace O-glicosídico de los derivados de sacarosa modificada 7 (Esquema 1,
pagina 27), 17 (Esquema 2, pagina 29) y 26 (Esquema 3, pagina 30), los cuales
contienen un grupo amino en lugar de hidroxilo en las posiciones 4’ de fructosa y
6’ de glucosa. Esta actividad hidrólitica generará los intermediarios 9 (Esquema 1)
y 18 (Esquema 2), los cuales llevarán a cabo un cierre de anillo para generar los
iminoazúcares 10 y 20 respectivamente.
Munguía Verdi Lorena Página 23
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Producción de la invertasa de C.flavigena
Desarrollar intermediarios vía químico enzimática que conduzcan a un
iminoazúcar de potencial actividad inhibitoria de (-glucosidasa a partir de
sacarosa.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Caracterización cinética de la enzima
Obtención de los intermediarios de la ruta sintética empleada en la
transformaron de la sacarosa hasta el iminoazúcar.
Evaluación de la actividad hidrólitica de la invertasa de C.flavigena sobre
los intermediarios 7,17 y 26.
Evaluación de la actividad hidrólitica de la invertasa comercial de
Sacharomyces cerevisae sobre los intermediarios obtenidos en la ruta
sintética 7,17 y 26.
Munguía Verdi Lorena Página 24
5. MATERIALES Y MÉTODOS
Los reactivos empleados son de grado analítico obtenidos comercialmente
(Sigma-Aldrich Co.) y los disolventes usados fueron destilados previos a su uso.
La purificación de los intermediarios fue llevada a cabo usando como fase
estacionaria silica gel 60 (Merck Co.) y el curso de las reacciones fue monitoreada
por cromatografía en capa fina usando cromatofolios de silica gel 60 y como
sistema revelador solución de sulfato cerico amoniacal seguido por calentamiento.
Los espectros de resonancia magnética nuclear de hidrógeno (1H RMN) y carbono
(13
C RMN) fueron registrados en un espectrómetro Varían 300 Gemini usando
cloroformo deuterado como disolvente.
Para la producción del extracto enzimático se utilizo un reactor de 10 L en un
cultivo por lote, el sustrato fue sacarosa grado reactivo así como todos los
componentes del medio de cultivo. Para su caracterización también se utilizaron
reactivos de grado analítico.
Munguía Verdi Lorena Página 25
6. METODOLOGÍA
6.1.1 Microorganismo
Cellulomonas flavigena CDBB 531, obtenida de la Colección microbiana del
CINVESTAV. La cepa de este microorganismo se resembró cada mes en tubos
de agar inclinados con un medio de conservación específico.
6.1.2 Preparación del inóculo
La producción del extracto enzimático, se realizó en un cultivo por lote. El
crecimiento de Cellulomonas flavigena de un tubo de agar, se resuspendió en 3.3
ml de regulador de fosfatos (1.22 M pH 7) y se transfirió a un matraz Erlenmeyer
nefelométrico de 500 ml con 100 ml de medio conteniendo: 10 g/L Glicerol, 3 g/L
(NH4)2SO4, 0.16 g/L MgSO47H2O, 0.075 g/L NaCl, 0.019 g/L CaCl22H2O, 800
µg/L ZnSO47H2O, 21µg/L MnCl2 4H2O2
, 4mg/mL Tiamina, 0.13mg/mL Biotina, el
cual se incubó a 150 rpm, a 37ºC por 24 h. El crecimiento fue medido por
densidad óptica y se utilizó como inóculo
Munguía Verdi Lorena Página 26
6.1.3 Obtención de la enzima
Se realizó un cultivo por lote, en un reactor tipo tanque agitado con capacidad de
10 L, conteniendo 5 L con la siguiente composición: 10 g/L Sacarosa,3 g/L
(NH4)2SO4,0.16 g/L MgSO47H2O, 0.075 g/LNaCl, 0.019 g/L CaCl22H2O,800 µg/L
ZnSO47H2O,21µg/LMnCl2 4H2O2,120µg/L FeSO4 /H2O,120µg/L CoCl2 6H2O,
0.13µg/L Na2MoO4 2H2O,0.7µg/L CuCl2 H2O,1.1µg/L BaCl2 2H2O,1.25µg/L NiSo4
6H2O,0.75µg/L Na2B4O7 10H2
O,0.65µg/L Kl, 4mg/mL Tiamina, 0.13mg/mL Biotina
y Fosfatos 2 mMoles. El cultivo se incubó durante 32 h a 37°C. Las células se
separaron por centrifugación a 10000 revoluciones por minuto por 40 min a 4°C, y
se utilizaron para el aislamiento, caracterización de la enzima y su uso en la
obtención de los intermediarios de sacarosa modificados.
6.1.4 Aislamiento de la enzima
Como la enzima es intracelular, las células se lavaron con buffer de acetatos y se
adicionó un inhibidor de proteasas (PMSF (Fenilmetilsulfonil floruro) a 1mM).
Posteriormente se rompieron en una prensa francesa (French preassure cell
press. American Instrument.co.inc.) a una presión de 1500 psig (libras por pulgada
cuadrada) . Las células rotas fueron centrifugadas a 10000 revoluciones por
minuto y lavadas con buffer de acetatos, para su posterior caracterización y
utilización en los intermediarios de sacarosa modificada.
Munguía Verdi Lorena Página 27
6.1.5 Determinación de la actividad enzimática
Se utilizó sacarosa al10% p/v, como sustrato en la determinación de la actividad
enzimática.
La actividad fue determinada incubando una cantidad apropiada del extracto
enzimático, sustrato y regulador de Tris HCl 0.1M pH 7, en un volumen final de
1750µL e incubando a 55ºC por 5 min. La liberación de azúcares reductores se
siguió por el método del ácido dinitrosalicílico (DNS) (Miller, 1959) usando una
mezcla equimolar de glucosa y fructosa como estándar. La actividad se expresó
en unidades internacionales (UI). Una unidad internacional (UI) de actividad se
definió como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 µmol de azúcares
reductores equivalentes a fructosa en las condiciones mencionadas. Todos los
ensayos fueron hechos por triplicado y se reportó el valor promedio.
6.2 Caracterización enzimática
6.2.1 Efecto del pH y de la temperatura de incubación sobre la actividad de
invertasa
Se observó el efecto del pH sobre la actividad de la enzima a valores de pH entre
5.5 y 8 en buffer de Tris - HCl 0.1M a la temperatura óptima previamente
determinada. Para la temperatura óptima para la actividad enzimática, se
determinó incubando la enzima en presencia del sustrato por 5 min a
Munguía Verdi Lorena Página 28
temperaturas entre 50-65 ºC. en el buffer antes mencionado al pH que resulto
óptimo para la enzima.
6.2.3 Determinación de los parámetros cinéticos
Para la determinación del Km y Vmax
, se trabajo a los valores óptimos de pH y
temperatura utilizando concentraciones variables de sacarosa (5% al 40%) y para
el cálculo de las constantes, se empleo la representación de Lineaweaver- Burk.
6.2.4 Evaluación de la actividad hidrólitica de la invertasa de C.flavigena sobre el
intermediario.
A 1750 µL de buffer de Tris HCl 0.1M pH 7 conteniendo cada uno de los
intermediarios, disueltos previamente en di-metil-formamida (10% p/v), se
adicionaron 250 µL del extracto enzimático de C. flavigena. La actividad de la
invertasa fue determinada por método de DNS (Miller, 1959).
6.2.5 Evaluación de la actividad hidrólitica de la invertasa comercial de
Sacharomyces cerevisae sobre los intermediarios obtenidos en la ruta sintética.
A 1750 µL de buffer de acetatos 0.1M pH 5.5 conteniendo cada uno de los
intermediarios disueltos previamente en di-metil-formamida (10% p/v) se le
adicionaron 250 µL de una solución enzimática de una invertasa comercial de
Munguía Verdi Lorena Página 29
Sacharomyces cerevisae. La actividad de la invertasa fue determinada por
método de DNS (Miller, 1959).
6.2.4 Termo estabilidad
La estabilidad de la enzima con respecto al tiempo se midió incubando una
cantidad de enzima constante a 55°C tomando alícuotas a diferentes tiempos y
midiendo actividad enzimática por el método del DNS (Miller, 1959)
6.3 Obtención de los Amino azúcares
La metodología sintética para la obtención de los iminoazúcares objeto de nuestro
estudio se basa en los esquemas 1 y 2 que se describe a continuación.
El esquema 1 inicia con la protección selectiva de sacarosa 1 en las posiciones
hidroxílcas 6 y 4 de glucosa para los cual se utiliza benzaldehído dimetilacetal en
medio ácido (Garegg, 1995, Robyt, 1997), generando el intermediario protegido 2.
El siguiente paso consiste en la reacción de tosilación en piridina para incorporar
el ester sulfónico en la posición 4’ de fructosa conteniendo la posición hidroxílica
primaria (Rai, 2005), para generar el intermediario 3. Posterior peracetilación con
anhídrido acético en piridina conduce a la obtención del intermediario 4, este
Munguía Verdi Lorena Página 30
último paso tiene la finalidad de permitir la separación de las señales de los
hidrógenos del disacárido en su espectro de resonancia magnética nuclear de
hidrógeno (1
subsecuente de este intermediario bajo condiciones de hidrogenación catalítica
conduce a la formación intermediario 6 el cual contiene una amina primaria en la
posición 4’ de la fracción de fructosa del disacárido. La remoción final de los
grupos protectores bencilinen y acetato se llevara a cabo con Yodo en metanol y
solución de metóxido de sodio respectivamente para generar el intermediario de
sacarosa isostérico 7.
H RMN) así como favorecer la purificación del disacárido en sistemas
no polares. El intermediario resultante se hace reaccionar con azida de sodio en
DMF para mediante una reacción de sustitución nucleofílica reemplazar el grupo
tosilo por el grupo azida y dar lugar a la formación del intermediario 5. La reacción
El siguiente paso es crítico y consiste en someter el intermediario 7 a la acción de
la enzima hidrólitica invertasa la cual presumiblemente debe reconocer el sustrato
modificado conteniendo el grupo amino en la posición 4’ de fructosa que es un
isóster clásico del alcohol primario del sustrato natural. Si el reconocimiento no es
posible se someterá el intermediario de sacarosa antes mencionado a condiciones
de hidrólisis ácida con la finalidad de separar los monómeros constitutivos,
aunque como se ha documentado existe el riesgo de modificación estructural de
los carbohidratos cuando están sujetos a condiciones ácidas (Brito-Arias, 2006).
Para esta ruta sintética la hidrólisis del disacárido modificado representa la
Munguía Verdi Lorena Página 31
liberación del intermediario de fructosa 9 conteniendo el grupo amino el cual
llevara a cabo una reacción de adición nucleofílica intramolecular (Ichikawa, 1998)
dando lugar a la formación de la imina cíclica la cual por reducción catalítica
conducirá a la formación del imino azúcar 10 que constituye uno de los productos
de interés como sustancia activa de potencial actividad hipoglucemiante.
Esquema 1
OR1O
R1OR2O
OR2 O O
OR3
OR3
R4R3O
OR1O
R1OR2O
OR2 OH
O
OR3
OR3
OR4R3O
1 R1, R2, R3= H, R4 = OH
2 R1 = CH(Ph), R2, R3 = H, R4 = OHi
vii
4 R1 = CH(Ph), R2 , R3 = Ac, R4 = OTs
5 R1 = CH(Ph), R2 , R3 = Ac, R4 = N3
ii
iii
6 R1 = CH(Ph), R2 , R3 = Ac, R4 = NH2
iv
HO+
7 R1, R2 , R3 = H, R4 = NH2
v
OHO
OH
H2NNHO
OH
HOH
HO
vii
8 9
10
3 R1 = CH(Ph), R2 , R3 = H, R4 = OTs
vi
i) PhCH(OMe)2, pTsOH, DMF, 50oC. ii) TsCl, Py, 25oC. iii) Ac2O, Py, t.a. iv) NaN3, DMF. reflujo v) H2, Pd-C, EtOH.vi) a) MeONa-MeOH. b) I2, MeOH. vii) Invertasa. o H3O+. viii) a) 1N HCl. b) H2, Pd-C 10%, EtOH.
Munguía Verdi Lorena Página 32
El esquema 2 propone la protección inicial de sacarosa 1 con benzaldehído
dimetilacetal en medio ácido generando el intermediario 11 el cual es sometido a
condiciones de peracetilación dando lugar al intermediario 12. El siguiente paso
consiste en la remoción del grupo benciliden de las posiciones 4 y 6 de glucosa
para lo cual se emplea yodo en metanol a reflujo (Robyt, 1996) generando el
intermediario parcialmente protegido 13 el cual se hace reaccionar con cloruro de
tosilo en piridina con la finalidad de producir el intermediario 14, el cual contiene el
éster sulfónico en la posición 6 de glucosa. Posteriormente se sigue una
secuencia de pasos similares al esquema 1 consistentes en la reacción con azida
de sodio en DMF e hidrogenación catalítica para dar lugar a la obtención de los
intermediarios 6 y 7 respectivamente. La reacción de desacetilación para generar
el intermediario 15 será un paso previo para la reacción de hidrólisis enzimática
del disacárido modificado antes mencionado el cual contiene el grupo amino en la
posición 6 de glucosa. La acción hidrólitica de invertasa liberará el intermediario
aminado de glucosa 16 el cual llevara a cabo la ciclización intramolecular para
conducir a la imina cíclica que generara después de ser sometida a hidrogenación
catalítica a la formación del iminoazúcar 17 siendo este el producto de interés en
esta síntesis.
Munguía Verdi Lorena Página 33
Esquema 2
OR1
R2R3O
OR3 O O
OR4
OR4
OR5R4O
OR1O
R1'OR2O
OR2 OH
O
OR3
OR3
OR4R3O
1 R1, R2 = OH, R3, R3, R4, R5 = H
11 R1, R2 = O2CH(Ph), R3, R4, R5 = Hi
viii
ii
iii
iv
HO+
v
ix
18 19
20
H
NH2
O
OH
OH
OH
N
OH
OH
HO
H12 R1, R2 = O2CH(Ph), R3, R4, R5 = Ac
13 R1, R2 = OH, R3, R4, R5 = Ac
14 R1 = OTs, R2 = OH, R3, R4, R5 = Ac
15 R1 = N3, R2 = OH, R3, R4, R5 = Ac
16 R1 = NH2, R2 = OH, R3, R4, R5 = Ac
17 R1 = NH2, R2 = OH, R3, R4, R5 = H
vi
vii
i) PhCH(OMe)2, pTsOH, DMF, 50oC. ii) Ac2O, Py, t.a. iii) I2, MeOH reflujo iv) TsCl, Py, t.a., 7 h. v) NaN3, DMF, reflujo 6 h. vi) H2, Pd-C, EtOH. vii) MeONa, MeOH. viii) Invertasa. o H3O+. ix) a) 1N HCl. b) H2, Pd-C 10%, EtOH.
Munguía Verdi Lorena Página 34
Paralelamente se llevo a cabo la ruta descrita en el esquema 3 en donde la
secuencia de reacciones es la misma excepto la utilización de acetónido como
grupo protector de las posiciones 4 y 6 de glucosa en lugar del grupo benciliden.
Esquema 3
O
R1O
R1OR2O
OR2 O O
OR3
OR3
R4R3O
1 R1, R2, R3 = H, R4 = OH
21 R1 = CMe2, R2, R3=H, R4 = OHi
22 R1 = CMe2, R2 , R3 = H, R4 = OTs
24 R1 = CMe2, R2 , R3 = Ac, R4 = N3
ii
iii
25 R1 = CMe2, R2 , R3 = Ac, R4 = NH2
iv
v
23 R1 = CMe2, R2 , R3 = Ac, R4 = OTs
26 R1 , R2 , R3 = H, R4 = NH2
i) C3H6O, 2,2-DMP, pTsOH, t.a. ii) TsCl, Py, 25oC. iii) Ac2O, Py, t.a. iv) NaN3, DMF. reflujo v) H2, Pd-C, EtOH.vi) a) MeONa-MeOH. b) I2, MeOH. vii) Invertasa. o H3O+. viii) a) 1N HCl. b) H2, Pd-C 10%, EtOH.
Munguía Verdi Lorena Página 35
7. DESARROLLO EXPERIMENTAL
Obtención de 4,6-O-Benciliden sacarosa (2).
OO
O
OO
OHOH
OH
OH
OHHO
OHO
HO
OO
OHOH
OH
OH
OHHO
En un matraz bola de 250 mL se mezclan en el siguiente orden sacarosa (grado
reactivo) (5 g, 14.6 mmol), benzaldehído dimetilacetal (6 mL, 39.4 mmol),
dimetilformamida (50 mL), y ácido paratoluensulfónico (0.5 g) y la reacción se
coloca en un evaporador rotatorio a una temperatura de 50o
C durante 1 hora,
monitoreando la reacción por cromatografía en capa fina. Se adiciona trietilamina
(2.4 mL) y se evapora usando una bomba de alto vacío. El residuo se purifica por
cromatografía en columna usando sílica gel 60 como fase estacionaria y un
sistema de elusión hexano-acetato de etilo-metanol (8:2:0.1) para generar el
intermediario 2 (5.0 g, 79.6 %) como melaza.
Munguía Verdi Lorena Página 36
Obtención de 4,6-O-Benciliden-6’-tosil sacarosa (3).
OO
O
OO
OHOH
OH
OH
OHHO
PhO
OO
OO
OTsOH
OH
OH
OHHO
Ph
En un matraz bola de 250 mL se mezclan en el siguiente orden 4,6-O-Benciliden
sacarosa (5.00 g, 11.6 mmol), piridina (135 mL), cloruro de tosilo (6.79 g, 11.6
mmol), y la reacción se agita a temperatura ambiente durante 24 horas. El
producto de reacción se purifica por cromatografía en columna usando sílica gel
60 como fase estacionaria y como fase movil un gradiente de una mezcla hexano-
acetato de etilo, para generar el intermediario 3 (5.4 g, 80 %) como un sólido.
Munguía Verdi Lorena Página 37
Obtención de 4,6-O-Benciliden-1’,3’,4’-tri-O-acetil-6’-tosil sacarosa (4).
OO
O
OO
OTsOH
OH
OH
OHHO
Ph OO
O
OO
OTsOAc
OAc
OAc
OAcAcO
Ph
En un matraz bola de 100 mL se mezclan el intermediario 3 (2.00 g, 5.84 mmol),
piridina (12.6 mL, 159.4 mmol), y anhídrido acético (10 mL, 97.9 mmol) y la
reacción se agita durante 24 horas a temperatura ambiente. El producto de
reacción se coevapora con tolueno (3 x 20 mL) y el residuo se purifica por
cromatografía en columna usando sílica gel como fase estacionaria y como
sistema de elusión un gradiente de hexano-acetato de etilo para generar el
intermediario 4 (2.1 g, 80 %) como sólido.
Munguía Verdi Lorena Página 38
Obtención de 4,6-O-Benciliden-1’,3’,4’-tri-O-acetil-6’-azida sacarosa (5).
OO
O
OO
OTsOAc
OAc
OAc
OAcAcO
Ph OO
O
OO
N3OAc
OAc
OAc
OAcAcO
Ph
En un matraz bola de 100 mL se mezclan el intermediario 4 (2.00 g, 2.5 mmol),
dimetilformamida (13 mL), y azida de sodio (3.3 g, 5.0 mmol), llevando la
reacción a 80o
C durante 8 horas. El producto de reacción se diluye con acetato
de etilo (50 mL) se lava con agua (50 mL), se seca con sulfato de sodio anhidro y
se evapora en rotavapor. El residuo se purifica por cromatografía en columna
usando sílica gel como fase estacionaria y como sistema de elusión un gradiente
de hexano-acetato de etilo para generar el intermediario 5 (2.3 g, 70 %) como
sólido.
Munguía Verdi Lorena Página 39
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
8.1 PRODUCCIÓN
La cinética de crecimiento para la producción de invertasa de C.flavigena se llevo
acabo en una fermentación por lote.
Figura 6. Cinética de crecimiento de Cellulomonas flavigena en sacarosa al 1%.
Actividad hidrólitica ( ), crecimiento ( )
Munguía Verdi Lorena Página 40
Se puede observar en la figura 6 el crecimiento de Cellulomonas flavigena CDBB
531, obtenida de la Colección microbiana del CINVESTAV, realizada en un cultivo
por lote, en un reactor tipo tanque agitado con capacidad de 10 L.
Durante las primeras 22 h el crecimiento fue lineal. Posteriormente se presentó un
crecimiento exponencial de 22 a 37.5 h. A partir de las 37.5 h el crecimiento se
mantiene constante y aproximadamente a las 38 h empieza a decaer.
El máximo de actividad hidrólitica se obtuvo al inicio de la fase estacionaria de
crecimiento e inmediatamente empezó a decaer.
En la literatura es reportado que que la invertasa proveniente de Aspergillus Níger
presenta una fase exponencial de crecimiento en un rango de 35 a 48 horas
(Romero 2000).
La invertasa producida por fermentación de Penicillium chysogenum y
Saccharomyces cerevisae reporta que el crecimiento es lento hasta las 120 horas,
encontrando invertasa intracelular y extracelular (Poonawalla, 1965).
Esta reportado que tanto en hongos como bacterias, la invertasa puede ser
extracelular e intracelular (Jee-Song y col.1996), en esta bacteria fue intracelular,
por lo que se procedió a romper las células, en el sobrenadante se detectó
actividad y con este extracto se procedió a su caracterización.
Munguía Verdi Lorena Página 41
8.2 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA
8.2.1 pH y Temperatura óptima
Para la determinación de pH óptimo se hicieron ensayos con diferentes buffers:
acetatos 0.1 M, fosfatos 0.1 M, citratos fosfatos, maleato 0.1 M y tris HCl 0.1 M.
Los datos de pH óptimo que se encuentran reportados para las invertasas en la
literatura son en su mayoría en el rango ácido. Las invertasas dependiendo de su
pH se clasifican en: acidas, básicas y neutras. La invertasa producida por
Cellulomonas flavigena es una invertasa neutra. Esta mostró actividad a
diferentes pH, alcanzando su máxima actividad en un buffer de Tris HCl a pH
=7. En la siguiente tabla se muestran las máximas actividades en cada uno de los
buffers probados:
Tabla 3. Actividades máximas de invertasa producida por Cellulomonas flavigena en
buffers diferentes
Buffer Actividad UI/ml
Tris HCl 1.4
Tris Maleato 0.57
Fosfatos no presento actividad
Acetatos 0.734
Citratos Fosfatos no presento actividad
Munguía Verdi Lorena Página 42
En la figura 7, se observa que a intervalos muy cerrados de pH la actividad
disminuye aproximadamente un 50%.
Figura 7. Gráfico de actividad hidrólitica en Buffer Tris HCl 0.1 M, 5 minutos
Para la determinación de la temperatura óptima se sometió la enzima a un rango
de entre 55°C y 65 °C de temperatura, en buffer de tris HCl 0.1 M. La máxima
actividad fue obtenida a la temperatura de 55°C. En la siguiente tabla se muestran
las actividades de la enzima a diferentes temperaturas. En la literatura se reporta
para una invertasa de Aspergillus Níger una temperatura optima de 50º C
(L’Hocine et al., 2000).
La invertasa obtenida de esta bacteria proveniente de una planta muestra las
caracteristicas de pH reportadas en la literatura (www.brenda.unikoeln).
Munguía Verdi Lorena Página 43
Tabla 4. Actividades máximas de invertasa producida por Cellulomonas flavigena a
diferentes temperaturas
Temperatura °C Actividad UI / ml
50 No presento
55 1.388478582
60 0.437223043
65 No presento
El siguiente grafico muestra el rango de temperaturas probadas y las actividades
correspondientes cada una.
Figura 8. Gráfico de Temperatura óptima en Buffer Tris HCl 0.1 M, 5 minutos
Munguía Verdi Lorena Página 44
La temperatura óptima se encuentra dentro del intervalo reportado para esta
enzima (www.brenda.unikoeln).
8.3 Termo estabilidad
Una característica deseable en las enzimas es que sean estables. La siguiente
grafica muestra el efecto de la temperatura sobre la actividad de la enzima con la
temperatura óptima (55oC) previamente analizada. Puede observarse que la
actividad disminuye significativamente a los 30 minutos.
Figura 9. Gráfico de Termo estabilidad
Munguía Verdi Lorena Página 45
Se considera una alternativa para hacer más termoestable a una enzima
adicionar glicerol y manitol a diferentes concentraciones.
8.4 PARAMÉTROS CINÉTICOS
Km y Vmax
La cinética de sustrato contra velocidad muestra un comportamiento totalmente
hiperbólico. El valor de Km determinado mediante la representación Lineweaver-
Burk es de 62.5 mmoles / mL. Este valor es más alto a los ya reportados; en la
literatura se encuentra que la afinidad por el sustrato va desde 30 a 45 mmoles
para sacarosa. En cuanto a la Vmax el valor obtenido es de 1.6 mmoles / min
mg.
Munguía Verdi Lorena Página 46
8.5 Obtención de los iminoazúcares
El desarrollo experimental para la obtención de los iminoazúcares inició con la ruta
propuesta en el esquema 1 y consistió en la reacción de protección selectiva de
las posiciones 4 y 6 de la glucosa con benzaldehído dimetilacetal para lo cual se
llevaron a cabo diferentes condiciones experimentales que se muestran en la
siguiente tabla:
Tabla 5. Condiciones experimentales
Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3
Reactivos Benzaldehído
dimetilacetal, ácido
paratoluensulfónico,
dimetilformamida
Benzaldehído,
cloruro de
zinc
Benzaldehído
dimetilacetal, ácido
paratoluensulfónico,
dimetilformamida
Condiciones Temperatura
ambiente, 24 horas
Temperatura
ambiente, 24
horas
1 hora, 60ºC
Referencia R. Khan, K.S. Mufti,
M.R. Jenner,
Carbohydrate
Research 65
(1978), 109-113
Lipták,
Carbohydrate.
Research 116
(1983) 217-
225
H.M.I. Osborn,
Carbohydrates, ed.
Academia Press,
2003, 62
Munguía Verdi Lorena Página 47
Los resultados obtenidos mostraron similitud en sus espectros de RMN de
hidrógeno y en la cromatografía de capa fina. El espectro de 1H RMN del
intermediario 2 parcialmente purificado muestra señales en la región alifática,
vinílica y aromática. En la región entre 3.3 y 4.5 ppm se observa un patrón de
señales multiples sobrepuestas que corresponden a los hidrógenos de la
sacarosa. En 5.4 ppm una señal simple que corresponde al hidrógeno bencílico, y
en la región entre 7.2 y 7.6 una señal múltiple correspondiente a los hidrógenos
aromáticos (figura 1).
Figura 10.- Espectro de 1H RMN del intermediario 2 en CDCl3.
Munguía Verdi Lorena Página 48
El siguiente paso consistió en la reacción de tosilación del intermediario 2
utilizando cloruro de tosilo y piridina a temperatura ambiente durante 24 horas
para generar el intermediario 3. El espectro de 1H RMN del intermediario 3
presenta señales en la región alifática, vinílica y aromática. En campo alto 2.42
ppm se observa una señal simple correspondiente al metilo del grupo tosilo. Entre
4.0 y 4.7 ppm se observa un sistema complejo de señales correspondientes a los
hidrógenos no intercambiables de la sacarosa, así como en 6.0 ppm una señal
simple para el hidrógeno bencílico, y en 6.06 ppm una señal doble (J= 8.4)
correspondiente al hidrógeno de la posición anomérica de glucosa. En 7.6 se
observa un patrón de señales doble y múltiple y en 7.82 ppm una señal doble que
corresponde al sistema monosustituído del grupo benciliden y a los hidrógenos del
grupo tosilo característico de un sistema A2X2
para-sustituido (espectro 2 ).
Munguía Verdi Lorena Página 49
Figura 11.- Espectro de 1H RMN del intermediario 3 en CDCl3
.
Munguía Verdi Lorena Página 50
El espectro de 13
C RMN del intermediario 3 muestra señales en la región vinílica
para los carbonos de los monosacáridos y en la región aromática (figura 3).
Figura 12.- Espectro de 13C RMN del intermediario 3 en CDCl3
.
La reacción de peracetilación se llevó a cabo bajo condiciones de anhídrido
acético en piridina a temperatura ambiente obteniéndose el intermediario 4 aunque
parcialmente acetilado. El espectro de 1
H RMN del intermediario 4 presenta
señales en la región alifática, vinílica y aromática. A campo alto en 2.0 ppm de
Munguía Verdi Lorena Página 51
Observan 2 señales simples que integran para 9 hidrógenos lo que supone que la
Protección se dio solo en posiciones hidroxílicas. En 2.42 ppm se observa una
señal simple correspondiente al metilo del grupo tosilo. De 4.2 a 4.6 ppm se
observa un sistema de señales múltiples correspondientes a 7 hidrógenos no
intercambiables de la sacarosa, en 5.1 ppm una señal múltiple, en 5.5 una señal
doble, en 6.0 una señal doble y en 6.1 ppm una señal simple para el hidrógeno
bencílico. En 7.2 se observa un patrón de señales doble y múltiple y en 7.82 ppm
una señal doble que corresponde al sistema monosustituído del grupo benciliden y
a los hidrógenos del grupo tosilo característico de un sistema A2X2
para-sustituido
(espectro 4).
Munguía Verdi Lorena Página 52
Figura 13.- Espectro de 1H RMN del intermediario 4 en CDCl3
.
El espectro de 13
C RMN del intermediario 4 muestra señales en la región alifática
para los grupos metilo de acetato y tosilo, en la región vinílica para los carbonos
de sacarosa y aromática para los carbonos del grupo benciliden y tosilo. En 170
ppm se observan señales características de carbonilos pertenecientes a los
grupos acetato. (figura 5).
Munguía Verdi Lorena Página 53
Figura 14.- Espectro de 13C MN del intermediario 4 en CDCl3
.
El intermediario 4 se hace reaccionar con azida de sodio en dimetilformamida bajo
condiciones de reflujo generando el intermediario 5. El espectro de 1
H RMN
presenta señales en la región alifática, vinílica y aromática. A campo alto en 2.0
ppm de observa 1 señal simple que integra para 9 hidrógenos lo que supone que
la protección se dio solo en 3 posiciones hidroxílicas. Entre 3.4 y 3.8 ppm se
observan 2 señales doble de doble correspondiente a 2 hidrógenos. Entre 4.4 y
4.6 ppm una señal doble de doble y una señal doble que integran para 2
Munguía Verdi Lorena Página 54
hidrógenos. En 5.16 ppm se observa una señal múltiple que integra para 1
hidrógeno. En 5.6 ppm, 6.1 ppm y 6.2 ppm se observan 2 señales dobles y 1
señal simple que integran para 3 hidrógenos. En campo bajo se observa en 7.4
ppm una señal múltiple que corresponde al anillo aromático del grupo benciliden,
no observándose las señales correspondientes al grupo tosilo lo cual demuestra la
sustitución por el grupo azida (figura 5).
Figura 15.- Espectro de 1H RMN del intermediario 5 en CDCl3
.
Munguía Verdi Lorena Página 55
Paralelamente se llevo a cabo la ruta descrita en el esquema 3 en donde la
secuencia de reacciones es la misma excepto la utilización de acetónido como
grupo protector de las posiciones 4 y 6 de glucosa en lugar del grupo benciliden.
Esquema 3
i) C3H6O, 2,2-DMP, pTsOH, t.a. ii) TsCl, Py, 25oC. iii) Ac2O, Py, t.a. iv) NaN3, DMF. reflujo v) H2, Pd-C, EtOH.vi) a) MeONa-MeOH. b) I2, MeOH. vii) Invertasa. o H3O+. viii) a) 1N HCl. b) H2, Pd-C 10%, EtOH.
iv
vi
O
R1O
R1OR2O
OR2 O O
OR3
OR3
OR4R3O
1 R1, R2, R3, R4 = H
21 R1 = CMe2, R2, R3, R4 = Hi
22 R1 = CMe2, R2 , R3 = H, R4 = Ts
24 R1 = CMe2, R2 , R3 = Ac, R4 = N3
ii
iii
25 R1 = CMe2, R2 , R3 = Ac, R4 = NH2
26 R1, R2 , R3 = H, R4 = NH2
v
23 R1 = CMe2, R2 , R3 = Ac, R4 = Ts
Munguía Verdi Lorena Página 56
La ruta sintética consistió en la preparación inicial del intermediario 21 al hacer
reaccionar sacarosa comercial con acetona y 2,2- dimetoxipropano en medio
ácido. En el espectro de 1
H RMN se observan señales en la región alifática y
vinílica. A campo alto se observan 3 señales simples en 1.2 ppm y 2.7 y 2.8 ppm
que corresponden a los metilos del grupo acetónido y dimetilformamida
respectivamente. En la región de 3.6-4.2 se observa un sistema sobrepuesto de
señales correspondientes a los hidrógenos no intercambiables de la sacarosa
(espectro 6).
Figura 16.- Espectro de 1H RMN del intermediario 21 en CDCl3.
Munguía Verdi Lorena Página 57
El siguiente paso consistió en hacer reaccionar el intermediario 21 con cloruro de
tosilo y piridina a temperatura ambiente durante 24 horas para generar el
intermediario 22. El espectro de 1
H RMN presenta señales en la región alifática,
vinílica y aromática. A campo alto 1.2 ppm se observan 3 señales simples que
corresponden a los metilos del grupo acetónido y al grupo metilo unido al benceno.
Entre 3.4 y 4.2 ppm se observa el sistema complejo de señales correspondientes
a los hidrógenos no intercambiables de la sacarosa y en la región aromática 7.2 y
8.0 ppm se observan 2 señales dobles que corresponden a los hidrógenos unidos
al anillo aromático típicos de un sistema A2X2
para-sustituido.
Figura 17.- Espectro de 1H RMN del intermediario 22 en CDCl3.
Munguía Verdi Lorena Página 58
El intermediario 22 se sometió a condiciones de acetilación bajo condiciones de
anhídrido acético y trietilamina para generar el intermediario 23 a temperatura
ambiente durante 24 horas. El espectro de 1
señales en la región alifática, vinílica y aromática. A campo alto 1.2 ppm se
observan 3 señales simples que corresponden a los metilos del grupo acetónido y
al grupo metilo unido al benceno. En 2.1 se observan señales asignables a los
grupos acetato. Entre 3.7 y 4.7 ppm se observa el sistema complejo de señales
H RMN del intermediario 23 presenta
correspondientes a los hidrógenos no intercambiables de la sacarosa y en la
región aromática 7.2 y 8.0 ppm se observan 2 señales dobles que corresponden a
los hidrógenos unidos al anillo aromático típicos de un sistema A2X2
para-
sustituido.
Munguía Verdi Lorena Página 59
Figura 18.- Espectro de 1H RMN del intermediario 23 en CDCl3
.
El siguiente paso consistió en la reacción de sustitución nucleofílica del grupo
tosilo por el grupo azida seguido por una hidrogenación catalítica para generar el
intermediario reducido 25. El espectro de 1
H RMN muestra señales dobles que
corresponden al acetónido, en 2.0 ppm se observan 3 señales simples para los
grupo acetato, y de 3.2 a 5.0 ppm se muestra un sistema múltiple de señales para
los hidrógenos no intercambiables de la sacarosa (figura 7). Para verificar la
reducción del grupo azida al amino se obtuvo el espectro de infrarrojo
correspondiente, observándose la aparición de una banda ancha entre 3280 y
Munguía Verdi Lorena Página 60
3460 cm-1, así como la ausencia de la banda característica del grupo azida entre
2080 y 2160 cm-1 (ver anexo).
Figura 19.- Espectro de 1H RMN del intermediario 25 en CDCl3
.
Con la finalidad de explicar el porque no se llevaba a cabo la acetilación completa
del intermediario tosilado 3 se sometió a condiciones de peracetilación el
intermediario 2 obteniéndose en este caso el producto peracetilado 12 (esquema
2). El espectro de 1
H RMN de este intermediario muestra 6 señales simples que
integran para 18 hidrógenos lo cual demuestra la acetilación completa del
Munguía Verdi Lorena Página 61
intermediario 2. Entre 3.6 4.4 ppm se observan 3 señales múltiples que integran
para 7 hidrógenos. Entre 5.0 y 5.6 ppm se muestran 3 señales múltiples que
integran para 4 hidrógenos. En 5.8 y 6.4 se muestran 2 señales dobles que
integran para 2 hidrógenos. En campo bajo entre 7.2 y 7.6 ppm se encuentra una
señal múltiple para los hidrógenos aromáticos (figura 8).
Figura 20.- Espectro de 1H RMN del intermediario 12 en CDCl3
.
El correspondiente espectro de 13CRMN del intermediario 12 muestra señales de
carbono en la región alifática, vinílica y aromática, resaltando la presencia de
señales en 170 ppm asignables a los carbonilos de los grupos acetato (figura 9).
Munguía Verdi Lorena Página 62
Figura 21.- Espectro de 13C RMN del intermediario 12 en CDCl3
.
Munguía Verdi Lorena Página 63
9. Evaluación enzimática de los intermediarios
Se llevaron a cabo ensayos de evaluación enzimática de los intermediarios 2 y 21
los cuales contienen las posiciones 4 y 6 de glucosa protegidas con el grupo
benciliden e isopropiliden respectivamente con invertasa comercial y con el
extracto parcialmente puro de Invertasa aislada de Cellulomonas flavígena, como
parte del desarrollo de la primera etapa del proyecto.
Así, los intermediarios 2 y 21 fueron tratados por separado con ácido
dinitriosalicílico (DNS) por 5 min. A 55o
O O
O OH
OH
OH
HO
HO
OH
OH
OHInvertasa O
OH
HO OH
OH
OH
O OH
HO
HO
OH
OH
+
C y posteriormente enfriados con hielo. Los
ensayos fueron negativos, lo cual se observó por la ausencia en el cambio de
coloración. El fundamento de este método indirecto se basa en la capacidad de la
invertasa de reconocer e hidrólizar la sacarosa o algún derivado de esta,
liberando un equivalente de glucosa y fructosa siendo la primera un azúcar
reductor.
Sacarosa α-D-glucopiranosa (reductor) α-D-fructofuranosa
Munguía Verdi Lorena Página 64
Una vez liberado el azúcar reductor (glucosa), este reacciona con ácido
dinitrosalicílico el cual se reduce al ácido 3-amino-5-nitro salicílico, observándose
un cambio de coloración de amarillo a rojo que se cuantifica colorimétricamente a
540-570 nm .
OH
HO
O2N NO2
O
Acido 3,5-dinitrosalicílico
+
CHO
OHH
HHO
OHH
OHH
CH2OH
D-Glucosa
OH
HO
O2N NH2
O
Acido 3,5-dinitrosalicílico
+
COOH
OHH
HHO
OHH
OHH
CH2OH
Acido glucónicoamarillo rojo
La figura muestra un primer vial que contiene el intermediario 2, conteniendo
invertasa comercial y DNS y el segundo glucosa, invertasa y DNS. La ausencia
del cambio de coloración en el primer vial muestra inequívocamente el resultado
negativo para los derivados 2 y 21 tanto con invertasa comercial así como del
extracto parcialmente puro.
Figura. Ensayo de hidrólisis de los intermediarios 2 y 21 por acción de invertasa.
Munguía Verdi Lorena Página 65
A partir de este resultado podemos plantear que la enzima no llevo a cabo la
hidrólisis del enlace glucosídico en ninguno de los intermediarios evaluados
debido a un efecto de impedimento estérico, o bien a la imposibilidad de
interacción de los residuos de aminoácidos del sitio activo con las posiciones 4 y 6
del fragmento de glucosa
Generalmente las hidrolasas actúan mediante un mecanismo ácido – base, donde
el acido aspártico y glutámico actúan como acido y el OH como base. Se
encuentra reportado en la literatura los sitios de la molécula de sacarosa en los
que se da la unión con el sitio activo de la invertasa, estos sitios son: los oxígenos
4′ y 6 ′ de la fructosa y el oxigeno 4 de la glucosa.
Con lo anterior, se puede justificar el que la invertasa de Cellulomonas flavigena y
la invertasa comercial de S.cerevisae no reconocieron el enlace glucosídico para
los intermediarios 2 y 21 ; ya que las posiciones señaladas para la hidrólisis han
sido ocupadas por otras moléculas químicas, lo que ha obstruido el sitio de unión;
o bien ha roto con el mecanismo de ácido - base.
En la siguiente figura se muestran las posiciones de los oxígenos que participan
con el sitio activo.
Munguía Verdi Lorena Página 66
Figura 22. Representación de una molécula de sacarosa por difracción de rayos X en la
que se representan los oxígenos en los que se lleva acabo la unión del sitio activo de la
enzima con la molécula de sacarosa ( ο glucosa y ο fructosa).
En la siguiente tabla se muestra los residuos de aminoácidos que conforman el
sitio catalítico de la invertasa de T.maritima.
Munguía Verdi Lorena Página 67
Tabla 6. Cuerpos de hidrógenos y sitios de unión entre la sacarosa y los residuos de
aminoácidos del sitio activo de la invertasa de T.maritima
Munguía Verdi Lorena Página 68
10. CONCLUSIONES
Se obtuvo una invertasa de una fuente diferente a las ya reportadas, donde
la caracterización de esta coincide con con lo ya reportado en la literatura
para esta enzima
Se obtuvieron avances substanciales en la producción de intermediarios vía
síntesis química, a partir de un sustrato accesible como es la sacarosa que
conducirán a la obtención de un iminoazúcar con posible efecto inhibitorio
de α-glucosidasa.
Se comprobó que los intermediarios 2 y 21 de sacarosa protegida en las
posiciones 4 y 6 de la fracción de glucosa no fueron hidrolizados vía
enzimática, debido a un impedimento esterico en los sitios de la sacarosa
donde encaja el sitio activo de la invertasa.
Munguía Verdi Lorena Página 69
11. RECOMENDACIONES
Concluir con la síntesis química del inhibidor de α- glucosidasa, escalarlo y
caracterizarlo.
Plantear a futuro un estudio comparativo entre el reconocimiento enzimático
de invertasa hacia los aminoazúcares y la actividad hipoglucemiante de
estos hacia alfa-glucosidasa, y que esto permita determinar la correlación
entre reconocimiento y grado de inhibición.
Munguía Verdi Lorena Página 70
12. BIBLIOGRAFÍA
Jee-Song,C.,Saxton,J.,Hemmimg,F.W.,Peberdy,J.F.1996.Purification and
partial characterization of the high a low molecular weigth form (S-and F-
form)of invertasa secreted by Aspergillus nidulans. BBA 1296(2):207-218
Miller,G.L.1959.Use of Dinitrosalicylic and reagent for determination of
reducing sugar.Analytical Chem. 31:426
Ashim Roy, Bassudeb Achari,SukhenduB. Mandal.A short and simple
synthesis of 1-Deoxynojirimycin Derivatives from D-glucose.SYNTHESIS
2006,No.6, pp 1035-1039.
M.Isabel García Moreno, Matilde agular, Carmen Ortiz Mellet and M. Garcia
Fernandez. Intermolecular Benzyl Protection. Organic letters 2006 Vol.8, No
2, pp 297-299.
Nikos g. Oikonomakos, costas Tirandis, demetres D.Leonidas.Iminosugars
as potential inhibitors of Glycogenolysis. J.Med. Chem.2006,49,5687-5701.
Munguía Verdi Lorena Página 71
L′Hocine, L., Wang, Z., Jiang,B.,Xu S. 2000. purification and partial
characterization of fructosyltransferase and invertasa from Aspergillus níger
ASOO23. J. Biotechnol.81(1):73-80
The competitive Emzyme information System http://www.brenda.uni-
Koeln.de/
Ciaran McDonnell,Linda Cronin, Julie L. O′Brien, and Paul V Murphy.A
general synthesys of iminosugars.J.Org.Chem.2004, 69,3565-3568.
Yoshikata Ichikawa, Yasuhiro Igarashi,Mie Ichikawa and yohitomo
Suhara.1-N-Iminosugars:Potential and selective inhibitors of β-
Glycosidades.J.Am.Chem.Soc. 1998, 120, 3007-3018.
Chia-Chen Liu, Li-Chun Huang, Chen- Tien chang and Hsien – Yi Sung.
Purification and characterization of soluble invertasa from suspension
cultured bamboo (Bambusa edulis) cells. Biochemical Science 2005, 64,
1003-1007.
Initial characterization of sucrose-6-phosphate hydrolase from Streptococus
mutans and its apparent identity with intracellular invertasa.Biochemical and
Biophysical Communications, 1979, 89,307-314.
Munguía Verdi Lorena Página 72
Walter A. Szarek, Alexander Zamojski,kamal N. Tiwari, and Eduard R .Ison
A new, facile Method for Cleavage of acetals and dithioacetals in
carbohydrate derivatives . Tetrahedrom Letters , 1986,27, 3827-3830.
Riaz Khizar S. Mufti, and Michael R.JennerSintesys and reactions of 4,6-
acetals of sucrose.Carbohydr. res,1978,65,109-112
C.A., Aguilar-Salinas, O., Velazquez Monroy, F. J. Gómez-Pérez, A.,
González Chávez, A., Lara Esqueda, V., Molina Cuevas, J.A., Rull-Rodrigo,
R. Tapia Conyer, Diabetes Care 2003, 26:2021.
E. García-Urdiales, I. Alonso, V. Gotor, Chem Rev. 2005, 105, 313.
H.J.M. Gijsen, L. Qiao, W. Fitz, C.-H. Wong, Chem. Rev. 1996, 96, 443.
R.R., Hung, J.A. Straub, G.M. Whitesides J. Org. Chem. 1991, 56, 3849.
Y. Ichikawa, Y-C-Lin, D.P. Dumas, G-J. Shen, E. García-Junceda, M.A.
Williams, R. Bayer, C. Ketcham, L.E. Walker, J.C. Paulson, C..-H. Wong, J.
Am. Chem. Soc. 1992, 114, 9283
Munguía Verdi Lorena Página 73
Ichikawa, Y., Igarashi, M., Ichikawa, Y., Suhara J. Am. Chem. Soc. 1998,
120, 3007.
G. S., Jacob Current Opinión in Structural Biology 1995, 5, 605.
L.T. Kanerva, E., Vantinnen Tetrahedron Asymmetry 1993, 4, 85.
G.C., Look., C.H., Fotsch, C.-H:, Wong, Acc. Chem. Res. 1993, 26, 182.
C.-H., Wong, R.L., Halcomb, Y. Ichikara, T., Kajimoto Angew. Chem. Int.
Ed. Engl. 1995, 34, 521.
Darío Patricio Leal, María Inés Isla, Marta Amelia Vattuone and Antonio R.
Sampietro .A hysteretic invertase
Bruce M. Chassy and E. Victoria Porter .Initial characterization of sucrose-6-
phosphate hydrolase from streptococcus mutans and its apparent identity
with intracellular invertasa.
from Equisetum giganteum L .
Phytochemistry, Volume 52, Issue 6, November 1999, Pages 1009-1016
Biochemical and Biophysical Research
Communications ,Volume 89, Issue 1 , 12 July 1979, Pages 307-314
C.-H. Wong Pure & Appl. Chem. 1995, 67, 1609
: M Brito-Arias "Synthesis and Characterization of Glycosides" editorial
Springer 2007
Munguía Verdi Lorena Página 74
"http://en.wikipedia.org/wiki/Reducing_sugar
http://bq.unam.mx/mensajebioquimico
(http://bq.unam.mx/mensajebioquimico)
top related