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Aplicações tecnológicas de Celulases no aproveitamento da biomassa

Luzia T.A.S.Semêdo, DSc.

IV SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE TECNOLOGIAS E TRATAMENTO DE RESÍDUOS - ECOS DE VENEZA 09 Novembro 2011 Casa da Ciência – UFRJ - RJ

Razões ambientais

açúcares

Evolução da produção da cana-de-açúcar etanol e cana-de açúcar

UNICA e MAPA, 2011 Projeto Pró alcool – Inicio em 1975

Produção mundial de bioetanol combustível em 2008 Elaborado com base em RFA (2010)

Uso da Terra no Brasil

ICONE, ESALQ e IBGE.

Área referente ao ano de 2009

Recursos nacionais

• 44% da matriz energética do Brasil é renovável e 13,5% é derivada da cana-de-açúcar; • O Brasil gera aproximadamente 600 milhões de toneladas de resíduos agroindustriais e florestais por ano.

Xarope rico em glicose

Biomassa

Coleta e redução de tamanho

Pré-tratamento

Hidrólise enzimática

Fermentação

Destilação

ETANOL

Leveduras

Pentoses Mecânicos Térmicos Ácidos Álcalis Oxidação

Lignina

Caldeiras

Produção de enzimas

Micro-organismos

Visão Geral do Processo

Paredes, 2011

Biomassa lignocelulósica

Estrutura da Biomassa

Parveen Kumar et al. 2009.

Hemicelulose

Lignina

Celulose Celulose

Hemicelulose

Lignina

Pré-tratamento

Estrutura da celulose homopolissacarídeo de β-1,4 glicose

(forma linear)

β-1,4 Celobiose

Ghosh & Ghosh, 1993

Níveis de organização da celulose cristalina

Hidrólise Enzimática da Celulose

Enzimas do complexo celulásico são inibidas por celobiose e glicose

Fermentação alcóolica

Métodos de trabalho com celulases Fontes de

nutrientes: vantagem dos resíduos agro-

industriais

milhocina Farelo de trigo Dresh cervejeiro

Bagaço de cana de açúcar

Discos de papel enterrados

Meio seletivo de celulose azure 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Fermentações submersas (exemplo)

100mL de meio

1mL da suspensao de esporos

incubação: 4 dias, 30 C, 200 rpm

suspensão de esporos ou

pré-inóculo

300 mL de meio

Retirada de alíquotas diárias para realização de dosagens da concentração de açúcares redutores, celulases e pH

Incubação: 200 rpm, 30 C

Medida da atividade enzimática

1. Atividade endoglucanase / CMCase

3,0 mL CMC 4%, tampão citrato de sódio, pH 4,8

+ 3,0 mL sobrenadante

50 C, até

10 min

Retirada de alíquotas a cada 2 minutos

0,5ml DNS

Dosagem da concentração de açúcares redutores

Mistura reacional

Medida da atividade enzimática

2. Atividade exoglucanase / FPase

1,0 mL tampão citrato de sódio pH 4,8, 50mM

+ 0,5 mL sobrenadante

+

1 tira de papel de

filtro 1,0 X 6,0 cm

(~50mg)

0,5ml DNS

50 C, 60 minutos,

sob agitação

Mistura reacional

Dosagem da concentração de açúcares redutores

1,0 mL solução de celobiose 15mM

+

1,0 mL sobrenadante

3. Atividade β-glicosidase

50 C, 30 minutos,

sob agitação

Dosagem da concentração de glicose

Medida da atividade enzimática

Kit de glicose oxidase P-nitro-fenil-glicosídeo

Métodos analíticos

•Dosagem da concentração de proteína total solúvel (Método de Lowry et al. (1951) ou Bradford (1976)

•Dosagem da concentração de açúcares redutores (Miller, 1959)

redução de 3,5-dinitrosalicitato (de cor amarelo forte) a 3-amino-5-nitro-salicilato (de cor laranja-marrom) f

Leitura a 540nm

DNS

•Dosagem da concentração de glicose

Glicose + ½ O2 + H2O Ácido Glucónico + H2O2

2 H2O2 + 4-Aminoantotipirina + Fenol Quinonaimina + 4 H2O

Glicose oxidase

peroxidase

Leitura a 500nm

•Determinação da atividade específica (UI/ mg de proteína)

• Gel de atividade enzimática (zimogramas)

Gel de poliacrilamida com ou sem SDS (0,2% CMC)

130V, 1h

Incubação à 50 C, pH 4,8 durante 1h

Revelação com Vermelho do Congo

Outras análises

Determinação do efeito da temperatura

Podem ser testadas temperaturas na faixa de 30 C a 100 C.

Determinação do efeito do pH Podem ser testados valores de pH na faixa de 3,0 a 10,0.

Estabilidade da enzima ao pH A enzima podrá ser incubada na temperatura ótima, e nos valores de pH de 3,0 a 10,0, durante um período de tempo variado, de horas até dias.

Estabilidade da enzima a íons metálicos, e outros compostos (EDTA, etc)

Termoestabilidade da enzima

A enzima poderá ser incubada no pH ótimo, e nas temperaturas de 40 C, 50 ºC , 60 ºC, etc, durante um período de tempo variado, de horas até dias.

Caracterização das celulases

Obrigada!

NREL

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