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Escola de Engenharia de Lorena – EEL- USP
Obtenção de óleo extraído da Microalga Chlorella sp
Edson de Almeida Vidal Junior
Lorena
2014
Edson de Almeida Vidal Junior
Obtenção de óleo extraído da Microalga Chlorella sp
Monografia apresentada como exigência para obtenção do grau de Bacharelado em Engenharia química da Escola de engenharia de Lorena EEL USP.
Orientador: Prof. Dr. Messias Borges Silva
Lorena
2014
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Catalogação na Publicação Biblioteca “Cel. Luiz Sylvio Teixeira Leite”
Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo
Vidal Junior, Edson de Almeida
Obtenção de óleo extraído da Microalga Chlorella sp
/ Edson de almeida Vidal junior; orientador Messias
Borges Silva. - Lorena, 2014.
51 p.
Monografia apresentada como requisito parcial
para a conclusão de Graduação do Curso de Engenharia
Química - Escola de Engenharia de Lorena da
Universidade de São Paulo. 2014
Orientador: Messias Borges Silva
1. Cultivo de microalgas.. 2. Chlorella sp. 3.
Extração lipídica. I. Título. II. Silva, Messias
Borges, orient.
Dedicatória
Aos meus pais: Claudia e Edson,
Pela educação e formação de caráter que obtive,
Que mesmo nos momentos mais adversos se dedicaram ao meu futuro,
Renunciando muitas vezes seus sonhos para eu alcançar os meus,
Serão eternamente merecedores do meu amor e minha admiração,
Sou muito grato por ter vocês comigo.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Messias Borges Silva, meu orientador, pela confiança em mim depositada em realizar esse trabalho, muito obrigado pelos conselhos, pela paciência e orientação. À Prof.ª Dra. Patrícia Caroline Molgero da Rós, pelas sugestões, conselhos e simpatia intrínseca sempre que precisei dela. À Prof.ª Dra. Larissa de Freitas Teixeira pelas sugestões e contribuições ao trabalho. Aos Professores Dr. Luís Fernando Figueiredo Faria, Dr. Domingos Sávio Giordani, que contribuíram para a concretização deste trabalho. Aos professores Dr. Ararão Serra e a Prof.ª Dra. Jayne Carlos de Souza Barbosa pela simpática e prontidão em ajudar sempre que precisei, agradeço e admiro os dois pela compaixão com os animais. À minha amiga Carolina R. Tomiello, que foi sempre minha companheira de graduação, obrigado pelos momentos que dividi com você, pela amizade e cumplicidade. À minha amiga de laboratório Carla Loures de Almeida, muito obrigado pela orientação dada durante o trabalho, pelas sugestões e pela convivência, foi uma experiência maravilhosa conviver contigo e acima de tudo ter o prazer de ser seu amigo. A sua energia, proatividade e criatividade contagiam. Seu caráter é admirável. Aos meus pais, Claudia e Edson, por confiarem em mim durante esses cinco anos. Muito obrigado pelo amor, carinho, educação.
Epígrafe
"Ninguém pode construir em teu lugar as pontes que precisarás passar para atravessar o rio da vida. Ninguém, exceto tu, só tu. Existem, por certo, atalhos
sem número, e pontes, e semideuses que se oferecerão para levar-te além do rio, mas isso te custaria a tua própria pessoa: tu te hipotecarias e te perderias.
Existe no mundo um único caminho por onde só tu podes passar. Aonde leva? Não perguntes, siga-o!"
Friedrich Nietzsche
RESUMO O óleo extraído das algas pode ser utilizado para vários fins, tais como: Produção de biodiesel, por exemplo, sendo uma fonte de energia sustentável, pois o seu metabolismo utiliza o gás carbônico que é liberado na queima do combustível, também pode ser utilizado como suplemento alimentar. O meio de cultivo das algas, métodos de secagem da massa úmida e métodos de extração do óleo a partir da massa seca bem como a análise da importância das variáveis no processo e otimização por meio de ferramentas da qualidade foram abordados nesse trabalho. As massas foram secas em estufa e liofilizador. Os métodos de extração testados foram: Método Folch, método de Bligh and Dyer, banho de ultrassom com solvente e ultrassom de sonda com solvente. Os resultados obtidos foram satisfatórios, mostrando que a microalga pode obter um rendimento de até 20%, através da adequação do método de extração, que no trabalho foi o de banho de ultrassom, e da utilização da massa seca em estufa. Palavras-chave: Microalga, Chlorella sp, Lipídeos, Planejamento de experimentos.
ABSTRACT The oil from algae can be used in many ways, for instance, producing biofuel, being a renewable and sustainable energy feedstock, its metabolism uses carbonic gas which is produced on the fuel’s combustion, the oil also can used as food supplement. The cultivation of the algae, the methods to obtain the dry mass, the methods of extracting the oil from the algae and analyzing the importance of the process’s variables and optimizing by using the quality tools, these topics were discussed here. The masses were dried in the kiln and lyophilizer. The tested extraction methods were: Folch method, Bligh and Dyer method, ultrasound bath with solvent and ultrasound probe with solvent. Chlorella sp seems to be a good feedstock of lipids. The right choice of the extraction method which was ultrasound bath with solvent and the use of the more efficient dried mass, which was dried mass in the kiln. Keywords: Microalgae, Chlorella sp., Lipids, Design of Experiments
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Chlorella sp ............................................................................................... 16
Figura 2 - Fotobiorreator ........................................................................................... 17
Figura 3 – Arranjo ortogonal L8 ................................................................................. 22
Figura 4 - Meios de cultivo. ....................................................................................... 24
Figura 6 - Curva de calibração. Concentração versus Absorbância. ......................... 25
Figura 7 - Microalga floculando ................................................................................. 26
Figura 8 - Filtração a vácuo ....................................................................................... 26
Figura 9 - Biomassa filtrada....................................................................................... 27
Figura 10 - Massa seca no liofilizador. ...................................................................... 27
Figura 11 - Massa seca em estufa ............................................................................ 28
Figura 12 - Separação de fases (método FOLCH) .................................................... 29
Figura 13 - Recuperação do solvente no rotaevaporador ......................................... 29
Figura 14 - Separação de fases (método Bligh and Dyer). ....................................... 30
Figura 15 - Ultrassom de sonda. ............................................................................... 31
Figura 16 - Fluxograma ultrassom de sonda. ............................................................ 32
Figura 17 - Ultrassom de banho e centrífuga ............................................................ 32
Figura 18 - Fluxograma ultrassom de banho. ............................................................ 33
Figura 19 - Biomassa autolisada. .............................................................................. 33
Figura 20 - Curva de crescimento do experimento 1. ................................................ 36
Figura 21 - Curva de crescimento do experimento 2. ................................................ 37
Figura 22 - Curva de crescimento do experimento 3. ................................................ 38
Figura 23 - Curva de crescimento do experimento 4. ................................................ 40
Figura 24 - Curva de crescimento do experimento 5. ................................................ 41
Figura 25 - Curva de crescimento do experimento 6. ................................................ 42
Figura 26 - Curva de crescimento do experimento 7. ................................................ 44
Figura 27 - Curva de crescimento do experimento 8. ................................................ 45
Figura 28 – Efeitos dos fatores no crescimento celular. ............................................ 46
Figura 29 - Análise de resíduos (concentração celular) ............................................ 47
Figura 30 - Análise de resíduos (pH inicial) ............................................................... 48
Figura 31 - Análise de resíduos (concentração de nitrato) ........................................ 49
Figura 32 - Análise de resíduos (porcentagem de enchimento) ................................ 50
Figura 33 - Análise de resíduos (temperatura) .......................................................... 51
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Rendimento em galões de óleo por acre no ano ...................................... 14
Tabela 2 - Conteúdo de óleo em algumas espécies de algas ................................... 15
Tabela 3 - Fatores e seus níveis ............................................................................... 23
Tabela 4 - Reagentes utilizados para a preparação do meio de cultivo .................... 23
Tabela 5 - Condições experimentais do experimento 1. ........................................... 35
Tabela 6 - Concentração de alga (g/L) do experimento 1. ......................................... 35
Tabela 7 - Condições experimentais do experimento 2 ............................................ 36
Tabela 8 - Concentração de alga (g/L) do experimento 2. ......................................... 37
Tabela 9 - Condições experimentais do experimento 3. ........................................... 38
Tabela 10 - Concentração de alga (g/L) do experimento 3. ....................................... 38
Tabela 11 - Condições experimentais do experimento 4 .......................................... 39
Tabela 12 - Concentração de alga (g/L) do experimento 4. ....................................... 39
Tabela 13 - Condições experimentais do experimento 5. ......................................... 40
Tabela 14 - Concentração de alga (g/L) do experimento 5. ....................................... 41
Tabela 15 - Condições experimentais do experimento 6 .......................................... 42
Tabela 16 - Concentração de alga (g/L) do experimento 6. ....................................... 42
Tabela 17 - Condições experimentais do experimento 7 .......................................... 43
Tabela 18 - Concentração de alga (g/L) do experimento 7. ....................................... 43
Tabela 19 - Condições experimentais do experimento 8 .......................................... 44
Tabela 20 - Concentração de alga (g/L) do experimento 8. ....................................... 45
Tabela 21 - ANOVA da média para concentração celular ......................................... 47
Tabela 22 - ANOVA da média para concentração celular ......................................... 48
Tabela 23 - ANOVA da média para concentração de nitrato .................................... 49
Tabela 24 - ANOVA da média para % de enchimento .............................................. 50
Tabela 25 - ANOVA da média para temperatura ....................................................... 51
Tabela 26 - ANOVA, SN versus [celular]. .................................................................. 52
Tabela 27 - ANOVA, SN versus [Nitrato]. .................................................................. 52
Tabela 28 - ANOVA, SN versus % de enchimento. ................................................... 53
Tabela 29 - ANOVA, SN versus Temperatura. .......................................................... 53
Tabela 30 - ANOVA, SN versus pH inicial. ................................................................ 53
Tabela 31 - Rendimento de % de óleo/massa seca dos diferentes métodos de
extração a partir das massas secas em estufa e liofilizador. .................................... 56
Tabela 32 - Rendimento da extração lipídica após otimização. ................................ 58
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................................12
2 OBJETIVO E JUSTIFICATIVA ........................................................................................................13
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................................14
3.1 Microalgas ........................................................................................................ 14
3.1.1 Chlorella sp ................................................................................................ 15
3.2 Cultivo .............................................................................................................. 16
3.2.1 Meio de cultivo ........................................................................................... 17
3.3 Métodos de extração de lipídeos. .................................................................... 18
3.3.1 Método Folch ............................................................................................. 18
3.3.2 Método Bligh e Dyer .................................................................................. 19
3.3.3 Extração Soxhlet ........................................................................................ 19
3.3.4 Extração com fluido supercrítico. ............................................................... 19
3.3.5 Extração por pressão e utilizando Hexano como solvente ........................ 19
3.3.6 Extração por ultrassom. ............................................................................. 20
3.3.6.1 Extração com solvente ....................................................................... 20
3.3.6.2 Extração enzimática ........................................................................... 20
3.4 Método de Taguchi .......................................................................................... 20
4 METODOLOGIA ...............................................................................................................................22
4.1 Parte experimental ........................................................................................... 22
4.1.1 Cultivo de Microalga Chlorella sp .............................................................. 22
4.1.2 Preparação do meio de cultivo .................................................................. 24
4.1.3 Obtenção da curva de calibração .............................................................. 25
4.2 Obtenção da massa seca ................................................................................ 26
4.3 Extração de lipídeos ......................................................................................... 28
4.3.1 Método Folch ............................................................................................. 28
4.3.2 Método Bligh and Dyer .............................................................................. 30
4.3.3 Ultrassom de sonda ................................................................................... 31
4.3.4 Ultrassom de banho ................................................................................... 32
4.4 Determinação do rendimento ........................................................................... 34
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ......................................................................................................35
5.1 Cálculos das concentrações celulares de microalgas ...................................... 35
5.2 Análise dos dados utilizando planejamento de experimentos .......................... 46
5.2.1 Análise dos efeitos ..................................................................................... 46
5.2.2 Cálculo da ANOVA e análise dos residuais para os fatores. ..................... 47
5.3 Escolha do melhor meio de cultivo baseado no crescimento celular: .............. 53
5.4 Extração do óleo. ............................................................................................. 54
5.4.1 Método Folch: ............................................................................................ 54
5.4.2 Método de Bligh and Dyer: ........................................................................ 54
5.4.3 Método de ultrassom de sonda: ................................................................. 55
5.4.4 Método do ultrassom de banho: ................................................................ 55
5.5 Otimização da extração de óleo. ...................................................................... 56
6 CONCLUSÃO ....................................................................................................................................59
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................60
12
1 INTRODUÇÃO
Microalgas são os organismos unicelulares com mais rápido crescimento
fotossintetizante e podem completar um ciclo inteiro de crescimento em poucos dias.
Algumas espécies de algas têm um grande conteúdo de óleo (na faixa de 60% de
óleo por peso) e podem produzir cerca de quinze mil galões de óleo por acre (0,4
hectare) por ano, sob condições ótimas (DEMIRBAS, 2011).
Algas crescem naturalmente por todo mundo. Sob condições ótimas, elas podem
ser cultivadas gerando grandes quantidades. Existem mais de cem mil diferentes
espécies de microrganismos pertencentes à família das algas. Existem em várias
formas e cores, desde um minúsculo protozoário numa lagoa até grandes montes de
algas marinhas que habitam o oceano.
Como algas são fáceis de serem cultivadas e podem ser manipuladas para se
produzirem grandes quantidades, sem que haja distúrbio em habitats naturais ou
fontes de alimentos.
O que a alga necessita é água, luz e dióxido de carbono. Algas consomem gás
carbônico, ou seja, através da fotossíntese captam o gás carbônico do ar e
devolvem oxigênio, por essa razão plantas de biodiesel estão sendo construídas
perto das indústrias que liberam uma gran4de quantidade de CO2, reciclando o CO2,
reduzindo assim a poluição (GONÇALVES AL; PIRES JCM; SIMÕES M, 2013).
A produção do óleo da alga por acre depende do tipo da alga, da forma que
ocorre o crescimento e do método de extração. A produção das algas tem o
potencial de superar outros produtos potenciais como o óleo de palma ou de milho.
Especialistas estimam que 140 milhões de galões de biodiesel sejam necessários
para substituir produtos a base de petróleo a cada ano. Para atingir esta meta, as
companhias precisarão somente de uma área de cerca de 95 milhões de acres para
produzir as algas, pequena se comparada aos bilhões de acres de outras fontes
para produção de biodiesel.
A utilização da Chlorella sp como fonte de matéria-prima para obtenção de
lipídios tem-se apresentado uma ótima alternativa para o produção do biodiesel.
Sendo uma alga resistente a contaminação, de rápido ciclo de crescimento e
rendimentos significativos (GRIFFITS; M. J.; HARRISON, S. T, 2009),( LIANG, Y.,
SARKANY, N.;CUI, Y. ,2009).
13
2 OBJETIVO E JUSTIFICATIVA
Objetivo
Este trabalho teve como objetivo comparar métodos de extração do óleo da
microalga Chlorella sp. Os métodos de extração utilizados foram método de Folch,
Bligh and Dyer, Ultrassom de sonda com solvente e ultrassom de banho com
solvente. A otimização da extração foi feita a partir da análise dos métodos de
extração lipídica.
Justificativa
A crescente necessidade de energia e poluição ambiental induz ao estudo de
alternativas para substituir a geração de energia de forma poluente pela energia
limpa para os setores industriais e de transporte. Dessa forma o óleo obtido da alga
é de extrema importância por ser uma fonte em potencial para a produção de
biocombustíveis.
14
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Microalgas
Existem muitas espécies de microalgas e são diversificadas em tamanho,
pigmentação, mecanismo de reprodução, composição e habitat. São organismos
tipicamente aquáticos, embora algumas espécies possam habitar o solo. Elas são
abundantemente encontradas em águas doces e salgadas. Como outras plantas, as
células das algas contém núcleo, um ou mais cloroplastos (SMITH,1950).
Diversos estudos vêm sendo desenvolvidos com microalgas, em relação a
sua utilização na obtenção de diversos compostos com alto valor agregado, como os
ácidos graxos e a biofixação de gás carbônico (CHRISTI, 2013).
Microalgas produzem lipídios na forma de triacilglicerol (LOURENÇO, 2006).
Comparativamente algas produzem mais óleo do que quaisquer outras oleaginosas
que estão atualmente em uso. Muitas espécies de microalgas podem ser induzidas
para acumular quantidades substanciais de lipídios, muitas vezes maior do que 60 %
da sua biomassa (BENEMANN et al., 1980), (HARUM et al., 2010). A Tabela 1
abaixo apresenta os rendimentos de diversas oleaginosas e algas. É importante
ressaltar que existem variações significativas nos rendimentos, mesmo dentro de
uma mesma semente oleaginosa, dependendo de onde ela é cultivada, a variedade,
e a espécie da planta.
Tabela 1 - Rendimento em galões de óleo por acre no ano
Fonte de óleo Rendimento
Algodão 18
Soja 48
Cártamo 83
Girassol 102
Colza 127
Óleo de Palma 635
Microalgas 5000-1500
Fonte: Oakhaven. 2010
Da mesma forma, para as algas, há variações significativas entre os rendimentos
de óleo entre diferentes cepas de algas. A Tabela 2 apresenta os diferentes
15
rendimentos de óleo em relação à matéria seca de em diferentes espécies de algas.
Tabela 2 - Conteúdo de óleo em algumas espécies de algas
Espécie de alga % em peso de óleo
Ankistrodesmus TR-87 28-40
Botyococcus braunii 29-75
Chlorella sp 29
Chlorella protothecoides (autotrófica/heterotrófica)
15-55
Cyclotella DI-35 42
Dunaliella Tertiolecta 36-42
Hantzschia DI-160 66
Nannochloris 31
Nitzschia TR-114 46
Phaeodactylum tricornutum 28-50
Scenedesmus TR-84 31
Stichococcus 45
Tetraselmis suecica 15-32
Thalassiosira pseudonana 21-31
Fonte: Oakhaven. 2010
3.1.1 Chlorella sp
Chlorella é um gênero de algas verdes de uma única célula, pertencente ao filo
Chlorophyta. Ela apresenta forma esférica, de cerca de 5 a 10 micrômetros de
diâmetro sem flagelos. Contem os pigmentos fotossintéticos clorofila verde em seu
cloroplasto (ILLMAN; SCRAGG; SHALES, 2000). Através da fotossíntese, ela se
multiplica rapidamente, necessitando apenas de dióxido de carbono, água, luz solar,
e uma pequena quantidade de minerais para se reproduzir (WEISSMANN et al.,
1992).
É também muito resistente à contaminação, além de possuir crescimento
rápido e cultivo fácil (HUNTLEY; REDALJE, 2007).
O Bioquímico e fisiologista alemão Otto Heinrich Warburg, recebeu o Prêmio
Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1931 por suas pesquisas sobre respiração
celular, também estudou a fotossíntese na Chlorella (WARBURG,1928). Em 1961,
Melvin Calvin, da Universidade da Califórnia, recebeu o Prêmio Nobel de Química
por sua pesquisa sobre os caminhos da assimilação de dióxido de carbono em
16
plantas usando Chlorella. Na Figura 1 pode-se observar a imagem da microalga
Chlorella:
Figura 1 - Chlorella sp
Fonte: National institute for environmental studies.
3.2 Cultivo
O cultivo de microalgas pode ser feito de duas maneiras: sistemas abertos e
sistemas fechados. Sistemas abertos apresentam baixo custo de instalação e fácil
operação. Porém os sistemas abertos são mais suscetíveis à contaminação (XU et
al., 2009). Os sistemas fechados são feitos geralmente em fotobiorreatores. Um
esquema de fotobiorreator pode ser observado na Figura 2.
O fotobiorreator é um equipamento fechado que fornece um ambiente
controlado e permite uma elevada produtividade de microalgas. Como se trata de um
sistema fechado, todos os requisitos de crescimento das microalgas são introduzidos
no sistema e controlados de acordo com a necessidade (SUALI; SARBATLY, 2012).
17
Fotobiorreatores facilitam um melhor controle do ambiente de cultura, tais
como o fornecimento de dióxido de carbono, o abastecimento de água, a
temperatura ideal, a exposição eficiente de luz, a densidade da cultura, os níveis de
pH, a taxa de fornecimento de gás e o regime de mistura (SHEEHAN et al.,1988).
Figura 2 - Fotobiorreator
Fonte: Oilgae,cultivation of algae in photobioreactor.
3.2.1 Meio de cultivo
Para o seu pleno desenvolvimento as microalgas necessitam dispor de
macronutrientes essenciais, micronutrientes e baixas concentrações de vitaminas
(GUILLARD, 1975).
Macronutrientes
Classificam-se como macronutrientes carbono, hidrogênio, oxigênio,
nitrogênio, fósforo, enxofre, potássio, magnésio, silício e ferro que apresentam
funções de grande importância, como constituir a estrutura de biomoléculas,
membranas e do meio intracelular, participar do processo de troca de energia,
regular atividades metabólicas, dentre outras (LOURENÇO, 2006).
Micronutrientes
Quanto aos micronutrientes, os principais são manganês, molibdênio, cobalto,
18
boro, vanádio, zinco, cobre e selênio que participam da estrutura e atividade de
diversas enzimas (LOURENÇO, 2006).
Vitaminas
De acordo com Lourenço (2006) as vitaminas que são usualmente
adicionados aos meios de cultivos são:
Tiamina (B1), que possui função geral de agir como coenzima;
Cianocobalamina (B12) que não possui ainda um papel metabólico
suficientemente elucidado;
Biotina (B7) que atua no transporte de CO2
3.3 Métodos de extração de lipídeos.
Existem alguns métodos para a extração de lipídeos, tais como o método de
Folch e o método de Bligh e Dyer, mais conhecidos na literatura. Há também outros
tipos de extração, como a extração por ultrassom, por pressão, por fluido
supercrítico, soxhlet e utilizando o hexano (MERCER; ARMENTA, 2011).
3.3.1 Método Folch.
Consiste numa mistura de clorofórmio / metanol (2/1) Após a dispersão, toda a
mistura é agitada durante 15-20 min num agitador orbital à temperatura ambiente. A
mistura é filtrada (funil com um papel de filtro dobrado) ou centrifugada para
recuperar a fase líquida.
O solvente é lavado com 0,2 volumes com solução de cloreto de sódio a 0,9
%.Depois da centrifugação e de separação da fase superior, a fase inferior de
clorofórmio contendo lipídios é evaporada a vácuo num rotaevaporador (FOLCH et
al., 1957).
19
3.3.2 Método Bligh e Dyer.
O método de Bligh e Dyer é uma simples adaptação do procedimento de Folch e
foi desenvolvido apenas como um meio econômico (em termos de volumes de
solventes) de extração de lipídios a partir de amostras que contêm relativamente
pouco teor de lipídios e uma alta proporção de água. O método consiste nas
seguintes etapas:
Para cada 1 mL de amostra, adicionar 3,75 mL de 1:2 (volume / volume) de
clorofórmio/metanol com agitação vigorosa, em seguida adicionar 1,25 mL
clorofórmio continuando agitação até o final do preparo da mistura, e após adicionar
1,25 mililitros de água destilada .
Centrifugar a 1000 rotações por minuto, durante 5 minutos.
A fase inferior é extraída com uma pipeta de Pasteur, insere-se a pipeta
delicadamente para não misturar as duas fases, e retira-se cerca de 90% da fase
inferior (a que contem lipídios) (BLIGH; DYER, 1959).
3.3.3 Extração Soxhlet
É um método de extração que utiliza solventes químicos. O óleo é extraído por
meio de lavagens repetidas, ou de percolação, com um solvente orgânico tal como o
hexano ou éter de petróleo, sob refluxo (GREENWELL et al., 2010).
3.3.4 Extração com fluido supercrítico.
Gás carbônico é liquefeito sob pressão e aquecido até ao ponto em que ele tenha
as propriedades de um líquido e de um gás, deste modo o gás carbônico atua como
o solvente para a extração do óleo (AMARO et al., 2011).
3.3.5 Extração por pressão e utilizando Hexano como solvente
Hexano pode ser utilizado sozinho como solvente ou pode ser usado juntamente
com o processo de prensagem de óleo / bagaço. Após o óleo ser extraído do
bagaço, a polpa restante pode ser misturada com ciclo- hexano para extrair o teor de
óleo restante. O óleo dissolve-se no ciclo-hexano, e a polpa é filtrada. O óleo e o
20
ciclo-hexano são separados por meio de destilação. Estes métodos em conjunto
podem extrair cerca de 95% do total de óleo presente nas algas
(REGITANO;D'ARCE, 1987); (SUALI ; SARBATLY, 2012).
3.3.6 Extração por ultrassom.
A sonicação intensa de líquidos gera ondas sonoras que se propagam para o
meio líquido resultando em ciclos alternados de alta e de baixa pressão. Durante o
ciclo de baixa pressão, pequenas bolhas de vácuo são criadas no líquido. Quando
as bolhas atingem um determinado tamanho, elas entram em colapso violentamente
durante o ciclo de alta pressão. Isto é chamado de cavitação. Durante a implosão
jatos de líquidos de alta velocidade e pressão são produzidos localmente. As forças
de cisalhamento resultantes quebram a estrutura celular mecanicamente e
melhoram a transferência de massa (SUALI; SARBATLY, 2012).
A extração por ultrassom pode ser feita utilizando solventes ou enzimas.
3.3.6.1 Extração com solvente
Os ciclos de alta pressão aumentam a difusão de solventes na estrutura da
célula. O hexano é utilizado neste processo. Enquanto o ultrassom rompe a parede
celular mecanicamente, os lipídios se dissolvem no ciclo-hexano. Após esse
procedimento o óleo é separado da polpa por filtração, e em seguida o ciclo-hexano
é separado do óleo por destilação (HALIM et al., 2012).
3.3.6.2 Extração enzimática
Efeitos sinérgicos fortes podem ser observados quando se combina o tratamento
enzimático com sonicação. A cavitação auxilia as enzimas na penetração na
amostra, resultando numa extração mais rápida e com rendimentos mais elevados.
Neste caso, a água atua como um solvente e as enzimas degradam as paredes
celulares (MERCER; ARMENTA, 2011).
3.4 Método de Taguchi
O método de Taguchi foi desenvolvido por Genichi Taguchi para melhorar a
21
qualidade de manufaturados. É muito aplicado na engenharia, biotecnologia,
marketing e publicidade. A utilização do planejamento de experimento é de suma
importância e envolve as seguintes etapas:
- A seleção de variáveis independentes;
- Seleção de número de configurações de nível para cada variável independente;
- Seleção da matriz ortogonal;
- Atribuição das variáveis independentes para cada coluna;
- A realização dos experimentos; e
- Análise dos dados (SANKAR; NELLIAN, 1996).
O método de Taguchi é distinto de outras abordagens para engenharia de
qualidade por parte de alguns conceitos específicos, por exemplo:
- Minimização da função perda de qualidade;
- Maximização da relação sinal-ruído; e
- Matrizes ortogonais.
A estratégia de concepção experimental utilizada no método Taguchi é baseada
em matrizes ortogonais e fatorial fracionada, nas quais nem todas as combinações
possíveis de fatores e níveis são testadas. É útil para estimar os efeitos de fatores
principais no processo. O objetivo principal deste tipo de estratégia é obter o máximo
de informações sobre o efeito dos parâmetros sobre o processo de ensaios
experimentais mínimos. Em adição ao fato de exigir um número menor de
experiências, as matrizes ortogonais ainda permitem testar os fatores usando uma
mistura de número de níveis (SILVA et al., 2013).
22
4 METODOLOGIA
4.1 Parte experimental
A parte experimental foi realizada no laboratório de meio ambiente, localizado na
Escola de Engenharia de Lorena. A metodologia adotada foi a otimização do cultivo
da microalga Chlorella sp e os diferentes métodos de extração foram testados.
4.1.1 Cultivo de Microalga Chlorella sp
O cultivo ocorreu em fotobiorreatores, onde houve uma variação nos fatores de
entrada, conforme planejamento experimental, a fim de obter diferentes resultados e
selecionar o melhor experimento para a extração. Foi utilizado o método de Taguchi
matriz L8, utilizando 5 fatores em dois níveis. Segundo a Figura 3:
Figura 3 – Arranjo ortogonal L8
Fonte: Autoria própria
Os fatores e seus níveis estão representados na Tabela 3:
23
Tabela 3 - Fatores e seus níveis
Sendo: [celular]: Concentração de celular; [Nitrato]: concentração de nitrato.
A Tabela 4 apresenta os reagentes necessários para a preparação do meio
f/2 sem sílica, foi utilizado este meio cultivo nos experimentos (GUILLARD, 1975),
(AMARAL, 2013).
Reagentes utilizados para a preparação do meio de cultivo
Tabela 4 - Reagentes utilizados para a preparação do meio de cultivo
Reagentes Concentração
Sal marinho 33,3 g/l
NaNO3 75g/l
NaH2PO4. H2O 5g/l
FeCl3.6H2O 3,15g/l
Na2EDTA 4,3g/l
ZnSO4. 7H2O 22,2mg/l
MnCl2. 4H2O 180mg/l
Na2MoO4. 2H2O 6,3mg/l
CoCl2. 6H2O 10mg/l
CuSO4.5H2O 9,8mg/l
Tiamina(B1) 100mg/l
Cianocobalamina (B12) 0,5mg/l
Biotina (B7) 0,5mg/l
Fator Nível
1 2
[celular] 5% do volume total 10% do volume total
pH inicial 6 7
[Nitrato] 0.5 mol/L 1.0 mol/L
% de enchimento 40% de 500 mL 90% de 500 mL
Temperatura 25°C 30°C
24
4.1.2 Preparação do meio de cultivo
A cepa foi doada pelo Instituto Oceanográfico da Universidade de São Paulo.
Manteve-se a cepa a partir de sucessivos repiques. Os experimentos foram
realizados em triplicata, com duração de sete dias cada. Em um erlenmeyer de 500
mL o meio de cultivo foi previamente esterilizado na autoclave. Após a autoclave, foi
necessário esperar o meio atingir a temperatura ambiente para adicionar as
vitaminas e as células na concentração desejada. Esse foi o procedimento para
todos os experimentos. Os meios cultivos podem ser observados na Figura 11:
Figura 4 - Meios de cultivo.
Fonte: Autoria própria.
25
Foi utilizado um espectrofotômetro da marca Femto para a leitura diária da
absorbância. E assim obteve-se a curva de crescimento celular para cada
experimento.
4.1.3 Obtenção da curva de calibração
Foram realizadas leituras de absorbância para diferentes concentrações
celulares, a partir destes dados foi construída uma curva de calibração que através
da equação de linearização, calculou-se a concentração de alga dos experimentos.
A figura 6 mostra a curva de calibração obtida:
Figura 5 - Curva de calibração. Concentração versus Absorbância.
1,21,00,80,60,40,20,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
Concentração
Ab
so
rbâ
ncia
S 0,0163182
R-Sq 99,6%
R-Sq(adj) 99,6%
Fitted Line PlotC2 = 0,01042 + 0,7301 C1
Fonte: Autoria própria.
26
4.2 Obtenção da massa seca
Realizou-se a floculação com solução de sulfato de alumínio, após adição de
solução, a floculação ocorreu em 15 minutos, conforme a Figura 7:
Figura 6 - Microalga floculando
Fonte: Autoria própria
Após essa etapa foi realizada filtração a vácuo, segundo a Figura 8, após a
filtração a biomassa ficou com o seguinte aspecto, mostrado na Figura 9:
Figura 7 - Filtração a vácuo
Fonte: Autoria própria
27
Figura 8 - Biomassa filtrada
Fonte: Autoria própria
A massa seca foi obtida de duas maneiras diferentes: Secagem em estufa por 24
horas a 60°C e liofilização por 6 horas. A Figura 10 mostra a massa seca em
lifiolizador e a Figura 11 mostra a massa seca em estufa.
Figura 9 - Massa seca no liofilizador.
Fonte: Autoria própria
28
Figura 10 - Massa seca em estufa
Fonte: Autoria própria
4.3 Extração de lipídeos
Foram testados os métodos clássicos da literatura, como o método de Folch e o
de Bligh e Dyer. Após realização e adequação desses métodos à biomassa seca,
foram testados também alguns outros métodos descritos na sessão abaixo.
A amostra foi pesada em balança analítica.
4.3.1 Método Folch
Foram pesadas 506 miligramas de massa algal, a essa amostra foi
adicionado 20 mL de metanol e 40 mL de clorofórmio. O tempo de extração foi de 18
horas em um agitador magnético da marca IKA C-MAG HS 7. Foram utilizadas
esferas de sílica para auxiliar na autólise da célula. Após esse procedimento a
biomassa foi filtrada e o filtrado foi purificado. Inicialmente adiciona-se a solução um
terço do volume obtido de solução 0.88% de cloreto de potássio em um funil de
separação, segundo esquema abaixo da Figura 12:
29
Figura 11 - Separação de fases (método FOLCH)
Fonte: Autoria própria
A fase superior é descartada, enquanto a inferior é purificada com uma
solução de clorofórmio e água. A fase superior foi descartada novamente e a fase
inferior foi transferida para um balão volumétrico, onde foi separado o solvente do
óleo em um rotaevaporador a 60 °C. Segundo a Figura 13:
Figura 12 - Recuperação do solvente no rotaevaporador
Fonte: Autoria própria
30
Após esse procedimento o balão foi colocado em um dessecador e após
algumas horas o balão foi pesado para o cálculo da massa de óleo obtida.
4.3.2 Método Bligh and Dyer
Foram pesadas 508 miligramas de massa algal, a essa amostra foi
adicionado 20mL de metanol e 40 mL de clorofórmio e 16 mL de água. O
tempo de extração foi de 18 horas em um agitador magnético. Após esse
procedimento a polpa foi filtrada e foi adicionado ao filtrado uma mistura de
clorofórmio e água segundo a Figura 14:
Figura 13 - Separação de fases (método Bligh and Dyer).
Fonte: Autoria própria
Após esse procedimento o balão foi colocado em um dessecador e após
algumas horas o balão foi pesado para o cálculo da massa de óleo obtida.
31
4.3.3 Ultrassom de sonda
A extração foi realizada em ultrassom de sonda da marca Sonics por 20 minutos
na frequência de 20kHz mostrado na figura 15.
Figura 14 - Ultrassom de sonda.
Fonte: Autoria própria
Utilizou uma mistura clorofórmio, metanol e água 1:2:0.8 respectivamente, filtrou-
se a solução e o processo se repetiu com a biomassa retida no filtro. Na fase de
separação foi utilizada uma solução de clorofórmio e água 3:1 na quantidade de um
terço do volume obtido no ultrassom. O procedimento foi repetido até 3 vezes.
Segundo o esquema abaixo na Figura 16:
32
Figura 15 - Fluxograma ultrassom de sonda.
Fonte: Autoria própria.
4.3.4 Ultrassom de banho
Foi utilizado um ultrassom da marca Kerry Pulsation na frequência de 40 kHz e
uma centrífuga da marca Quimis segundo a figura 17.
Figura 16 - Ultrassom de banho e centrífuga
Fonte: Autoria própria
33
Foi utilizada uma mistura 2:1 clorofórmio: metanol, a massa seca foi colocada
dentro de um tubo de centrífuga e em seguida foi adicionada a mistura. O ultrassom
foi operado por 20 minutos, então a amostra foi centrifuga e o sobrenadante retirado.
À massa centrifugada era adicionada a mistura 2:1 clorofórmio/metanol e foi repetido
o procedimento por 20 minutos. O procedimento foi repetido até 3 vezes. De acordo
com esquema abaixo na Figura 18:
Figura 17 - Fluxograma ultrassom de banho.
Fonte: Autoria própria.
Após a extração a biomassa ficou da seguinte forma, segundo a Figura 19:
Figura 18 - Biomassa autolisada.
Fonte: Autoria própria
34
4.4 Determinação do rendimento
Após secagem e obtenção do óleo, calculou-se o rendimento segundo a
equação 1:
( ) ( )
A umidade foi calculada numa balança Mettler Toledo de modelo HB43-S.
35
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1 Cálculos das concentrações celulares de microalgas Foram calculadas as concentrações celulares de cada experimento a partir da
equação da figura 6. Sendo que R1, R2 e R3 significam os reatores empregados no
cultivo.
Experimento 1:
Data da inoculação: 10/07/2014
As condições experimentais são apresentadas na tabela 5, os resultados na
tabela 6 e o gráfico de crescimento celular na figura 20.
Tabela 5 - Condições experimentais do experimento 1.
Fator Nível
[celular] 1
pH inicial 1
[Nitrato] 1
% de enchimento 1
Temperatura 1
Tabela 6 - Concentração de alga (g/L) do experimento 1.
Dia Hora R1 R2 R3 Média das
absorbâncias Concentração de alga (g/L)
10/jul. 16:00 0,078 0,081 0,075 0,078 0,067
11/jul. 16:00 0,101 0,111 0,1 0,104 0,086
12/jul. 16:00 0,178 0,188 0,172 0,179 0,141
13/jul. 16:00 0,186 0,232 0,18 0,199 0,156
14/jul. 16:00 0,24 0,308 0,188 0,245 0,189
15/jul. 16:00 0,288 0,365 0,238 0,297 0,227
16/jul. 16:00 0,35 0,446 0,282 0,359 0,272
17/jul. 16:00 0,426 0,518 0,354 0,433 0,326
18/jul. 16:00 0,452 0,545 0,384 0,460 0,346
36
Figura 19 - Curva de crescimento do experimento 1.
Concentração celular
Experimento 2:
Data da inoculação: 22/07/2014
As condições experimentais são apresentadas na tabela 7, os resultados na
tabela 8 e o gráfico de crescimento celular na figura 21.
Tabela 7 - Condições experimentais do experimento 2
Fator Nível
[celular] 1
pH inicial 1
[Nitrato] 1
% de enchimento 2
Temperatura 2
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
10/jul 11/jul 12/jul 13/jul 14/jul 15/jul 16/jul 17/jul 18/jul
R1
R2
R3
Ab
so
rbâ
ncia
37
Tabela 8 - Concentração de alga (g/L) do experimento 2.
Dia Hora R1 R2 R3 Média das
absorbâncias Concentração de alga (g/L)
22/jul. 16:00 0,116 0,12 0,116 0,117 0,096
23/jul. 16:00 0,146 0,148 0,133 0,142 0,114
24/jul. 16:00 0,188 0,209 0,188 0,195 0,152
25/jul. 16:00 0,218 0,222 0,216 0,219 0,170
26/jul. 16:00 0,264 0,275 0,248 0,262 0,202
27/jul. 16:00 0,31 0,326 0,28 0,305 0,233
28/jul. 16:00 0,382 0,412 0,352 0,382 0,289
29/jul. 16:00 0,431 0,469 0,433 0,444 0,335
30/jul. 16:00 0,482 0,502 0,48 0,488 0,367
Figura 20 - Curva de crescimento do experimento 2.
Concentração celular
Experimento 3:
Data da inoculação: 22/07/2014
As condições experimentais são apresentadas na tabela 9, os resultados na
tabela 10 e o gráfico de crescimento celular na figura 22.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
22/jul 23/jul 24/jul 25/jul 26/jul 27/jul 28/jul 29/jul 30/jul
R1
R2
R3
Ab
so
rbâ
ncia
38
Tabela 9 - Condições experimentais do experimento 3.
Fator Nível
[celular] 1
pH inicial 2
[Nitrato] 2
% de enchimento 1
Temperatura 1
Tabela 10 - Concentração de alga (g/L) do experimento 3.
Dia Hora R1 R2 R3 Média das
absorbâncias Concentração de alga (g/L)
22/jul. 16:00 0,056 0,06 0,06 0,059 0,053
23/jul. 16:00 0,101 0,08 0,08 0,087 0,074
24/jul. k16:00 0,182 0,187 0,185 0,185 0,145
25/jul. 16:00 0,25 0,255 0,186 0,230 0,178
26/jul. 16:00 0,34 0,315 0,251 0,302 0,231
27/jul. 16:00 0,433 0,36 0,315 0,369 0,280
28/jul. 16:00 0,454 0,52 0,406 0,460 0,346
29/jul. 16:00 0,481 0,558 0,487 0,509 0,382
30/jul. 16:00 0,547 0,584 0,543 0,558 0,418
Figura 21 - Curva de crescimento do experimento 3.
Concentração celular
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
R1
R2
R3
Ab
so
rbâ
ncia
39
Experimento 4:
Data da inoculação: 01/08/2014
As condições experimentais são apresentadas na tabela 11, os resultados na
tabela 12 e o gráfico de crescimento celular na figura 23.
.
Tabela 11 - Condições experimentais do experimento 4
Fator Nível
[celular] 1
pH inicial 2
[Nitrato] 2
% de enchimento 2
Temperatura 2
Tabela 12 - Concentração de alga (g/L) do experimento 4.
Dia Hora R1 R2 R3 Média das
absorbâncias Concentração de alga (g/L)
01/ago. 16:00 0,085 0,081 0,081 0,082 0,070
02/ago. 16:00 0,1 0,108 0,103 0,104 0,086
03/ago. 16:00 0,128 0,136 0,12 0,128 0,104
04/ago. 16:00 0,176 0,188 0,17 0,178 0,140
05/ago. 16:00 0,288 0,33 0,271 0,296 0,227
06/ago. 16:00 0,387 0,429 0,348 0,388 0,293
07/ago. 16:00 0,372 0,453 0,466 0,430 0,325
08/ago. 16:00 0,526 0,538 0,472 0,512 0,384
09/ago. 16:00 0,63 0,645 0,567 0,614 0,459
40
Figura 22 - Curva de crescimento do experimento 4.
Concentração celular
Experimento 5:
Data da inoculação: 01/08/2014
As condições experimentais são apresentadas na tabela 13, os resultados na
tabela 14 e o gráfico de crescimento celular na figura 24.
.
Tabela 13 - Condições experimentais do experimento 5.
Fator Nível
[celular] 2
pH inicial 1
[Nitrato] 2
% de enchimento 1
Temperatura 2
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
R1
R2
R3Ab
so
rbâ
ncia
41
Tabela 14 - Concentração de alga (g/L) do experimento 5.
Dia Hora R1 R2 R3 Média das
absorbâncias Concentração de alga (g/L)
01/ago. 16:00 0,085 0,08 0,084 0,083 0,071
02/ago. 16:00 0,088 0,086 0,089 0,088 0,074
03/ago. 16:00 0,097 0,093 0,098 0,096 0,080
04/ago. 16:00 0,128 0,105 0,11 0,114 0,093
05/ago. 16:00 0,142 0,136 0,154 0,144 0,115
06/ago. 16:00 0,177 0,177 0,182 0,179 0,141
07/ago. 16:00 0,243 0,252 0,241 0,245 0,189
08/ago. 16:00 0,252 0,258 0,248 0,253 0,194
09/ago. 16:00 0,258 0,268 0,252 0,259 0,120
Figura 23 - Curva de crescimento do experimento 5.
Concentração celular
Experimento 6:
Data da inoculação: 28/08/2014
As condições experimentais são apresentadas na tabela 15, os resultados na
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
R1
R2
R3
Ab
so
rbâ
ncia
42
tabela 16 e o gráfico de crescimento celular na figura 25:
Tabela 15 - Condições experimentais do experimento 6
Fator Nível
[celular] 2
pH inicial 1
[Nitrato] 1
% de enchimento 2
Temperatura 1
Tabela 16 - Concentração de alga (g/L) do experimento 6.
Dia Hora R1 R2 R3 Média das
absorbâncias Concentração de alga (g/L)
28/ago. 16:00 0,046 0,042 0,043 0,044 0,042
29/ago. 16:00 0,063 0,059 0,06 0,061 0,054
30/ago. 16:00 0,071 0,068 0,069 0,069 0,061
31/ago. 16:00 0,079 0,082 0,078 0,080 0,068
01/set 16:00 0,088 0,093 0,085 0,088 0,075
02/set 16:00 0,118 0,131 0,115 0,121 0,099
03/set 16:00 0,182 0,227 0,189 0,199 0,155
04/set 16:00 0,286 0,31 0,315 0,303 0,232
05/set 16:00 0,47 0,41 0,42 0,433 0,326
Figura 24 - Curva de crescimento do experimento 6.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
R1
R2
R3
Ab
so
rbâ
ncia
43
Concentração celular
Experimento 7:
Data da inoculação: 28/08/2014
As condições experimentais são apresentadas na tabela 17, os resultados na
tabela 18 e o gráfico de crescimento celular na figura 26.
.
Tabela 17 - Condições experimentais do experimento 7
Fator Nível
[celular] 2
pH inicial 2
[Nitrato] 1
% de enchimento 1
Temperatura 2
Tabela 18 - Concentração de alga (g/L) do experimento 7.
Dia Hora R1 R2 R3 Média Massa de alga (g/L)
28/ago 16:00 0,079 0,084 0,085 0,082 0,070
29/ago 16:00 0,1 0,102 0,108 0,103 0,085
30/ago 16:00 0,123 0,134 0,138 0,131 0,106
31/ago 16:00 0,186 0,188 0,28 0,218 0,169
01/set 16:00 0,216 0,262 0,283 0,256 0,195
02/set 16:00 0,286 0,323 0,3 0,303 0,231
03/set 16:00 0,33 0,394 0,46 0,394 0,298
04/set 16:00 0,462 0,471 0,528 0,487 0,365
05/set 16:00 0,514 0,524 0,642 0,56 0,419276
44
Figura 25 - Curva de crescimento do experimento 7.
Concentração celular
Experimento 8:
Data da inoculação: 10/07/2014
As condições experimentais são apresentadas na tabela 19, os resultados na
tabela 20 e o gráfico de crescimento celular na figura 27.
Tabela 19 - Condições experimentais do experimento 8
Fator Nível
[celular] 2
pH inicial 2
[Nitrato] 1
% de enchimento 2
Temperatura 1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
R1
R2
R3Ab
so
rbâ
ncia
45
Tabela 20 - Concentração de alga (g/L) do experimento 8.
Dia Hora R1 R2 R3 Média das
absorbâncias Concentração de alga (g/L)
10/jul. 16:00 0,086 0,1 0,088 0,091 0,077
11/jul. 16:00 0,131 0,176 0,141 0,149 0,119
12/jul. 16:00 0,142 0,204 0,173 0,173 0,136
13/jul. 16:00 0,178 0,282 0,201 0,220 0,171
14/jul. 16:00 0,247 0,335 0,268 0,283 0,217
15/jul. 16:00 0,344 0,416 0,365 0,375 0,284
16/jul. 16:00 0,367 0,484 0,42 0,423 0,319
17/jul. 16:00 0,472 0,554 0,423 0,483 0,363
18/jul. 16:00 0,545 0,586 0,463 0,531 0,398
Figura 26 - Curva de crescimento do experimento 8.
Os experimentos apresentaram uma média final de concentração celular de
0,30 g/L até 0,45 g/L, com exceção do experimento 5, que pode ter apresentado
alguma contaminação. Para a maioria dos experimentos o reator 2 apresentou maior
crescimento, isto pode ser explicado devido a sua disposição no local de
experimentos, sendo um pouco mais exposto a luz do que os outros reatores .Todos
as curvas apresentam um crescimento similar, apresentando a fase Lag, onde
Concentração celular
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
R1
R2
R3
Ab
so
rbâ
ncia
46
praticamente não ocorre divisão celular, há um aumento de massa. Essa fase é
considerada um período de adaptação no qual a atividade enzimática, múltipla da
célula, o cultivo foi parado no final da fase Log, ou seja, verifica-se uma tendência a
estabilização da curva ao final de sete dias (LOURENÇO, 2006), (SCHMIDELL et
al.,2001).
5.2 Análise dos dados utilizando planejamento de experimentos
5.2.1 Análise dos efeitos
Primeiramente os efeitos foram analisados individualmente, apresentados na
figura 28:
Figura 27 – Efeitos dos fatores no crescimento celular.
;
Observa-se na figura acima que por ordem decrescente de importância os fatores
são concentração de nitrato, [celular], % enchimento, temperatura e pH inicial. De
modo que quanto mais inclinada a reta, mais impactante é o fator.
47
5.2.2 Cálculo da ANOVA e análise dos residuais para os fatores.
A tabela 21 apresenta ANOVA da média para a concentração celular e a figura
29 os gráficos de análise de resíduos.
Tabela 21 - ANOVA da média para concentração celular
Fator DF SS MS F P
[celular] 1 0,0075 0,0075 1,22 0,312
Erro 6 0,0372 0,0062 Total 7 0,0447
Figura 28 - Análise de resíduos (concentração celular)
Observa-se nos gráficos acima que a distribuição é normal, as variâncias são
homogêneas, a média tende a 0 e há independência, ou seja, ANOVA pode ser
considerada, pois não há nenhuma variável extra que comprometa a análise.
A concentração celular é um fator importante, como demonstram os dados acima
48
(p-valor e teste de Fischer). Para significância do fator o p-value devem ser maiores
que 0.05 e o F deve ser maiores que 0.5.
A tabela 22 apresenta ANOVA da média para o pH inicial e a figura 3- os gráficos
de análise de resíduos.
Tabela 22 - ANOVA da média para concentração celular
Fator DF SS MS F P
pH inicial 1 3E-05 3E-05 0 0,952
Erro 6 0,0447 0,0075 Total 7 0,0447
Figura 29 - Análise de resíduos (pH inicial)
Observa-se nos gráficos acima que a distribuição é normal, as variâncias são
49
homogêneas, a média tende a 0 e há independência, ou seja, ANOVA pode ser
considerada, pois não há nenhuma variável extra que comprometa a análise.
Analisando ANOVA observa-se que o para o teste de Fischer o pH inicial é
insignificativo. Para significância do fator o p-value devem ser maiores que 0.05 e o
F devem ser maiores que 0.5.
De acordo com a literatura a microalga Chorella sp tem preferência do pH de 5.5
a 8, sendo que no trabalho foi utilizado 5 a 6 (dentro da faixa ideal de crescimento),
por essa razão não há significância do pH no crescimento (R. B, 2006).
A tabela 23 apresenta ANOVA da média para a concentração de nitrato e a figura
31 os gráficos de análise de resíduos.
Tabela 23 - ANOVA da média para concentração de nitrato
Fator DF SS MS F P
Concentração de nitrato 1 0,0121 0,0121 2,23 0,186
Erro 6 0,0326 0,0054 Total 7 0,0447
Figura 30 - Análise de resíduos (concentração de nitrato)
50
Observa-se nos gráficos acima que a distribuição é normal, as variâncias são
homogêneas, a média tende a 0 e há independência, ou seja, ANOVA pode ser
considerada, pois não há nenhuma variável extra que comprometa a análise.
A concentração de nitrato é um fator importante, como demonstram os dados
acima (p-valor e teste de Fischer). Para significância do fator o p-value deve ser
maior que 0.05 e o F devem ser maiores que 0.5.
A tabela 24 apresenta ANOVA da média para a % de enchimento e a figura 32 os
gráficos de análise de resíduos.
Tabela 24 - ANOVA da média para % de enchimento
Fator DF SS MS F P
% de enchimento 1 0,0035 0,0035 0,51 0,503
Erro 6 0,0412 0,0069 Total 7 0,0447
Figura 31 - Análise de resíduos (porcentagem de enchimento)
51
Observa-se nos gráficos acima que a distribuição é normal, as variâncias são
homogêneas, a média tende a 0 e há independência, ou seja, ANOVA pode ser
considerada, pois não há nenhuma variável extra que comprometa a análise.
A porcentagem de enchimento é um fator importante, como demonstram os dados
acima (p-valor e teste de Fischer). Para significância do fator o p-value devem ser
maiores que 0.05 e o F deve ser maiores que 0.5.
A tabela 25 apresenta ANOVA da média para temperatura e a figura 33 os
gráficos de análise de resíduos.
Tabela 25 - ANOVA da média para temperatura
Fator DF SS
MS F P
Temperatura 1 0,0003 0,0003 0,03 0,859
Erro 6 0,0445 0,0074 Total 7 0,0447
Figura 32 - Análise de resíduos (temperatura)
52
Observa-se nos gráficos acima que a distribuição é normal, as variâncias são
homogêneas, a média tende a 0 e há independência, ou seja, ANOVA pode ser
considerada, pois não há nenhuma variável extra que comprometa a análise.
Analisando ANOVA observa-se que o para o teste de Fischer a temperatura é
insignificativa. Para significância do fator o p-value deve ser maior que 0.05 e o F
devem ser maiores que 0.5.
Segundo a literatura as temperaturas de 25°C e 30°C não apresentam diferença
no crescimento celular no período de sete dias, a diferença no crescimento só é
observada após dez dias de cultivo (LATALA,1991).
Sinal ruído.
O sinal ruído foi calculado com base na fórmula de quanto maior melhor.
Foram obtidos os seguintes resultados:
Sendo SN= Sinal ruído
A tabela 26 apresenta ANOVA do SN versus [celular]
Tabela 26 - ANOVA, SN versus [celular].
Fator DF SS MS F P
[celular] 1 6,09 6,09 1,24 0,308
Erro 6 29,52 0,92 Total 7 35,61
A tabela 27 apresenta ANOVA do SN versus Concentração de nitrato
Tabela 27 - ANOVA, SN versus [Nitrato].
Fator DF SS MS F P
[nitrato] 1 8,59 8,59 1,91 0,216
Erro 6 27,02 4,5 Total 7 35,61
53
A tabela 28 apresenta ANOVA do SN versus % de enchimento
Tabela 28 - ANOVA, SN versus % de enchimento.
Fator DF SS MS F P
% enchimento 1 3,29 3,29 0,61 0,464
Erro 6 32,31 5,39 Total 7 35,61
A tabela 29 apresenta ANOVA do SN versus Temperatura
Tabela 29 - ANOVA, SN versus Temperatura.
Fator DF SS MS F P
Temperatura 1 0,8 0,8 0,14 0,723
Erro 6 34,81 5,8 Total 7 35,61
A tabela 30 apresenta ANOVA do SN versus pH inicial
Tabela 30 - ANOVA, SN versus pH inicial.
Fator DF SS MS F P
pH inicial 1 0,17 0,17 0,03 0,873
Erro 6 35,44 5,91 Total 7 35,61
Os dados acima corroboram as observações feitas na análise com a média. Ou
seja, temperatura e pH inicial foram descartados por não serem significativos. Para
significância do fator o p-value deve ser maior que 0.05 e o F deve ser maiores que
0.5.
5.3 Escolha do melhor meio de cultivo baseado no crescimento celular:
Com base nos resultados estatísticos obteve-se o melhor nível de cada fator para a
condição ideal.
[celular]:Nível baixo
Concentração de nitrato: Nível alto
% de enchimento: Nível alto
54
5.4 Extração do óleo. Após obter a condição ideal de crescimento foi feita a extração lipídica em
diversos métodos de extração.
5.4.1 Método Folch:
Massa seca em estufa, umidade de 20%
Foram pesadas 506 miligramas de massa algal, a essa amostra foi
adicionado 20mL de metanol e 40 mL de clorofórmio.
Após esse procedimento o balão é colocado em um dessecador e após
algumas horas o balão é pesado para o cálculo da massa de óleo obtida.
A massa de óleo pesada foi 40 mg.
O rendimento foi calculado segundo a equação 1 citada na metodologia:
( ) ( )
O rendimento foi de 9,88% de grama de óleo por grama de massa seca.
Massa seca no liofilizador:
Massa pesada: 503 mg
Umidade: 13%
A massa de óleo obtida foi 40 mg. Obtendo o rendimento de 6,85% de grama
de óleo por grama de massa seca.
5.4.2 Método de Bligh and Dyer:
Massa seca em estufa, umidade de 18%.
Foram pesadas 508mg de massa algal, a essa amostra foi adicionado
20mL de metanol e 40 mL de clorofórmio e 16 mL de água.
Após esse procedimento o balão é colocado em um dessecador e após
algumas horas o balão é pesado para o cálculo da massa de óleo obtida.
A massa de óleo pesada foi 47 mg.
55
O rendimento foi calculado segundo a equação 1.
O rendimento foi de 11,28% de grama de óleo por grama de massa seca.
Massa seca no liofilizador:
Massa pesada: 505 mg
Umidade: 10%
A massa de óleo obtida foi 35 mg. Obtendo o rendimento de 7,7%.
5.4.3 Método de ultrassom de sonda:
Massa seca em estufa.
Umidade de 19%.
Massa pesada: 510 mg.
Em um recipiente foram adicionados os 510 mg de massa algal e uma mistura
de 76 mL de clorofórmio metanol e água.
A massa de óleo obtida foi de 55 mg. Obtendo um rendimento de 13,31% de
grama de óleo por grama de massa seca.
Massa seca no liofilizador:
Massa pesada: 501 mg
Umidade: 12%
A massa de óleo obtida foi 40 mg. Obtendo o rendimento de 9,08% de grama
de óleo por grama de massa seca.
5.4.4 Método do ultrassom de banho:
Massa seca em estufa.
Umidade de 20%.
Massa pesada: 509 mg.
Em um tubo de centrifuga foram adicionados 509mg de massa algal.
A massa de óleo obtida foi de 60 mg. Obtendo um rendimento de 14,73% de
grama de óleo por grama de massa seca.
56
Massa seca no liofilizador:
Massa pesada: 504 mg.
Umidade: 10%.
A massa de óleo obtida foi 43 mg. Obtendo o rendimento de 9,48 % de grama
de óleo por grama de massa seca.
Podemos observar na tabela 31 o rendimento para cada método e massa:
Tabela 31 - Rendimento de % de óleo/massa seca dos diferentes métodos de extração a partir das massas secas em estufa e liofilizador.
Massa seca Método de
extração Rendimento
Estufa Folch 9,88%
Liofilizador Floch 6,85%
Estufa Bligh and Dyer 11,28%
Liofilizador Bligh and Dyer 7,7%
Estufa
Ultrassom de
sonda com
solvente
13,31%
Liofilizador
Ultrassom de
sonda com
solvente
9,08%
Estufa
Ultrassom de
banho com
solvente
14,73%
Liofilizador
Ultrassom de
banho com
solvente
9,48%
5.5 Otimização da extração de óleo.
Para a otimização da produção lipídica, foi alterada a concentração de nitrato,
57
que é o fator que mais influencia o crescimento celular.
Microalgas crescendo num meio com déficit de nitrato produzem mais lipídio,
enquanto o seu crescimento celular não é tão alto. (YEESANG; CHEIRSILP, 2011)
Dessa forma foi feita a extração lipídica dos experimentos que possuíam a
concentração de nitrato em nível baixo. Também foi escolhido o melhor método de
extração obtido anteriormente, que foi o ultrassom de banho com a massa seca em
estufa.
Foram obtidos os seguintes resultados:
- Experimento 1:
Umidade de 22%.
Massa pesada: 502 mg.
A massa de óleo obtida foi 72 mg. Obtendo o rendimento de 18,4 % de grama
de óleo por grama de massa seca.
- Experimento 2:
Umidade de 23%.
Massa pesada: 505 mg.
A massa de óleo obtida foi 78 mg. Obtendo o rendimento de 20 % de grama
de óleo por grama de massa seca.
- Experimento 7:
Umidade de 20%.
Massa pesada: 503 mg.
A massa de óleo obtida foi 64 mg. Obtendo o rendimento de 15,9% de grama
de óleo por grama de massa seca.
- Experimento 8:
Umidade de 25%.
Massa pesada: 501 mg.
A massa de óleo obtida foi 70 mg. Obtendo o rendimento de 18,63% de
grama de óleo por grama de massa seca.
58
A tabela 32 mostra o rendimento de extração lipídica dos experimentos
mostrando as condições experimentais:
Tabela 32 - Rendimento da extração lipídica após otimização.
Experimento Fator Nível Rendimento
1
[celular] 1
18,4% [Nitrato] 1
% de enchimento 1
2
[celular] 1
20% [Nitrato] 1
% de enchimento 2
7
[celular] 2
15,90% [Nitrato] 1
% de enchimento 1
8
[celular] 2
18,63% [Nitrato] 1
% de enchimento 2
Observa-se que a quantidade de lipídio extraído foi maior sob o déficit de
nitrato. Verifica-se que o experimento que apresentam porcentagem de enchimento
no nível alto e concentração celular em nível baixo foi experimento que obteve maior
rendimento, podendo ser um indício de que esses fatores não são tão influentes na
acumulação de lipídio na célula. Os resultados são condizentes com a literatura
(AMARAL, 2013).
59
6 CONCLUSÃO
Concluiu-se que:
1- Não é proporcional a taxa de crescimento celular com a produção de lipídio.
2- Dentre os métodos de extração o que melhor atendeu às necessidades foi o
ultrassom de banho, pois se obteve um rendimento maior na extração e ainda é
utilizado pouco solvente.
3- A massa seca em estufa obteve um rendimento maior do que a massa
liofilizada em todos os casos.
4- Porcentagem de enchimento e concentração celular aparentam ser fatores
significativos apenas no crescimento celular e não no acúmulo de lipídio celular.
5- A otimização da extração de lipídios foi de 20 a 30%.
60
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