obtenção de óleo extraído da microalga chlorella...

Escola de Engenharia de Lorena – EEL- USP

Obtenção de óleo extraído da Microalga Chlorella sp

Edson de Almeida Vidal Junior

Lorena

2014

Edson de Almeida Vidal Junior


Monografia apresentada como exigência para obtenção do grau de Bacharelado em Engenharia química da Escola de engenharia de Lorena EEL USP.

Orientador: Prof. Dr. Messias Borges Silva

Lorena

2014

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE

TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA

FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Catalogação na Publicação Biblioteca “Cel. Luiz Sylvio Teixeira Leite”

Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo

Vidal Junior, Edson de Almeida


/ Edson de almeida Vidal junior; orientador Messias

Borges Silva. - Lorena, 2014.

51 p.

Monografia apresentada como requisito parcial

para a conclusão de Graduação do Curso de Engenharia

Química - Escola de Engenharia de Lorena da

Universidade de São Paulo. 2014

Orientador: Messias Borges Silva

1. Cultivo de microalgas.. 2. Chlorella sp. 3.

Extração lipídica. I. Título. II. Silva, Messias

Borges, orient.

Dedicatória

Aos meus pais: Claudia e Edson,

Pela educação e formação de caráter que obtive,

Que mesmo nos momentos mais adversos se dedicaram ao meu futuro,

Renunciando muitas vezes seus sonhos para eu alcançar os meus,

Serão eternamente merecedores do meu amor e minha admiração,

Sou muito grato por ter vocês comigo.

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Messias Borges Silva, meu orientador, pela confiança em mim depositada em realizar esse trabalho, muito obrigado pelos conselhos, pela paciência e orientação. À Prof.ª Dra. Patrícia Caroline Molgero da Rós, pelas sugestões, conselhos e simpatia intrínseca sempre que precisei dela. À Prof.ª Dra. Larissa de Freitas Teixeira pelas sugestões e contribuições ao trabalho. Aos Professores Dr. Luís Fernando Figueiredo Faria, Dr. Domingos Sávio Giordani, que contribuíram para a concretização deste trabalho. Aos professores Dr. Ararão Serra e a Prof.ª Dra. Jayne Carlos de Souza Barbosa pela simpática e prontidão em ajudar sempre que precisei, agradeço e admiro os dois pela compaixão com os animais. À minha amiga Carolina R. Tomiello, que foi sempre minha companheira de graduação, obrigado pelos momentos que dividi com você, pela amizade e cumplicidade. À minha amiga de laboratório Carla Loures de Almeida, muito obrigado pela orientação dada durante o trabalho, pelas sugestões e pela convivência, foi uma experiência maravilhosa conviver contigo e acima de tudo ter o prazer de ser seu amigo. A sua energia, proatividade e criatividade contagiam. Seu caráter é admirável. Aos meus pais, Claudia e Edson, por confiarem em mim durante esses cinco anos. Muito obrigado pelo amor, carinho, educação.

Epígrafe

"Ninguém pode construir em teu lugar as pontes que precisarás passar para atravessar o rio da vida. Ninguém, exceto tu, só tu. Existem, por certo, atalhos

sem número, e pontes, e semideuses que se oferecerão para levar-te além do rio, mas isso te custaria a tua própria pessoa: tu te hipotecarias e te perderias.

Existe no mundo um único caminho por onde só tu podes passar. Aonde leva? Não perguntes, siga-o!"

Friedrich Nietzsche

RESUMO O óleo extraído das algas pode ser utilizado para vários fins, tais como: Produção de biodiesel, por exemplo, sendo uma fonte de energia sustentável, pois o seu metabolismo utiliza o gás carbônico que é liberado na queima do combustível, também pode ser utilizado como suplemento alimentar. O meio de cultivo das algas, métodos de secagem da massa úmida e métodos de extração do óleo a partir da massa seca bem como a análise da importância das variáveis no processo e otimização por meio de ferramentas da qualidade foram abordados nesse trabalho. As massas foram secas em estufa e liofilizador. Os métodos de extração testados foram: Método Folch, método de Bligh and Dyer, banho de ultrassom com solvente e ultrassom de sonda com solvente. Os resultados obtidos foram satisfatórios, mostrando que a microalga pode obter um rendimento de até 20%, através da adequação do método de extração, que no trabalho foi o de banho de ultrassom, e da utilização da massa seca em estufa. Palavras-chave: Microalga, Chlorella sp, Lipídeos, Planejamento de experimentos.

ABSTRACT The oil from algae can be used in many ways, for instance, producing biofuel, being a renewable and sustainable energy feedstock, its metabolism uses carbonic gas which is produced on the fuel’s combustion, the oil also can used as food supplement. The cultivation of the algae, the methods to obtain the dry mass, the methods of extracting the oil from the algae and analyzing the importance of the process’s variables and optimizing by using the quality tools, these topics were discussed here. The masses were dried in the kiln and lyophilizer. The tested extraction methods were: Folch method, Bligh and Dyer method, ultrasound bath with solvent and ultrasound probe with solvent. Chlorella sp seems to be a good feedstock of lipids. The right choice of the extraction method which was ultrasound bath with solvent and the use of the more efficient dried mass, which was dried mass in the kiln. Keywords: Microalgae, Chlorella sp., Lipids, Design of Experiments

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Chlorella sp ............................................................................................... 16

Figura 2 - Fotobiorreator ........................................................................................... 17

Figura 3 – Arranjo ortogonal L8 ................................................................................. 22

Figura 4 - Meios de cultivo. ....................................................................................... 24

Figura 6 - Curva de calibração. Concentração versus Absorbância. ......................... 25

Figura 7 - Microalga floculando ................................................................................. 26

Figura 8 - Filtração a vácuo ....................................................................................... 26

Figura 9 - Biomassa filtrada....................................................................................... 27

Figura 10 - Massa seca no liofilizador. ...................................................................... 27

Figura 11 - Massa seca em estufa ............................................................................ 28

Figura 12 - Separação de fases (método FOLCH) .................................................... 29

Figura 13 - Recuperação do solvente no rotaevaporador ......................................... 29

Figura 14 - Separação de fases (método Bligh and Dyer). ....................................... 30

Figura 15 - Ultrassom de sonda. ............................................................................... 31

Figura 16 - Fluxograma ultrassom de sonda. ............................................................ 32

Figura 17 - Ultrassom de banho e centrífuga ............................................................ 32

Figura 18 - Fluxograma ultrassom de banho. ............................................................ 33

Figura 19 - Biomassa autolisada. .............................................................................. 33

Figura 20 - Curva de crescimento do experimento 1. ................................................ 36








Figura 28 – Efeitos dos fatores no crescimento celular. ............................................ 46

Figura 29 - Análise de resíduos (concentração celular) ............................................ 47

Figura 30 - Análise de resíduos (pH inicial) ............................................................... 48

Figura 31 - Análise de resíduos (concentração de nitrato) ........................................ 49

Figura 32 - Análise de resíduos (porcentagem de enchimento) ................................ 50

Figura 33 - Análise de resíduos (temperatura) .......................................................... 51

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Rendimento em galões de óleo por acre no ano ...................................... 14

Tabela 2 - Conteúdo de óleo em algumas espécies de algas ................................... 15

Tabela 3 - Fatores e seus níveis ............................................................................... 23

Tabela 4 - Reagentes utilizados para a preparação do meio de cultivo .................... 23

Tabela 5 - Condições experimentais do experimento 1. ........................................... 35

Tabela 6 - Concentração de alga (g/L) do experimento 1. ......................................... 35

Tabela 7 - Condições experimentais do experimento 2 ............................................ 36

Tabela 8 - Concentração de alga (g/L) do experimento 2. ......................................... 37

Tabela 9 - Condições experimentais do experimento 3. ........................................... 38

Tabela 10 - Concentração de alga (g/L) do experimento 3. ....................................... 38

Tabela 11 - Condições experimentais do experimento 4 .......................................... 39


Tabela 13 - Condições experimentais do experimento 5. ......................................... 40








Tabela 21 - ANOVA da média para concentração celular ......................................... 47

Tabela 22 - ANOVA da média para concentração celular ......................................... 48

Tabela 23 - ANOVA da média para concentração de nitrato .................................... 49

Tabela 24 - ANOVA da média para % de enchimento .............................................. 50

Tabela 25 - ANOVA da média para temperatura ....................................................... 51

Tabela 26 - ANOVA, SN versus [celular]. .................................................................. 52

Tabela 27 - ANOVA, SN versus [Nitrato]. .................................................................. 52

Tabela 28 - ANOVA, SN versus % de enchimento. ................................................... 53

Tabela 29 - ANOVA, SN versus Temperatura. .......................................................... 53

Tabela 30 - ANOVA, SN versus pH inicial. ................................................................ 53

Tabela 31 - Rendimento de % de óleo/massa seca dos diferentes métodos de

extração a partir das massas secas em estufa e liofilizador. .................................... 56

Tabela 32 - Rendimento da extração lipídica após otimização. ................................ 58

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................................12

2 OBJETIVO E JUSTIFICATIVA ........................................................................................................13

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................................14

3.1 Microalgas ........................................................................................................ 14

3.1.1 Chlorella sp ................................................................................................ 15

3.2 Cultivo .............................................................................................................. 16

3.2.1 Meio de cultivo ........................................................................................... 17

3.3 Métodos de extração de lipídeos. .................................................................... 18

3.3.1 Método Folch ............................................................................................. 18

3.3.2 Método Bligh e Dyer .................................................................................. 19

3.3.3 Extração Soxhlet ........................................................................................ 19

3.3.4 Extração com fluido supercrítico. ............................................................... 19

3.3.5 Extração por pressão e utilizando Hexano como solvente ........................ 19

3.3.6 Extração por ultrassom. ............................................................................. 20

3.3.6.1 Extração com solvente ....................................................................... 20

3.3.6.2 Extração enzimática ........................................................................... 20

3.4 Método de Taguchi .......................................................................................... 20

4 METODOLOGIA ...............................................................................................................................22

4.1 Parte experimental ........................................................................................... 22

4.1.1 Cultivo de Microalga Chlorella sp .............................................................. 22

4.1.2 Preparação do meio de cultivo .................................................................. 24

4.1.3 Obtenção da curva de calibração .............................................................. 25

4.2 Obtenção da massa seca ................................................................................ 26

4.3 Extração de lipídeos ......................................................................................... 28

4.3.1 Método Folch ............................................................................................. 28

4.3.2 Método Bligh and Dyer .............................................................................. 30

4.3.3 Ultrassom de sonda ................................................................................... 31

4.3.4 Ultrassom de banho ................................................................................... 32

4.4 Determinação do rendimento ........................................................................... 34

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ......................................................................................................35

5.1 Cálculos das concentrações celulares de microalgas ...................................... 35

5.2 Análise dos dados utilizando planejamento de experimentos .......................... 46

5.2.1 Análise dos efeitos ..................................................................................... 46

5.2.2 Cálculo da ANOVA e análise dos residuais para os fatores. ..................... 47

5.3 Escolha do melhor meio de cultivo baseado no crescimento celular: .............. 53

5.4 Extração do óleo. ............................................................................................. 54

5.4.1 Método Folch: ............................................................................................ 54

5.4.2 Método de Bligh and Dyer: ........................................................................ 54

5.4.3 Método de ultrassom de sonda: ................................................................. 55

5.4.4 Método do ultrassom de banho: ................................................................ 55

5.5 Otimização da extração de óleo. ...................................................................... 56

6 CONCLUSÃO ....................................................................................................................................59

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................60

12

1 INTRODUÇÃO

Microalgas são os organismos unicelulares com mais rápido crescimento

fotossintetizante e podem completar um ciclo inteiro de crescimento em poucos dias.

Algumas espécies de algas têm um grande conteúdo de óleo (na faixa de 60% de

óleo por peso) e podem produzir cerca de quinze mil galões de óleo por acre (0,4

hectare) por ano, sob condições ótimas (DEMIRBAS, 2011).

Algas crescem naturalmente por todo mundo. Sob condições ótimas, elas podem

ser cultivadas gerando grandes quantidades. Existem mais de cem mil diferentes

espécies de microrganismos pertencentes à família das algas. Existem em várias

formas e cores, desde um minúsculo protozoário numa lagoa até grandes montes de

algas marinhas que habitam o oceano.

Como algas são fáceis de serem cultivadas e podem ser manipuladas para se

produzirem grandes quantidades, sem que haja distúrbio em habitats naturais ou

fontes de alimentos.

O que a alga necessita é água, luz e dióxido de carbono. Algas consomem gás

carbônico, ou seja, através da fotossíntese captam o gás carbônico do ar e

devolvem oxigênio, por essa razão plantas de biodiesel estão sendo construídas

perto das indústrias que liberam uma gran4de quantidade de CO2, reciclando o CO2,

reduzindo assim a poluição (GONÇALVES AL; PIRES JCM; SIMÕES M, 2013).

A produção do óleo da alga por acre depende do tipo da alga, da forma que

ocorre o crescimento e do método de extração. A produção das algas tem o

potencial de superar outros produtos potenciais como o óleo de palma ou de milho.

Especialistas estimam que 140 milhões de galões de biodiesel sejam necessários

para substituir produtos a base de petróleo a cada ano. Para atingir esta meta, as

companhias precisarão somente de uma área de cerca de 95 milhões de acres para

produzir as algas, pequena se comparada aos bilhões de acres de outras fontes

para produção de biodiesel.

A utilização da Chlorella sp como fonte de matéria-prima para obtenção de

lipídios tem-se apresentado uma ótima alternativa para o produção do biodiesel.

Sendo uma alga resistente a contaminação, de rápido ciclo de crescimento e

rendimentos significativos (GRIFFITS; M. J.; HARRISON, S. T, 2009),( LIANG, Y.,

SARKANY, N.;CUI, Y. ,2009).

13

2 OBJETIVO E JUSTIFICATIVA

Objetivo

Este trabalho teve como objetivo comparar métodos de extração do óleo da

microalga Chlorella sp. Os métodos de extração utilizados foram método de Folch,

Bligh and Dyer, Ultrassom de sonda com solvente e ultrassom de banho com

solvente. A otimização da extração foi feita a partir da análise dos métodos de

extração lipídica.

Justificativa

A crescente necessidade de energia e poluição ambiental induz ao estudo de

alternativas para substituir a geração de energia de forma poluente pela energia

limpa para os setores industriais e de transporte. Dessa forma o óleo obtido da alga

é de extrema importância por ser uma fonte em potencial para a produção de

biocombustíveis.

14

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Microalgas

Existem muitas espécies de microalgas e são diversificadas em tamanho,

pigmentação, mecanismo de reprodução, composição e habitat. São organismos

tipicamente aquáticos, embora algumas espécies possam habitar o solo. Elas são

abundantemente encontradas em águas doces e salgadas. Como outras plantas, as

células das algas contém núcleo, um ou mais cloroplastos (SMITH,1950).

Diversos estudos vêm sendo desenvolvidos com microalgas, em relação a

sua utilização na obtenção de diversos compostos com alto valor agregado, como os

ácidos graxos e a biofixação de gás carbônico (CHRISTI, 2013).

Microalgas produzem lipídios na forma de triacilglicerol (LOURENÇO, 2006).

Comparativamente algas produzem mais óleo do que quaisquer outras oleaginosas

que estão atualmente em uso. Muitas espécies de microalgas podem ser induzidas

para acumular quantidades substanciais de lipídios, muitas vezes maior do que 60 %

da sua biomassa (BENEMANN et al., 1980), (HARUM et al., 2010). A Tabela 1

abaixo apresenta os rendimentos de diversas oleaginosas e algas. É importante

ressaltar que existem variações significativas nos rendimentos, mesmo dentro de

uma mesma semente oleaginosa, dependendo de onde ela é cultivada, a variedade,

e a espécie da planta.

Tabela 1 - Rendimento em galões de óleo por acre no ano

Fonte de óleo Rendimento

Algodão 18

Soja 48

Cártamo 83

Girassol 102

Colza 127

Óleo de Palma 635

Microalgas 5000-1500

Fonte: Oakhaven. 2010

Da mesma forma, para as algas, há variações significativas entre os rendimentos

de óleo entre diferentes cepas de algas. A Tabela 2 apresenta os diferentes

15

rendimentos de óleo em relação à matéria seca de em diferentes espécies de algas.

Tabela 2 - Conteúdo de óleo em algumas espécies de algas

Espécie de alga % em peso de óleo

Ankistrodesmus TR-87 28-40

Botyococcus braunii 29-75

Chlorella sp 29

Chlorella protothecoides (autotrófica/heterotrófica)

15-55

Cyclotella DI-35 42

Dunaliella Tertiolecta 36-42

Hantzschia DI-160 66

Nannochloris 31

Nitzschia TR-114 46

Phaeodactylum tricornutum 28-50

Scenedesmus TR-84 31

Stichococcus 45

Tetraselmis suecica 15-32

Thalassiosira pseudonana 21-31

Fonte: Oakhaven. 2010

3.1.1 Chlorella sp

Chlorella é um gênero de algas verdes de uma única célula, pertencente ao filo

Chlorophyta. Ela apresenta forma esférica, de cerca de 5 a 10 micrômetros de

diâmetro sem flagelos. Contem os pigmentos fotossintéticos clorofila verde em seu

cloroplasto (ILLMAN; SCRAGG; SHALES, 2000). Através da fotossíntese, ela se

multiplica rapidamente, necessitando apenas de dióxido de carbono, água, luz solar,

e uma pequena quantidade de minerais para se reproduzir (WEISSMANN et al.,

1992).

É também muito resistente à contaminação, além de possuir crescimento

rápido e cultivo fácil (HUNTLEY; REDALJE, 2007).

O Bioquímico e fisiologista alemão Otto Heinrich Warburg, recebeu o Prêmio

Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1931 por suas pesquisas sobre respiração

celular, também estudou a fotossíntese na Chlorella (WARBURG,1928). Em 1961,

Melvin Calvin, da Universidade da Califórnia, recebeu o Prêmio Nobel de Química

por sua pesquisa sobre os caminhos da assimilação de dióxido de carbono em

16

plantas usando Chlorella. Na Figura 1 pode-se observar a imagem da microalga

Chlorella:

Figura 1 - Chlorella sp

Fonte: National institute for environmental studies.

3.2 Cultivo

O cultivo de microalgas pode ser feito de duas maneiras: sistemas abertos e

sistemas fechados. Sistemas abertos apresentam baixo custo de instalação e fácil

operação. Porém os sistemas abertos são mais suscetíveis à contaminação (XU et

al., 2009). Os sistemas fechados são feitos geralmente em fotobiorreatores. Um

esquema de fotobiorreator pode ser observado na Figura 2.

O fotobiorreator é um equipamento fechado que fornece um ambiente

controlado e permite uma elevada produtividade de microalgas. Como se trata de um

sistema fechado, todos os requisitos de crescimento das microalgas são introduzidos

no sistema e controlados de acordo com a necessidade (SUALI; SARBATLY, 2012).

17

Fotobiorreatores facilitam um melhor controle do ambiente de cultura, tais

como o fornecimento de dióxido de carbono, o abastecimento de água, a

temperatura ideal, a exposição eficiente de luz, a densidade da cultura, os níveis de

pH, a taxa de fornecimento de gás e o regime de mistura (SHEEHAN et al.,1988).

Figura 2 - Fotobiorreator

Fonte: Oilgae,cultivation of algae in photobioreactor.

3.2.1 Meio de cultivo

Para o seu pleno desenvolvimento as microalgas necessitam dispor de

macronutrientes essenciais, micronutrientes e baixas concentrações de vitaminas

(GUILLARD, 1975).

Macronutrientes

Classificam-se como macronutrientes carbono, hidrogênio, oxigênio,

nitrogênio, fósforo, enxofre, potássio, magnésio, silício e ferro que apresentam

funções de grande importância, como constituir a estrutura de biomoléculas,

membranas e do meio intracelular, participar do processo de troca de energia,

regular atividades metabólicas, dentre outras (LOURENÇO, 2006).

Micronutrientes

Quanto aos micronutrientes, os principais são manganês, molibdênio, cobalto,

18

boro, vanádio, zinco, cobre e selênio que participam da estrutura e atividade de

diversas enzimas (LOURENÇO, 2006).

Vitaminas

De acordo com Lourenço (2006) as vitaminas que são usualmente

adicionados aos meios de cultivos são:

Tiamina (B1), que possui função geral de agir como coenzima;

Cianocobalamina (B12) que não possui ainda um papel metabólico

suficientemente elucidado;

Biotina (B7) que atua no transporte de CO2

3.3 Métodos de extração de lipídeos.

Existem alguns métodos para a extração de lipídeos, tais como o método de

Folch e o método de Bligh e Dyer, mais conhecidos na literatura. Há também outros

tipos de extração, como a extração por ultrassom, por pressão, por fluido

supercrítico, soxhlet e utilizando o hexano (MERCER; ARMENTA, 2011).

3.3.1 Método Folch.

Consiste numa mistura de clorofórmio / metanol (2/1) Após a dispersão, toda a

mistura é agitada durante 15-20 min num agitador orbital à temperatura ambiente. A

mistura é filtrada (funil com um papel de filtro dobrado) ou centrifugada para

recuperar a fase líquida.

O solvente é lavado com 0,2 volumes com solução de cloreto de sódio a 0,9

%.Depois da centrifugação e de separação da fase superior, a fase inferior de

clorofórmio contendo lipídios é evaporada a vácuo num rotaevaporador (FOLCH et

al., 1957).

19

3.3.2 Método Bligh e Dyer.

O método de Bligh e Dyer é uma simples adaptação do procedimento de Folch e

foi desenvolvido apenas como um meio econômico (em termos de volumes de

solventes) de extração de lipídios a partir de amostras que contêm relativamente

pouco teor de lipídios e uma alta proporção de água. O método consiste nas

seguintes etapas:

Para cada 1 mL de amostra, adicionar 3,75 mL de 1:2 (volume / volume) de

clorofórmio/metanol com agitação vigorosa, em seguida adicionar 1,25 mL

clorofórmio continuando agitação até o final do preparo da mistura, e após adicionar

1,25 mililitros de água destilada .

Centrifugar a 1000 rotações por minuto, durante 5 minutos.

A fase inferior é extraída com uma pipeta de Pasteur, insere-se a pipeta

delicadamente para não misturar as duas fases, e retira-se cerca de 90% da fase

inferior (a que contem lipídios) (BLIGH; DYER, 1959).

3.3.3 Extração Soxhlet

É um método de extração que utiliza solventes químicos. O óleo é extraído por

meio de lavagens repetidas, ou de percolação, com um solvente orgânico tal como o

hexano ou éter de petróleo, sob refluxo (GREENWELL et al., 2010).

3.3.4 Extração com fluido supercrítico.

Gás carbônico é liquefeito sob pressão e aquecido até ao ponto em que ele tenha

as propriedades de um líquido e de um gás, deste modo o gás carbônico atua como

o solvente para a extração do óleo (AMARO et al., 2011).

3.3.5 Extração por pressão e utilizando Hexano como solvente

Hexano pode ser utilizado sozinho como solvente ou pode ser usado juntamente

com o processo de prensagem de óleo / bagaço. Após o óleo ser extraído do

bagaço, a polpa restante pode ser misturada com ciclo- hexano para extrair o teor de

óleo restante. O óleo dissolve-se no ciclo-hexano, e a polpa é filtrada. O óleo e o

20

ciclo-hexano são separados por meio de destilação. Estes métodos em conjunto

podem extrair cerca de 95% do total de óleo presente nas algas

(REGITANO;D'ARCE, 1987); (SUALI ; SARBATLY, 2012).

3.3.6 Extração por ultrassom.

A sonicação intensa de líquidos gera ondas sonoras que se propagam para o

meio líquido resultando em ciclos alternados de alta e de baixa pressão. Durante o

ciclo de baixa pressão, pequenas bolhas de vácuo são criadas no líquido. Quando

as bolhas atingem um determinado tamanho, elas entram em colapso violentamente

durante o ciclo de alta pressão. Isto é chamado de cavitação. Durante a implosão

jatos de líquidos de alta velocidade e pressão são produzidos localmente. As forças

de cisalhamento resultantes quebram a estrutura celular mecanicamente e

melhoram a transferência de massa (SUALI; SARBATLY, 2012).

A extração por ultrassom pode ser feita utilizando solventes ou enzimas.

3.3.6.1 Extração com solvente

Os ciclos de alta pressão aumentam a difusão de solventes na estrutura da

célula. O hexano é utilizado neste processo. Enquanto o ultrassom rompe a parede

celular mecanicamente, os lipídios se dissolvem no ciclo-hexano. Após esse

procedimento o óleo é separado da polpa por filtração, e em seguida o ciclo-hexano

é separado do óleo por destilação (HALIM et al., 2012).

3.3.6.2 Extração enzimática

Efeitos sinérgicos fortes podem ser observados quando se combina o tratamento

enzimático com sonicação. A cavitação auxilia as enzimas na penetração na

amostra, resultando numa extração mais rápida e com rendimentos mais elevados.

Neste caso, a água atua como um solvente e as enzimas degradam as paredes

celulares (MERCER; ARMENTA, 2011).

3.4 Método de Taguchi

O método de Taguchi foi desenvolvido por Genichi Taguchi para melhorar a

21

qualidade de manufaturados. É muito aplicado na engenharia, biotecnologia,

marketing e publicidade. A utilização do planejamento de experimento é de suma

importância e envolve as seguintes etapas:

- A seleção de variáveis independentes;

- Seleção de número de configurações de nível para cada variável independente;

- Seleção da matriz ortogonal;

- Atribuição das variáveis independentes para cada coluna;

- A realização dos experimentos; e

- Análise dos dados (SANKAR; NELLIAN, 1996).

O método de Taguchi é distinto de outras abordagens para engenharia de

qualidade por parte de alguns conceitos específicos, por exemplo:

- Minimização da função perda de qualidade;

- Maximização da relação sinal-ruído; e

- Matrizes ortogonais.

A estratégia de concepção experimental utilizada no método Taguchi é baseada

em matrizes ortogonais e fatorial fracionada, nas quais nem todas as combinações

possíveis de fatores e níveis são testadas. É útil para estimar os efeitos de fatores

principais no processo. O objetivo principal deste tipo de estratégia é obter o máximo

de informações sobre o efeito dos parâmetros sobre o processo de ensaios

experimentais mínimos. Em adição ao fato de exigir um número menor de

experiências, as matrizes ortogonais ainda permitem testar os fatores usando uma

mistura de número de níveis (SILVA et al., 2013).

22

4 METODOLOGIA

4.1 Parte experimental

A parte experimental foi realizada no laboratório de meio ambiente, localizado na

Escola de Engenharia de Lorena. A metodologia adotada foi a otimização do cultivo

da microalga Chlorella sp e os diferentes métodos de extração foram testados.

4.1.1 Cultivo de Microalga Chlorella sp

O cultivo ocorreu em fotobiorreatores, onde houve uma variação nos fatores de

entrada, conforme planejamento experimental, a fim de obter diferentes resultados e

selecionar o melhor experimento para a extração. Foi utilizado o método de Taguchi

matriz L8, utilizando 5 fatores em dois níveis. Segundo a Figura 3:

Figura 3 – Arranjo ortogonal L8

Fonte: Autoria própria

Os fatores e seus níveis estão representados na Tabela 3:

23

Tabela 3 - Fatores e seus níveis

Sendo: [celular]: Concentração de celular; [Nitrato]: concentração de nitrato.

A Tabela 4 apresenta os reagentes necessários para a preparação do meio

f/2 sem sílica, foi utilizado este meio cultivo nos experimentos (GUILLARD, 1975),

(AMARAL, 2013).

Reagentes utilizados para a preparação do meio de cultivo

Tabela 4 - Reagentes utilizados para a preparação do meio de cultivo

Reagentes Concentração

Sal marinho 33,3 g/l

NaNO3 75g/l

NaH2PO4. H2O 5g/l

FeCl3.6H2O 3,15g/l

Na2EDTA 4,3g/l

ZnSO4. 7H2O 22,2mg/l

MnCl2. 4H2O 180mg/l

Na2MoO4. 2H2O 6,3mg/l

CoCl2. 6H2O 10mg/l

CuSO4.5H2O 9,8mg/l

Tiamina(B1) 100mg/l

Cianocobalamina (B12) 0,5mg/l

Biotina (B7) 0,5mg/l

Fator Nível

1 2

[celular] 5% do volume total 10% do volume total

pH inicial 6 7

[Nitrato] 0.5 mol/L 1.0 mol/L

% de enchimento 40% de 500 mL 90% de 500 mL

Temperatura 25°C 30°C

24

4.1.2 Preparação do meio de cultivo

A cepa foi doada pelo Instituto Oceanográfico da Universidade de São Paulo.

Manteve-se a cepa a partir de sucessivos repiques. Os experimentos foram

realizados em triplicata, com duração de sete dias cada. Em um erlenmeyer de 500

mL o meio de cultivo foi previamente esterilizado na autoclave. Após a autoclave, foi

necessário esperar o meio atingir a temperatura ambiente para adicionar as

vitaminas e as células na concentração desejada. Esse foi o procedimento para

todos os experimentos. Os meios cultivos podem ser observados na Figura 11:

Figura 4 - Meios de cultivo.

Fonte: Autoria própria.

25

Foi utilizado um espectrofotômetro da marca Femto para a leitura diária da

absorbância. E assim obteve-se a curva de crescimento celular para cada

experimento.

4.1.3 Obtenção da curva de calibração

Foram realizadas leituras de absorbância para diferentes concentrações

celulares, a partir destes dados foi construída uma curva de calibração que através

da equação de linearização, calculou-se a concentração de alga dos experimentos.

A figura 6 mostra a curva de calibração obtida:

Figura 5 - Curva de calibração. Concentração versus Absorbância.

1,21,00,80,60,40,20,0

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0,0

Concentração

Ab

so

rbâ

ncia

S 0,0163182

R-Sq 99,6%

R-Sq(adj) 99,6%

Fitted Line PlotC2 = 0,01042 + 0,7301 C1


26

4.2 Obtenção da massa seca

Realizou-se a floculação com solução de sulfato de alumínio, após adição de

solução, a floculação ocorreu em 15 minutos, conforme a Figura 7:

Figura 6 - Microalga floculando


Após essa etapa foi realizada filtração a vácuo, segundo a Figura 8, após a

filtração a biomassa ficou com o seguinte aspecto, mostrado na Figura 9:

Figura 7 - Filtração a vácuo


27

Figura 8 - Biomassa filtrada


A massa seca foi obtida de duas maneiras diferentes: Secagem em estufa por 24

horas a 60°C e liofilização por 6 horas. A Figura 10 mostra a massa seca em

lifiolizador e a Figura 11 mostra a massa seca em estufa.

Figura 9 - Massa seca no liofilizador.


28

Figura 10 - Massa seca em estufa


4.3 Extração de lipídeos

Foram testados os métodos clássicos da literatura, como o método de Folch e o

de Bligh e Dyer. Após realização e adequação desses métodos à biomassa seca,

foram testados também alguns outros métodos descritos na sessão abaixo.

A amostra foi pesada em balança analítica.

4.3.1 Método Folch

Foram pesadas 506 miligramas de massa algal, a essa amostra foi

adicionado 20 mL de metanol e 40 mL de clorofórmio. O tempo de extração foi de 18

horas em um agitador magnético da marca IKA C-MAG HS 7. Foram utilizadas

esferas de sílica para auxiliar na autólise da célula. Após esse procedimento a

biomassa foi filtrada e o filtrado foi purificado. Inicialmente adiciona-se a solução um

terço do volume obtido de solução 0.88% de cloreto de potássio em um funil de

separação, segundo esquema abaixo da Figura 12:

29

Figura 11 - Separação de fases (método FOLCH)


A fase superior é descartada, enquanto a inferior é purificada com uma

solução de clorofórmio e água. A fase superior foi descartada novamente e a fase

inferior foi transferida para um balão volumétrico, onde foi separado o solvente do

óleo em um rotaevaporador a 60 °C. Segundo a Figura 13:

Figura 12 - Recuperação do solvente no rotaevaporador


30

Após esse procedimento o balão foi colocado em um dessecador e após

algumas horas o balão foi pesado para o cálculo da massa de óleo obtida.

4.3.2 Método Bligh and Dyer


adicionado 20mL de metanol e 40 mL de clorofórmio e 16 mL de água. O

tempo de extração foi de 18 horas em um agitador magnético. Após esse

procedimento a polpa foi filtrada e foi adicionado ao filtrado uma mistura de

clorofórmio e água segundo a Figura 14:

Figura 13 - Separação de fases (método Bligh and Dyer).


Após esse procedimento o balão foi colocado em um dessecador e após

algumas horas o balão foi pesado para o cálculo da massa de óleo obtida.

31

4.3.3 Ultrassom de sonda

A extração foi realizada em ultrassom de sonda da marca Sonics por 20 minutos

na frequência de 20kHz mostrado na figura 15.

Figura 14 - Ultrassom de sonda.


Utilizou uma mistura clorofórmio, metanol e água 1:2:0.8 respectivamente, filtrou-

se a solução e o processo se repetiu com a biomassa retida no filtro. Na fase de

separação foi utilizada uma solução de clorofórmio e água 3:1 na quantidade de um

terço do volume obtido no ultrassom. O procedimento foi repetido até 3 vezes.

Segundo o esquema abaixo na Figura 16:

32

Figura 15 - Fluxograma ultrassom de sonda.


4.3.4 Ultrassom de banho

Foi utilizado um ultrassom da marca Kerry Pulsation na frequência de 40 kHz e

uma centrífuga da marca Quimis segundo a figura 17.

Figura 16 - Ultrassom de banho e centrífuga


33

Foi utilizada uma mistura 2:1 clorofórmio: metanol, a massa seca foi colocada

dentro de um tubo de centrífuga e em seguida foi adicionada a mistura. O ultrassom

foi operado por 20 minutos, então a amostra foi centrifuga e o sobrenadante retirado.

À massa centrifugada era adicionada a mistura 2:1 clorofórmio/metanol e foi repetido

o procedimento por 20 minutos. O procedimento foi repetido até 3 vezes. De acordo

com esquema abaixo na Figura 18:

Figura 17 - Fluxograma ultrassom de banho.


Após a extração a biomassa ficou da seguinte forma, segundo a Figura 19:

Figura 18 - Biomassa autolisada.


34

4.4 Determinação do rendimento

Após secagem e obtenção do óleo, calculou-se o rendimento segundo a

equação 1:

( ) ( )

A umidade foi calculada numa balança Mettler Toledo de modelo HB43-S.

35

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 Cálculos das concentrações celulares de microalgas Foram calculadas as concentrações celulares de cada experimento a partir da

equação da figura 6. Sendo que R1, R2 e R3 significam os reatores empregados no

cultivo.

Experimento 1:

Data da inoculação: 10/07/2014

As condições experimentais são apresentadas na tabela 5, os resultados na

tabela 6 e o gráfico de crescimento celular na figura 20.

Tabela 5 - Condições experimentais do experimento 1.

Fator Nível

[celular] 1

pH inicial 1

[Nitrato] 1

% de enchimento 1

Temperatura 1

Tabela 6 - Concentração de alga (g/L) do experimento 1.

Dia Hora R1 R2 R3 Média das

absorbâncias Concentração de alga (g/L)

10/jul. 16:00 0,078 0,081 0,075 0,078 0,067

11/jul. 16:00 0,101 0,111 0,1 0,104 0,086

12/jul. 16:00 0,178 0,188 0,172 0,179 0,141

13/jul. 16:00 0,186 0,232 0,18 0,199 0,156

14/jul. 16:00 0,24 0,308 0,188 0,245 0,189

15/jul. 16:00 0,288 0,365 0,238 0,297 0,227

16/jul. 16:00 0,35 0,446 0,282 0,359 0,272

17/jul. 16:00 0,426 0,518 0,354 0,433 0,326

18/jul. 16:00 0,452 0,545 0,384 0,460 0,346

36

Figura 19 - Curva de crescimento do experimento 1.

Concentração celular

Experimento 2:




Tabela 7 - Condições experimentais do experimento 2

Fator Nível

[celular] 1

pH inicial 1

[Nitrato] 1

% de enchimento 2

Temperatura 2

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

10/jul 11/jul 12/jul 13/jul 14/jul 15/jul 16/jul 17/jul 18/jul

R1

R2

R3

Ab

so

rbâ

ncia

37




22/jul. 16:00 0,116 0,12 0,116 0,117 0,096

23/jul. 16:00 0,146 0,148 0,133 0,142 0,114

24/jul. 16:00 0,188 0,209 0,188 0,195 0,152

25/jul. 16:00 0,218 0,222 0,216 0,219 0,170

26/jul. 16:00 0,264 0,275 0,248 0,262 0,202

27/jul. 16:00 0,31 0,326 0,28 0,305 0,233

28/jul. 16:00 0,382 0,412 0,352 0,382 0,289

29/jul. 16:00 0,431 0,469 0,433 0,444 0,335

30/jul. 16:00 0,482 0,502 0,48 0,488 0,367



Experimento 3:




0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

22/jul 23/jul 24/jul 25/jul 26/jul 27/jul 28/jul 29/jul 30/jul

R1

R2

R3

Ab

so

rbâ

ncia

38


Fator Nível

[celular] 1

pH inicial 2

[Nitrato] 2

% de enchimento 1

Temperatura 1




22/jul. 16:00 0,056 0,06 0,06 0,059 0,053

23/jul. 16:00 0,101 0,08 0,08 0,087 0,074

24/jul. k16:00 0,182 0,187 0,185 0,185 0,145

25/jul. 16:00 0,25 0,255 0,186 0,230 0,178

26/jul. 16:00 0,34 0,315 0,251 0,302 0,231

27/jul. 16:00 0,433 0,36 0,315 0,369 0,280

28/jul. 16:00 0,454 0,52 0,406 0,460 0,346

29/jul. 16:00 0,481 0,558 0,487 0,509 0,382

30/jul. 16:00 0,547 0,584 0,543 0,558 0,418



0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

R1

R2

R3

Ab

so

rbâ

ncia

39

Experimento 4:




.


Fator Nível

[celular] 1

pH inicial 2

[Nitrato] 2

% de enchimento 2

Temperatura 2




01/ago. 16:00 0,085 0,081 0,081 0,082 0,070

02/ago. 16:00 0,1 0,108 0,103 0,104 0,086

03/ago. 16:00 0,128 0,136 0,12 0,128 0,104

04/ago. 16:00 0,176 0,188 0,17 0,178 0,140

05/ago. 16:00 0,288 0,33 0,271 0,296 0,227

06/ago. 16:00 0,387 0,429 0,348 0,388 0,293

07/ago. 16:00 0,372 0,453 0,466 0,430 0,325

08/ago. 16:00 0,526 0,538 0,472 0,512 0,384

09/ago. 16:00 0,63 0,645 0,567 0,614 0,459

40



Experimento 5:




.


Fator Nível

[celular] 2

pH inicial 1

[Nitrato] 2

% de enchimento 1

Temperatura 2

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

R1

R2

R3Ab

so

rbâ

ncia

41




01/ago. 16:00 0,085 0,08 0,084 0,083 0,071

02/ago. 16:00 0,088 0,086 0,089 0,088 0,074

03/ago. 16:00 0,097 0,093 0,098 0,096 0,080

04/ago. 16:00 0,128 0,105 0,11 0,114 0,093

05/ago. 16:00 0,142 0,136 0,154 0,144 0,115

06/ago. 16:00 0,177 0,177 0,182 0,179 0,141

07/ago. 16:00 0,243 0,252 0,241 0,245 0,189

08/ago. 16:00 0,252 0,258 0,248 0,253 0,194

09/ago. 16:00 0,258 0,268 0,252 0,259 0,120



Experimento 6:



0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

R1

R2

R3

Ab

so

rbâ

ncia

42

tabela 16 e o gráfico de crescimento celular na figura 25:


Fator Nível

[celular] 2

pH inicial 1

[Nitrato] 1

% de enchimento 2

Temperatura 1




28/ago. 16:00 0,046 0,042 0,043 0,044 0,042

29/ago. 16:00 0,063 0,059 0,06 0,061 0,054

30/ago. 16:00 0,071 0,068 0,069 0,069 0,061

31/ago. 16:00 0,079 0,082 0,078 0,080 0,068

01/set 16:00 0,088 0,093 0,085 0,088 0,075

02/set 16:00 0,118 0,131 0,115 0,121 0,099

03/set 16:00 0,182 0,227 0,189 0,199 0,155

04/set 16:00 0,286 0,31 0,315 0,303 0,232

05/set 16:00 0,47 0,41 0,42 0,433 0,326


0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

R1

R2

R3

Ab

so

rbâ

ncia

43


Experimento 7:




.


Fator Nível

[celular] 2

pH inicial 2

[Nitrato] 1

% de enchimento 1

Temperatura 2


Dia Hora R1 R2 R3 Média Massa de alga (g/L)

28/ago 16:00 0,079 0,084 0,085 0,082 0,070

29/ago 16:00 0,1 0,102 0,108 0,103 0,085

30/ago 16:00 0,123 0,134 0,138 0,131 0,106

31/ago 16:00 0,186 0,188 0,28 0,218 0,169

01/set 16:00 0,216 0,262 0,283 0,256 0,195

02/set 16:00 0,286 0,323 0,3 0,303 0,231

03/set 16:00 0,33 0,394 0,46 0,394 0,298

04/set 16:00 0,462 0,471 0,528 0,487 0,365

05/set 16:00 0,514 0,524 0,642 0,56 0,419276

44



Experimento 8:





Fator Nível

[celular] 2

pH inicial 2

[Nitrato] 1

% de enchimento 2

Temperatura 1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

R1

R2

R3Ab

so

rbâ

ncia

45




10/jul. 16:00 0,086 0,1 0,088 0,091 0,077

11/jul. 16:00 0,131 0,176 0,141 0,149 0,119

12/jul. 16:00 0,142 0,204 0,173 0,173 0,136

13/jul. 16:00 0,178 0,282 0,201 0,220 0,171

14/jul. 16:00 0,247 0,335 0,268 0,283 0,217

15/jul. 16:00 0,344 0,416 0,365 0,375 0,284

16/jul. 16:00 0,367 0,484 0,42 0,423 0,319

17/jul. 16:00 0,472 0,554 0,423 0,483 0,363

18/jul. 16:00 0,545 0,586 0,463 0,531 0,398


Os experimentos apresentaram uma média final de concentração celular de

0,30 g/L até 0,45 g/L, com exceção do experimento 5, que pode ter apresentado

alguma contaminação. Para a maioria dos experimentos o reator 2 apresentou maior

crescimento, isto pode ser explicado devido a sua disposição no local de

experimentos, sendo um pouco mais exposto a luz do que os outros reatores .Todos

as curvas apresentam um crescimento similar, apresentando a fase Lag, onde


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

R1

R2

R3

Ab

so

rbâ

ncia

46

praticamente não ocorre divisão celular, há um aumento de massa. Essa fase é

considerada um período de adaptação no qual a atividade enzimática, múltipla da

célula, o cultivo foi parado no final da fase Log, ou seja, verifica-se uma tendência a

estabilização da curva ao final de sete dias (LOURENÇO, 2006), (SCHMIDELL et

al.,2001).

5.2 Análise dos dados utilizando planejamento de experimentos

5.2.1 Análise dos efeitos

Primeiramente os efeitos foram analisados individualmente, apresentados na

figura 28:

Figura 27 – Efeitos dos fatores no crescimento celular.

;

Observa-se na figura acima que por ordem decrescente de importância os fatores

são concentração de nitrato, [celular], % enchimento, temperatura e pH inicial. De

modo que quanto mais inclinada a reta, mais impactante é o fator.

47

5.2.2 Cálculo da ANOVA e análise dos residuais para os fatores.

A tabela 21 apresenta ANOVA da média para a concentração celular e a figura

29 os gráficos de análise de resíduos.

Tabela 21 - ANOVA da média para concentração celular

Fator DF SS MS F P

[celular] 1 0,0075 0,0075 1,22 0,312

Erro 6 0,0372 0,0062 Total 7 0,0447

Figura 28 - Análise de resíduos (concentração celular)

Observa-se nos gráficos acima que a distribuição é normal, as variâncias são

homogêneas, a média tende a 0 e há independência, ou seja, ANOVA pode ser

considerada, pois não há nenhuma variável extra que comprometa a análise.

A concentração celular é um fator importante, como demonstram os dados acima

48

(p-valor e teste de Fischer). Para significância do fator o p-value devem ser maiores

que 0.05 e o F deve ser maiores que 0.5.

A tabela 22 apresenta ANOVA da média para o pH inicial e a figura 3- os gráficos

de análise de resíduos.

Tabela 22 - ANOVA da média para concentração celular

Fator DF SS MS F P

pH inicial 1 3E-05 3E-05 0 0,952

Erro 6 0,0447 0,0075 Total 7 0,0447

Figura 29 - Análise de resíduos (pH inicial)


49



Analisando ANOVA observa-se que o para o teste de Fischer o pH inicial é

insignificativo. Para significância do fator o p-value devem ser maiores que 0.05 e o

F devem ser maiores que 0.5.

De acordo com a literatura a microalga Chorella sp tem preferência do pH de 5.5

a 8, sendo que no trabalho foi utilizado 5 a 6 (dentro da faixa ideal de crescimento),

por essa razão não há significância do pH no crescimento (R. B, 2006).

A tabela 23 apresenta ANOVA da média para a concentração de nitrato e a figura

31 os gráficos de análise de resíduos.

Tabela 23 - ANOVA da média para concentração de nitrato

Fator DF SS MS F P

Concentração de nitrato 1 0,0121 0,0121 2,23 0,186

Erro 6 0,0326 0,0054 Total 7 0,0447

Figura 30 - Análise de resíduos (concentração de nitrato)

50




A concentração de nitrato é um fator importante, como demonstram os dados

acima (p-valor e teste de Fischer). Para significância do fator o p-value deve ser

maior que 0.05 e o F devem ser maiores que 0.5.

A tabela 24 apresenta ANOVA da média para a % de enchimento e a figura 32 os

gráficos de análise de resíduos.

Tabela 24 - ANOVA da média para % de enchimento

Fator DF SS MS F P

% de enchimento 1 0,0035 0,0035 0,51 0,503

Erro 6 0,0412 0,0069 Total 7 0,0447

Figura 31 - Análise de resíduos (porcentagem de enchimento)

51




A porcentagem de enchimento é um fator importante, como demonstram os dados

acima (p-valor e teste de Fischer). Para significância do fator o p-value devem ser

maiores que 0.05 e o F deve ser maiores que 0.5.

A tabela 25 apresenta ANOVA da média para temperatura e a figura 33 os

gráficos de análise de resíduos.

Tabela 25 - ANOVA da média para temperatura

Fator DF SS

MS F P

Temperatura 1 0,0003 0,0003 0,03 0,859

Erro 6 0,0445 0,0074 Total 7 0,0447

Figura 32 - Análise de resíduos (temperatura)

52




Analisando ANOVA observa-se que o para o teste de Fischer a temperatura é

insignificativa. Para significância do fator o p-value deve ser maior que 0.05 e o F

devem ser maiores que 0.5.

Segundo a literatura as temperaturas de 25°C e 30°C não apresentam diferença

no crescimento celular no período de sete dias, a diferença no crescimento só é

observada após dez dias de cultivo (LATALA,1991).

Sinal ruído.

O sinal ruído foi calculado com base na fórmula de quanto maior melhor.

Foram obtidos os seguintes resultados:

Sendo SN= Sinal ruído

A tabela 26 apresenta ANOVA do SN versus [celular]

Tabela 26 - ANOVA, SN versus [celular].

Fator DF SS MS F P

[celular] 1 6,09 6,09 1,24 0,308

Erro 6 29,52 0,92 Total 7 35,61

A tabela 27 apresenta ANOVA do SN versus Concentração de nitrato

Tabela 27 - ANOVA, SN versus [Nitrato].

Fator DF SS MS F P

[nitrato] 1 8,59 8,59 1,91 0,216

Erro 6 27,02 4,5 Total 7 35,61

53

A tabela 28 apresenta ANOVA do SN versus % de enchimento

Tabela 28 - ANOVA, SN versus % de enchimento.

Fator DF SS MS F P

% enchimento 1 3,29 3,29 0,61 0,464

Erro 6 32,31 5,39 Total 7 35,61

A tabela 29 apresenta ANOVA do SN versus Temperatura

Tabela 29 - ANOVA, SN versus Temperatura.

Fator DF SS MS F P

Temperatura 1 0,8 0,8 0,14 0,723

Erro 6 34,81 5,8 Total 7 35,61

A tabela 30 apresenta ANOVA do SN versus pH inicial

Tabela 30 - ANOVA, SN versus pH inicial.

Fator DF SS MS F P

pH inicial 1 0,17 0,17 0,03 0,873

Erro 6 35,44 5,91 Total 7 35,61

Os dados acima corroboram as observações feitas na análise com a média. Ou

seja, temperatura e pH inicial foram descartados por não serem significativos. Para

significância do fator o p-value deve ser maior que 0.05 e o F deve ser maiores que

0.5.

5.3 Escolha do melhor meio de cultivo baseado no crescimento celular:

Com base nos resultados estatísticos obteve-se o melhor nível de cada fator para a

condição ideal.

[celular]:Nível baixo

Concentração de nitrato: Nível alto

% de enchimento: Nível alto

54

5.4 Extração do óleo. Após obter a condição ideal de crescimento foi feita a extração lipídica em

diversos métodos de extração.

5.4.1 Método Folch:

Massa seca em estufa, umidade de 20%


adicionado 20mL de metanol e 40 mL de clorofórmio.

Após esse procedimento o balão é colocado em um dessecador e após

algumas horas o balão é pesado para o cálculo da massa de óleo obtida.

A massa de óleo pesada foi 40 mg.

O rendimento foi calculado segundo a equação 1 citada na metodologia:

( ) ( )

O rendimento foi de 9,88% de grama de óleo por grama de massa seca.

Massa seca no liofilizador:

Massa pesada: 503 mg

Umidade: 13%

A massa de óleo obtida foi 40 mg. Obtendo o rendimento de 6,85% de grama

de óleo por grama de massa seca.

5.4.2 Método de Bligh and Dyer:

Massa seca em estufa, umidade de 18%.

Foram pesadas 508mg de massa algal, a essa amostra foi adicionado

20mL de metanol e 40 mL de clorofórmio e 16 mL de água.

Após esse procedimento o balão é colocado em um dessecador e após

algumas horas o balão é pesado para o cálculo da massa de óleo obtida.

A massa de óleo pesada foi 47 mg.

55

O rendimento foi calculado segundo a equação 1.

O rendimento foi de 11,28% de grama de óleo por grama de massa seca.



Umidade: 10%

A massa de óleo obtida foi 35 mg. Obtendo o rendimento de 7,7%.

5.4.3 Método de ultrassom de sonda:

Massa seca em estufa.

Umidade de 19%.

Massa pesada: 510 mg.

Em um recipiente foram adicionados os 510 mg de massa algal e uma mistura

de 76 mL de clorofórmio metanol e água.

A massa de óleo obtida foi de 55 mg. Obtendo um rendimento de 13,31% de

grama de óleo por grama de massa seca.



Umidade: 12%



5.4.4 Método do ultrassom de banho:

Massa seca em estufa.

Umidade de 20%.


Em um tubo de centrifuga foram adicionados 509mg de massa algal.

A massa de óleo obtida foi de 60 mg. Obtendo um rendimento de 14,73% de


56



Umidade: 10%.

A massa de óleo obtida foi 43 mg. Obtendo o rendimento de 9,48 % de grama


Podemos observar na tabela 31 o rendimento para cada método e massa:

Tabela 31 - Rendimento de % de óleo/massa seca dos diferentes métodos de extração a partir das massas secas em estufa e liofilizador.

Massa seca Método de

extração Rendimento

Estufa Folch 9,88%

Liofilizador Floch 6,85%

Estufa Bligh and Dyer 11,28%

Liofilizador Bligh and Dyer 7,7%

Estufa

Ultrassom de

sonda com

solvente

13,31%

Liofilizador

Ultrassom de

sonda com

solvente

9,08%

Estufa

Ultrassom de

banho com

solvente

14,73%

Liofilizador

Ultrassom de

banho com

solvente

9,48%

5.5 Otimização da extração de óleo.

Para a otimização da produção lipídica, foi alterada a concentração de nitrato,

57

que é o fator que mais influencia o crescimento celular.

Microalgas crescendo num meio com déficit de nitrato produzem mais lipídio,

enquanto o seu crescimento celular não é tão alto. (YEESANG; CHEIRSILP, 2011)

Dessa forma foi feita a extração lipídica dos experimentos que possuíam a

concentração de nitrato em nível baixo. Também foi escolhido o melhor método de

extração obtido anteriormente, que foi o ultrassom de banho com a massa seca em

estufa.

Foram obtidos os seguintes resultados:

- Experimento 1:

Umidade de 22%.


A massa de óleo obtida foi 72 mg. Obtendo o rendimento de 18,4 % de grama


- Experimento 2:

Umidade de 23%.


A massa de óleo obtida foi 78 mg. Obtendo o rendimento de 20 % de grama


- Experimento 7:

Umidade de 20%.




- Experimento 8:

Umidade de 25%.


A massa de óleo obtida foi 70 mg. Obtendo o rendimento de 18,63% de


58

A tabela 32 mostra o rendimento de extração lipídica dos experimentos

mostrando as condições experimentais:

Tabela 32 - Rendimento da extração lipídica após otimização.

Experimento Fator Nível Rendimento

1

[celular] 1

18,4% [Nitrato] 1

% de enchimento 1

2

[celular] 1

20% [Nitrato] 1

% de enchimento 2

7

[celular] 2

15,90% [Nitrato] 1

% de enchimento 1

8

[celular] 2

18,63% [Nitrato] 1

% de enchimento 2

Observa-se que a quantidade de lipídio extraído foi maior sob o déficit de

nitrato. Verifica-se que o experimento que apresentam porcentagem de enchimento

no nível alto e concentração celular em nível baixo foi experimento que obteve maior

rendimento, podendo ser um indício de que esses fatores não são tão influentes na

acumulação de lipídio na célula. Os resultados são condizentes com a literatura

(AMARAL, 2013).

59

6 CONCLUSÃO

Concluiu-se que:

1- Não é proporcional a taxa de crescimento celular com a produção de lipídio.

2- Dentre os métodos de extração o que melhor atendeu às necessidades foi o

ultrassom de banho, pois se obteve um rendimento maior na extração e ainda é

utilizado pouco solvente.

3- A massa seca em estufa obteve um rendimento maior do que a massa

liofilizada em todos os casos.

4- Porcentagem de enchimento e concentração celular aparentam ser fatores

significativos apenas no crescimento celular e não no acúmulo de lipídio celular.

5- A otimização da extração de lipídios foi de 20 a 30%.

60

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AMARAL, M.S. Cultivo da microalga marinha Chlorella sp.como fonte de matéria-prima para a produção de biodiesel, 2013.

AMARO, H. M.; CATARINA GUEDES, A.; XAVIER MALCATA, F. Advances and

perspectives in using microalgae to produce biodiesel. Applied Energy, v. 88, n. 10,

2011.

BENEMANN, J.R., KOOPMAN, B.I., WEISSMAN, J.C., EISENBERGM D.M AND

GOEBEL P. (1980). G.Shelef and C.J Soeder (editores) Algae Biomass: Production

and use, Elsevier, Amsterdam, pp 457-496

BENEMANN, J.R. NREL-AFOSR Workshop, Algal Oil for Jet Fuel

Production, Arlington, VA February 19th, 2008

BLIGH, E.G. AND DYER,W.J. 1959. A rapid method for total lipid extraction and

purification. Can.J.Biochem.Physiol. 37:911-917.

Chlorella sp. Disponível em: <www.nies.go.jp/biology/mcc/home.htm> Acesso em: 30 abr. 2014 Chlorella sp. Disponível em: <www.nies.go.jp/biology/mcc/home.htm> Acesso em: 5 mai. 2014

DERNER, R. B, 2006. Efeito de fontes de carbono no crescimento ena

composição bioquímico das microalgas Chaetoceros muelleri e Thalassiosira

fluviatilis com ênfase no Teor de ácidos graxos poli-insaturados.

Fotobiorreator. Disponível em: <http://www.oilgae.com/algae/cult/pbr/pbr.html> Acesso em: 23 abr. 2014 Rendimento de óleo de oleaginosas comparado às microalgas. Disponível em: <Fonte: http://oakhavenpc.org/cultivating_algae.htm> Acesso em: 16 abr. 2014

61

DEMIRBAS A, DEMIRBAS MF: Importance of algae oil as a source of

biodiesel. Energy Conv. Manag. 2011, 52:163–170

FOLCH ET AL., Journal of Biological Chemical 1957, 226, 497

HALIM, R., DANQUAH, M.K AND WEBLEY, P.A.: Extraction of oil from

microalgae for biodiesel production: A review. Biotechnol. Adv. 30:3 (2012). pp. 709-

732.

HALIM, R.; GLADMAN, B.; DANQUAH, M.K.; WEBLEY, P.A. Oil extraction from

microalgae for biodiesel production. Bioresour Technol, v. 102 p. 178–85. 2011.

HARUN, R.; SINGH, M.; FORDE, G. M.; DANQUAH, M. K. Bioprocess

engineering of microalgae to produce a variety of consumer products. Renewable &

Sustainable Energy Reviews, v.14, p.1037-1047. 2010.

HUNTLEY, M.E.; REDALJE, D.G. CO2 mitigation and renewable oil from

photosynthetic microbes: a new appraisal. Mitigation and Adaptation Strategies for

Global Change, v. 12, p. 573-608, 2007.

http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1961, acessado em

06/04/2014 as 23:55

http://www.oilgae.com/algae/oil/extract/mec/mec.html, acessado em 05/05/2014

as 15 25.

http://www.hielscher.com/algae_extraction_01.htm, acessado em 04/04/2014 as

19:50

GONÇALVES AL, PIRES JCM, SIMÕES M: Biodiesel from microalgal oil extraction. In Environmental Chemistry for a Sustainable World. Volume 3. Edited by: Lichtfouse E, Schwarzbauer J, Robert D. Heidelberg: Springer; 2013.

62

GRIFFITS, M. J. & HARRISON, S. T. (2009). Lipid productivity as a key characteristic

for choosing algal species for biodiesel production. J. Appl. Phycol., 21(5), 493-507.

GUILLARD, R.R.L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. In:

SMITH, W.L.; CHANLEY, M.H. (Eds.). Culture of marine invertebrate animals. New

York: Plenum. 1975. p. 29-60.

IHAB H. FARAG, Algae & Energy in the Northeast Advancing knowledge,

research and innovation, University of Vermont, Davis Center, Burlington, VT, March

17- 18, 2010.

ILLMAN, A. M.; SCRAGG, A. H.; SHALES, S. W.. Increase in Chlorella strains

calorific values when grown in low nitrogen medium. Enzyme and Microbial

Technology, v. 27, p. 631-635, 2000.

LATALA,ADAM. Effects of salinity, temperature and light on the growth and

morphology of green planktonic algae. Institute of oceanography, University of

Gdansk,Gdnya,1991

LIANG, Y., SARKANY, N. & CUI, Y. (2009). Biomass and lipid productivities of

Chlorella vulgaris under autotrophic, heterotrophic and mixotrophic growth conditions.

Biotechnol. Lett., 31(7), 1043-1049.

LOURENÇO, S. O. Cultivo de microalgas marinhas: princípios e aplicações. São

Carlos: Rima, 2006. 588 p.

MERCER, P. AND ARMENTA, R.E.: Developments in oil extraction from

microalgae. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 113:5 (2011), pp. 539-547

SILVA, M.B. Robust Design and Taguchi Method Application, design of

experiments application. Published: June 26, 2013

SHEEHAN J., DUNAHAY T., BENEMANN J. AND ROESSLER, P.: A look back

63

at the U.S. DASP: Biodiesel from algae, 1998.

SUALI, E. & R. SARBATLY. Conversion of microalgae to biofuel. Renewable &

Sustainable Energy Reviews, v. 16, 2012.

SANKAR NELLIAN.Integration of Taguchi design of experiments and finite

element method for robust design, 1996.

SCHMIDELL, W.; LIMA, U. A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W. Biotecnologia

Industrial – Engenharia Bioquímica, vol. 2, São Paulo: Edgard Blücher, 2001.

SMITH, G. M. Freshwater Algae of the United States 2d edition, McGraw-Hill

Book Co., New York (1950)

XU, L.; WEATHERS, P. J.; XIONG, X. R.; LIU, C.Z.. Microalgal bioreactors:

Challenges and opportunities. Engineering in Life Sciences, v. 9, p. 178-189. 2009.

WARBURG, OTTO.Über die katalytischen Wirkungen der lebendign Substanz

(Berlin, 1928)

WEISSMAN, J.C. AND TILLETT, D.T.(1992). In Aquatic Species Project Report,

FY 1989-1990, pp.32-56,NREL,Golden Co, NREL/MP-232-4174 (1992)

WEISSMAN, J.C. AND GOEBEL, R.P. (1987). Design and Analysis of Pond

Systems for the Purpose of Producing Fuels, Final Report, Solar Energy Res.Inst.,

Golden CO, SERI/STR-231-2840 (1987)

YEESANG, C. AND B. CHEIRSILP, 2011. Effect of nitrogen, salt, and iron content

in the growth medium and light intensity on lipid production by microalgae isolated

from freshwater sources in Thailand. Bioresource Technol.

YUSUF CHRISTI, Constraints to commercialization of algal fuels, Journal of

Biotechnology, 2013

obtenção de óleo extraído da microalga chlorella...

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