noÇÕes de espectrometria de massa - … · sistema de vácuo entrada da amostra detector sistema...

The world leader in serving science

NOÇÕES DE ESPECTROMETRIA DE

MASSA

José Felipe Lugãofelipe.lugao@novanalitica.com.br

� Responde às duas perguntas mais importantes da Química Analítica:

• O que é ?• Tempo de Retenção• Peso molecular• Estrutura molecular

• Quanto tem ?• Área cromatográfica

Cromatografia Acoplada a Espectrometria de Massa

Cromatograma

Espectro MS

Qual é o espectrômetro de massa ideal ?

Entrada

de

Amostras

?

Sistema de

Vácuo

Entrada da

AmostraDetector

Sistema

de

Dados

Analizador

de MassasIonização

Atmosfera

Componentes do Espectrômetro de Massa

Espectro X Cromatograma

?

Se ampliarmos

esta região do

cromatograma...

1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25Time

50

100

%

TIC

Como um Detector de Massa Cria Um Cromatograma ?

Veremos que nesta

escala o pico é

feito por pontos

discretos...

2.12 2.14 2.16 2.18 2.20 2.22 2.24 2.26 2.28Time78

100

%

TIC

Como um Detector de Massa Cria Um Cromatograma ?

Cada ponto

representa uma

única varredura

(espectro) do

analisador de

massa...

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 3000

100

%

240

241

Como um Detector de Massa Cria Um Cromatograma ?

Cada ponto do

cromatograma

possui um

espectro único

Como um Detector de Massa Cria Um Cromatograma ?

TIC - Cromatograma

produzido pela soma

do sinal de todas as

massas observadas

a cada varredura...

espectro

Como um Detector de Massa Cria Um Cromatograma ?

TIC x RIC (Cromatograma de Massa Reconstruído)

C:\Documents and Settings\...\PPB006 30/9/2008 08:02:25

26 27 28 29 30 31 32

Time (min)

0

20

40

60

80

Rel

ativ

e A

bund

ance

RT: 27,83RT: 31,66RT: 28,16

RT: 26,13 RT: 28,41 RT: 30,93

RT: 29,60 RT: 30,43RT: 26,82

NL:1,68E8

TIC MS ICIS PPB006

26 27 28 29 30 31 32

Time (min)

0

20

40

60

80

Rel

ativ

e A

bund

ance

RT: 27,83RT: 31,66RT: 28,16

RT: 26,13 RT: 28,41 RT: 30,93

RT: 29,60 RT: 30,43RT: 26,82

NL:1,68E8

TIC MS ICIS PPB006

26 27 28 29 30 31 32

Time (min)

0

50

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

RT: 28,35

26,1331,6627,83

29,06 30,9129,60

26,30 27,20 28,9529,85 30,43

31,1026,95

NL:4,24E6

m/z= 93,11-94,11 MS PPB006

26 27 28 29 30 31 32

Time (min)

0

50

100

Rel

ativ

e A

bund

ance RT: 28,41

27,18

27,88

27,35 29,0631,6630,9126,28 29,8526,82 30,43

NL:2,33E7

m/z= 159,55-163,26 MS PPB006

50 100 150 200 250 300 350 400 450

m/z

0

50

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

93,01

69,0194,03

161,07 204,11133,03

207,12 258,88 280,44 340,84 413,66385,77 439,50

50 100 150 200 250 300 350 400 450

m/z

0

50

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

161,07

105,01

204,1181,01 133,04189,08 207,13 281,12 327,36 385,52 440,36

TIC TIC

RIC 93 RIC 161

Modos de Ionização

Ionização

APIAPI CICI EIEI

Sem fragmentos Com Fragmentos

Fontes de Íons

� GC/MS•

• CI

� LC/MS• ESI• APCI

Ion VolumeRemovível

Lentes

Filamento

e-e- e-

EI

Coluna

++

+

Espectro EI

� M + e-→ M.+ + 2e- + fragmentos

Pico Base

Ion Molecular

Fonte de Íons

Mo

lecu

lar

Wei

ght

Non-Polar Polar

EI/CI

ESI

APCI

100,000

1000

ESI

APCI

Analizadores de Massa

� Quadrupolo� Triplo Quadrupolo� Ion Trap 3D� Ion Trap Linear� Ion Ciclotron� Time Of Flight� Setor Magnetico� Orbitrap� Híbridos� ....

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GC/MS QUADRUPOLO

++

Os íons são varridos pela variação das

voltagens DC/RF aplicadas às barras do

quadrupolo.

Quadrupolo

+

+Os íons são varridos pela variação das

voltagens DC/RF aplicadas às barras do

quadrupolo.

Quadrupolo

Full Scan X SIM

Full Scan

SIM (173)

CHBr3

Full Scan + SIM na mesma corrida

�SIM: Análise de traços de compostos alvos�Full Scan: Espectro de massa para identificação de desconhecidos e confirmação dos alvos encontrados

�Exemplo:• 14 Pesticidas• EI, Full Scan + SIM• Matriz: Morango/Espinafre/Pera

Método Full Scan + SIM

Método Full Scan + SIM

GCMS Quadrupolo– EI Full Scan + SIM

RT: 4.97 - 33.08

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32Time (min)

0

50

100

0

50

100

0

50

100

Rel

ativ

e A

bun

danc

e

0

50

100

0

50

1008.80

12.09 12.395.18 21.24

8.80

12.09 12.395.18 21.24

21.82

21.24

14.61

11.06

11.35

NL: 3.96E7

TIC MS data08

NL: 3.96E7

TIC F: + c Full ms [ 50.00-500.00] MS data08

NL: 7.57E4

TIC F: + c SIM ms [ 131.50-132.50] MS data08

NL: 2.06E3

TIC F: + c SIM ms [ 224.50-225.50] MS data08

NL: 7.43E3

TIC F: + c SIM ms [ 178.50-179.50, 263.50-264.50] MS data08

Pesticides analysed in strawberry/spinach/pea

extract at 5 pg/µl, 2ul injection

Raw

Full Scan

Methiocarb

3 dos 14segmentosSIM

GC/MS Quadrupolo (ISQ) – Sensibilidade

RT: 3.50 - 4.50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

RT: 3.92AA: 321AH: 406

NL:1.28E3

TIC MS ICIS 500_ag

NCI, SIM500 ag OFN (5 x 10E-16g)

m/z 272S/N 27:1Turbo 70L/s, EI Full Scan

1pg OFN

m/z 272S/N > 600:1

ISQ – Aplicação: Poluentes Semivoláteis em Águas

Average IDL = 0,023 ng/uL (~20pg on column)Working Range: 0.05 to 200 ng/uL

120 Compostos20 minutos1uL, Split 1:20

ISQ – Aplicação: Poluentes Voláteis em Águas

EPA 524.3

84 compostos18 min5 ml amostra30:1 split

Average IDL = 0,035 ug/L (~5pg on column)Working Range: 0.05 to 200 ng/uL

Cocaína em Urina

(2)

(1)

1

2

(3)

3

(4)

4

Aplicação ISQ Toxicologia

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MS/MSION TRAP E

TRIPLOQUADRUPOLO

Isolando a Matriz

?!

GC/MS – Organofosforado

MS/MS

GC/MS/MS Ion Trap – Organofosforado

251 > 169

MS/MS

� Análise de composto-alvo� Coeluição de muitos picos� Matriz interferente� Confirmação

Caracterização Estrutural

MS/MSn continua sendo necessário e

complementar à informação de massa exata

Esta informação coletivamente define a estrutura da molécula

Fragmentação por LC/MS/MS

ESI Full Scan MS/MS

Cromatograma

ESI Full Scan MS[MH]+

Ion Trap

Ion Trap Linear

Why Linear (2D) Ion Traps?

A technology evolution based on basic principles

3-Dimensional vs. 2-DimensionalRF Quadrupole Ion Trap

Trapping Efficiency (Effect of RF Phase)

1.2 MHz, 5kV

760 kHz

~ 70%

~ 5%

Successful Trapping of Injected Ions

Tube Lens

Skimmer

Ion Transfer

Tube

Ion Ejection – 2D vs 3D

Skimmer

~ 100% of ions trapped are detected due to radial ejection

Axial ejection allows for hybridization– without compromise (FT)!

Linear Ion Trap

Hybrid Quadrupole Trap

~ 15% detected*

Axial ejection depends on fringe fields generated by grid –this grid compromises triple quadrupole performance

Radial Detection ~ High Sensitivity

Majority of trapped ions cannot be scanned out

*Hager, J., RCM., 2003, 17, 1389

Ion Trap Linear x 3D

•Trapping efficiency

•Detection efficiency

•Trapping capacity

LTQ 3D Traps

~ 50-100% ~50% ~ 1-2x

~ 55-70% ~5% ~ 11-14x

Increase

~ 20,000 ions ~500 ions ~ 40x

Exemplo MS/MSn Flavonóide

Exemplo MS/MSn Flavonóide

Rhoifolin

Ion Trap - Aplicações

Triploquadrupolo

Fragmentando moléculas de mesma massa

100

+

4060

100

+

80 20

Triploquadrupolo TSQ GC/MS/MS & LC/MS/MS

0,025 ppb 0,250 ppb 2,0 ppb

C:\Xcalibur\...\231106\NPF_36 23/11/2006 14:21:132.0ng/mL NPFs/NPAHD3.0ng/mL ACE 3 C18 50 X 2 Acetato NH40.5mM/MeOH(50;50) 200uL/min.

RT: 0,00 - 9,00 SM: 7G

0 2 4 6 8

Time (min)

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

6500

7000

7500

8000

Inte

nsity

RT: 1,99SN: 128

NL: 8,01E3

m/z= 290,50-291,50 F: + c sid=-10,00 SRM ms2 335,10@-12,00 [ 262,00-291,00] MS NPF_39

RT: 0,00 - 9,00 SM: 7G

0 2 4 6 8

Time (min)

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

55000

60000

Inte

nsity

RT: 1,99SN: 1154

NL: 6,30E4

m/z= 290,50-291,50 F: + c sid=-10,00 SRM ms2 335,10@-12,00 [ 262,00-291,00] MS NPF_33

RT: 0,00 - 9,00 SM: 7G

0 2 4 6 8

Time (min)

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

220000

240000

260000

280000

300000

320000

340000

360000

380000

400000

420000

440000

460000

Inte

nsity

RT: 1,96SN: 8257

NL: 4,64E5

m/z= 290,50-291,50 F: + c sid=-10,00 SRM ms2 335,10@-12,00 [ 262,00-291,00] MS NPF_36

NPAMOZ – LANAGRO

330 pesticidas em alimentos

Aplicações Triploquadrupolo

Multiresíduo – 32 pesticidas, 10ng/mL – Spike em Água

Amostra Real – Extrato Vegetal

?

?

??

?

?

?

?

??

IprodioneBitertanol

Elemental composition

� Calculations for : 250 amu� monoisotopic mass� C 12.0000 - 1 to 20 � H 1.0078 - 0 to 60 � N 14.0030 - 0 to 10� O 15.9949 - 0 to 10� S 31.9720 - 0 to 5� Cl 34.9688 - 0 to 5

Isolation Window� +-2 amu = 30.562� +-1 amu = 15.278� +-0.5 amu = 7.632� +-0.2 amu = 3.704� +-0.1 amu = 2.564

2564 3704

7832

15278

30562

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

0,1 0,2 0,5 1 2

SRM with Unit Resolution

Q1Q2

Q3

408.6

408.1

1 Da

1 Da

256.2

256.3

Improved Selectivity in H-SRM Mode

Q1

Q2

Q3

408.6

408.1

1 Da

256.3

0.2 Da

Iprodione

Bitertanol

MS/MS Triploquadrupolo – Análise de Composto Alvo

Benefícios e Limitações da Técnica SRM Triploquadrupolo

Benefícios:�Baixos limites de detecção são alcançados�Excelente quantificação�Robustez

Limitações:�Apenas compostos alvos podem ser analisados�Não permite novos resultados após a aquisição�Limitado número de compostos por corrida�Não é possível buscar compostos desconhecidos

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Orbitrap: A new class of Mass Spectrometer

Resolução

Resolução

288.0441 C9H21O2P1S3 Terbufos

288.0949 C13H21O3P1S1 Iprobenfos

288.1142 C15H17N4Cl1 Myclobutanil

288.1256 C11H20N4O3S1 Epronaz

288.1351 C11H21N4O3P1 Pirimethaphos

288.1474 C16H20N2O3 Imazamethabenz

0.1033 amu

Is a simultaneous measurement possible?

Element Exact MassH 1.007825C 12.000000N 14.003074O 15.994915

Exact Mass and Isobaric Compounds

289.00 289.05 289.10 289.15 289.20m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

289.1314

289.0513 289.1022

289.1215

289.1329 289.1424

R = 10,000

289.00 289.05 289.10 289.15 289.20m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

289.1390

289.1021289.0514

289.1215

289.1329289.1424

R = 20,000

289.00 289.05 289.10 289.15 289.20m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

289.1424289.1547289.1329289.1022

289.0514

289.1215R = 100,000

Yes, at high resolution !

Resolução e Massa Exata

Exatidão de Massa (ppm) = 106 X (Mm – Mr) / Mr

Resolução = M / (M2 – M1)

250.000 250.005

100.000 FWHM @ 200 m/z =0,002 m/z

200 m/z

1 ppm = 200.0000 +- 0,0002 m/z

199,99 m/z

239.00 239.05 239.10 239.15 239.20 239.25m/z

0

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

239.15181C11 H 19 O2 N4

6.50 ppm

239.00 239.05 239.10 239.15 239.20 239.25m/z

0

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

239.15033C 11 H 19 O2 N 4

0.32 ppm

R = 15,000Error = 6.50 ppm

R = 80,000Error = 0.32 ppm

Standard Pesticide Mixture in Horse Feed Matrix

Unusually high error of 6.5 ppm indicates the need for higher resolutionReanalysis at 80,000 resolving power

Quadrupole Orbitrap (Qexactive)

� 140.000 FWHM� 1 – 3 ppm� MS/MS

zm

k

/=ω

Lord of the ion rings: Retainment of the rings

Frequencias são convertidas em m/z utilizando transformada de Fourier

zm

k

/=ω

Lord of the ion rings: Retainment of the rings

Frequencias são convertidas em m/z utilizando transformada de Fourier

Aplicação Exactive

510 Pesticides Exactive

RIC (1 ppb)

Multiresíduos por LC-Full Scan MS – Targeted Screening

Análise Pós-Aquisição• Busca por compostos-alvos – “Screening”

• Pesticidas• Drogas Veterinárias• Hormônios• Toxinas• Poluentes Orgânicos Persistentes• PCBs• Etc,

• Confirmação• Distribuição Isotópica• Full Scan MS/MS

Sample(s) Database(s) Result(s)

Relative mass errors at different resolving power settings of 151compounds at the 25 ppb level in horsefeed and honey matrix.

Conclusion

Minimum 70,000 resolution is requiredMass Accuracy Should Cross the Peak

(not by averaging)

Orbitrap – Análise Antidoping

RT: 0.00 - 18.00

0 5 10 15

Time (min)

0

1000

1000

100

0

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

0

1000

1007.32

7.68

7.99

2.64

10.01

9.70

NL: 2.39E7

m/z= 233.0231-233.0255 F: FTMS + p ESI Full ms [100.00-1000.00] MS cal5_02

NL: 6.40E6

m/z= 404.1221-404.1261 F: FTMS + p ESI Full ms [100.00-1000.00] MS cal5_02

NL: 2.18E6

m/z= 343.0382-343.0416 F: FTMS + p ESI Full ms [100.00-1000.00] MS cal5_02

NL: 5.99E6

m/z= 163.0528-163.0544 F: FTMS + p ESI Full ms [100.00-1000.00] MS cal5_02

NL: 1.02E6

m/z= 746.4801-746.4875 F: FTMS + p ESI Full ms [100.00-1000.00] MS cal5_02

NL: 5.03E6

m/z= 528.0754-528.0806 F: FTMS + p ESI Full ms [100.00-1000.00] MS cal5_02

RT: 7.50 - 7.90

7.55 7.60 7.65 7.70 7.75 7.80 7.85 7.90

Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

7.69 NL: 3.88E6

TIC F: FTMS + p ESI Full ms2 404.02@hcd40.00 [50.00-430.00] MS cal5_02

cal5_02 #1739 RT: 7.69 AV: 1 NL: 7.33E5F: FTMS + p ESI Full ms2 404.02@hcd40.00 [50.00-430.00]

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420

m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

329.0806

344.1041

372.0992

316.1092183.0560 301.0852216.0665134.0606 172.0399287.0824273.0899129.0454 187.0509107.0499 242.032682.0298 226.8040 401.816871.2217 386.1146 420.7813

Number of scans across a peak doing MS/MS

AzoxystrobinMH+ = 404.1242

Quantitation

Confirmation

QEXACTIVE - Quanfirmation Azoxystrobin 1.5ppb

Boscalid

Diuron

Azoxystrobin

Methomyl

Indoxacarb

Spinosad D

Q Exactive Full Scan Quan (Azoxystrobin at 1.5ppb)

Direct comparison of neat vs matrix

Q Exactive Quantitation Full Scan Targeted DD MS/MS (Azoxystrobin at 1.5ppb)

Direct comparison of neat vs matrix

Melamine-Tainted Milk Scandal

SIEVE Workflow

Unalign vs Align

Unaligned

Aligned

Incurred Orange Sample - Navel

Incurred Orange Sample - Navel

Imaverol

Isotope Ratio – Actual vs. Simulation

Actual

Simulation

Imaverol

Mass Accuracy 0.454 ppm

Obrigado

� felipe.lugao@novanalitica.com.br

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