mutacoes em bacterias
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Modificação da informação genética (II)
Principais mecanismos que geram variabilidade genét ica nas bactérias e contribuem para o processo de evolução:
. Mutação
. Transposição
. Transferência de genes ( veiculada por plasmídeos ou bacteriófagos)
. Recombinações entre regiões das moléculas do DNA
Como surgemas mutações ?
• Espontâneas– na ausência de qualquer agente mutagénico– aleatórias; podem resultar de erros durante a replicação do
DNA– Baixa frequência: ~ 10-8 por par de nucleótidos e por
geração
• Induzidas– Desenvolvem-se após exposição a um agente mutagénico,
que aumenta a frequência de mutação.
Mutação - qualquer alteração permanente de uma sequência debases do DNA, mesmo que não tenha efeito detectável no fenótipo.
Pode levar ao estabelecimento de uma subpopulação.
Teste de Ames– usado para despistar a potencial acção mutagénica de compostos químicos (por exemplo, compostos aditivos de alimentos ou cosméticos, pesticidas, etc.); recorre a mutantes auxotóficos de bactérias (ex. Mutante His- de Salmolella sp.). Neste teste, é analisada a frequência de reversão das células de mutante auxotrófico a prototróficas por acção do composto a testar.
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Teste de Ames-detecção de compostos mutagénicos
Placa controlo(colónias de revertentes espontâneos)
Placa onde foi introduzido o possível agente mutagénico–maior nº de colónias prototróficas em relação à histidina do que na placa controlo
Estirpe ou clone - uma população de células geneticamente idênticas
Gene- um fragmento de DNA em que a sequência de bases, após transcrição e tradução, origina uma proteína com uma sequência de aminoácidos bem definida
Genoma - conjunto de todos os genes de um organismo.
Genótipo - conjunto de genes específico que um organismo possui.(Ex. his, his-)
- gene hisC (codifica para proteína HisC); hisC-
Fenótipo - propriedade observável. A expressão fenotípica é profundamente influenciada por factores ambientais.Ex. Estirpe His+ versus estirpe His-
→→→→
Mutação espontânea
Tautomerismo de bases-resulta de erros na replicação do DNA devido à incorporação de nucleótidos contendo for-mas tautoméricas raras das bases.
Os níveis de mutação espontâneasão controlados pela actividade de polimerases 5´-3´ e exonucleases 3´-5´(reconhecimento e reparaçãode erros durante a replicaçãodo DNA)
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Mutação espontânea por transição
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Neste tipo de mutação uma purina é substituída por outra purina diferente (ou uma pirimidina por outra pirimidina d iferente)ex: G A
C T
Neste tipo de mutação uma purina é substituída por outra purina diferente (ou uma pirimidina por outra pirimidina d iferente)ex: G A
C T
Outras causas de mutações espontâneas:- radicais de oxigénio (p.ex. Guanina →→→→ 8-Hidroxiguanina)
Mutação pontual
Adição e eliminação de bases
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Seta azul –indica a direcção da replicação
Hipotéticamente, pode ocorrerum escorregamento numa dascadeias (cadeia em formação ou parental) que leva àformação de um “laço”estabilizado por ligações de –H-
A continuação da replicaçãode DNA leva à adição ou remoçãode nucleotídeo(s), respectivamente.
Adição de 1 T Eliminação de 2 Ts
Transposição
- requer a enzima transposase e extremidades contendo sequências de repetição invertida (IR); recombinação não-homóloga
- em células do tipo procariótico e do tipo procariótico
- sequências de inserção são transposões simples
Transposões complexos – podem transportar genes diversos (p.ex. Genes que conferem resistência a antibióticos ou a metais pesados, genes que codificam para toxinas, etc)
(~750 – 1600 bp)
Tn-5Tn-10
Canamicina (resistência)Tetraciclina (resistência)
Tn-1681 →→→→ Heat-stable enterotoxin formation (virulência)
A mutação pode ocorrer por inserção de uma sequênci a de inserção ou de um transposão complexo dentro da sequência codificante de um gene ou na sua região reguladora.
Consequências possíveis:
- paragem prematura da tradução por introdução de um codão „stop“;- interrupção da sequência codificadora de um gene;- activação da transcrição de um gene (o transposão pode transportar uma região reguladora);- transferência de genes para plasmídeos, ou de plasmídeos para o cromossoma;
(P.ex. Os transposões complexos que transportam genes de resistência a antibióticos podem contribui para a criação de plasmídeos R e para a disseminação deste fenómeno entre bactérias)
Efeito das mutações ao nível das proteínas
Mutação "missense"
Molécula de DNAnormal
⇒⇒⇒⇒ Proteína normal
Mutação pontualnum codão pode levar à substituição de um aminoácido por outro, resultando numa proteínadiferente (p.ex. inactiva)
Mutação "nonsense“(sem sentido)
Origina o aparecimentode um codão STOP, tendocomo consequência a produçãode uma proteína truncada, sem actividade
Mutação "frameshift„(mutação desfasada)
A adição ou eliminação depares de bases não múltiplosde 3, leva à alteração da gre-lha de leitura aberta do segmento de DNA que codifica para uma proteína
Expressão das mutações
A detecção de mutantes numa população microbiana só é posível se as alteraçõesocorridas no património genético do microrganismo c ausar uma alteração de fenótipo
���� "Forward mutation„ (mutação directa)
���� "Reverse mutation" (mutação inversa)
AAA ( K, Lys) GAA (E, Glu) AAA (K, Lys)selvagem mutante selvagem
Forward Reverse
UCC (S, Ser) UGC (C, Cys) AGC (S, Ser)selvagem mutante selvagem
Forward Reverse
Gene →→→→ gene mutado →→→→ proteína modificadaselvagem „ Forward “
Estirpe selvagem →→→→ Mutante
Contudo, a seguir a uma primeira mutação directa, p odem seguir-se mutações (mutação inversa ou mutação supressão) que restabel ecem o genótipo selvagem ou um genótipo equivalente ao que existia antes d a 1ª mutação ⇒⇒⇒⇒ restabelecimento do fenótipo original
���� "Suppressor mutation" (mutação supressão)
As mutações de supressão (alteração compensatória) podem restabelecero fenótipo original. Podem ser intragénicas ou extragénicas
K S P S L R AAAG AGU CCA UCA CUU AAU GCC
(-A) (+G)
AAG GUC CAU CAC UUA AUG GCCK V H H L M A
Selvagem
Mutanteduplo
Ex. mutação supressão intragénica
Mutação silenciosa
Devido à degenerescência do código genético, nem todas asmutações são expressas fenotipicamente. Em muitos codões,a modificação na 3a base é uma mutação silenciosa.
GCU GCC, GCA, GCGA A A A
Mutação neutra
Resulta na codificação de um aminoácido diferente, masfuncionalmente equivalente
AAA AGAK R
Lisina Arginina (aminoácidos com cadeias laterais iónicas)
���� Agentes mutagénicos
����Químicos ����Físicos
Exemplo:Radiação UV
Mutações induzidas
���� Preparação e selecção de mutantes
Agentes mutagénicos - são agentes que aumentam a taxa de mutação (~ 1000 x)
Taxa de mutação - é a probabilidade de haver uma mutaçãonum gene quando a célula divide. A taxa de mutação espontânea num determinado gene é de 10 - 8 (1 mutação em cada 10 8 genes que replicam)
• Os agentes mutagénicos são frequentemente usados em laboratório para aprodução de mutantes para investigação ou melhoramento de estirpes para fins biotecnológicos
⇒⇒⇒⇒ Selecção de mutantes
• Para fins biotecnológicos, os mutantes obtidos por ma nipulação genética são mais difíceis de aceitar
�Bioquímicos- levam a alterações metabólicas
- Auxotróficos- Têm mutações em vias metabólicas- Necessitam de um produto de uma
via metabólica no meio de cultura, porque não são capazes de o sintetizar
- Prototróficos• Crescem em meio mínimo
(sem suplementos adicionais)
Exemplos• Auxotróficos para a síntese de
aminoácidos, vitaminas, etc.- Placas réplica com meio de cultura completo e meio mínimo
Tipo de mutantes Selecção
Detecção e selecção de mutantes
Mutantes nutricionais (auxotróficos Lys-)obtidos por réplica plating
"Master plate "Meio de crescimento completo (contendo lisina)(os mutantes Lys- estão assinaladoscom um x)
" Replica plate "Meio mínimo (sem lisina)
Selecção indirecta (negativa)- „replica plating“
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
1) Tratamento com agente mutagénico
2) Selecção de mutantes auxotróficos para a Lisina (Lys-)
A selecção indirectapermite detectar Mutantes bioquímicose mutantes condicionais
Por exemplo, a técnica de replica platingé usada para identificar mutantes que perderam a capacidade de sintetizar um nutrienteessencial (são auxotróficosem relação a esse nutriente)
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Mutantes nutricionais (auxotróficos Lys-)obtidos por réplica plating
"Master plate "Meio de crescimento completo (contendo lisina)(os mutantes Lys- estão assinaladoscom um x)
" Replica plate "Meio mínimo (sem lisina)
�Bioquímicos- levam a alterações metabólicas
- Auxotróficos- Têm mutações em vias metabólicas- Necessitam de um produto de uma
via metabólica no meio de cultura, porque não são capazes de o sintetizar
- Prototróficos• Crescem em meio mínimo
(sem suplementos adicionais)
Exemplos• Auxotróficos para a síntese de
aminoácidos, vitaminas, etc.
• Deficientes na capacidade de fermentar açúcares
- Placas réplica com meio de cultura completo e meio mínimo
- Meio contendo um indicador de pH
Tipo de mutantes Selecção
Detecção e selecção de mutantes
Tipo de mutantes Selecção
���� MorfológicosAnálise da morfologia colonial(cor, mucosidade)
Ex: mutantes pigmentados e despigmentados de Aspergillus nidulans
���� de Resistência (resistentes)
Crescimento em meio de cultura que contém concentrações seleccionadas do agente de resistência (ex. toxina, antibiótico, etc.)
Ex: Desenvolvimento de colónias resistentesa um antibiótico
Selecção directa
A selecção directapermitedetectar mutantes morfológicos,mutantes de resistênciae mutantes prototróficos(a partir de população de mutante auxotrófico)
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Teste de Ames– usado para despistar a potencial acção mutagénica de compostos químicos (por exemplo, compostos aditivos de alimentos ou cosméticos, pesticidas, etc.); recorre a mutantes auxotóficos de bactérias (ex. Mutante His- de Salmolella sp.). Neste teste, é analisada a frequência de reversão das células do mutante auxotrófico a prototróficas por acção do composto a testar.
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
���� Exemplos de agentes mutagénicos
����Químicos ����Físicos
Exemplo:Radiação UV
Incorporação de análogos de bases
Nos análogos de bases existe maior frequência da forma enol rara
Ex: 5-bromouracilo
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
A molécula de 5-bromouracilo é incorporada no DNA em lugar detimina, mas muitas vezes emparelha com guanina. O c rescimento de uma população de células na presença deste análo go origina uma descendência de células onde ocorreu substituiç ão de bases(par A-T →→→→ par G-C).
Agentes alquilantes
Agentes:HidroxilaminaMetanossulfonato de etilo (EMS)Metanossulfonato de metilo (MMS)N-metil-N´-nitro-N-nitrosoguanidina
Posições de alquilação:N7 e O6 da guaninaN3 da adeninaO4 da timina
A alquilação de purinas (A, G)também torna mais lábil a sua ligação à desoxirribose ⇒⇒⇒⇒ depurinação do DNA
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
⇒⇒⇒⇒ Emparelhamento errado de bases
Desaminação oxidativa das bases por acção de HNO2
A adenina é desaminada a hipoxantina a qual forma ligação com citosina emvez de timina
A citosina é desaminada a uracilo, o qual liga a adenina em vez de guanina
A guanina é desaminada a xantina, a qual continua a emparelhar com citosina, mas só por duas ligações de hidrogénio⇒⇒⇒⇒ Ligação mais lábil
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
Ácido nitroso como agente mutagénico
A adenina desaminada emparelha com a citosina
(In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)
O ácido nitroso pode ser gerado na água a partir de NO2- (nitrito; poluente da água)
Agentes que se intercalam entre as bases da cadeia dupla de DNA
Estes agentes químicos intercalam-se entre as bases do DNAformando um "laço" numa das cadeias. Quando ocorre replicação,uma ou mais bases podem ser inseridas ou eliminadas. Estes agentes causam mutações do tipo "frameshift" .
Exemplos:
-Brometo de etídeo-Acridina laranja-Proflavina
Agentes mutagénicos físicos – Radiação UV
Mutantes de interesse são seleccionados entre as células sobreviventes.
Vantagem: é eficiente e evita o recurso a compostos químicos (que são tóxicos)
Realizar selecção de mutantes naausência de luz visível(mutação pode ser eficientementereparada por acção fotoquímica)
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