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Objectivos:
◉◉◉◉ Listar e descrever as ferramentas de estudo da célula
◉◉◉◉ Definir e analisar a metodologia usada na:
-Microscopia óptica e electrónica; -Microscopia de fluorescência;
-Microscopia de contraste de fase; -Microscopia confocal; -Microscopia Electrónica de Transmissão e de Varrimento.
◉◉◉◉ Listar e descrever a preparação do material biológico para a microscopia óptica e electrónica
Métodos instrumentais de análise para o estudo de células e tecidos - Microscopia
BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR IBIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR IBIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR IBIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR I
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Poder de resolução
�Microscopia depende de: - técnicas de preparação das amostras biológicas - poder de resolução dos microscópios
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Algumas descobertas importantes na
história da microscopia
1611 - Kepler sugere maneiras de construir 1 microsc composto
1881 - Retzius, Cajal e outros desenvolvem técnicas de coloração e lançaram os fundamentos da anatomia microscópia
1879 - Flemming descreve o comportamento dos cromossomas na mitose de cél animais.
1683 - Leeuwenhoek visualiza pela 1ªx uma bactéria
1882 a 1899 – Klebs e Pasteur utilizando variados corantes identificam importantes agentes patogénicos.
1886 – Zeiss constroi uma série de lentes q permite revelar estruturas nos limites teóricos da luz visível
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na
histhisthisthistóóóória da microscopiaria da microscopiaria da microscopiaria da microscopia
1932 – Zernicke inventa o microscópio de contraste de fase
Estes 2 microsc permitem que células vivas não coradas sejam vistas em detalhe pela 1ª vez
1981 – Allen e Inoué – aperfeiçoam o microscópio óptico de contraste com sistema de vídeo avançado
1988 – Microscópios confocais de varredura comerciais passam a ser amplamente utilizados
1898 – Golgi descreve pela 1ªx o aparelho de Golgi depois da coloração das células com nitrato de prata
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Detalhes revelados pelo microscópio óptico
O limite máximo de resolução de 1 microscópio óptico é determinado pelo comprimento de onda da luz visível, q varia de 0,4 µµµµm (violeta) a 0,7 µµµµm(vermelho).
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Limite de resolução – é o limite de separação pelo qual 2 objectos podem ser distinguidos.
Limite de resolução depende de:
- comprimento de onda da luz (λλλλ)
- abertura numérica do sistema de lentes (an)
Detalhes revelados pelo microscópio óptico
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
A abertura numérica – é a capacidade do sistema de lentes recolher a luz.
- lentes secas - an não pode ser maior que 1
- lentes de imersão – an pode chegar a 1,4
Qto > a an > a resolução e > a luminosidade.
Detalhes revelados pelo microscópio óptico
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação do material biológico para a microscopia óptica -Fixação
A fixação imobiliza,
mata e
preserva e endurece as células.
torna-as permeáveis aos corantes e
produz uma ligação cruzada entre as suas
macromoléculas, permitindo que estas
permaneçam estabilizadas nas suas posições
naturais
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação do material biológico para a microscopia óptica -Fixação
Procedimentos antigos usavam ácidos e solventes orgânicoscomo o álcool. Diferentes poderes de penetração ∴∴∴∴ usados em combinações.
Actualmente usam-se os aldeídos (formaldeído e glutaraldeído) que formam ligações covalentes com os grupos amino-livres das proteínas produzindo ligações cruzadas.
Qualquer tratamento usado na fixação pode alterar a estrutura da célula ou das suas moléculas ∴∴∴∴ uma alternativa é o congelamento rápido.
Vantagens- proteínas bem preservadas
Desvantagens- estrutura fina da célula é destruída pelos cristais de gelo
O tecido congelado é seccionado com um criostato (micrótomomantido numa câmara a ↓↓↓↓ T)
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação do material biológico para a microscopia óptica -Embebição
Mesmo após a fixação os tecidos são macios e frágeis e precisam de ser embebidos em ceras MO
resinas, ME
1º na forma líquida de seguida na forma sólida (por esfriamento ou polimerização).
O material biológico embebido é seccionado com um micrótomo/ultramicrótomo
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação do material biológico para a microscopia óptica -Embebição
O micrótomo – é um aparelho com uma lâmina metálica afiada
As secções:
- de 1 a 10 µm de espessura,
- colocadas sobre a superfície plana de uma lâmina de vidro
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação do material biológico para a microscopia óptica -Coloração
Depois de fixado e seccionado, o material biológico tem que ser coradopara poder ser observado ao microscópio.
Uma vez que que os corantes têm diferentes afinidades e poderes de penetração têm que ser utilizadas em combinações.
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Há uma relativa falta de especificidade dos corantes a nível molecular que tem levado ao desenvolvimento de procedimentos de coloração mais selectivos e racionais, particularmente a métodos que revelem proteínas específicas ou outras macromoléculas na célula.
Preparação do material biológico para a microscopia óptica -Coloração
Assim algumas enzimas podem ser localizadas nas células através da sua actividade catalítica.
Regiões mais sensíveis podem ser avaliadas através de fluorocromos
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Microscopia de FluorescênciaMicroscopia de FluorescênciaMicroscopia de FluorescênciaMicroscopia de Fluorescência
Moléculas fluorescentes absorvem luz a 1 determinado λλλλ e emite um λλλλ + longo, visualizado através de 1 filtro contra um fundo escuro
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Microscopia de FluorescênciaMicroscopia de FluorescênciaMicroscopia de FluorescênciaMicroscopia de Fluorescência
O 1º permite a passagem de λλλλq excitem determinados fluorocromos
O 2º permite passagem de λλλλ emitidos qdo o corante fluoresce
Os fluorocromos são detectados em microsc de fluorescência q difere dos normais por ter uma luz + potente q passa por 2 conjuntos filtros:
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Microscopia de FluorescênciaMicroscopia de FluorescênciaMicroscopia de FluorescênciaMicroscopia de Fluorescência
Imagem de FISH com fluoresceine rodamina
A fluoresceina emite fluorescência verde qdo excitada com luz azulA rodamina “ “ vermelha “ “ “ “ amarel/verde
As 2 cores são vistas separada/ alternando conjuntos de filtros
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Microscopia de Contraste de FaseMicroscopia de Contraste de FaseMicroscopia de Contraste de FaseMicroscopia de Contraste de Fase
Qdo se fixa 1a cél ela perde alguns componentes ou
são simples/ distorcidos
∴∴∴∴ a forma + correcta de examinar as células seria quando estas ainda estivessem vivas, sem as fixar ou congelar.
Qdo a luz atravessa 1a cél viva a fase do λ é alterado de acordo com o índice de refracção da cél. A luz ao passar através do núcleo é retardada e deslocada em relação àluz que atravessam áreas + delgadas.
O microsc de contraste de fase explora os efeitos da interferência qdo estes 2 conjuntos de ondas se recombinam, criando uma imagem da estrutura da célula
Microscopia de Contraste de FaseMicroscopia de Contraste de FaseMicroscopia de Contraste de FaseMicroscopia de Contraste de Fase
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
A luz q passa através de 1a célnão corada
sofre pouca alteração de amplitude e ∴
os detalhes das estruturas não se conseguem ver
As partes coradas da cél
Reduzem a amplitude e ∴
A imagem colorida da cél é vista
Microscopia Microscopia Microscopia Microscopia ConfucalConfucalConfucalConfucal
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Para a microscopia óptica 1 tecido tem q ser cortado em secções q, qto + fina a secção + nítida é a imagem.
Neste processo a informação 3D é perdida.
Com o Mic confucal de varrimento a partir de 1a série de secções tiradas em ≠≠≠≠s profundidades e armazenadas em computador é fácil reconstruir a imagem 3D
o Mic confucal de varrimento é para o microscopista o que o CAT scanner épara o radiologista. Ambos fornecem imagens seccionadas detalhadas do interior de uma estrutura intacta. Gastrula – Drosophila
mic convencional e de fluorescênc confucal
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Microscopia ElectrMicroscopia ElectrMicroscopia ElectrMicroscopia Electróóóónica de Transmissão (TEM)nica de Transmissão (TEM)nica de Transmissão (TEM)nica de Transmissão (TEM)
TEM TEM TEM TEM –––– ‘‘‘‘TransmissiomTransmissiomTransmissiomTransmissiom ElectronElectronElectronElectron MicroscopeMicroscopeMicroscopeMicroscope’’’’
Teorica/ tem 1a resolução 10 000x > q o MO e 1 poder de resolução - 1Å
Na prática tem 1a resolução 100x > q o MO e 1 poder de resolução 20Å
Porquê? Devido a problemas na preparação da amostraContraste eDanos causados pela radiação
No TEM os electrões atravessam a amostra para formar a imagem
Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na
histhisthisthistóóóória da microscopia electrria da microscopia electrria da microscopia electrria da microscopia electróóóónicanicanicanica
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
1897 – J. Thompson anuncia a existência de partículas carregadas –va/ + tarde denominadas “electrões”
1931– Ruska et al constróem o 1º TEM 1935 – Knoll demonstra a viabilidade do mic electrónico de varredura 1939 - Siemens produz o 1º TEM para fins comerciais
1945 – Porter, Claude e Fullam, usam o TEM para examinar célula em cultura depois de fixadas e contrastadas com OsO4
1948 – Pease e Baker, preparam secções de mat biológico de 0,1 a 0,2 µµµµm
1952 – Palade, Porter e Sjöstrand desenvolvem métodos de fixação e corte q possibilitam pela 1ªx a visualização de várias estruturas intracelulares
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na Algumas descobertas importantes na
histhisthisthistóóóória da microscopia electrria da microscopia electrria da microscopia electrria da microscopia electróóóónicanicanicanica
1953 – Porter e Blum desenvolvem o 1º ultramicrótomo
1956 – Glauert et al propõem a resina epoxi araldite como agente de inclusão. 1961 – Luft introduz a resina Epon
1957 – Robertson descreve a estrutura trilaminar da membrana celular vista pela 1ªx no TEM
1959 – Singer usa anticorpos acopolados à ferratina para detectar moléculas da célula
1965 – Cambridge instruments produz o 1º microscópio de varrimento
1968 – De Rosier e Klug descrevem técnicas para a reconstituição de estruturas 3D a partir de micrografias electrónicas
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Preparação do material biológico para a
microscopia electrónica
1º com gluteraldeído que faz com que as moléculas de proteínas façam ligações covalente/ cruzadas com os seus vizinhos
2º com tetróxido de ósmio q se liga e estabiliza as bicamadaslipídicas assim como as proteínas
FixaFixaFixaFixaççççãoãoãoão
DesidrataDesidrataDesidrataDesidrataççççãoãoãoão
Como a amostra é exposta ao vácuo mto forte não pode ser analisada viva, com H2O, ∴∴∴∴ é feita a desidratação numa série crescente de alcoóis
Preparação do material biológico para a
microscopia electrónica
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
EmbebiEmbebiEmbebiEmbebiççççãoãoãoão
Feita com uma resina q se polimeriza formando 1 bloco sólido de plástico
CorteCorteCorteCorte
Cortes ultrafinos (na ordem dos 50 a 100nm de espessura) feitos num ultramicrótomo e colocados numa grelha
ContrastaContrastaContrastaContrastaççççãoãoãoão
Feito com sais de metais pesados como o urânio e o chumbo
Preparação do material biológico para a
microscopia electrónica
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
mitocôndria
nucléolo
vacúolo
ribossomas
RE
Golgi
Microscopia ElectrMicroscopia ElectrMicroscopia ElectrMicroscopia Electróóóónica de Varrimentonica de Varrimentonica de Varrimentonica de Varrimento
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Secções finas obtidos por TEM são pedaços bidimensionais de tecidos e não transmitem de imediato a organização 3D dos componentes celulares
Este é conseguido usando o microscópio electrónico de varrimento, q é num aparelho <, + simples e + barato do q um TEM.
Utiliza os electrões q são dispersos ou emitidos da superfície da amostra ∴somente características da superfíciepodem ser examinadas e a resolução atingível não é mto alta macrófago
COMO ESTUDAR AS CÉLULAS – MICROSCOPIA
Microscopia ElectrMicroscopia ElectrMicroscopia ElectrMicroscopia Electróóóónica de Varrimentonica de Varrimentonica de Varrimentonica de Varrimento
A amostra é fixada,
desidratada e
coberta com uma camada fina de metal pesado de
seguida
varrida por um feixe de electrões.
A quantidade de electrões emitidos é medido para controlar a intensidade de um 2º feixe, q se move em sincronia com o 1º e forma a imagem num écran.
Como a imagem tem brilhos e sombras dá 1a aparência 3D.
Cílio do ouvido interno do boi
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