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MORFOGÊNESE. MEIOS DE CULTURA. PROBLEMAS NA CULTURA DE TECIDOS.

AF073 – BIOTECNOLOGIA VEGETAL

Prof. Dr. Luiz Antonio Biasi

MORFOGÊNESE

Origem da forma da planta e sua organização que pode ser estudada nos níveis:

*Estrutural (organização funcional da célula)*Tecidos*Órgãos*Planta inteira

ENVOLVE CRESCIMENTO E DIFERENCIAÇÃO

A morfogênese é o resultado de um complexo controle hormonal múltiplo, espacial e temporal, por meio da regulação e expressão gênica.

Mudanças quantitativas

Mudanças qualitativas

INTEGRAÇÃO ENTRE OS PROCESSOS DE DIVISÃOE ESPECIALIZAÇÃO CELULAR

MORFOGÊNESE IN VITRO:

*Organogênese DiretaIndireta

*Embriogênese somática DiretaIndireta

Explante

Novos órgãos(organogênese)

Novos embriões(embriões)

Calo

Indireta

Direta

ORGANOGÊNESE INDIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS FOLIARES DE ABACATEIRO

ORGANOGÊNESE INDIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS CAULINARES DE MARACUJAZEIRO

ORGANOGÊNESE DIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS RADICULARES DE CAQUIZEIRO

Segmento radicular

Segmentos foliares

ORGANOGÊNESE DIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS FOLIARES DE CAQUIZEIRO

ORGANOGÊNESE DIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS FOLIARES DE MIRTILEIRO

EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA

Embriogênese somática indireta

Massas celulares

Embriões globulares

Embriões cordiformes

Embriões torpedo

Embriões cotiledonares

Plantas

Explante

EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA DO CAQUIZEIRO

EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA EM TANGERINEIRA ‘PONKAN’

Ferrari (2016)

Ferrari (2016)

Campo (2018)

Fonte: Hering et el. (2014). Scientia Horticulturae, 179(24):284-292.

Embriogênese somática de pupunha em biorreator de imersão temporária

CARTES R, P. et al. Encapsulated Somatic Embryos and Zygotic Embryos for Obtaining Artificial Seeds of Rauli-Beech (Nothofagus alpina (Poepp. & Endl.) Oerst.). Chilean J. Agric. Res., v.69, n.1, p. 112-118, 2009.

Sementes sintéticas

COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA:

1.SAIS MINERAIS:

Macronutrientes:

► Nitrogênio*Amônio (cátion)*Nitrato (ânion)*Concentração de amônio deve ser no máximo até 1/3 do N total.*Importante para o crescimento vegetal e embriogênese somática

► Fósforo*Absorvido da forma H2PO4

-

*Atua no metabolismo energético, na regulação de processos enzimáticos e na ativação de enzimas.

*Necessário para a síntese do ATP.*Na organogênese está envolvido na diferenciação da parte aérea, pois reverte

o efeito das auxinas.

MEIOS DE CULTURA

► Potássio*Utilizado na forma de nitrato, fosfato ou cloreto, mas absorvido como íon livre*Ativador de várias enzimas do metabolismo de carboidratos e proteínas. *É necessário para a embriogênese somática. *A deficiência de potássio pode conduzir a hiperhidricidade e decréscimo na

taxa de absorção de fosfato.

► Cálcio*Usado na forma de nitrato ou cloreto. *Está envolvido na divisão celular, uma vez que um dos componentes da

lamela média é o pectato de cálcio. *Importante para controle da necrose apical.

► Magnésio*Usado na forma de sulfato de magnésio. *Importante para formação da clorofila.*Co-fator importante para várias reações enzimáticas que atuam sobre

substratos fosforilados.

► Enxofre*Utilizado na forma de sulfato.*Envolvido no metabolismo energético na formação do fosfosulfato de

adenosina, constituinte da tiamina, biotina e coenzima A.

Micronutrientes:

► Ferro*Absorvido na forma de quelato com EDTA.*Envolvido nas reações de oxi-redução nos organismos vivos.*Essencial para a síntese da clorofila.

► Manganês*Essencial no metabolismo para a reação de Hill na fotossíntese, quando

a molécula de água é quebrada produzindo elétrons e oxigênio.

► Zinco*Importante nas reações de oxi-redução das plantas. *Co-fator de enzimas anidrase carbônica.

► Boro*Participa do metabolismo de carboidratos, transporte de açúcares, da

síntese de ácidos nucléicos (DNA e RNA), de fitohormônios, formação de paredes celulares e divisão celular.

► Cobre*É um cátion que em dose acima do normal é fitotóxico às culturas. *Constituinte da enzima plastocianina que é importante componente do

transporte de elétrons.

► Molibdênio* Co-fator da redutase do nitrato.

► Cobalto*Está envolvido na expansão foliar.

► Cloro*É essencial para a fotossíntese, sendo requerido durante a reação de Hill.*Pode ser tóxico dependendo da concentração e da espécie.

► Iodo*Sem ação definida.

2. SUBSTÂNCIAS ORGÂNICAS:

-Vitaminas: tiamina (B1), ácido nicotínico (niacina), piridoxina (B6)

-Aminoácidos: glicina

-Mio-inositol

-Adenina

3. CARBOIDRATOS:

-Sacarose (mais utilizado)

-Outros carboidratros: sorbitol; dextrose (glicose); maltose; galactose.

4. AGENTES SOLIDIFICANTES

-Agar: polissacarídeo de algas marinhas (6 a 7%)

-Gomas: polímeros produzidos por bactérias (2 a 3%)

*Gelrite® - Kelco Division of Merck & Co

*Phyta-gel® - Sigma Chemical Co

5. ÁGUA

-Destilada

-Deionizada

-Sistema ‘Milli-Q’: filtros de carvão ativado, colunas de troca iônica e

filtros de acetato de celulose.

6.SUBSTÂNCIAS COMPLEXAS

-Água de coco

-Extrato de levedura

-Extrato de malte

-Caseina hidrolisada

-Banana

Conjunto de aminoácidos

Alguns componentes orgânicos da água de coco (Krikorian, 1991).

AminoácidosAspárticoGlutâmico

SerinaAminobutíricoAsparagina

Glicina ß-AlaninaTreonina Histidina

GlutaminaArgininaLisinaValina

MetioninaTirosinaProlina

HomoserinaFenilalanina

Hidroxiprolina

Vitaminas Acido nicotínico

Acido pantotênicoBiotina, Riboflavina

Ácido fólico Tiamina

Piridoxina Acido ascórbico

Substâncias de crescimentoAuxina

GiberelinaZeatina

1,3-DifenilureaGlicosideo de zeatinaRibosideo de zeatina

Outros compostos nitrogenados

Amônio,Etanolamina

Dihidroxifenilalanina

Ácidos orgânicosChiquímico

QuinicoPirrolidona-carboxilico

SuccínicoMálico

Cítrico e desconhecidos

Outros compostosARN-Polimerase

UraciloAdenina

LeucoantocianinasFosfatase ácida

DiastaseDeshidrogenase

PeroxidaseCatalase

AçúcaresSacaroseGlicoseFrutose

Álcoois de açúcarSorbitol

m-InositolSiloinositol

7. REGULADORES VEGETAIS

-Auxinas

*Ácido indolacético (AIA)*Ácido indolbutírico (AIB)*Ácido naftalenoacético (ANA)*2,4-D*Picloran

-Citocininas

*Cinetina*Benziladenina (BAP)*Zeatina*2iP

-Giberelinas

*Ácido giberélico (GA3)

Divisão celularAlongamento celularDiferenciação celular

REGULADORES VEGETAIS

Auxinas naturais Auxinas artificiais

AUXINAS

Principalmente utilizadas para Enraizamento de brotaçõesIndução da embriogênese somática

Divisão celularDiferenciação celular

Citocininas naturais

Citocininas artificiais

CITOCININAS

Principalmente utilizadas para Proliferação de brotações axilaresDiferenciação de gemas adventícias

Skoog and Miller (1957).

Alongamento celular Divisão celular

GIBERELINAS

OUTROS REGULADORES:

Brassinosteróides:-Mais de 60 conhecidos-Alongamento de caules; crescimento do tubo polínico; desenrolamento defolhas de gramíneas

Poliaminas:-Encontradas em plantas e animais-Tipos: putrescinas;espermidinas; esperminas-Divisão e alongamento celular; enraizamento; formação de tubérculos

Ácido jasmônico:-Formação de tubérculos; amadurecimento de frutos; formação depigmentos; sinalizador de estresse

Ácido salicílico:-Estimula a floração; floração em plantas termogênicas; mecanismo dedefesa.

959,25

4,63

306

0,010,103

Água Sacarose

Ágar Sais

Substâncias orgânicas Reguladores de crescimento

Composição de 1 litro do meio de cultura MS em gramas.

Proporção entre os componentes do meio de cultura em g / litro.

Componentes MS NN WPM QL

Macronutrientes mg L-1 μM mg L-1 μM mg L-1 μM mg L-1 μM

NH4NO3 1650 20612,12 720 8994,39 400 5000,00 400 5000,00

KNO3 1900 18791,41 950 9396,64 - - 1800 17802,36

K2SO4 - - - - 990 5680,40 - -

KH2PO4 170 1249,17 68 499,67 170 1249,70 270 1983,96

Ca(NO3)2.4H2O - - - - 556 2354,40 1200 5080,80

CaCl2.2H2O 440 2992,59 - - 96 652,93 - -

CaCl2 - - 166 1495,30 - - - -

MgSO4.7H2O 370 1501,01 185 750,51 370 1501,10 360 1460,45

Micronutrientes

Fe2SO4.7H2O 27,80 100,00 27,80 100,00 27,80 100,00 27,80 100,00

Na2EDTA 37,30 100,20 37,30 100,20 37,30 100,20 37,30 100,20

H3BO3 6,20 100,26 10,00 161,71 6,20 100,26 6,20 100,26

MnSO4.H2O - - 18,90 111,83 - - - -

MnSO4.4H2O 22,30 99,97 - - 22,30 99,97 1,00 4,48

ZnSO4.7H2O 8,60 29,91 10,00 34,77 8,60 29,91 8,60 29,91

KI 0,83 5,00 - - - - 0,08 0,4 8

Na2MoO4.2H2O 0,25 1,03 0,25 1,03 0,25 1,03 0,25 1,03

CoCl2.6H2O 0,025 0,10 - - - - 0,025 0,10

CuSO4.5H2O 0,025 0,10 0,025 0,10 0,25 1,00 0,025 0,10

Composição de alguns meios de cultura.

MS – Murashige & Skoog (1962)NN – Nitsch & Nitsch (1969)WPM – Lloyd & McCown (1986)QL – Quoirin & Lepoivre (1977)

PROBLEMAS NA CULTURA DE TECIDOS IN VITRO

1.DECLÍNIO DO VIGOR

● Produção de substâncias fenólicas.● Hiperhidricidade● Habituação dos cultivos● Maturidade dos explante● Erros no balanço nutricional do meio de cultura● Utilização de fitorreguladores inadequados● Demora para repicagem dos cultivos

2.NECROSE APICAL

● Deficiência de cálcio● Temperaturas elevadas que favorece a diferença entre crescimento

e translocação do nutriente● Alta umidade que reduz a transpiração e a translocação dos íons

pelo xilema● Reguladores de crescimento ● Longo intervalo entre subcultivos● Gases tóxicos produzidos pela chama do bico de bussen para a

flambagem● Altas taxas de CO2 produzido pela própria planta in vitro

Formas para reduzir a necrose:► Elevar a concentração de cálcio no meio de cultura► Aumentar a concentração de boro► Trocar a flambagem com gás por esterilizadores

elétricos► Utilizar tampas que permitam as trocas gasosas

3.OXIDAÇÃO

Formas de controle:● Adição de antioxidantes como cisteína, PVP, ácido ascórbico e ácido cítrico● Adição de carvão ativado (adsorve os fenóis)● Cultivo inicial no escuro● Troca frequente do meio de cultura● Redução da concentração de ferro e cobre no meio de cultura● Adequação do tipo e concentração dos reguladores de crescimento● Uso de meios líquidos

Reação do oxigênio com íons metálicos dos outros compostos do meio de cultura. Os explantes podem liberar exudatos que tornam o

meio de cultivo escuro pela liberação de fenóis.

Meio de cultura sem carvão ativado Meio de cultura com carvão ativado

4.HIPERHIDRICIDADE

Induzida por:● Meio líquido● Alta concentração de citocininas (BAP)● Elevada umidade in vitro● Altas temperaturas● Baixa irradiância luminosa ou manutenção no escuro

Estado fisiológico que a planta apresenta elevado teor de água no interior das células e tecidos com

aspecto translúcido.

VR043-43 Normal VR043-43 Vitrificado

Folhas translúcidas, alongadas, túrgidas,

frágeis, aquosas e com aparência de vidro

Vitrificação

Lavanda normal Lavanda hiperhidrica

Formas de controle:

► Aumento da concentração de ágar no meio de cultura► Utilização de meio dupla fase (meio líquido e sólido)► Redução da umidade no ambiente in vitro► Em meio líquido, utilizar suportes porosos para sustentação dos

explantes (ponte de papel)► Adição de ácidos orgânicos (citrato, succinato ou malato) ao meio de

cultura para auxiliar a assimilação do NH4+► Redução da concentração de íons de amônio no meio de cultura► Aumento da luminosidade► Redução da concentração de citocininas► Evitar o uso do BAP► Transferência da cultura para um meio de cultivo ausente de

fitorreguladores► Fazer subcultivos mais frequentes► Substituição da sacarose por frutose ou galactose

5.CONTAMINAÇÃO

Ocorrência de● Bactérias● Fungos● Leveduras● Formigas

Geralmente exógenos

Geralmente endógenos

Contaminação bacteriana provavelmente endógena

Contaminação bacteriana provavelmente endógena

Contaminação fungica por manipulação indequada

Contaminação fungica por manipulação indequada

Contaminação fungica por manipulação indequada

Formas de controle:

► Controle fitossanitário das plantas matrizes► Assepsia adequada► Imersão dos explantes em fungicidas► Uso de antibióticos no meio de cultura► Limpeza das câmaras de fluxo laminar► Higienização das mãos► Cuidados durante o manuseio dos explantes e subcultivos► Esterilização correta dos meios de cultura e materiais de trabalho► Limpeza do laboratório► Retirar os frascos contaminados da sala de crescimento► Subcultivos frequentes

6.VARIAÇÃO SOMACLONAL

● Mudanças cariotípicas numéricas*Euploidia: haploidia, poliploidia*Aneuploidia

● Mudanças caritípicas estruturais*Deleções*Duplicações*Inversões*Translocações

● Mutações no DNA citoplasmático

Variabilidade genética que ocorre nos cultivos in vitro.

Larkin, P.J.; Scowcroft, W.R.Somaclonal variation – a novelsource of variability from cellcultures for plant improvement.Theor. Appl. Genet. 60:197-214. 1981).

Causas:

► Genótipos menos estáveis► Explantes com polissomatismo► Estresse in vitro► Diferenciação via rotas indiretas de morfogênese (calo)► Concentrações elevadas de reguladores vegetais► Multiplicação via gemas adventícias► Elevado número de subcultivos