ministério da saúde instituto nacional de câncer ... · do título de mestre em oncologia ......
Post on 19-Jan-2019
215 Views
Preview:
TRANSCRIPT
PRISCILA PEREIRA SENA
Diagnóstico Molecular de Mutações no Gene RB1 em Pacientes com Retinoblastoma e
seus Familiares: Implicações para o Aconselhamento Genético.
Orientadores: Prof. Dr. Fernando Regla Vargas Prof. Dra. Cibele Rodrigues Bonvicino
RIO DE JANEIRO 2013
Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer Coordenação de Pós-graduação Stricto sensu
i
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER Pós-graduação em oncologia
PRISCILA PEREIRA SENA Diagnóstico Molecular de Mutações no Gene RB1 em Pacientes com Retinoblastoma e seus Familiares: Implicações para o Aconselhamento Genético.
Dissertação apresentada ao Instituto Nacional de Câncer como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Oncologia
Orientadores: Prof. Dr. Fernando Regla Vargas Prof. Dra. Cibele Rodrigues Bonvicino
RIO DE JANEIRO 2013
Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer Coordenação de Pós-graduação Stricto sensu
S474d Sena, Priscila Pereira.
Diagnóstico molecular de mutações no gene RB1 em pacientes
com retinoblastoma e seus familiares : implicações para o
aconselhamento genético. / Priscila pereira Sena. – Rio de Janeiro, 2013.
xii, 62 f.: il.
Dissertação (Mestrado em Oncologia) - Instituto Nacional de
Câncer José Alencar Gomes da Silva, 2013.
Orientadores: Fernando Regla Vargas e Cibele Rodrigues
Bonvicino.
1. Retinoblastoma - genética. 2. Genes do Retinoblastoma.
3. Mutação. 4. Deleção Cromossômica. Cromossomos Humanos Par 13 -
genética. 5. Técnicas de Amplificação de Ácido Nucleico. 6.
Aconselhamento Genético. I. Regla Vargas, Fernando (orient.). II. Bonvicino,
Cibele Rodrigues (orient.). III. Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes
da Silva. III. Título.
CDD 616.994042
ii
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER Pós-graduação em oncologia
AUTOR: PRISCILA PEREIRA SENA
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE MUTAÇÕES NO GENE RB1 EM PACIENTES COM RETINOBLASTOMA E SEUS FAMILIARES: IMPLICAÇÕES P ARA O
ACONSELHAMENTO GENÉTICO.
ORIENTADORES: Prof. Dr. Fernando Regla Vargas
Prof. Dra. Cibele Rodrigues Bonvicino
Aprovada em:__/__/___
EXAMINADORES:
Prof. Dr. Fernando Regla Vargas (Presidente) Profa. Dra. Iêda Maria Orioli Profa. Dra. Beatriz de Camargo Profa. Dra. Esther Alicia Rocio Hassan Prof. Dr. Miguel Ângelo Martins Moreira Prof. Dr. Juan Clinton Llerena Junior
RIO DE JANEIRO 2013
Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer Coordenação de Pós-graduação Stricto sensu
iii
Dedico este trabalho ao Kássio Lago Melo (in memorian), como um pedido de desculpas por não ter trabalhado a tempo na descoberta da cura para sua calvície precoce.
iv
Agradecimentos:
• Aos pacientes e seus familiares, por me permitirem a realização deste
trabalho;
• Aos meus professores da pós-graduação, pela transmissão de seus
conhecimentos;
• Ao Dr. Hector, chefe do Laboratório de Genética do Instituto Nacional de
Câncer, pelo espaço cedido e pela disponibilidade de reagentes, materiais e
equipamentos;
• Aos meus orientadores, Fernando Regla Vargas e Cibele Rodrigues
Bonvicino, por terem confiado a mim o projeto e acreditado na minha
capacidade de execução da tarefa;
• A Leila Cabral e Leila Monnerat, por não hesitarem em ajudar sempre que
precisei;
• Aos funcionários do laboratório de genética, pela manutenção da ordem;
• Ao Ministério da Saúde/INCA, pelo suporte financeiro;
• A Shay, Mirela, Raquel, Morgana, Hanna, Marionzinha e Raissa, por todas as
risadas e também pelos momentos de seriedade. Amo vocês;
• A Carol e Livinha, pelas gordices, fashionices e divagações sobre os
acontecimentos da vida;
• A todos os meus amigos da genética, em especial o Régis (meu pupilo!), por
tudo que passamos juntos diariamente;
• Ao William e ao Marcelo (Doca), por me transmitirem paz e tranquilidade;
• Aos meus amigos em geral, por compreenderem minha ausência nos eventos
sociais;
• A minha família, por estar comigo em tudo, para tudo, para sempre.
v
Sumário
LISTA DE FIGURAS...................................................................................................vi
LISTA DE TABELAS..................................................................................................vii
LISTA DE ANEXOS...................................................................................................viii
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS.......................................................................ix
RESUMO.....................................................................................................................xi
ABSTRACT.................................................................................................................xii
INTRODUÇÃO.............................................................................................................1
OBJETIVOS...............................................................................................................14
MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................................15
RESULTADOS...........................................................................................................22
DISCUSSÃO..............................................................................................................33
CONCLUSÕES..........................................................................................................46
REFERÊNCIAS..........................................................................................................47
vi
Lista de figuras
Figura 1.1. Estrutura do olho humano..........................................................................2
Figura 1.2. Teoria dos dois eventos mutacionais.........................................................5
Figura 1.3. Representação da interação entre p16INK4a, CDK4/6 e pRB..................8
Figura 1.4. Estimativa de riscos em retinoblastoma...................................................12
Figura 3.1. Ilustração do funcionamento da técnica de MLPA...................................16
Figura 3.2. Região do cromossomo 13 abrangida pelo FISH....................................20
Figura 4.1. Porcentagem de amostras avaliadas no estudo pelo método de MLPA, segundo a lateralidade do tumor................................................................................22
Figura 4.2. Fluxograma da condução do estudo........................................................22
Figura 4.3. Distribuição do número de pacientes analisados por MLPA e a presença ou não de mutação em relação à lateralidade do tumor............................................23
Figura 4.4. Figura representativa da deleção evidenciada no éxon 19 do gene RB1 da amostra INCA – T1................................................................................................23
Figura 4.5. Figura representativa da deleção evidenciada no éxon 22 do gene RB1 da amostra INCA – T2................................................................................................24
Figura 4.6. Figura representativa da deleção evidenciada nos éxons 10 e 11 do gene RB1 da amostra INCA – B6........................................................................................24
Figura 4.7. Figura representativa da deleção parcial do gene RB1 e do lócus RCBTB2 evidenciada na amostra HCPA – NI1..........................................................25
Figura 4.8: Figura representativa da deleção parcial do gene RB1 e do lócus ITM2B evidenciada na amostra HSM – B3............................................................................25
Figura 4.9. Figura representativa da deleção do lócus ITM2B e das regiões do promotor e éxon 1 do gene RB1, evidenciada na amostra INCA – B8......................26
Figura 4.10. Figura representativa da deleção cromossômica evidenciada na amostra INCA – B7, abrangendo os loci ITM2B, CHC1L e DLEU1, além do gene RB1.............................................................................................................................26
vii
Figura 4.11. Figura representativa da deleção cromossômica evidenciada na amostra INCA – U26, abrangendo os loci ITM2B, RCBTB2 (CHC1L) e DLEU1, além do gene RB1...............................................................................................................27
Figura 4.12. Figura representativa da deleção cromossômica evidenciada na amostra INCA – U28, abrangendo os loci ITM2B, RCBTB2 (CHC1L) e DLEU1, além do gene RB1...............................................................................................................27
Figura 4.13. Figura representativa da deleção cromossômica evidenciada na amostra HSM – B4, abrangendo o locus ITM2B e o gene RB1.................................28
Figura 4.14. Figura representativa da deleção cromossômica evidenciada na amostra HSM – B6, abrangendo os loci ITM2B, RCBTB2 (CHC1L) e DLEU1, além do gene RB1...............................................................................................................28
Figura 4.15. Eletroferograma da amostra INCA – T1.................................................29
Figura 4.16. Resultado do bandeamento GTG da amostra INCA – U28...................29
Figura 4.17. Resultado do FISH da amostra INCA – B7............................................30
Figura 4.18. Resultado do bandeamento GTG da amostra INCA – B7.....................30
Figura 4.19. Sobrevida em 60 meses de acompanhamento em relação ao tipo de mutação observada....................................................................................................32
Figura 5.1. Estrutura do RB1 e correspondência éxon/proteína................................34
Lista de tabelas
Tabela 1.1. Classificação Internacional para o Retinoblastoma intraocular.................3
Tabela 1.2. Resumo das modificações pós-traducionais que podem ocorrer na proteína pRb.................................................................................................................9
Tabela 3.1. Caracterização das amostras obtidas para o estudo..............................15
Tabela 4.1. Resultados das análises moleculares e citogenéticas de 11 pacientes do estudo.........................................................................................................................31
Tabela 4.2. Estimativa de sobrevida dos pacientes em 60 meses............................32
Tabela 5.1. Distribuição das mutações germinativas e somáticas no gene RB1 em relação ao fenótipo dos pacientes..............................................................................43
viii
Lista de anexos
Anexo I: Cópias da aprovação do Comitê de Ética em pesquisa do Instituto Nacional de Câncer para o projeto intitulado “Estudos Citomoleculares em Retinoblastoma” e os Modelos de Consentimento Livre e Esclarecido....................................................55
Anexo II. Quadros das sondas presentes nos kits para MLPA..................................60
Anexo III. Instruções para montagem da placa e parâmetros do sequenciador para análise da reação de MLPA.......................................................................................62
ix
Lista de siglas e abreviaturas
ηg nanograma
°C graus Celsius
b base
BRI2 ≡ITM2B
CDKN2A gene cyclin-dependent kinase inhibitor 2A
CHC1L ≡ RCBTB2
COLS colaboradores
DLEU1 gene deleted in lymphocytic leukemia 1
DNA ácido desoxirribonucléico
dNTP trifosfato de desoxirribonucleotídeo
E2F elongation factor 2
EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético
EtOH etanol
Fig figura
g grama
GOD globo ocular direito
GOE globo ocular esquerdo
Graf figura
h hora
HCPA Hospital de Clínicas de Porto Alegre
HSM Hospital Santa Marcelina
INCA Instituto Nacional de Câncer
ITM2B gene integral membrane protein 2B
Kb quilobase
KHCO3 hidrogenocarbonato de potássio
M molar
Mb megabase
MgCl2 cloreto de magnésio
min minuto
x
mL mililitro
MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
mM milimolar
NaCl cloreto de sódio
NaOH hidróxido de sódio
NH4Cl cloreto de amônio
p16INK4a ≡CDKN2A
pb pares de base
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
pH potencial hidrogeniônico
pRB proteína retinoblastoma
RAN gene member RAS oncogene family
RB1 gene retinoblastoma 1
RCBTB2 gene regulator of chromosome condensation and BTB domain containing protein 2
RefSeq sequência referência depositada no GeneBank
RNA ácido ribonucléico
RNAm ARN mensageiro
rpm rotação por minuto
SDS dodecil sulfato de sódio
seg segundo
SNP single-nucleotide polymorphism
T.E. tris-EDTA
Tab tabela
TDF tetralogia de Fallot
Tris tris(hidroximetil)aminometano
ZHX2 gene zinc fingers and homeoboxes 2
µg micrograma
µL microlitro
xi
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE MUTAÇÕES NO GENE RB1 EM PACIENTES COM RETINOBLASTOMA E SEUS FAMILIARES: IMPLICAÇÕES PARA O
ACONSELHAMENTO GENÉTICO.
Priscila Pereira Sena
O retinoblastoma (RB) é um tumor pediátrico com incidência anual de 12-27 casos por milhão no Brasil. O supressor tumoral RB1, principal gene relacionado à sua ocorrência, localiza-se em 13q14.2 e apresenta 27 éxons. A proteína RB atua na suspensão do ciclo celular através da ligação a fatores de transcrição da família E2F, prevenindo a entrada da célula na fase S. Portadores de mutações patogênicas constitutivas, germinativas ou embrionárias, tendem a desenvolver tumores bilaterais, e 15% dos portadores de RB unilateral também revelam mutações constitutivas. Em 5-15% dos casos ocorrem deleções citogenéticas em 13q14, envolvendo total ou parcialmente o gene RB1, resultando em uma desordem rara, denominada síndrome de deleção 13q, com presença ou não de RB, retardo do crescimento, microcefalia, dismorfia facial e defeitos congênitos no coração, fígado e rins. Para um paciente sem mutação germinativa, o risco de recorrência tumoral em seus irmãos e gerações subsequentes, bem como de tumores secundários é menor. Já em casos de pacientes que revelam mutações germinativas, é necessário investigar seus pais e irmãos, visto que aproximadamente 10% dos portadores de mutações são assintomáticos. O sequenciamento, apesar de ser o método de rastreamento de alterações mais utilizado, não é eficiente em detectar todos os eventos mutacionais. Com base em tais informações, nosso estudo objetivou investigar a presença de anormalidades constitutivas em RB1 e em 13q14, utilizando um método complementar, em amostras de pacientes com RB, a fim de reunir dados relevantes ao aconselhamento genético dessas famílias. Após a análise por sequenciamento direto dos 27 éxons de RB1, as amostras de DNA que não revelaram variantes genéticas foram submetidas à análise pelo método de MLPA. Amostras de pacientes recém-diagnosticados também foram analisadas por esse método. Foram empregadas 98 amostras de DNA; dessas, obtivemos resultados de 66. O MLPA revelou a presença de deleções totais ou parciais em sete pacientes, envolvendo todo o gene RB1 e genes contíguos. Em três casos, um único éxon ou éxons consecutivos de RB1 foram deletados e, em apenas um probando, a deleção ocorreu na região promotora e éxon 1. Os pacientes com alterações detectadas tiveram seus familiares estudados para as respectivas alterações. Em apenas uma família a mesma mutação foi observada em dois irmãos. Um deles desenvolveu retinoblastoma durante o estudo e o outro se encontra sob monitoramento clínico. A correlação genótipo-fenótipo confirmou, em dois casos, a suspeita clínica de síndrome da deleção 13q. Em outros três casos não houve relato clínico da de sinais sindrômicos,apesar da presença de uma grande deleção em 13q14 mostrada por MLPA, significando uma possível manifestação fenotípica branda da condição. Esses resultados sinalizam a importância de avaliar o probando e seus familiares utilizando um método complementar ao sequenciamento, visto que alterações constitutivas podem representar um risco de ocorrência tumoral em outros membros da família, bem como de tumores secundários ao RB. O MLPA mostrou-se eficiente no rastreamento de mutações e na identificação de alterações no número de cópias no lócus RB1, complementando a caracterização molecular dos pacientes e seus familiares envolvidos.
xii
MOLECULAR DIAGNOSIS OF MUTATIONS IN RB1 GENE IN RETINOBLASTOMA PATIENTS AND THEIR RELATIVES: IMPLICATIONS FOR GENETIC
COUNSELING. Priscila Pereira Sena
Retinoblastoma (RB) is a childhood tumor with an annual incidence of 12-27 cases per million in Brazil. The tumor suppressor RB1 is the major gene related to tumor occurrence is located at 13q14.2 and has 27 exons. The RB protein acts in cell cycle arrest by binding to E2F family of transcription factors, preventing S phase entry of the cell cycle. Carriers of germline or embryonic constitutional pathogenic mutations tend to develop bilateral tumors, and 15% of patients with unilateral RB also reveal constitutional mutations. Cytogenetic deletions in 13q14 chromosomal region occur in 5-15% of cases, involving the whole or part of RB1 gene, resulting in a rare disorder called 13q deletion syndrome, with RB development or not, growth retardation, microcephaly, facial dysmorphia, and birth defects in the heart, liver and kidneys. For a patient without a germline mutation, the risk of tumor recurrence in subsequent generations and their siblings, is lower, as well as the risk of secondary tumors. But for patients who reveal germline mutations, it is necessary to investigate their parents and siblings, as approximately 10% of mutation carriers are asymptomatic. Sequencing, besides being the most used method for mutational screening, is not efficient in detecting all the events. Based on this, our study aimed to investigate the presence of constitutional abnormalities in RB1 and 13q14, using a complementary method, in samples from patients with RB, in order to gather relevant data to genetic counseling. After analysis by direct sequencing of the 27 exons of RB1, DNA samples showing no variants were analyzed by MLPA method. Samples from newly diagnosed patients were also investigated by this method. We used 98 DNA samples; from these, we obtained results of 66. MLPA revealed the presence of complete or partial deletions in seven patients, involving the entire RB1 and contiguous genes. In three cases, a single exon or consecutive exons of RB1 were deleted, and in one proband, a deletion occurred involving the promoter region and exon 1. The families of affected patients were investigated for the variants identified in the probands. In only one family the same constitutive mutation was observed in two siblings. One of them developed retinoblastoma during this study and the other is under clinical monitoring. The genotype-phenotype correlation has confirmed, in two cases, clinical suspicion of 13q deletion syndrome. In other three cases there was no clinical report of suspected syndrome, despite the presence of a large deletion at 13q14 shown by MLPA, which could mean a mild phenotypic manifestation of the condition. These results indicate the importance of assessing the proband and their families using a complementary method of analysis, since constitutional changes may present a risk of tumor occurrence in other family members, as well as secondary tumors in RB patients. MLPA was an effective method for mutation and copy number variation screening, complementing the molecular characterization of patients and their relatives.
1
1. Introdução
O retinoblastoma é um tumor infantil que, apesar de raro, apresenta-se como
a malignidade intraocular mais comum da infância (SUCKLING E COLS., 1982). No
processo de desenvolvimento tumoral são acometidas células imaturas da retina e o
tumor pode ser diagnosticado desde o nascimento até, em geral, os cinco anos de
idade. Alguns casos esparsos de retinoblastoma em adultos jovens já foram
relatados (ZHANG E COLS., 2012). Nesses, o tumor pode se originar de uma lesão
benigna da retina (LOHMANN E GALLIE, 2004), denominada retinoma.
Clinicamente, essa lesão pode apresentar diferentes características: em alguns
casos, observa-se uma massa homogênea, acinzentada e translúcida, desde a
superfície da retina até a cavidade do humor vítreo (Fig. 1.1), com desvio da
irrigação sanguínea para a mesma; em outros, pode apresentar-se opaca e com
nódulos brancos (aparentemente calcificados). Pode-se ainda observar, em cerca de
61% dos casos de lesão, a migração e proliferação de pigmentos do epitélio da
retina em áreas ao redor dos nódulos (GALLIE E COLS., 1982). O desenvolvimento
tumoral pode acometer apenas um dos olhos (retinoblastoma unilateral, cerca de
60% do total de casos) ou ambos os olhos (retinoblastoma bilateral). Pacientes com
desenvolvimento tumoral em ambos os olhos, em geral, manifestam os sintomas
mais precocemente (14-16 meses) quando comparados aos pacientes com tumor
em apenas um dos olhos (29-30 meses) (DRAPER E COLS., 1992). Em alguns
casos de tumores unilaterais ou bilaterais o retinoblastoma encontra-se associado a
tumores neuroblásticos intracranianos, mais frequentemente ao pinealoblastoma,
tumor primário na glândula pineal de semelhanças histológicas com o retinoblastoma
(SINGH E COLS., 1999). Esses casos são denominados retinoblastoma trilateral,
porque a glândula pineal é considerada fotossensível em vertebrados inferiores
(ANTONELI E COLS., 2007).
2
Figura 1.1. Estrutura do olho humano. Retirada de http://www.klimanaturali.org/2011/03/olho-humano-estrutura-do-olho-humano.html. (Acessado em 11/03/2013).
O sintoma clínico comumente observado é o reflexo branco pupilar
(LOHMANN E GALLIE, 2004), mas outros sintomas menos indicativos do
desenvolvimento tumoral podem estar presentes, tais como estrabismo,
vascularização anormal da íris, inflamação e aumento da quantidade de fluido
intraocular (com conseqüente expansão do globo ocular), presença de sangue entre
a córnea e a íris, celulite orbital e exoftalmia. Existem ainda crianças que não
apresentam sintomas clínicos, apesar da presença de uma massa tumoral em
desenvolvimento (AERTS E COLS., 2006).
Estima-se que sejam diagnosticados 5000 novos casos de retinoblastoma no
mundo a cada ano (BASAVARAJAPPA E CORSON, 2012); no Brasil, as taxas de
incidência do tumor, ajustadas para a idade de zero a quatro anos, variam de 14.6
por milhão (em Salvador) a 27 por milhão, em Natal (DE CAMARGO, 2010).
O tratamento do retinoblastoma em países desenvolvidos é multimodal e
inclui a enucleação (retirada do globo ocular), radioterapia, quimioterapia,
braquiterapia e termoterapia, o que os permite atingir uma taxa de sobrevivência de
95% dos pacientes; nos países desenvolvidos da América Latina essas taxas
encontram-se entre 80 e 89% (HOUSTON E COLS., 2011). A estratégia de
tratamento a ser seguida depende de fatores como o comprometimento de um ou
3
ambos os olhos, o tamanho e a localização do tumor, o estágio da doença segundo
a classificação Reese-Ellsworth e a presença de doença extraocular (HOLLAND-
FREI E COLS., 2010).
A classificação Reese-Ellsworth para tumores oculares foi criada em 1960 e,
apesar de ainda ser muito utilizada, é falha em relação à presença de sementes
vítreas e subretinianas. Essa constatação promoveu o desenvolvimento de uma
nova classificação internacional, que abrange apenas tumores intraoculares,
conforme pode ser vista na tabela 1.1.
Tabela 1.1. Classificação Internacional para o Retinoblastoma (Rb) intraocular.
(Adaptada de Holland-Frei e colaboradores, 2010, e Houston e colaboradores, 2011).
Grupo Subgrupo Referências Características específicas
A - Tumor pequeno Rb ≤ 3mm
Tumor grande com uma ou mais
das características abaixo:
Rb > 3mm ou com uma ou mais das
características abaixo:
Localização macular ≤ 3mm da fovéola
Localização justapapilar ≤ 1.5mm do nervo óptico
B -
Fluido subretiniano adicional ≤ 3mm da margem tumoral
Sementes focais Rb com uma das características abaixo:
C1 Sementes subretinianas ≤ 3mm
C2 Sementes vítreas ≤ 3mm C
C3 Sementes subretinianas e vítreas ≤ 3mm
Sementes difusas Rb com uma das características abaixo:
D1 Sementes subretinianas > 3mm
D2 Sementes vítreas > 3mm D
D3 Sementes subretinianas e vítreas > 3mm
Rb extenso ocupando > 50% do globo
ocular ou com qualquer das características
abaixo:
Opacidade por hemorragia na câmara
anterior, vítreo ou espaço subretiniano E
-
Retinoblastoma extenso
Invasão do nervo óptico pós laminar, > 2mm
da coroide, esclera, órbita ou câmara
anterior
4
1.1. Genética, epigenética e citogenética do retino blastoma
O desenvolvimento tumoral está relacionado, primariamente, à ocorrência de
dois eventos mutacionais em ambos os alelos do gene supressor tumoral
“retinoblastoma 1” (RB1) de uma mesma célula. Na ausência da atividade normal do
gene RB1, há um acúmulo de instabilidade genômica e aberrações cromossômicas,
o que permite a iniciação, promoção e metástase tumorais (DI FIORE E COLS.,
2013). O gene recebe esse nome por ter sido identificado com alta frequência de
mutações em uma família com casos recorrentes de retinoblastoma, mas alterações
em sua função são associadas também a outros tipos de câncer (senão todos), tais
como osteossarcoma, câncer de pulmão de pequenas células, tumores de próstata e
mama, (HARBOUR, 2001), cérebro e cavidade oral, doença de Hodgkin e melanoma
(DI FIORE E COLS., 2013).
A teoria dos dois eventos mutacionais no gene RB1 foi proposta por Knudson
em 1971 e nos diz que pacientes com predisposição ao desenvolvimento tumoral
receberam a primeira mutação via células germinativas e, portanto, bastaria a
ocorrência de um segundo evento, agora somático, em uma célula retiniana para
que ela se transformasse. Nos casos não hereditários, ambos os eventos
mutacionais ocorrem em uma mesma célula somática da retina em desenvolvimento,
como pode ser visto na figura 1.2 (KNUDSON, 1971).
5
Figura 1.2. Teoria dos dois eventos mutacionais proposta por Knudson. Adaptada de
Holland-Frei (2010).
A maioria das mutações constitutivas encontradas no gene RB1 é a
substituição de um ou alguns poucos pares de bases (LOHMANN E COLS., 1996);
muitas dessas substituições são transições de citosina para timina (C>T). Porém,
cerca de 15% dos casos hereditários revelam grandes deleções no gene RB1
(LOHMANN, 1999) e deleções citogenéticas na banda 13q14 correspondem a 3% -
5% dos mesmos (HARBOUR, 1998). Análises citogenéticas de linfócitos
demonstram a ocorrência de deleções submicroscópicas e rearranjos envolvendo a
região 13q14 em 7,5-8% dos pacientes com retinoblastoma bilateral e 1-4,9% dos
pacientes com retinoblastoma unilateral esporádico (um caso esporádico é a
primeira – e até então única - ocorrência daquele tumor observada na família).
Pequenas deleções também são observadas em cerca de 10% dos pacientes com
retinoblastoma bilateral (LOHMANN, 1999).
Corson e colaboradores, em 2007, observaram que os dois eventos
mutacionais, apesar de necessários à iniciação do desenvolvimento tumoral, não
Retinoblastoma hereditário Retinoblastoma esporádico
6
são as únicas alterações genômicas no retinoblastoma. Algumas mudanças
subsequentes, como ganhos em 1q, 2p, 6p e 13q e perda em 16q, foram propostas
como cruciais para a progressão tumoral, não somente nos casos de retinoblastoma,
mas também em outros tipos de câncer (CORSON E COLS., 2007). Em 1999, Jones
e Laird propuseram um modelo expandido dos dois eventos mutacionais, para incluir
o silenciamento epigenético como um mecanismo de tumorigênese. Mais
recentemente outros estudos identificaram alterações epigenéticas que poderiam
contribuir para a progressão tumoral, tais como hipermetilação dos genes MGMT,
RB1, MSH6, PAX5, CD44, GATA5, TP53, VHL e GSTP1. Esses genes pertencem a
vias de reparo do DNA, senescência e apoptose, regulação transcricional,
degradação proteica, interação célula-célula, adesão e migração celulares (LIVIDE E
COLS., 2012).
Em 75% dos casos hereditários de retinoblastoma, a mutação no gene RB1 é
de novo, o que significa que ela ocorreu em algum período do desenvolvimento
embrionário do paciente (HOLLAND-FREI E COLS., 2010). Portanto o histórico
familiar do paciente não é suficiente para identificação de um caso hereditário,
sendo necessário o screening genético do mesmo, a fim de se identificar mutações
constitutivas.
Nas famílias que apresentam retinoblastoma recorrente, cerca de 90% dos
indivíduos que carregam a mutação desenvolvem o tumor, o que revela alta
penetrância da mesma, e os afetados podem desenvolver múltiplos tumores
bilaterais, significando uma alta expressividade. Entretanto, em algumas famílias,
portadores de mutação em RB1 não desenvolvem o tumor (penetrância reduzida) e
alguns indivíduos afetados têm apenas retinoblastoma unilateral ou retinocitomas
benignos. Muitos mecanismos foram propostos para explicar o retinoblastoma de
baixa penetrância, tais como fatores imunológicos, padrão de metilação do DNA,
mecanismos epigenéticos, eventos mutacionais tardios, fatores individuais de
resistência e atividade de genes moduladores (HARBOUR, 2001). Os mecanismos
moleculares recorrentes em famílias que apresentam retinoblastoma de baixa
penetrância foram divididos em classes 1 e 2. As mutações de classe 1 (que
ocorrem na região promotora e em sítios de splicing), não alteram estrutural ou
funcionalmente a proteína do retinoblastoma (pRB), mas causam uma redução dos
níveis de expressão da proteína normal. Já as mutações de classe 2 não
necessariamente reduzem os níveis de expressão da proteína mas, por afetarem a
7
região codificante do gene, podem originar uma proteína mutante, parcialmente
inativada (HARBOUR, 2001).
Se o primeiro evento mutacional em RB1 ocorrer durante a embriogênese, o
paciente pode apresentar mosaicismo para o mesmo e o grau de células afetadas
dependerá da época do desenvolvimento em que houve o defeito genético (SIPPEL
E COLS., 1998). O retinoblastoma familial corresponde a cerca de 10% do total de
casos (LOHMANN E GALLIE, 2004) e as famílias afetadas têm predisposição ao
desenvolvimento de outros tumores além de retinoblastoma, tais como sarcomas
ósseos e de tecidos moles, melanoma, tumores cerebrais, doença de Hodgkin,
câncer de pulmão, leiomiossarcoma uterino, câncer de mama e tumores de
glândulas salivares e mucosa oral (DI CIOMMO E COLS., 2000; FRANCIS E COLS.,
2012); o osteossarcoma é o tumor secundário mais comum, com uma incidência
1000 vezes maior nos casos hereditários (DI FIORE E COLS., 2013).
O gene RB1 é um supressor tumoral que consiste em 27 regiões
codificadoras de proteína, dispersas em 183 Kb de sequência genômica, localizado
no braço longo do cromossoma 13, na região 13q14.2 (LOHMANN E GALLIE, 2004).
Sua proteína correspondente (pRb) contém 928 resíduos de aminoácidos (SELLERS
E KAELIN, 1997) e é responsável por regular o ciclo celular, fato que explica a perda
de expressão da mesma em diferentes tipos de tumor (CARRIÈRE E COLS., 2011).
Existem diferentes mecanismos capazes de desregular a pRb, como por exemplo as
já citadas mutações no gene RB1, hiperfosforilação e ligação da pRb a
oncoproteínas virais (REED E COLS., 2009). Nas células quiescentes ou no início
da fase G1 do ciclo celular, a pRb encontra-se hipofosforilada e associa-se a fatores
de transcrição da família “elongation factor 2”, (E2F - responsáveis pela regulação
da transição G1-S do ciclo), afim de reprimir a expressão de genes responsivos a
E2F, envolvidos na progressão do ciclo celular (HURFORD E COLS., 1997). Além
disso, também pode se ligar à região promotora de genes chave para a regulação da
proliferação celular e recrutar fatores remodeladores de cromatina, impedindo a
transcrição dos mesmos (LONGWORTH E DYSON, 2010).
Conforme a célula progride para a fase S, a pRb é fosforilada por enzimas
quinases dependentes de ciclina (Cdks), o fator E2F é liberado e a elevação desses
fatores de transcrição abre a origem de replicação do DNA, induzindo a transcrição
de genes da fase S (LOHMANN, 1999). Em caso de perda ou inativação da pRb, a
origem de replicação do DNA torna-se prontamente acessível, resultando em uma
8
transcrição descontrolada de genes da fase S e, consequentemente, em uma
progressão prematura do ciclo celular (LIAO E COLS., 2010).
Quando estudamos a proteína pRB, podemos perceber que sua
fosforilação/inativação é mediada pelas quinases dependentes de ciclina CDK4/6,
cuja superexpressão representa uma via de indução ao câncer (DI FIORE, 2013).
Diferentes estudos sugerem o envolvimento do gene CDK4 na tumorigênese;
dois deles são:
- Xiong e colaboradores, 1993 - demonstraram que a superexpressão de CDK4 pode
induzir o crescimento celular descontrolado e a transformação maligna;
- Wölfel e colaboradores, 1995 - identificaram, em casos de melanoma, uma
mutação somática no gene CDK4, cuja consequência para a proteína era impedir a
ligação da proteína CDKN2A (p16INK4a), inibidora de CDK4.
Além disso, a hipermetilação da região promotora do gene CDKN2A
(p16INK4a) promove uma diminuição do seu produto proteico, o que tem por
consequência a hiperfosforilação e inativação da pRB (INDOVINA E COLS., 2010).
Portanto, a alteração dos níveis de CDKN2A pode significar um novo marcador
hereditário de susceptibilidade ao desenvolvimento de retinoblastoma, sem alteração
constitutiva em RB1.
A figura 1.3 resume a rede de interações estabelecida entre as proteínas
pRB, CDKs e p16INK4a.
Figura 1.3. Representação esquemática da interação entre as proteínas p16INK4a, CDK4/6 e pRB. (Adaptada de Henley e Dick, 2012).
9
A proteína pRb sofre diversas modificações pós-traducionais e, algumas delas
(como a fosforilação por enzimas Cdks e p38 e a SUMOilação), por si só são
favoráveis à proliferação celular (conforme destacadas na tabela 1.2); outras, se
perturbadas, podem inviabilizar a regulação do ciclo celular pela via pRb.
Tabela 1.2. Resumo das modificações pós-traducionais que podem ocorrer na proteína pRb. (Retirada de Munro e colaboradores, 2012).
Sítio Modificação Enzima
responsável
Consequência funcional
S249 Fosforilação Cdk Transcrição
T356 Fosforilação Cdk Transcrição
T373 Fosforilação Cdk Transcrição
p38 Degradação de pRb S567 Fosforilação
Cdk Transcrição
Chk1/Chk2 Aumento de ligação a E2F-1 S612 Fosforilação
Cdk Transcrição
K720 SUMOilação Ubc9 Impede a interação pRb/E2F-1
S795 Fosforilação Cdk Transcrição
S807 Fosforilação Cdk Transcrição
K810 Metilação Set7/9 Antagoniza a fosforilação de pRb
S811 Fosforilação Cdk Transcrição
T821 Fosforilação Cdk Transcrição
T826 Fosforilação Cdk Transcrição
K860 Metilação Smyd2 Aumenta a repressão de pRb
K873 Acetilação P300, P/CAF Previne a fosforilação da pRb; promove a
diferenciação celular
Metilação Set7/9 Aumenta a repressão de pRb
K874 Acetilação P300, P/CAF Previne a fosforilação da pRb; promove a
diferenciação celular
1.2. Síndrome da Deleção 13q
A síndrome da deleção 13q é uma anomalia cromossômica rara, causada
pela perda parcial do cromossomo 13 e teve seus sinais clínicos primeiramente
estabelecidos em 1969, por Allderdice e colaboradores. Tais características clínicas
incluem retardo do crescimento, microcefalia, dismorfia facial e defeitos congênitos
10
no coração, fígado e rins, podendo ou não estar associados ao retinoblastoma
(QUÉLIN E COLS., 2009).
A síndrome de deleção 13q é dividida em três grupos, baseados no tamanho
e na localização da deleção: o grupo 1 engloba as deleções da região cromossômica
proximal à banda 13q32, cujos portadores apresentam retardo mental leve a
moderado, dismorfias variadas e retardo no crescimento; o grupo 2 é referente a
deleções na banda cromossômica 13q32 e seus portadores desenvolvem uma ou
mais malformações, incluindo microcefalia severa e malformações do cérebro e
tratos gastrointestinal e genitourinário (MITTER E COLS., 2011); já o grupo 3
engloba deleções distais às bandas 13q33-34, cujos pacientes apresentam apenas
baixo desenvolvimento intelectual, raramente associado a outras malformações
(BROWN E COLS., 1995; HUANG E COLS., 2012).
1.3. Aconselhamento Genético em Retinoblastoma
O aconselhamento genético é o processo de comunicação que lida com os
problemas associados à ocorrência ou ao risco de ocorrência de determinada
desordem genética em uma família. Esse processo visa ajudar o indivíduo e a
família a entender: 1) os fatos médicos (incluindo o diagnóstico, o provável curso da
doença e os métodos de tratamento disponíveis); 2) a importância da
hereditariedade e de que forma ela contribui para o risco de recorrência da doença
na família; 3) as alternativas disponíveis mediante esse risco e 4) a escolha do que é
mais apropriado, de forma não diretiva, mas em vista de um risco real e da posição
ética e religiosa da família (EPSTEIN E COLS., 1975).
As ferramentas utilizadas pelo conselheiro genético vão desde o exame físico
e conhecimento do histórico familiar do paciente, passando por análises genéticas e
citogenéticas laboratoriais, até a divulgação dos resultados e a ajuda à família para o
entendimento da situação, o que exige o envolvimento de uma equipe
multiprofissional, composta não somente por médicos especializados na clínica e na
genética da doença, mas também de profissionais da área biomédica com
experiência em laboratório, enfermeiros e psicólogos para lidar com as implicações
emocionais e o estresse social advindos do processo de aconselhamento
(NUSSBAUM E COLS., 2007).
11
O Programa de Aconselhamento Genético em Retinoblastoma do Instituto
Nacional de Câncer foi criado em 2002, tendo em vista o risco real de casos
hereditários da doença e a evidência de casos de retinoblastoma familial,
representados por algumas famílias em tratamento na instituição. Inicialmente, a
consulta é feita ao paciente e seus familiares de primeiro grau (pais e irmãos), para
a coleta de informações do histórico familiar de câncer e outras doenças genéticas.
Na primeira consulta é coletado sangue periférico do paciente, para que seu material
genético seja analisado quanto a presença de alterações hereditárias que possam
estar relacionadas à ocorrência do retinoblastoma; caso alguma alteração seja
observada, os pais e irmãos são novamente chamados à consulta, para coleta de
material para análise. Então a alteração genética observada no paciente é
pesquisada no DNA dos seus progenitores e irmãos menores de cinco anos de
idade.
Considerando a história natural da doença, o aconselhamento genético em
retinoblastoma atua na prevenção secundária, visto que o objetivo é detectar
precocemente novos casos da doença na família, bem como de outros tumores no
paciente, além de orientá-los mediante a possibilidade de uma alteração genética
ser passada à geração seguinte.
Para a estimativa de risco sem o resultado genético, são levados em
consideração o histórico familiar do paciente e a literatura do retinoblastoma.
Portanto, como a quase totalidade dos casos bilaterais apresenta mutação
germinativa e cerca de 15% dos casos unilaterais também apresentam mutação
germinativa, levando-se em consideração que essa mutação apresenta uma
herança autossômica dominante e penetrância de 90% (VALVERDE E COLS.,
2005), a predição de risco sem o teste genético nos daria as proporções mostradas
na figura a seguir:
12
Figura 1.4. Estimativa de riscos em retinoblastoma com base na literatura e histórico
familiar. Adaptada de Abramson e Schefler (2010).
O problema de uma estimativa de risco sem o conhecimento da genética do
paciente reside no fato de que os pacientes unilaterais com mutações germinativas
não são clinicamente distinguíveis daqueles que não têm mutação, representando
um risco para seus descendentes de 45% de desenvolvimento do tumor. Além disso,
a mutação não diagnosticada pode ter sido herdada por esse paciente via células
germinativas dos pais e, portanto, não somente seus descendentes, mas também
seus irmãos subsequentes encontram-se sob risco de um desenvolvimento tumoral.
1.4. Amplificação multiplex de sondas dependentes de ligação:
a técnica de MLPA.
A técnica de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) foi
primeiramente descrita em 2002 (SCHOUTEN E COLS., 2002) e consiste na
amplificação de sondas, complementares às regiões do DNA que se deseja analisar,
a fim de se avaliar o número de cópias dessas regiões presentes no genoma. Com
essa metodologia, é possível ser feita a quantificação relativa de até 50 regiões de
interesse em apenas uma reação de PCR (Polymerase Chain Reaction), o que
facilita a análise do gene RB1, visto que o sequenciamento de seus 27 éxons é
bastante demorado e dispendioso.
Cada sonda do conjunto de reagentes é composta por duas partes. Uma das
partes contém um trecho complementar a uma região do DNA e uma seqüência de
reconhecimento do primer, e a outra parte de cada sonda é formada por: (1) um
13
trecho complementar a uma região do DNA adjacente à região que pareia com a
primeira parte da sonda, (2) uma sequência alongadora, diferente para cada sonda,
o que permite que as mesmas sejam identificadas pelo tamanho, e (3) uma região
de reconhecimento para o outro primer do par. Quando as duas partes de uma
mesma sonda hibridizam no DNA, uma enzima ligase une as duas pontas
adjacentes; em seguida, as sondas são separadas do DNA e amplificadas, para
posterior quantificação das cópias resultantes.
A quantificação das cópias é feita em sequenciador automático, que gera um
gráficode picos para cada amostra; cada pico corresponde à quantificação relativa
do número de cópias observado de cada sonda. Os dados numéricos de altura e
área do gráfico são extraídos do sequenciador e analisados em um software que,
por sua vez, fornece um gráfico de barras em que cada barra corresponde a uma
sonda do conjunto de reagentes. Se a barra se encontra entre os valores 0.7 e 1.3
do eixo das ordenadas, significa que a região do DNA em que aquela sonda
hibridiza encontra-se em um número normal de cópias (dois alelos presentes).
Valores acima de 1,35 indicam uma possível duplicação da região; valores abaixo de
0,65 indicam a provável perda daquela região em um dos alelos.
14
2. Objetivos
2.1. Objetivo geral
Detectar, por MLPA, alterações no número de cópias de sequências alvo no gene
RB1 e na região 13q14 em pacientes com retinoblastoma e seus familiares de até 3º
grau (se possível), e comparar a sobrevida dos pacientes com grandes alterações a
dos pacientes com mutações de ponto.
2.2. Objetivos específicos
• Investigar, através da utilização de sondas (método de MLPA), a existência de
grandes deleções ou duplicações germinativas no gene RB1 e na região
13q14 em amostras de pacientes com retinoblastoma, cujos seqüenciamento
direto do gene RB1 e análise pela técnica de SSCP (Single-Strand
Conformation Polymorphism), já realizados por membros do nosso grupo,
tenham apresentado resultados negativos para alterações patogênicas;
• Para as novas amostras enviadas ao laboratório, fazer o rastreamento inicial
de alterações através da técnica de MLPA;
• Validar, quando possível, as alterações evidenciadas pelo método de MLPA,
através da utilização de outros recursos disponíveis no laboratório, tais como
técnicas de citogenética e sequenciamento direto;
• Investigar a presença dessas alterações em outros membros da família do
paciente, como portadores assintomáticos da alteração;
• Comparar a sobrevida em 60 meses de acompanhamento dos pacientes com
grandes alterações em 13q14 em relação aos pacientes com mutações
pontuais em RB1;
• Reunir dados relevantes para o aconselhamento genético dos pacientes e
seus familiares.
15
3. Material e métodos
Este trabalho é parte de um projeto maior, intitulado “Estudos Citomoleculares
em Retinoblastoma”, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto
Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva. A cópia da aprovação, bem como
o modelo de Consentimento Livre e Esclarecido, constam no anexo I, ao fim do
documento.
3.1. Descrição do grupo de estudo
Como critérios de inclusão, foram considerados pacientes portadores de
retinoblastoma encaminhados ao Programa de Aconselhamento Genético em
retinoblastoma do Instituto Nacional de Câncer (INCA) desde seu início, cuja análise
prévia dos 27 éxons do gene RB1, realizada em amostras de DNA extraídas a partir
de sangue periférico, foi negativa para alterações patogênicas. Além desses, foram
incluídos pacientes com RB recém-diagnosticado, provenientes de três instituições
diferentes: Hospital Santa Marcelina (HSM – São Paulo), Hospital de Clínicas de
Porto Alegre (HCPA – Porto Alegre) e INCA, Rio de Janeiro, admitidos no programa
durante o período de janeiro de 2011 a agosto de 2012. Dados clínicos dos
pacientes do INCA foram coletados de seus prontuários (idade ao diagnóstico,
lateralidade do tumor, estadiamento, histórico familiar, status do paciente – segundo
o último registro de consulta – e enucleação). Os prontuários médicos foram
revisados pela última vez em 30/11/12. Para os pacientes do HCPA e HSM, a
reunião de dados clínicos foi feita conforme informações enviadas pelos respectivos
hospitais. Os pais e irmãos do probando também foram analisados para os casos
em que foram encontradas alterações no gene RB1 e na região 13q14. Um total de
noventa e oito pacientes pôde ser reunido (Tab. 3.1).
Tabela 3.1. Caracterização das amostras obtidas para o estudo.
Lateralidade do tumor Instituição de Origem
Unilateral Bilateral Trilateral Desconhecida Total
INCA 45 21 2 - 68
HCPA 9 3 2 1 15
HSM 9 6 - - 15
Total 63 30 4 1 98
16
3.2. Análise de variação do número de cópias
Por não terem sido detectadas mutações no gene RB1 dos pacientes
previamente analisados pelo grupo de retinoblastoma e, concomitante ao
sequenciamento direto do gene RB1 feito para as amostras recém admitidas no
programa, utilizou-se o conjunto de reagentes “SALSA MLPA KIT P047 RB1” (MRC-
Holland), segundo o protocolo do fabricante, salvo modificações descritas em SENA,
2010. A figura 3.1 a seguir ilustra o funcionamento da técnica.
Figura 3.1. Ilustração do funcionamento da técnica de MLPA. Adaptada de Schouten e colaboradores (2002).
Foram utilizadas duas versões do conjunto de reagentes “SALSA MLPA KIT
P047 RB1” (Anders Nygren & Jan Schouten, MRC-Holland); o estudo começou com
o uso da versão B1, mas, durante o desenvolvimento do trabalho, os fabricantes
lançaram uma nova versão (C1) do conjunto de reagentes, que trouxe a substituição
17
de algumas sondas e o acréscimo de outras. Os quadros com as sondas presentes
em cada versão encontram-se no anexo II.
3.2.1. Reação de desnaturação (1º dia)
As amostras foram precipitadas em etanol e diluídas em T.E. (10mM de TRIS
pH8 + 0,1mM de EDTA pH8); o material obtido foi quantificado e diluído, de modo a
se obter a concentração de 20ηg/µL. Foram distribuídos 5 µL de amostra em tubos
de 0,2 µL, para a concentração final de 100 ηg de DNA; os tubos foram colocados
no termociclador e desnaturados a 98ºC por 25min.
3.2.2. Reação de hibridização (1º dia)
Foi preparada uma mistura contendo 1,5 µL do reagente SALSA MLPA buffer
+ 1,5 µL do reagente SALSA probemix para cada amostra e, quando o termociclador
atingiu a temperatura de 25ºC, foram adicionados 3,0 µL da mistura a cada amostra,
pipetando repetidas vezes; em seguida foi dada continuidade ao programa do
termociclador: as amostras foram incubadas a 95ºC por 1min, seguidos de 18h a
60ºC para hibridização das sondas.
3.2.3. Reação de ligação (2º dia)
Foi preparada a mistura da enzima Ligase-65, contendo os seguintes
reagentes para cada reação: 3 µL da Ligase-65 buffer A + 3,0 µL da Ligase-65 buffer
B + 25,0 µL de água milliQ + 1,0 µL da Ligase-65, sempre pipetando diversas vezes
para homogeneização da mistura. Após as 18h de hibridização, a temperatura do
termociclador foi reduzida a 54ºC e, a cada reação, foram adicionados 32,0 µL da
mistura da Ligase-65, pipetando lentamente. Dada continuidade ao programa do
termociclador, as amostras passaram por 15min de incubação a 54ºC (para ligação
das duas partes de cada sonda hibridizada), seguidos de 5min a 98ºC (para
inativação da Ligase-65) e redução final da temperatura a 4ºC.
3.2.4. Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Foi preparada uma mistura contendo, para cada reação: 7,5 µL de água milliQ
+ 2,0 µL do SALSA PCR primer mix + 0,5 µL de SALSA polymerase. A mistura foi
pipetada vigorosamente para homogeneização e mantida no gelo; foram
adicionados 10 µL da mistura a cada amostra, à temperatura ambiente. A reação de
18
PCR foi iniciada imediatamente, seguindo o programa no termociclador: 35 ciclos de
30seg a 95ºC, 30seg a 60ºC, 60seg a 72ºC, incubação final de 20min a 72ºC e
redução da temperatura para 15ºC, indicando o final da reação. Após a retirada do
termociclador, as reações foram diluídas e distribuídas em uma placa para análise
no seqüenciador. A diluição foi de 1:10 (1 µL da reação de PCR em 9 µL de água
milliQ). Em seguida, uma placa contendo as amostras foi colocada no seqüenciador
automático ABI-3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems). As instruções de
montagem da placa e os parâmetros utilizados no seqüenciador constam no anexo
III.
Os dados foram extraídos do seqüenciador com auxílio do programa
GeneMapper; a seleção dos controles para comparação com os pacientes foi feita
no programa Peak Scanner Software V1.0 e a obtenção do resultado final ocorreu
com o uso do software Coffalyser, conforme recomendação do fabricante dos
conjuntos de reagentes utilizados neste trabalho.
3.3. Análise citogenética: bandeamento GTG e FISH
Alguns resultados positivos para alteração puderam ser confirmados por
metodologias já disponíveis no laboratório; então, além do MLPA, também foram
utilizados os métodos de análise citogenética de cariotipagem e FISH (Fluorescence
In Situ Hybridization).
Para que fossem possíveis as análises citogenéticas, os pacientes foram
novamente chamados ao hospital, para coleta de sangue periférico em tubo
contendo heparina. Os cromossomos metafásicos foram obtidos a partir de linfócitos
de sangue periférico, segundo recomendações de Moorhead e cols. (1960), com
modificações de Bender (1965). Os casos foram analisados via bandeamento GTG
(G = Giemsa, T = Tripsina, G = banda G) (SEABRIGHT E COLS. 1971) e
identificados segundo o International System for Human Cytogenetic Nomenclature
(ISCN) (SHAFFER E COLS., 2009).
3.3.1. Obtenção dos cromossomos metafásicos
Em um tubo foram adicionados 6ml de meio RPMI-1640 (Vitrocell®) contendo
antibióticos; 1,2ml de soro fetal bovino (Vitrocell®); 0,2ml de fitohemaglutinina M
(Vitrocell®) e 0,5ml de sangue total. A cultura foi mantida a 37°C durante 72hs e
uma hora antes do término adicionou-se 0,05ml de colchicina (0,8µg/ml) (Vitrocell®).
19
Após as 72hs do implante da cultura de linfócitos, o tubo foi centrifugado a 1800rpm
por 10min e, em seguida, descartou-se o sobrenadante. Foram adicionados 6ml de
KCl (0,075M), feita homogeneização e a amostra foi mantida a 37°C por 30min.
Essa amostra foi novamente centrifugada a 1800rpm por 10min, o sobrenadante foi
descartado e o pellet foi homogeneizado. Acrescentou-se 6ml de fixador (3
metanol:1 ácido acético) à temperatura ambiente e a amostra foi centrifugada a
1800rpm por 10min. O sobrenadante foi descartado. O procedimento de lavagem
com fixador foi realizado até o sobrenadante ficar totalmente límpido.
3.3.2. Bandeamento GTG
Para se obter um padrão de bandeamento GTG, a lâmina, contendo material
fixado de cromossomos e preparada com seis dias de antecedência, foi tratada com
uma solução de tripsina (100mg/100ml Dulbeco) (136,87mM NaCl; 2,68mM KCl;
50,02mM KH2PO4; 5,37mM Na2HPO4) à temperatura ambiente por 12seg. Em
seguida, foi lavada em tampão fosfato (136,87mM KH2PO4; 15,09mM NaOH,
pH:6,8) à temperatura ambiente e, por fim, corada com Giemsa 5% por 5min, sendo
posteriormente lavada em água deionizada, secada ao ar e observada em um
microscópio Zeiss®, com câmera Axio Cam MRC®. As imagens foram capturadas
pelo sistema Axio Imager®.
3.3.3. Hibridização in situ (FISH)
A técnica de FISH seguiu o protocolo recomendado pela empresa VYSIS®,
salvo modificações. A sonda utilizada (cat#KBI-40001 PN 13 - 13q14, marcada em
verde com PlatinumBright 495), já disponível em nosso laboratório, foi desenvolvida
pela empresa Kreatech Diagnostics para fins diagnósticos da trissomia do
cromossomo 13 (Síndrome de Patau) e hibridiza na região 13q14.2, onde está
localizado o gene RB1, conforme pode ser visto na figura 3.2.
20
Figura 3.2. Representação esquemática da região do cromossomo 13 abrangida pela
sonda para FISH utilizada nesse estudo. Fonte: http://www.kreatech.com/products/repeat-
freetm-poseidontm-FISH-probes/pre-natal/pn-13-13q14-trisomy-13-patau-syndrome.html.
(Acessado em 02/01/13).
O material na lâmina, de cromossomos metafásicos previamente fixados, foi
desnaturado em uma solução de 70% formamida/2XSSC (NaCl 3M; citrato de sódio
3M, pH7,0) (pH 7,0) por 5min a 73°C. Em seguida foi feita uma desidratação gradual
em série crescente de alcoóis gelados (70%, 85% e 100%) durante 1min cada.
Posteriormente, a lâmina secou à temperatura ambiente. A sonda foi desnaturada a
73°C por 5min e aplicada sobre a lâmina, sendo esta montada com lamínula, selada
com cola apropriada e mantida no hibridizador de lâminas Hybrite (VYSIS®) a 37°C
por 18hs.
Após este período, retirou-se a lamínula da lâmina e a lâmina foi lavada três
vezes em solução de 50% formamida/2XSSC (pH 7,0) a 37°C, por 10min cada
lavagem. Depois, foi incubada numa solução de 2XSSC (pH 7,0) por 10min a 37°C.
Por fim, foi lavada numa solução de 2XSSC/0,1% Igepal (SIGMA®), pH 7,0, por
5min a 37°C. A lâmina foi coberta com lamínula de p lástico e incubada a 37°C por
5min. Após este tempo, foi lavada três vezes em solução 2XSSC/0,1% Igepal (pH
7,0), à temperatura ambiente, por 2min cada. O contraste foi feito com 10µl de DAPI
(125ng/ml) (Cytocell®). Os cromossomos foram analisados em um microscópio de
epi fluorescência Olympus DX-60® e as imagens capturadas pelo sistema QUIPS
Imaging Sofware – Path Vysion (VYSIS®).
21
3.4. Caracterização dos resultados obtidos
A caracterização dos resultados obtidos com o uso das técnicas de
citogenética (FISH e bandeamento GTG) foi feita de acordo com as normas de
nomenclatura estabelecidas no ISCN edição 2009 (SHAFFER E COLS. 2009). Para
a nomenclatura dos resultados obtidos com a técnica de MLPA foram utilizadas as
normas estabelecidas pelo ICSN edição 2009 e recomendações da Human Genome
Variation Society (HGVS), obtidas no sítio Nomenclature for the Description of
Sequence Variants (http://www.hgvs.org/mutnomen/), acessado em 01/10/2012.
3.5. Curvas de sobrevida
Dados moleculares de 49 pacientes (40 com mutações pontuais e nove com
grandes deleções) foram utilizados para estimar as taxas cumulativas de sobrevida
após 60 meses, pelo método não paramétrico de Kaplan-Meier. As comparações
entre as curvas de sobrevida foram realizadas pelo teste de log-rank com o software
R®. A sobrevida foi estimada considerando a data de matrícula no hospital, que
correspondeu ao início do tratamento, até a data da última visita ao hospital ou óbito.
Os resultados foram considerados estatisticamente significativos para p<0,05.
22
4. Resultados
Do total de 98 pacientes reunidos para o estudo, 66 puderam ser avaliados
quanto à presença de alterações no gene RB1 e/ou na região 13q pela técnica de
MLPA. A porcentagem de amostras avaliadas, segundo a lateralidade do tumor, é
evidenciada na figura 4.1 a seguir:
Figura 4.1. Porcentagem de amostras avaliadas no estudo pelo método de MLPA,
segundo a lateralidade do tumor.
Mutações constitutivas foram observadas em onze amostras, o que equivale a
cerca de 16,7% do total de sessenta e seis que tiveram resultado. O fluxograma a
seguir representa a condução do estudo, o número absoluto de amostras
parcialmente e totalmente sequenciadas, bem como os resultados obtidos com o
método de análise utilizado (figura 4.2).
Figura 4.2. Fluxograma da condução do estudo.
23
A distribuição dos pacientes com alteração ou não em RB1/13q, pelo método
de MLPA, em relação à lateralidade do tumor, pode ser vista na figura 4.3 a seguir:
Figura 4.3. Figura representativa da distribuição do número de pacientes analisados por MLPA e a presença ou não de mutação em relação à lateralidade do tumor (segundo dados obtidos por esse método de análise).
As amostras INCA – T1 e INCA – T2 revelaram deleção de apenas um éxon
do gene RB1, conforme pode ser visto nas figuras 4.4 e 4.5 a seguir:
Figura 4.4. Figura representativa da deleção evidenciada no éxon 19 do gene RB1 da amostra INCA – T1. Nomenclatura: MLPA g.157458-?_157603+?del. RefSeq: NG_009009.1.
DELETADO
24
Figura 4.5. Figura representativa da deleção evidenciada no éxon 22 do gene RB1 da amostra INCA – T2. Nomenclatura: MLPA g.166252-?_166365+?del. RefSeq: NG_009009.1.
A deleção evidenciada na amostra INCA – T1 pôde ser confirmada pelo
método de sequenciamento direto, realizado por outro membro do nosso grupo.
A análise da amostra INCA – B6 revelou a deleção de dois éxons
consecutivos (Fig. 4.6).
Figura 4.6. Figura representativa da deleção evidenciada nos éxons 10 e 11 do gene RB1 da amostra INCA – B6. Nomenclatura: MLPA g.68748-?_69858+?del. RefSeq: NG_009009.1.
O gene RB1 foi parcialmente deletado em duas amostras (Figs. 4.7 e 4.8).
DELETADOS
DELETADO
25
Figura 4.7. Figura representativa da deleção parcial do gene RB1 e do lócus RCBTB2 evidenciada na amostra HCPA – NI1. Nomenclatura: MLPA(49,027,069-?_49,107,316+?)del. RefSeq: NC_000013.10.
Figura 4.8: Figura representativa da deleção parcial do gene RB1 e do lócus ITM2B evidenciada na amostra HSM – B3. Nomenclatura: MLPA(48,807,274-?_48,934,489+?)del. RefSeq: NC_000013.10.
A deleção do gene ITM2B e das regiões promotora e do éxon 1 do gene RB1
foi observada em uma amostra de paciente (Fig. 4.9).
DELETADOS
DELETADOS
26
Figura 4.9. Figura representativa da deleção do lócus ITM2B e das regiões do
promotor e éxon 1 do gene RB1, evidenciada na amostra INCA – B8. Nomenclatura: MLPA(48,807,274-?_48,878,185+?)del. RefSeq: NC_000013.10.
Deleções cromossômicas foram observadas em cinco amostras, conforme
podem ser vistas nas figuras 4.10 a 4.14 a seguir.
Figura 4.10. Figura representativa da deleção cromossômica evidenciada na amostra
INCA – B7, abrangendo os loci ITM2B, CHC1L e DLEU1, além do gene RB1. Nomenclatura: MLPA13q14(P047-B1)x1. RefSeq: NC_000013.10.
DELETADOS
27
Figura 4.11. Figura representativa da deleção cromossômica evidenciada na amostra INCA – U26, abrangendo os loci ITM2B, RCBTB2 (CHC1L) e DLEU1, além do gene RB1. Nomenclatura: MLPA13q14(P047-B1)x1. RefSeq: NC_000013.10.
Figura 4.12. Figura representativa da deleção cromossômica evidenciada na amostra INCA – U28, abrangendo os loci ITM2B, RCBTB2 (CHC1L) e DLEU1, além do gene RB1. Nomenclatura: MLPA13q14(P047-B1)x1. RefSeq: NC_000013.10.
28
Figura 4.13. Figura representativa da deleção cromossômica evidenciada na amostra HSM – B4, abrangendo o locus ITM2B e o gene RB1. Nomenclatura: MLPA(48,807,274-?_49,054,381+?)del. RefSeq: NC_000013.10.
Figura 4.14. Figura representativa da deleção cromossômica evidenciada na amostra HSM – B6, abrangendo os loci ITM2B, RCBTB2 (CHC1L) e DLEU1, além do gene RB1. Nomenclatura: MLPA13q14(P047-B1)x1. RefSeq: NC_000013.10.
Alguns desses resultados puderam ser confirmados por outros métodos, para
os quais os reagentes e aparelhagem necessários à execução encontravam-se
disponíveis em nosso laboratório.
Dessa forma, a deleção evidenciada no éxon 19 do gene RB1 na amostra
INCA – T1 (Fig. 4.4) e a deleção cromossômica evidenciada na amostra INCA – U28
29
(Fig. 4.12) puderam ser confirmadas por sequenciamento e citogenética,
respectivamente, realizados por outros membros do grupo de Aconselhamento
Genético em Retinoblastoma. A deleção no éxon 19 do gene RB1 na amostra INCA
– T1 tratava-se da variante g.157517delC (RefSeq.NG_009009.1), deleção de base
única, conforme pode ser visto na figura 4.15. A figura 4.16 mostra o resultado do
cariótipo correspondente à amostra INCA – U28, que corrobora a deleção observada
por MLPA. A deleção cromossômica observada na amostra HSM – B6 (Fig. 4.14) foi
confirmada por bandeamento GTG.
Figura 4.15. Eletroferograma evidenciando a variante g.157517delC (RefSeq. NG_009009.1) no éxon 19 do gene RB1 da amostra INCA – T1.
Figura 4.16. Resultado do bandeamento GTG realizado para a amostra INCA – U28. A seta mostra o cromossomo 13 deletado. Nomenclatura: 46,XX,del(13q14).
A deleção cromossômica evidenciada na amostra INCA – B7 (Fig. 4.10)
também pôde ser confirmada por FISH e bandeamento GTG. Os resultados obtidos
podem ser observados, respectivamente, nas figuras 4.17 e 4.18 a seguir.
30
Figura 4.17. Resultado do FISH realizado para a amostra INCA – B7. A sonda KBI-40001 PN 13 - 13q14 (marcada em verde com PlatinumBright 495) complementar à região 13q14, marcou apenas um cromossomo 13 (ponta de seta). Nomenclatura: 46,XX.ish del(13)(q14.2q14.2)(PN 13X1).
Figura 4.18. Resultado do bandeamento GTG realizado para a amostra INCA – B7. Um dos cromossomos 13 do par encontra-se encurtado (seta). Nomenclatura: 46,XX,del(13q14).
A tabela 4.1 resume os resultados obtidos das análises genéticas e
citogenéticas para as onze amostras desse estudo com alteração em RB1/13q14.
31
Tabela 4.1. Resultados das análises moleculares e citogenéticas de 11 pacientes do estudo.
Identificação da amostra
Histórico familiar de RB
Idade ao diagnóstico (meses)
Lateralidade do tumor MLPA Sequenciamento ª Citogenética
Tamanho estimado da
deleção
Genes envolvidos
INCA – T1 Sim – pai 24 meses Trilateral MLPA g.157458-?_157603+?delª g.157517delC (Ex 19) n.a. 1b RB1
INCA – T2 Não 19 meses Trilateral MLPA g.166252-?_166365+?delª g.76721 G>C (In14) n.a. 113pb RB1
INCA – B6 Não 8 meses Bilateral MLPA g.68748-?_69858+?delª
g.44013C>T (In3) g.46476T>G (In4)
g.74587G>T (In11) g.160865G>A (In19) g.178130C>T (In25)
n.a. >1kb RB1
HCPA – NI1 Não informado Não informado Não informada MLPA(49,027,069-
?_49,107,316+?)delb
g.46476T>G (In4) g.74587G>T (In11)
g.160865G>A (In19) g.178130C>T (In25)
n.r. >80kb RB1 RCBTB2
HSM – B3 Não 5 meses Bilateral MLPA(48,807,274-
?_48,934,489+?)delb n.v.o. n.r. >127kb RB1
INCA – B8 Sim – irmã 4 meses Bilateral MLPA(48,807,274-
?_48,878,185+?)delb n.v.o. n.a. >70kb ITM2B
RB1
INCA – B7 Não 8 meses Bilateral MLPA13q14(P047-B1)x1c
g.44013C>T (In3) g.46476T>G (In4)
g.74587G>T (In11) g.160865G>A (In19) g.178130C>T (In25) g.178599T>A (In25)
46,XX,del(13q14) >1Mbb ITM2B RB1
RCBTB2 DLEU1
INCA – U26 Não Não informado Unilateral MLPA13q14(P047-B1)x1c n.v.o. n.r. >1Mbb ITM2B RB1
RCBTB2 DLEU1
INCA – U28 Não 20 meses Unilateral MLPA13q14(P047-B1)x1c n.v.o. 46,XX,del(13q14) >1Mbb ITM2B RB1
RCBTB2 DLEU1
HSM – B4 Não 12 meses Bilateral MLPA(48,807,274-
?_49,054,381+?)delb n.v.o. n.r. >247kb ITM2B
RB1
HSM – B6 Não 17 meses Bilateral MLPA13q14(P047-B1)x1c n.v.o. 46,XX,del(13q14) >1Mbb ITM2B RB1
RCBTB2 DLEU1
Abreviações: Ex, éxon; In, íntron; n.v.o., nenhuma variante observada; n.a., não se aplica; n.r., não realizada. aSequência referência NG_009009.1; bSequência referência: NC_000013.10; cDeleção de toda a região 13q14.2.
32
4.1. Curvas de sobrevida em 60 meses dos pacientes
Para avaliação do impacto dos achados moleculares descritos neste estudo,
foi calculada a probabilidade de sobrevida até 60 meses dos pacientes de acordo
com as variáveis “idade ao diagnóstico” e “tipo de mutação observada”. As curvas de
sobrevida foram obtidas pelo software Tinn R, utilizando o estimador de Kaplan-
Meier. As probabilidades estimadas de cada curva, os intervalos de confiança e os
valores de p encontram-se na tabela 4.2. A sobrevida global dos pacientes foi de
80% (IC 95%= 0,690 a 0,928).
Tabela 4.2. Estimativa de sobrevida dos pacientes em 60 meses, segundo a idade ao diagnóstico e o tipo de mutação observada.
Sobrevida em 60 meses de acompanhamento
Variáveis
P(St) IC95% p-valorLog-rank
Global 80,0% 0,690 0,928
Idade ao diagnóstico
Após 24 meses 80,0% 0,643 0,996
Até 24 meses 79,5% 0,647 0,977
0,802
Tipo de mutação
Mutação pontual 82,4% 0,713 0,951
Grandes deleções 55,6% 0,231 1
0,628
A figura gerada para análise de influência da variável “tipo de mutação” na
sobrevida dos pacientes pode ser visto a seguir (Fig. 4.19).
Figura 4.19. Sobrevida em 60 meses de acompanhamento em relação ao tipo de mutação observada (p=0,628).
33
5. Discussão
5.1. Histórico dos pacientes e correlação genótipo x fenótipo
Como pôde ser visto na figura 4.3, do total de 66 pacientes analisados, onze
revelaram alterações no gene RB1 ou na região 13q14, de localização do gene.
Desses, dois casos eram de tumores unilaterais (de um total de 42 unilaterais), seis
bilaterais (do total de 21 bilaterais), dois trilaterais (representando todos os casos
trilaterais) e um de lateralidade não-informada. Para uma maior acurácia no
processo de aconselhamento genético, cada caso em que houve a detecção de uma
alteração constitutiva foi analisado separadamente, o que nos permitiu obter os
históricos familiares e interpretações dos resultados descritos a seguir.
5.1.1. Amostra INCA – T1
A amostra INCA – T1 é proveniente de um paciente do sexo feminino, cujo
diagnóstico de retinoblastoma trilateral ocorreu aos 24 meses de idade. Ao exame
(cintilografia óssea), a paciente apresentava o globo ocular direito com tumor
ocupando quase a sua totalidade, e o nervo óptico direito espessado desde a origem
até o quiasma óptico. O globo ocular esquerdo revelava uma lesão menor, mas de
características semelhantes, ocupando parcialmente a câmara vítrea. Além disso,
havia uma grande formação expansiva e heterogênea, predominantemente sólida
(semelhante às encontradas nos globos oculares) e extra-axial, que se estendia e
invadia cranialmente o assoalho do 3º ventrículo e o corpo e prolongamento
anteriores do ventrículo lateral. A paciente foi a óbito nove meses após o
diagnóstico.
Quando investigado seu histórico familiar, soubemos que seu pai havia sido
enucleado aos 20 meses de idade, o que poderia ter sido um caso de
retinoblastoma. Infelizmente, o pai faleceu antes que pudéssemos conseguir
amostra de sangue para o rastreamento da alteração no gene RB1 encontrada na
amostra de DNA proveniente da filha. Essa paciente tinha dois irmãos menores de
cinco anos, sendo um apenas por parte de pai. Ambos tiveram o sangue coletado
para investigação da alteração encontrada na paciente; descobrimos que o irmão
34
por parte de pai tem a mesma alteração e, por isso, foi encaminhado para
acompanhamento clínico.
A alteração evidenciada na amostra dessa paciente foi uma deleção de base
única no éxon 19 do gene RB1 (g.157517delC , fig. 4.4 e fig. 4.15), constituindo uma
mutação do tipo frameshift, que altera o quadro de leitura da sequência de DNA.
Essa região do gene compõe o domínio pocket de ligação aos fatores de transcrição
da família E2F na proteína pRB, o que confere grande importância à manutenção de
sua sequência nucleotídica.
A figura 5.1 esclarece a importância de cada éxon do gene RB1 na formação
da proteína pRB.
Figura 5.1. Estrutura do gene RB1 e a correspondência éxon/domínio da proteína. Retirada de Harbour (1998).
Como mostrado na figura, o éxon 19 compõe a região espaçadora do domínio
pocket de ligação, região da proteína que se liga aos fatores de transcrição da
família E2F (HENLEY E DICK, 2012); dessa forma, um abalo nessa região pode
impedir a ligação da pRB a esses fatores de transcrição, o que justificaria a perda de
sua função como supressora tumoral.
5.1.2. Amostra INCA – T2
A amostra INCA – T2 é proveniente de um paciente do sexo feminino, cujo
diagnóstico de retinoblastoma trilateral ocorreu aos 19 meses de idade. Na
admissão, a paciente apresentava hemorragia e descolamento da retina no globo
ocular esquerdo (GOE), uma clínica pouco sugestiva de retinoblastoma. Os médicos
desconfiaram ser um caso de doença de Coat, condição rara, quase sempre
35
unilateral, em que há um desenvolvimento anormal dos vasos sanguíneos atrás da
retina. Sob essa condição, esses vasos rompem por excesso de fluxo sangüíneo e o
plasma liberado promove o descolamento total ou parcial da retina
(http://www.coatsdisease.org/index.html, acessado em 06/03/2013). Porém, o
exame de ressonância nuclear magnética (RNM) evidenciou massa tumoral no GOE
e na glândula pineal, levando ao diagnóstico clínico de retinoblastoma associado a
pinealoblastoma. A paciente passou por processo de enucleação do GOE e iniciou
tratamento.
Um ano após o diagnóstico e estando em tratamento, a paciente começou a
deambular curvada, queixar-se de dores abdominais e no pescoço, o que levou os
médicos a desconfiarem de ser um caso de meningite, inflamação das membranas
protetoras do cérebro e medula espinhal, confirmado pelo realce leptomeníngeo
observado ao exame de RNM; tratava-se de uma meningite carcinomatosa,
condição rara em casos de retinoblastoma, mas que acomete cerca de 5%-8% dos
pacientes com tumores sólidos (LIMA E COLS., 2003). Devido à disseminação
tumoral leptomeníngea, a paciente foi a óbito dois anos após o diagnóstico de RB.
A alteração evidenciada na amostra dessa paciente foi uma deleção no éxon
22 do gene RB1 (Fig. 4.5). Conforme mostra a figura 5.1, esse éxon também
compõe o domínio pocket da pRB, essencial para o exercício de sua função como
supressora tumoral.
Além disso, esse éxon compõe o domínio B de ligação da proteína ao
chamado “motivo LXCXE” presente em oncoproteínas virais e em diferentes
proteínas celulares envolvidas na atividade de regulação de cromatina. A
importância desse domínio para oncoproteínas virais é a supressão da pRB (visto
que o domínio conservado permite uma ligação estável dessas proteínas), levando à
proliferação celular (como é o caso das oncoproteínas E7 - do vírus HPV – e E1A,
de adenovírus); já para as proteínas celulares, a importância da integridade dessa
região reside no fato de que essas proteínas interagem diretamente com a pRB na
repressão da transcrição de genes responsivos a E2F (HENLEY E DICK, 2012).
Amostras de DNA dos pais da paciente foram investigadas para a presença
da alteração observada; não foi evidenciada a deleção do éxon 22 em nenhum dos
pais.
36
5.1.3. Amostra INCA – B6
A amostra INCA – B6 é proveniente de um paciente do sexo feminino, cujo
diagnóstico de retinoblastoma unilateral de globo ocular direito (GOD), classificação
internacional B (Tab. 1.1), ocorreu aos 7 meses de idade. Na admissão, a paciente
apresentava leucocoria e estrabismo no GOD, com múltiplos focos tumorais, pontos
de calcificação e sementes vítreas. Quatro meses após o diagnóstico, houve o
surgimento de um foco tumoral no globo ocular esquerdo. Após tratamento, a
paciente encontra-se viva, livre de doença.
A alteração evidenciada na amostra dessa paciente foi uma deleção dos
éxons 10 e 11 do gene RB1 (Fig. 4.6). De volta à figura 5.1, podemos ver que esses
éxons estão fora do domínio de ligação da pRB a fatores da família E2F; os éxons
10 e 11 compõem a região N-terminal da proteína, onde localizam-se os sítios de
fosforilação. Segundo a literatura, essa região não é importante para sua atividade
de supressão do crescimento celular, apesar de haver relatos de mutações
constitutivas em RB1 nessa região (HARBOUR, 1998).
Os pais da paciente foram investigados para a presença da alteração
observada; não houve evidência de deleção dos éxons 10 e 11 do gene RB1 nas
amostras de DNA dos pais.
37
5.1.4. Amostra HCPA – NI1
A amostra HCPA – NI1 é proveniente de um paciente do sexo masculino,
cujos dados de prontuário não puderam ser obtidos. A alteração evidenciada nesse
paciente foi uma deleção envolvendo os éxons 18 a 27 do gene RB1 e o lócus
RCBTB2 (Fig. 4.7).
O RCBTB2 é um gene contíguo a RB1 e regulador de cromatina; em 2002,
Latil e colaboradores observaram uma alta frequência de perda de heterozigosidade
nesse lócus em amostras de tumores de próstata, sustentando a ideia de que
RCBTB2 atua como supressor tumoral para essa neoplasia (LATIL E COLS., 2002).
Em 2004, foi proposto que a perda de RCBTB2, associada ao aumento de
expressão do gene RAN e perda do gene ZHX-2 resultaria em um fenótipo mais
agressivo em casos de mieloma múltiplo; porém, em um estudo envolvendo 52
cqasos de mieloma múltiplo, Armellini e colaboradores não encontraram nenhuma
relação entre a perda de RCBTB2 e um pior prognóstico da doença (ARMELLINI E
COLS., 2008).
5.1.5. Amostra HSM – B3
A amostra HSM – B3 é proveniente de um paciente do sexo feminino, cujo
diagnóstico de retinoblastoma bilateral ocorreu aos 5 meses de idade. Os sinais
clínicos apresentados pela paciente foram leucocoria e estrabismo; não puderam ser
obtidas informações quanto ao estadiamento dos tumores. A alteração evidenciada
na amostra dessa paciente foi uma deleção envolvendo o lócus ITM2B e os éxons 1
a 7 do gene RB1 (Fig. 4.8).
O gene ITM2B (BRI2) codifica uma proteína transmembrana e atua na
regulação do metabolismo de compostos β-amilóides. Devido à sua função,
mutações e deleções nesse gene são descritas na literatura da doença de Alzheimer
(que tem por característica a deposição de peptídeos β-amilóides, promovendo
amiloidose cerebrovascular e lesões pré amiloides) e nos casos de demência por
amiloidose (TOMIDOKORO E COLS., 2005; KILGER E COLS., 2011).
38
5.1.6. Amostra INCA – B8
A amostra INCA – B8 é proveniente de um paciente do sexo feminino, cujo
diagnóstico de retinoblastoma bilateral (GOD - classificação internacional C; GOE –
não classificável) ocorreu aos 4 meses de idade. Na admissão, a paciente
apresentava uma lesão que já havia invadido o nervo óptico no GOE e uma lesão
periférica ao nervo óptico no GOD; a enucleação ocorreu em dois anos após o
diagnóstico para o GOE e em três anos após o diagnóstico para o GOD.
Três anos após o diagnóstico e com a doença supostamente controlada, a
paciente evidenciou lesão na língua, afundamento da região retroauricular esquerda
e aumento da região submandibular; havia doença metastática, com tumorações nas
regiões mentoniana e mastoide. A paciente foi a óbito por progressão tumoral 4 anos
após o diagnóstico.
A alteração evidenciada na amostra dessa paciente foi a deleção do lócus
ITM2B e das regiões do promotor e éxon 1 do gene RB1 (Fig. 4.9). Como dito
anteriormente, a importância do lócus ITM2B reside no fato de que este gene atua
no controle da degradação de compostos β-amilóides, relacionados à ocorrência de
doença de Alzheimer. A perda da região promotora do gene RB1, bem como do
éxon 1, implicam na não produção da proteína e, portanto, uma haploinsuficiência de
RB1, visto que essa região é essencial para início da transcrição (HENLEY E DICK,
2012).
A irmã da paciente também teve retinoblastoma bilateral, mas ainda não
obtivemos resultados na análise molecular dessa paciente; é provável que esta
tenha a mesma alteração evidenciada na paciente INCA – B8 e que tal alteração
tenha sido herdada via células germinativas de um dos pais, ainda não avaliados por
essa técnica e que não têm histórico de retinoblastoma ou retinoma.
5.1.7. Amostra INCA – B7
A amostra INCA – B7 é proveniente de um paciente do sexo feminino, cujo
diagnóstico de retinoblastoma bilateral (GOD - classificação internacional B; GOE –
classificação internacional E) ocorreu aos 8 meses de idade. Na admissão, a
39
paciente apresentava leucocoria e estrabismo no olho esquerdo e, como
características fenotípicas, fronte olímpica, ponte nasal achatada e implantação
baixa da orelha. Não houve relato no prontuário sobre qualquer deficiência no
desenvolvimento mental. O olho esquerdo foi enucleado sete meses após o
diagnóstico, devido à grande quantidade de sementes vítreas e novo foco tumoral
supra nasal. O olho direito respondeu bem ao tratamento e o tumor atualmente
encontra-se calcificado.
A alteração evidenciada na amostra dessa paciente foi uma deleção
cromossômica envolvendo todo o gene RB1 e genes contíguos (Fig. 4.10, fig. 4.17 e
fig. 4.18). As implicações de uma deleção citogenética de tamanho porte (>1Mb,
conforme discriminado na tabela 4.1) são o espectro de alterações fenotípicas
observadas na síndrome de deleção 13q, como dito anteriormente. Na classificação
de grupos estabelecida para essa síndrome, de acordo com a deleção evidenciada a
paciente encontra-se no grupo I (que abrange deleções proximais que não envolvem
a região 13q32), cujos pacientes têm como uma das características clínicas o
retardo mental leve a moderado (MITTER E COLS., 2011), não observado nessa
paciente. Como os dados clínicos foram obtidos dos relatos de prontuário realizados
pouco tempo após a admissão da paciente, é possível que uma deficiência no
desenvolvimento mental da mesma não tenha sido notada devido a sua pouca
idade.
5.1.8. Amostra INCA – U26
A amostra INCA – U26 foi obtida de um paciente do sexo feminino, cuja idade
ao diagnóstico de retinoblastoma unilateral de globo ocular direito não pôde ser
obtida. A paciente foi admitida no INCA aos 11 anos de idade, já enucleada.
Segundo dados do prontuário, a paciente apresenta retardo mental leve.
A alteração observada na amostra dessa paciente foi uma deleção
cromossômica envolvendo todo o gene RB1 e genes contíguos (Fig. 4.11). Segundo
a análise pelo método de MLPA, a deleção evidenciada é a mesma observada na
amostra discutida anteriormente (INCA – B7) e ambas podem ser alocadas no grupo
I de classificação da síndrome de deleção 13q (MITTER E COLS., 2011); porém, tais
pacientes apresentam características fenotípicas diferentes, visto que não há relato
40
de dismorfias faciais, porém há relato de atraso no desenvolvimento mental dessa
paciente correspondente a amostra INCA – U26. Portanto, é importante que seja
feita uma análise dessas alterações utilizando técnicas de microarranjo, a fim de se
esclarecer a abrangência de cada deleção e as contribuições dos genes envolvidos
para as manifestações fenotípicas observadas.
5.1.9. Amostra INCA – U28
A amostra INCA – U28 é proveniente de um paciente do sexo masculino, cujo
diagnóstico de retinoblastoma unilateral de globo ocular esquerdo ocorreu aos 20
meses de idade. Na admissão, o paciente apresentava leucocoria, decorrente de um
tumor com sementes vítreas, acometimento da coróide e infiltração do nervo óptico e
lâmina crivosa. Como características fenotípicas, foram observadas face triangular,
palato rebaixado, dentes amontoados, mamilos supra-numerários, sindactilia 2/3 em
pododáctilos (2º e 3º dedos do pé unidos), testículos não-palpáveis em bolsa
escrotal e a cardiopatia denominada Tetralogia de Fallot (TDF). O paciente foi
submetido à enucleação do GOE 4 meses após o diagnóstico.
A tetralogia de Fallot é uma anomalia congênita rara, do coração, que provoca
baixos níveis de oxigenação sanguínea, decorrentes de defeitos no septo
interventricular, na artéria pulmonar, na artéria aorta e na parede do ventrículo direito
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmedhealth/PMH0002534/, acessado em 11/03/13).
Essa anomalia já havia sido reportada em outros casos de pacientes com
retinoblastoma associado à síndrome da deleção 13q: Kondo e colaboradores
(1985) reportaram a TDF em um paciente com deleção 13q14-13q32; Brown e
colaboradores (1993) reportaram essa anomalia associada à deleção 13q21.2-
13q32; por fim, Quélin e colaboradores, em 2009, reportaram dois casos de TDF, um
associado à deleção 13q31.1-13q33.3 e outro com deleção 13q31.1-13qter.
A alteração evidenciada na amostra desse paciente foi uma deleção
cromossômica envolvendo todo o gene RB1 e genes contíguos (Fig. 4.12 e fig.
4.16). Ao cariótipo (Fig. 4.16), foi possível perceber que a deleção em 13q14 vai
muito além da região cromossômica do gene RB1 e o fenótipo do paciente é
condizente com o observado por Brown e seu grupo (malformações e anormalidades
digitais), o que sugere que o paciente tenha perdido a região q32, proposta por esse
41
grupo como causadora dessas anormalidades fenotípicas (BROWN E COLS., 1993).
Além disso, o paciente apresenta algumas das malformações presentes no grupo 2
de classificação da síndrome de deleção 13q (MITTER E COLS., 2011), o que
corrobora essa informação. Porém, como o cariótipo do paciente não foi
esclarecedor quanto a isso, é necessário que seja feita uma análise com técnicas de
microarranjo para um maior detalhamento da região perdida.
O paciente tem um tio por parte de pai que utiliza prótese ocular, cuja
informação sobre o motivo da prótese não pôde ser obtida.
5.1.10. Amostra HSM – B4
A amostra HSM – B4 é proveniente de um paciente do sexo masculino, cujo
diagnóstico de retinoblastoma bilateral (GOD – classificação internacional E; GOE –
classificação internacional C) ocorreu aos 12 meses de idade. Na admissão, o
paciente apresentava estrabismo. Nos registros de prontuário não foram observadas
manifestações fenotípicas que pudessem ser relacionadas a alguma síndrome.
A alteração evidenciada na amostra desse paciente foi uma deleção
cromossômica envolvendo todo o gene RB1 e genes contíguos (Fig. 4.13). Por não
constarem dados de malformações ou retardo no desenvolvimento no prontuário do
paciente, este será novamente chamado para avaliação clínica, a fim de se verificar
que nenhum dado clínico tenha sido negligenciado. Dessa forma, até o momento,
não foi possível uma correlação genótipo x fenótipo para esse paciente.
Os pais do paciente também foram investigados para alterações em 13q14.
Ambas as amostras de DNA apresentaram duas cópias não alteradas dessa região.
5.1.11. Amostra HSM – B6
A amostra HSM – B6 é proveniente de um paciente do sexo feminino, cujo
diagnóstico de retinoblastoma bilateral (GOD – classificação internacional D; GOE –
classificação internacional E) ocorreu aos 17 meses de idade. Na admissão, a
paciente apresentava estrabismo e malformações condizentes com o diagnóstico
42
clínico de síndrome da deleção13q (não obtivemos detalhamentos das alterações
fenotípicas).
A alteração evidenciada na amostra dessa paciente foi uma deleção
cromossômica envolvendo todo o gene RB1 e genes contíguos (Fig. 4.14), o que
corroborou o diagnóstico clínico da síndrome. Por não terem sido obtidos dados
específicos sobre o fenótipo da paciente e a análise citogenética realizada, não
podemos classificá-la quanto ao grupo da síndrome (BROWN E COLS., 1995;
MITTER E COLS., 2011; HUANG E COLS., 2012) bem como não foi possível
estabelecer correlações genótipo x fenótipo para a mesma.
Os pais dessa paciente foram avaliados para alterações em 13q14; ambas as
amostras de DNA dos progenitores apresentaram duas cópias não alteradas dessa
região.
Conforme pode ser observado na figura 4.3, dos 21 pacientes bilaterais com
resultados de MLPA, apenas seis evidenciaram alterações em RB1/13q. Após
recorrermos novamente aos registros do grupo de aconselhamento genético em
retinoblastoma, observamos que, dos 15 pacientes com tumor bilateral que não
apresentaram alterações por MLPA, dois revelaram mutações no sequenciamento
do gene RB1 e seis revelaram variantes de significado incerto em regiões de íntron
do gene. Dessa forma existem, pelo menos, sete pacientes com tumores bilaterais
sem nenhuma variante constitutiva detectada no gene RB1 e que, portanto, ou não
teve um primeiro evento mutacional constitutivo ou tal evento mutacional não foi
detectável pelos métodos de análise utilizados.
Segundo Knudson, a teoria de que todo caso de tumor bilateral é hereditário
(mesmo nos casos clinicamente esporádicos – sem histórico familiar) é sustentada
pelos relatos de que a descendência direta dos sobreviventes ao tumor bilateral,
sem histórico familiar, apresenta um risco próximo de 50% de ser afetada
(KNUDSON, 1974).
Porém, conforme pode ser visto em Valverde e colaboradores (2005), cujo
estudo foi uma meta análise baseada em 932 relatos de mutação no gene RB1
(sendo 24 dessas relacionadas a outros tipos de câncer), uma proporção dos casos
bilaterais de retinoblastoma não revela mutações germinativas pelos métodos
convencionais de análise (Tab. 5.1), apresentando apenas eventos somáticos, em
DNA extraído de tecido tumoral.
43
Tabela 5.1. Distribuição das mutações germinativas e somáticas no gene RB1 em
relação ao fenótipo dos pacientes. (Adaptada de Valverde e colaboradores, 2005).
Fenótipo dos pacientes Germinativa Somática Total
Bilateral esporádico 424 24 448
Bilateral familiar 99 - 99
Baixa penetrância 27 - 27
Unilateral esporádico 52 131 183
Unilateral familiar 6 - 6
Não relatado 145 - 145
Total 753 155 908
Dessa forma, pode-se concluir que algum outro mecanismo de inativação da
proteína Rb possa estar envolvido no desenvolvimento do tumor bilateral, cuja
detecção não é possível a nível genético pelos métodos de análise utilizados no
presente estudo.
Alguns trabalhos sugerem que a metilação da região promotora do gene RB1
ocorra em 8 a 16% dos casos de retinoblastoma, sendo mais frequente entre os
unilaterais (OHTANI-FUJITA E COLS. 1997; CORSON E GALLIE 2007). A
hipermetilação das ilhas CpG desta região leva ao silenciamento da expressão
gênica, promovendo uma drástica diminuição dos níveis da pRB.
É ainda possível supor que alguns desses pacientes sejam casos de
mosaicismo somático (RUSHLOW E COLS., 2009), tendo o primeiro evento
mutacional no gene RB1 ocorrido em um momento tardio da embriogênese, o que
poderia impedir sua detecção em leucócitos.
Conforme mostrado na introdução do presente estudo, a proteína pRB é
inativada através de fosforilação mediada por quinases dependentes de ciclina
CDK4/6; essas podem se encontrar superexpressas, representando uma via de
indução ao câncer (DI FIORE, 2013) e, portanto, devem ser consideradas como um
44
possível fator indutor do desenvolvimento tumoral nesses pacientes sem alteração
detectável em RB1/13q14.
Outra hipótese para o desenvolvimento tumoral nos pacientes bilaterais sem
alteração constitutiva em RB1 reside no fato de que a proteína pRb sofre diversas
modificações pós-traducionais (conforme vistas na tabela 1.2) que favorecem a
proliferação celular e podem inviabilizar a regulação do ciclo celular pela via pRb.
5.2. Avaliação dos resultados das curvas de sobrevi da
Conforme visto na tabela 4.2, apesar de o grupo de pacientes portadores de
grandes deleções ter apresentado uma sobrevida diferente do grupo de pacientes
com mutações pontuais em RB1, essa diferença não foi estatisticamente significativa
(p=0,628). Como ambos os grupos amostrais são pequenos e o de pacientes com
grandes deleções é muito menor que o de pacientes com mutações pontuais em
RB1, é necessário que sejam avaliados grupos maiores sob essas condições para
que obtenhamos um reflexo real do impacto dessas alterações na sobrevida dos
pacientes.
Alguns dados observados nesse estudo corroboram a literatura, enquanto
outros confrontam. Em um estudo de 2011, Mitter e colaboradores observaram que
todos os pacientes com RB unilateral que apresentavam deleção em 13q14, essa
deleção foi maior que 1Mb (MITTER E COLS., 2011); o mesmo foi observado em
nosso estudo (dois pacientes unilaterais com deleção em 13q14, ambas maiores
que 1Mb). Porém, no mesmo estudo, aqueles autores observaram uma frequência
maior de tumores unilaterais associados à deleções em 13q, em detrimento dos
tumores bilaterais, o que é consistente com a literatura do retinoblastoma associado
à deleção 13q (BAUD E COLS., 1999), mas que não condiz com nossos achados;
em quatro casos que apresentaram deleções citogenéticas em 13q, dois eram de
amostras provenientes de pacientes com tumor unilateral e os outros dois, de
pacientes com tumor bilateral.
O grupo liderado por Mitter estabeleceu, no mesmo estudo de 2011, uma
relação direta entre haploinsuficiência de ITM2B e ocorrência de tumor bilateral, o
que também não condiz com nosso estudo (Tab. 4.1). Por fim, eles associaram a
perda dos genes ITM2B, RB1 e RCBTB2 à estatura acima do padrão, fator que não
foi avaliado em nosso estudo.
45
Como o nosso grupo amostral com deleção em 13q e manifestações
fenotípicas (relatadas em prontuário) é pequeno, é possível que esses dados que
confrontam a literatura sejam anulados quando avaliado um conjunto maior de
pacientes sob essas condições.
Os dados referentes às deleções observadas, tanto no gene RB1 quanto nos
genes contíguos (ITM2B, RCBTB2 e DLEU1) foram bastante relevantes ao
aconselhamento genético das famílias envolvidas, visto que mutações constitutivas
em RB1 são amplamente associadas a tumores secundários a retinoblastoma e
alterações genéticas nesses outros genes em 13q14 já foram relatados em casos de
Alzheimer (gene ITM2B) e outros tipos de câncer.
As amostras de pacientes com retinoblastoma bilateral que não revelaram
alteração cromossômica ou mutação no lócus 13q14.2 pelas técnicas de
sequenciamento, MLPA ou FISH estão sendo investigadas, por outro membro do
nosso grupo, quanto ao padrão de metilação em ilhas CpG da região promotora do
gene RB1.
46
6. Conclusões
A técnica de MLPA revelou-se uma boa opção para a detecção de grandes
alterações na região 13q14 e sua ampla utilização permitiu (e continua permitindo) o
esclarecimento do primeiro evento mutacional ocorrido e suas implicações para o
paciente e sua família, contribuindo positivamente para o programa de
aconselhamento genético em retinoblastoma do Instituto Nacional de Câncer.
Algumas das alterações evidenciadas pelo método de MLPA puderam ser
validadas com utilização de outros recursos disponíveis no laboratório, tais como
técnicas de citogenética e sequenciamento direto.
A alteração detectada em um dos pacientes foi evidenciada também e um dos
seus irmãos, determinando uma necessidade de acompanhamento clínico do
mesmo.
Com esse trabalho, foi possível reunirmos dados relevantes para o
aconselhamento genético dos pacientes com retinoblastoma e seus familiares.
47
7. Referências
Abramson DH, Schefler AC. 2004. Update on retinoblastoma. Retina, the journal of
retinal and vitreous diseases 24(6):828-845p.
Aerts I, Lumbroso-Le Rouic L, Gauthier-Villars M, Brisse H, Doz F, Desjardins L.
2006. Retinoblastoma. Orphanet Journal of Rare Diseases 1:31p.
Allderdice PW, Davis JG, Miller OJ , Klinger HP, Warburton D, Miller DA, Allen FH Jr,
Abrams CA, McGilvray E. 1969. The 13q-deletion syndrome. American Journal of
Human Genetics 21:499–512p.
Antoneli CBG, Ribeiro KCB, Sakamoto LH, Chojniak MM, Novaes PERS, Arias VEA.
2007. Trilateral Retinoblastoma. Pediatric Blood Cancer 48:306–310p.
Armellini A, Sarasquete ME, García-Sanz R, Chillón MC, Balanzategui A, Alcoceba
M, Fuertes M, López R, Hernández JM, Fernández-Calvo J, Sierra M, Megido M,
Orfão A, Gutiérrez NC, González M, San Miguel JF. 2008. Low expression of
ZHX2, but not RCBTB2 or RAN, is associated with poor outcome in multiple
myeloma. British Journal of Haematology 141(2):212-215p.
Basavarajappa HD, Corson TW. 2012. KIF14 as an oncogene in retinoblastoma: a
target for novel therapeutics? Future Medicinal Chemistry 4(17):2149-2152p.
Baud O, Cormier-Daire V, Lyonnet S, Desjardins L, Turleau C, Doz F. 1999.
Dysmorphic phenotype and neurological impairment in 22 retinoblastoma
patients with constitutional cytogenetic 13q deletion. Clinical genetics 55:478-
482p.
Bender MA. 1965. Methods in human cytogenetics. Arquivos Brasileiros de
Endocrinologia & Metabologia. 14(1):47-72p.
Brown S, Gersen S, Anyane-Yeboa K, Warburton D. 1993. Preliminary definition of a
‘‘critical region’’ of chromosome 13 in q32: report of 14 cases with 13q deletions
and review of the literature. American Journal of Medical Genetics 45:52–59p.
48
Brown S, Russo J, Chitayat D, Warburton D. 1995. The 13q - Syndrome: The
Molecular Definition of a Critical Deletion Region in Band 13q32. American
Journal of Human Genetics 57:859-866p.
Carrière C, Gore AJ, Norris AM, Gunn JR, Young AL, Longnecker DS, Korc M. 2011.
Deletion of Rb Accelerates Pancreatic Carcinogenesis by Oncogenic Kras and
Impairs Senescence in Premalignant Lesions. Gastroenterology 141:1091–
1101p.
Corson TW, Gallie BL. 2007. One hit, two hits, three hits, more? Genomic changes in
the development of retinoblastoma. Genes, Chromosomes & Cancer 46:617-
634p.
De Camargo B, De Oliveira Santos M, Rebelo MS, Reis RS, Ferman S, Noronha CP,
Pombo-de-Oliveira MS. 2010. Cancer incidence among children and adolescents
in Brazil: first report of 14 population-based cancer registries. International
Journal of Cancer 126:715-720p.
Di Ciommo D, Gallie BL, Bremner R. 2000. Retinoblastoma: the disease, gene and
protein provide critical leads to understand cancer. Cancer Biology 10:255-269p.
Di Fiore R, D’Anneo A, Tesoriere G, Vento R. 2013. RB1 in cancer: different
mechanisms of RB1 inactivation and alterations of pRb pathway in
tumorigenesis. Journal of Cellular Physiology 1-46p.
Draper GJ, Sanders BM, Brownbill PA, Hawkins MM. 1992. Patterns of risk of
hereditary retinoblastoma and applications to genetic counseling. British Journal
of Cancer 66:211-219p.
Epstein CJ. 1975. Genetic counseling. American Journal of Human Genetics
27(2):240-242p.
Francis JH, Kleinerman RA, Seddon JM, Abramson DH. 2012. Increased risk of
secondary uterine leiomyosarcoma in hereditary retinoblastoma. Gynecologic
Oncology. 124: 254–259p.
49
Francis JH, Kleinerman RA, Seddon JM, Abramson DH. 2012. Increased risk of
secondary uterine leiomyosarcoma in hereditary retinoblastoma. Gynecologic
Oncology 124(2):254-259p.
Gallie BL, Ellsworth RM, Abramson DH, Phillips RA. 1982. Retinoma: spontaneous
regression of retinoblastoma or benign manifestation of the mutation? British
Journal of Cancer 45: 513p.
Harbour JW. 1998. Overview of RB gene mutations in patients with retinoblastoma.
Implications for clinical genetic screening. Ophthalmology 105:1442–1447p.
Harbour JW. 2001. Molecular basis of low penetrance retinoblastoma. Archives of
Ophthalmology 119:1699-1704p.
Henley AS, Dick FA. 2012. The retinoblastoma family of proteins and their regulatory
functions in the mammalian cell division cycle. Cell Division. 7(10):14p.
Holland JF, Frei III E, Hong KW, Bast RC, Hait WN, Kufe DW, Pollock RE,
Weichselbaum RR. 2010. Cancer Medicine. 8ª ed. Connecticut: Shelton.
People’s Medical Publishing House – USA.
Houston SK, Murray TG, Wolfe SQ, Fernandes CE. 2011. Current Update on
Retinoblastoma. International Ophthalmology Clinics 51(1):77–91p.
http://www.coatsdisease.org/index.html. Coat’s disease, information for parents.
Acessado em 06/03/2013.
http://www.hgvs.org/mutnomen/. Nomenclature for the Description of Sequence
Variants. Acessado em 01/10/2012.
http://www.klimanaturali.org/2011/03/olho-humano-estrutura-do-olho-humano.html.
Klima Naturali, Meio Ambiente e Sustentabilidade. Acessado em 11/03/2013.
http://www.kreatech.com/products/repeat-freetm-poseidontm-FISH-probes/pre-
natal/pn-13-13q14-trisomy-13-patau-syndrome.html. Kreatech Diagnostics.
Acessado em 02/01/13.
50
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmedhealth/PMH0002534/. Pubmed Health.
Acessado em 11/03/13.
Huang C, Yang YF, Yin N, Chen JL, Wang J, Zhang H, Tan ZP. 2012. Congenital
heart defect and mental retardation in a patient with a 13q33.1-34 deletion. Gene
498:308-310p.
Hurford RK Jr, Cobrinik D, Lee MH, Dyson N. 1997. pRB and p107/p130 are required
for the regulated expression of different sets of E2F responsive genes. Genes &
Development 11:1447-1463p.
Indovina P, Acquaviva A, De Falco G, Rizzo V, Onnis A, Luzzi A, Giorgi F,
Hadjistilianou T, Toti P, Tomei V, Pentimalli F, Carugi A, Giordano A. 2010.
Downregulation and aberrant promoter methylation of p16INK4a: a possible
novel heritable susceptibility marker to retinoblastoma. Journal of Cellular
Physiology 223:143-150p.
Jones PA, Laird PW. 1999. Cancer epigenetics comes of age. Nature Genetics
21:163–167p.
Kilger E, Buehler A, Woelfing H, Kumar S, Kaeser SA, Nagarathinam A, Walter J,
Jucker M, Coomaraswamy J. 2011. BRI2 Protein Regulates β-Amyloid
Degradation by Increasing Levels of Secreted Insulin-degrading Enzyme (IDE).
The journal of biological chemistry 286(43):37446-37457.
Knudson AG. 1971. Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 68:820-823p.
Kondo I, Shin K, Honmura S, Nakajima H, Yamamura E, Satoh H, Terauchi M, Usuki
Y, Takita H, Hamaguchi H. 1985. A case report of a patient with retinoblastoma
and chromosome 13q deletion: assignment of a new gene (gene for LCP1) on
human chromosome 13. Human Genetics 71:263–266p.
Latil L, Morant P, Fournier G, Mangin P, Berthon P, Cussenot O. 2002. CHC1-L, a
candidate gene for prostate carcinogenesis at 13q14.2, is frequently affected by
51
loss of heterozygosity and underexpressed in human prostate cancer.
International Journal of Cancer 99:689-696p.
Liao CC, Tsai CY, Chang WC, Lee WH, Wang JM. 2010. RB-E2F1 complex
mediates DNA damage responses through transcriptional regulation of ZBRK1.
The American Society for Biochemistry and Molecular Biology 285(43):33134-
33143p.
Lima VS, Fernandes ASJr, Fonseca RP e Soaares Lima SS. 2003. Carcinomatose
meníngea nos tumores sólidos. Revista Brasileira de Cancerologia. 49(4): 245-
251p.
Livide G, Epistolato MC, Amenduni M, Disciglio V, Marozza A, Mencarelli MA, Toti P,
Lazzi S, Hadjistilianou T, De Francesco S, D’Ambrosio A, Renieri A, Ariani F.
2012. Epigenetic and Copy Number Variation Analysis in Retinoblastoma by MS-
MLPA. Pathology and Oncology Research 18:703–712p.
Lohmann DR, Brandt B, Höpping W, Passarge E, Horsthemke B. 1996. The
spectrum of RB1 germ-line mutations in hereditary retinoblastoma. American
Journal of Human Genetics 58:940-949p.
Lohmann DR, Gallie BL. 2004. Retinoblastoma: revisiting the model prototype of
inherited cancer. American Journal of Medical Genetics 129C: 23-28p.
Lohmann DR. 1999. RB1 gene mutations in retinoblastoma. Human Mutation 14:283-
288p.
Longworth MS, Dyson NJ. 2010. pRb, a local chromatin organizer with global
possibilities. Chromosoma 119:1–11p.
Mitter D, Ullmann R, Muradyan A, Klein-Hitpass L, Kanber D, Ounap K, Kaulisch M,
Lohmann D. 2011. Genotype-phenotype correlations in patients with
retinoblastoma and interstitial 13q deletions. European Journal of Human
Genetics 19(9):947-958.
52
Moorhead PS, Nowell PC, Mellman WJ, Battips DMA, Hungerford DA. 1960.
Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood.
Experimental Cell Research. 20:613-616p.
Munro S, Carr SM, La Thangue NB. 2012. Diversity within the pRb pathway: is there
a code of conduct? Oncogene 31:4343-4352p.
Nussbaum RL, McInnes RR, Willard HF. 2007. Thompson & Thompson Genetics in
Medicine. 7ªed. Pennsylvania: Philadelphia. Saunders, Elsevier.
Ohtani-Fujita N, Dryja TP, Rapaport JM, Fujita T, Matsumura S, Ozasa K, Watanabe
Y, Hayashi K, Maeda K, Kinoshita S, Matsumura T, Ohnishi Y, Hotta Y,
Takahashi R, Kato MV, Ishizaki K, Sasaki MS, Horsthemke B, Minoda K, Sakai
T. 1997. Hypermethylation in the Retinoblastoma Gene Is Associated with
Unilateral, Sporadic Retinoblastoma. Cancer Genetics and Cytogenetics 98:43-
49p.
Quélin C, Bendavid C, Dubourg C, de la Rochebrochard C, Lucas J, Henry C,
Jaillard S, Loget P, Loeuillet L, Lacombe D, Rival JM, David V, Odent S,
Pasquier L. 2009. Twelve new patients with 13q deletion syndrome: Genotype–
phenotype analyses in progress. European Journal of Medical Genetics 52:41–
46.
Reed CA, Mayhew CN, McClendon AK, Yang X, Witkiewicz A, Knudsen ES. 2009.
RB has a critical role in mediating the in vivo checkpoint response, mitigating
secondary DNA damage and suppressing liver tumorigenesis initiated by
aflatoxin B1. Oncogene 28(50):4434–4443p.
Rushlow D, Piovesan B, Zhang K, Prigoda-Lee NL, Marchong MN, Clark RD, Gallie
BL. 2009. Detection of mosaic RB1 mutations in families with retinoblastoma.
Human Mutation 30:842-851p.
Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G. 2002.
Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-
dependent probe amplification. Nucleic Acid Research 30: e57.
53
Seabright M. 1971. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet
2:971-972p.
Sellers WR, Kaelin WG Jr. 1997. Role of the retinoblastoma protein in the
patogenesis of human cancer. Journal of Clinical Oncology 15:3301-3312p.
Sena PP. 2010. Análise molecular de mutações complexas no gene RB1 em
pacientes com retinoblastoma. Trabalho de conclusão de curso (graduação em
Biomedicina). Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Estado
do Rio de Janeiro (UNIRIO) 96p.
Shaffer LG, Slovak ML, Campbell LJ. 2009. ISCN: An International System for
Human Cytogenetic Nomenclature. Basel-Stadt: Basel. S. Karger AG.
Singh AD, Shield CL, Shields JA. 1999. New insights into trilateral retinoblastoma.
American Cancer Society 68:135-141p.
Sippel KC, Fraioli RE, Smith GD, Schalkoff ME, Sutherland J, Gallie BL, Dryja TP.
1998. Frequency of somatic and germ-line mosaicism in retinoblastoma:
implications for genetic counseling. American Journal of Human Genetics
62:610-619p.
Suckling RD, Fitzgerald PH, Stewart J, Wells E. 1982. The incidence and
epidemiology of retinoblastoma in New Zealand: a 30-year survey. British Journal
of Cancer 46:729p.
Tomidokoro Y, Tammaryn L, Rostagno A, Neubert TA, Bojsen-Moller M,
Braendgaard H, Plant G, Holton J, Frangione B, Révész T, Ghiso J. 2005. Co-
existence of Danish and Alzheimer amyloid subunits (ADan and Aβ) in the
absence of compact plaques. The journal of biological chemistry 280(44):36883-
36894.
Valverde JR, Alonso J, Palacios I, Pestaña A. 2005. RB1 gene mutation up-date, a
meta-analysis based on 932 reported mutations available in a searchable
database. BMC Genetics 6:53p.
54
Wölfel T, Hauer M, Schneider J, Serrano M, Wolfel C, Klehmann-Hieb E, De Plaen E,
Hankeln T, Buschenfelde KM, Beach D. 1995. A p16NK4a-lnsensitive CDK4
Mutant Targeted by Cytolytic T Lymphocytes in a Human Melanoma. Science
269:1281-1284.
Xiong Y, Zhang H, Beach D. 1993. Subunit rearrangement of the cyclin-dependent
kinases is associated with cellular transformation. Genes & Development 7:1572-
1583p.
Zhang J, Benavente CA, McEvoy J, Flores-Otero J, Ding L, Chen X, Ulyanov A, Wu
G, Wilson M, Wang J, Brennan R, Rusch M, Manning AL, Ma J, Easton J,
Shurtleff S, Mullighan C, Pounds S, Mukatira S, Gupta P, Neale G, Zhao D, Lu C,
Fulton RS, Fulton LL, Hong X, Dooling DJ, Ochoa K, Naeve C, Dyson NJ, Mardis
ER, Bahrami A, Ellison D, Wilson RK, Downing JR, Dyer MA. 2012. A novel
retinoblastoma therapy from genomic and epigenetic analyses. Nature 481: 329-
334p.
55
Anexos
Anexo I: Cópias da aprovação do Comitê de Ética em pesquisa do Instituto
Nacional de Câncer para o projeto intitulado “Estud os Citomoleculares em
Retinoblastoma” e os Modelos de Consentimento Livre e Esclarecido.
Carta de aprovação
56
Modelo de Termo de Consentimento Livre e Esclarecid o
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Estudos Cito-Moleculares em Retinoblastoma
Nome do Voluntário:_____________________________________Idade:_________
Gênero: ( )Masculino ( )Feminino
O retinoblastoma é um tumor maligno intra-ocular infantil, que tem freqüência
relativamente alta na população. O tumor pode se manifestar em um ou nos dois
olhos e diferentemente de outros tipos de câncer, uma parte significativa dos
retinoblastomas é hereditária. Alterações no gene RB1 são os principais fatores
genéticos que causam o retinoblastoma, mas recentemente tem sido sugerido que
outros genes possam estar envolvidos no desenvolvimento do tumor, tais como
MDM2, MDM4 e NMYC. A análise genética do gene RB1 possibilita a identificação
de indivíduos com maior risco para o desenvolvimento de retinoblastoma. Desta
forma, poderá ser realizado um acompanhamento das famílias visando a detecção
precoce de alterações oculares.
Você em breve será submetido(a) a uma cirurgia para retirada do tumor
ocular e a uma punção venosa. Por isso está sendo convidado (a) a participar, de
um estudo clínico que envolve a análise genética de parte do tumor retirado e de
parte do sangue coletado.
Para que você possa decidir se quer participar ou não deste estudo, precisa
conhecer seus benefícios, riscos e implicações.
OBJETIVO DO ESTUDO
Pesquisar alterações no gene RB1 ou na região onde este gene se localiza e
genes relacionados (tais como MDM2, MDM4 e NMYC) em amostras de tumor e
sangue de pacientes com retinoblastoma.
PROCEDIMENTOS DO ESTUDO
Se você concordar em participar deste estudo, será coletada uma amostra de
seu sangue (3 a 5 mL, ou menos, dependendo da idade do participante) utilizando
material estéril e descartável para ser analisado exclusivamente neste estudo.
57
Paralelamente, de acordo com a autorização do senhor (a), ou do seu responsável,
será utilizada uma pequena parte do tumor ocular que foi retirado na cirurgia. A
amostra tumoral a ser utilizada neste estudo não afetará o processamento rotineiro
do material a ser enviado a patologia para análise.
MÉTODOS ALTERNATIVOS
Não existe metodologia alternativa para o objetivo deste estudo.
RISCOS
O seu tratamento será exatamente o mesmo caso você participe ou não deste
estudo. A coleta de sangue e a utilização de uma pequena parte do tumor
coincidirão com a coleta de sangue para os exames rotineiros, de forma a não ser
prevista punção venosa adicional. O mesmo se aplica à amostra tumoral: será
utilizada uma parte do tumor retirado após o procedimento cirúrgico realizado como
parte do seu tratamento médico. Somente em raros casos, poderá ser necessária
uma nova coleta de sangue, que será avisada com antecedência e mediante
autorização e aceite do participante, será realizada no hospital do INCA com
profissional treinado e tendo os mesmos cuidados. A coleta de sangue, que é parte
de seu tratamento regular, não acarreta risco maior, exceto um pequeno desconforto
local durante a punção ou manchas rochas transitórias chamadas de equimoses. A
utilização do tumor também não oferece riscos uma vez que o material será retirado
após o procedimento cirúrgico de retirada do tumor.
BENEFÍCIOS
Os benefícios esperados são o acompanhamento das famílias visando à
detecção precoce de alterações oculares e o aconselhamento genético destas
famílias. Além disso, a análise genética será de grande importância para a
correlação com o desenvolvimento do tumor, possibilitando, no futuro, novas
estratégias de tratamento.
ACOMPANHAMENTO, ASSISTÊNCIA E RESPONSÁVEIS
Será oferecido suporte dos profissionais do grupo de aconselhamento
genético a todos os indivíduos estudados, que terão oportunidade de optar pelas
condutas preventivas. Caso não deseje participar desta pesquisa, os exames
58
solicitados por seu médico agora e no futuro serão realizados normalmente.
Quaisquer dúvidas podem ser esclarecidas com o pesquisador responsável pelo
aconselhamento genético, Dr., Fernando Vargas, através do telefone (21) 3207-6514
ou (21) 3207-6584.
CARÁTER CONFIDENCIAL DOS REGISTROS
Além da equipe de saúde que cuidará de você, seus registros médicos
poderão ser consultados pelo Comitê de Ética do Hospital do Câncer I / INCA e
equipe de pesquisadores envolvidos. Seu nome não será revelado ainda que
informações de seu registro médico sejam utilizadas para propósitos educativos ou
de publicação, que ocorrerão independentemente dos resultados obtidos.
TRATAMENTO MÉDICO EM CASO DE DANOS
Todo e qualquer dano decorrente do desenvolvimento deste projeto de
pesquisa, e que necessite de atendimento médico, ficará a cargo da instituição. Seu
tratamento e acompanhamento médico independem de sua participação neste
estudo.
CUSTOS
Não haverá qualquer custo ou forma de pagamento para o paciente pela sua
participação no estudo.
BASES DA PARTICIPAÇÃO
É importante que você saiba que a sua participação neste estudo é
completamente voluntária e que você pode recusar-se a participar ou interromper
sua participação a qualquer momento sem penalidades ou perda de benefícios aos
quais você tem direito. Em caso de você decidir interromper sua participação no
estudo, a equipe assistente deve ser comunicada e a coleta de amostras para os
exames relativos ao estudo será imediatamente interrompida.
GARANTIA DE ESCLARECIMENTOS
Nós estimulamos a você ou seus familiares a fazer perguntas a qualquer
momento do estudo. Neste caso, por favor, ligue para o Dr. Fernando Regla Vargas
no telefone (21) 3207-6514 ou (21) 3207-6584. Se você tiver perguntas com relação
59
a seus direitos como participante do estudo clínico, também pode contar com uma
terceira pessoa imparcial, a Coordenadora do Comitê de Ética do Instituto Nacional
do Câncer Dra. Adriana Scheliga - Rua André Cavalcanti 37, telefone 21 – 3207-
6565.
DECLARAÇÃO DE CONSENTIMENTO E ASSINATURA
Li as informações acima e entendi o propósito deste estudo assim como os
benefícios e riscos potenciais da participação no mesmo. Tive a oportunidade de
fazer perguntas e todas foram respondidas. Eu, por intermédio deste, dou livremente
meu consentimento para participar neste estudo.
Entendo que poderei ser submetido a exames de sangue adicionais aos
necessários a meu tratamento e não receberei compensação monetária por minha
participação neste estudo.
Eu recebi uma cópia assinada deste formulário de consentimento.
__________________________________ ____ / _____ / _____
(Assinatura do Paciente ou responsável) dia mês ano
_______________________________________________________
(Nome do Paciente ou responsável – letra de forma )
__________________________________ ____ / ____ / _____
(Assinatura de Testemunha, se necessário) dia mês ano
Eu, abaixo assinado, expliquei completamente os detalhes relevantes deste
estudo ao paciente indicado acima e/ou pessoa autorizada para consentir pelo
paciente.
_________________________________________ ____ / ____ / ____
(Assinatura da pessoa que obteve o consentimento) dia mês ano
60
Anexo II. Quadros das sondas presentes nos kits par a MLPA. Kit: P047 RB1-B1
61
Kit: P047 RB1-C1
62
Anexo III. Instruções para montagem da placa e parâ metros do sequenciador para análise da reação de MLPA.
Montagem da placa e parâmetros utilizados no seqüenciador ABI-3130XL Genetic
Analyzer, 16 capilares.
-Escrever a placa em uma planilha, referência de localização das amostras;
-Adicionar 0,8µL da PCR + 0,2µL do LIZ* + 9,0µL de formamida HiDiTM (referência
ABI nº 4311320)em cada poço da placa.
*LIZ internal size standard _ é utilizado como padrão de tamanho de fragmento; é
composto por 16 fragmentos fita única, marcados com um corante, que variam entre
35 e 500 pares de bases (35, 50, 75, 100, 139, 150, 160, 200, 250, 300, 340, 350,
400, 450, 490 e 500 nucleotídeos). Uma descrição mais detalhada do produto pode
ser vista no site de produtos da Applied Biosystems
(https://products.appliedbiosystems.com).
Parâmetros utilizados no seqüenciador:
Voltagem inicial de injeção: 1,6kV;
Tempo inicial de injeção: 15seg.
Polímero: preferencialmente POP-4.
top related