métodos de inoculação e avaliação de doenças em plantas · g) seccionamento da parte aérea...

Métodos de inoculação e

avaliação de doenças em plantas

Métodos Mais Comuns Para Inoculação Artificial De

Bactérias Fitopatogênicas

a) Atomização

Penetração ocorrerá,

principalmente, através de

estômatos (em maior

número, distribuídos por

todo o filoplano) e de outras

aberturas naturais.

O controle da umidade

relativa torna-se crítico por

ser condicionante da

abertura estomatal e da

congestão de água na

câmara sub-estomática e

nos hidatódios.

Existem muitos aparelhos

passíveis de serem usados

ou adaptados como

atomizadores

Tipos de atomizadores utilizáveis para a inoculação de bactériasfitopatogênicas: (A) - Manual, tipo "De Vilbiss; (B) - Improvisado comuma agulha de injeção; (C) - Manual, comum; (D) - Acoplado a umcompressor

Procedimento

Utilizar mudas jovens,

sadias, em bom estado

nutricional, livres de

insetos e ácaros.

Manter as mudas em

câmara úmida (UR =

100%) por 24 horas

como pré-tratamento,

antes da inoculação.

Preparar suspensão de inóculo de OD550 =

0,1 a 0,2, a partir de cultura na fase

exponencial de crescimento.

http://bervieira.sites.uol.com.br/grafico.gif

Atomização

Atomizar o filoplano de maneira uniforme, tendo o cuidado de aplicar o inóculo em ambas as faces das folhas.

A atomização deve ser interrompida imediatamente antes do ponto de escorrimento.

Atomizador manual ou motorizado, sendo que, no último caso, a distribuição de inóculo tende a ser mais uniforme.

b) Uso de abrasivos

Trata-se de bom método para o caso de fitobactérias que preferencialmente penetram por ferimentos.

Desvantagem: por falta de prática, o pesquisador super-estimar a força de seus dedos e causar injúrias mecânicas muito extensas aos tecidos.

Se isto acontecer, essas injúrias vão se manifestar visualmente sob forma de necroses facilmente confundíveis com sintomas necróticos incitados pelo patógeno.

O abrasivo mais comumente usado é

carborundum“

Uso rotineiro para inoculação de certos vírus

de plantas.

PepYMV

Procedimento

Utilizar mudas jovens, sadias, em bom estado nutricional, livres de insetos e ácaros, cultivadas em vasos ou sacos de polietileno.

Polvilhar na superfície do órgão a ser inoculado pequena quantidade de carborundum, finíssimamente granulado.

Proceder à imersão de um chumaço de gaze na suspensão de inóculo e, o mais suavemente possível, passe o chumaço na superfície do órgão a ser inoculado.

O próprio dedo indicador de quem procede à inoculação pode substituir, com igual eficiência, o chumaço de gaze.

Imediatamente, transferir as plantas para câmara úmida e lá mantê-las por 24-48 horas.

c) Injeção

Esse método é muito eficiente porém muito drástico pois as células bacterianas são introduzidas diretamente no interior dos tecidos.

É usado principalmente para a condução de testes de hipersensibilidade em folhas.

O uso de câmara úmida como tratamento pós-inoculação pode ser benéfico mas não é essencial.

Mesmo no caso de associações compatíveis podem ocorrer sintomas atípicos ou sintomas semelhantes aos de hipersensibilidade.

d) Inoculação de folhas pelo uso de

tesoura Imergir uma tesoura

previamente esterilizada na suspensão de inóculo bacteriano e fazer cortes a partir dos bordos do limbo foliar.

Ao mesmo tempo que se faz o ferimento que serve de porta de entrada para o patógeno, o inóculo é depositado, sem excessos, no sítio de infecção.

Imediatamente após a inoculação, manter as plantas em câmara úmida por 24 horas.

Escala de avaliação de resistência de variedades de feijoeiro a X.

axonopodis pv. phaseoli, em que a inoculação é feita pelo

seccionamento do limbo com tesoura

e) Inoculação por picada

Utilizando um estilete,

alfinete ou outro

instrumento perfurante

previamente mergulhado

em suspensão de inóculo

Este método pode ser

usado, com eficiência, para

qualquer órgão.

O instrumento pode

perfeitamente ser

esterilizado por

autoclavagem, sempre que

necessário.

Acoplamento de um alfinete entomológico a um pincel

comum de pintura permite improvisar um ótimo e

eficiente instrumento para inoculação por picada

f) Inoculação por pressão

Este tipo de inoculação pode ser usado em situações especiais, quando o encharcamento de folhas com suspensão de inóculo se faz necessário.

Assim como a inoculação por injeção, este método é também muito drástico.

Como consequência, é um método muito empregado para testes de HR em plantas cujas folhas, por serem muito coriáceas, são praticamente impossíveis de serem infiltradas de outra forma como mandioca, eucalipto, ipê.

Compressor de ar acoplado a uma pistola de pintura ou equipamento similar, consegue-se mais uniformidade na dispensa do inóculo e mais eficiência bem como tem-se a possibilidade de padronizar a pressão.

Exemplo de inoculação por pressão, em que se usa uma pistola

comum de pintura para encharcamento de folhas de eucalipto com

suspensão de células de Acidovorax avenae.

g) Seccionamento da parte aérea

Geralmente para inocular monocotiledôneas

Consiste em seccionar, com lâmina de barbear, a parte aérea de plântulas e despositar uma gota de inóculo na área seccionada.

As folhas novas que surgem, quando a inoculação tem sucesso, já o fazem exibindo sintomas.

Dependendo do patógeno (E. carotovora, por exemplo) não há surgimento de folhas novas - a planta seccionada simplesmente não mais emite folhas e morre.

Esse método já foi usado, por exemplo, para inocular Erwinia stewartii em milho doce (Coplin, 1978) e A. avenae em arroz

Câmara úmida

h) Inoculação com palito

Palitos comuns de madeira são previamente esterilizados, imersos em suspensão de inóculo e introduzidos no caule da planta ou no ponto de inserção da folha no caule.

Consegue-se assim, sem a drasticidade do método de injeção, introduzir o patógeno profundamente nos tecidos.

i) Inoculação via hidatódios

Os hidatódios geralmente

situam-se nos bordos do

limbo foliar e são

importante porta de entrada

para as fitobactérias.

Xanthomonas campestris

pv. campestris é um típico

patógeno que penetra, em

condições de campo, via

hidatódios. Daí os sintomas

de lesão cuneiforme nos

bordos da folha.

Procedimento

Colocar as plantas a serem inoculadas em câmara úmida por 24 horas.

Passar suavemente um cotonete ou pincel depintura previamente imersos em suspensão deinóculo pelos bordos da folha, sem permitirescorrimento.

As plantas inoculadas não devem retornar à câmara úmida e sim serem mantidas, se possível, em local ventilado.

A temperatura de incubação deve estar entre 25oC e 30oC e nunca ultrapassar 30oC.

j) Inoculação de raízes lavadas

Colocar as sementes para germinar de preferência em leito devermiculita ou areia.

Quando as plântulas apresentarem o primeiro par de folhasdefinitivas, remover cuidadosamente a planta e lavar seu sistemaradicular sob água corrente.

Com tesoura estéril, seccionar as extremidades de algumas raizes.

Imergir o sistema radicular em suspensão de inóculo por algunsminutos

Replantar a muda em vasos com solo estéril. Aguarmoderadamente.

Sintomas podem demorar de dias a semanas para surgir,dependendo do patossistema em estudo

l) Inoculação de raizes "in situ"

Esta é uma variação do método anterior, em

que a planta não é arrancada. Estando a

planta no vaso, inserir um escalpelo no

substrato e fazer vários cortes no sistema

radicular.

Irrigar o vaso com a suspensão de inóculo.

m) Infestação do solo

Pode-se infestar o solo com uma quantidade

conhecida de inóculo.

A infestação pode ser feita misturando-se a

suspensão de inóculo e o solo usado para

preparar os vasos ou, já estando as plantas

em vasos, simplesmente proceder à irrigação

com a suspensão bacteriana, ferindo e, ou,

não ferindo o sistema radicular

n) Inoculação por seccionamento do

pecíolo

Este método foi usado, por exemplo, por

Pine et al. (1955) especificamente para

estudar a translocação de C. michiganense

subsp. michiganense via xilema de plântulas

de tomateiro.

O método consiste em seccionar o pecíolo

foliar próximo ao seu ponto de inserção no

caule e, na área seccionada, depositar uma

gota de inóculo.

http://www.esf.edu/chestnut/web_photos/inoculation.jpg

Escalas Diagrámaticas

Pimentão x Xanthomonas campestris pv. vesicatoria

1 2 3 4 5

Feijão x Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli

Análise de Imagens

Tese: Análise de Gerações para Reação à Mancha-

Bacteriana e Outros Caracteres Agronômicos em

Capsicum annuum L. (Elaine Manelli Riva)

Contagem do número

de pústulas/cm2 de

área inoculada,

obtendo-se média de

três contagens

Contagem de pústulas – Análise de Sintomas

Conversão da média do número de pústulas/cm2 em

uma escala de notas proposta a seguir, onde x é a

média do número de pústulas/cm2:

nota 1 = 0 x 15;

nota 2 = 15 < x 30;

nota 3 = 30 < x 45;

nota 4 = 45 < x 60;

nota 5 = 60 > x 75;

nota 6 = 75 > x 90;

nota 7 = 90 > x 105;

nota 8 = 105 > x 120;

nota 9 = 120 > x 135;

nota 10 = x > 135.

Tese: Fontes de resistência, métodos de inoculação e capacidade de combinação para a resistência à murcha-de-curtobacterium em feijão-de-vagem (Willian Krause)

Resistência à murcha-de-Curtobacterium

SINTOMAS

Murcha gradual das folhas,aparecendo áreasamareladas e irregulares,seguindo para o interior dafolha

Os sintomas são devido afalha no transporte deseiva provocada pelacolonização e degradaçãodas paredes dos vasos doxilema (Dinensem, 1978)

Os sintomas são maisagudos em períodos deestresse hídrico,temperaturas elevadas eem plantas jovens (5-8 cmde altura)

Microscopia eletrônica de varredura de secções de vasos de xilema de caules de feijoeiro comum(Phaseolus vulgaris) das cultivares Carioquinha (A) e IAC Carioca (B) colonizados por Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, aos 28 dias após a inoculação (Maringoni, 2002)

Para Cff, diversos métodos de inoculação já foram utilizados,

como:

hilo da semente por meio de agulha;

via raízes;

picada de agulha ou palito no caule;

1 5432Notas

Resultados

Não houve interação significativa entre métodos e genótipos.

O método ‘hilo da semente’ além de não conseguir discriminar

genótipos resistentes e suscetíveis, foi muito drástico não

permitindo a germinação de muitas sementes

Os métodos de inoculação ‘hilo da semente’ e ‘raízes in situ’

proporcionaram notas de reação dos genótipos à murcha-de-

curtobacterium mais baixas

Conclusões

Os genótipos ‘Novirex’, ‘IAC Carioca Tybatã’ e

‘Amarelo Baixo’ foram identificados com os

maiores níveis de resistência;

O método de ‘palito de dente’, além da boa

discriminação entre os genótipos resistentes e

suscetíveis, apresenta rapidez e facilidade na

execução, sendo o método de inoculação mais

indicado.

Tese: Marcadores de DNA no Melhoramento do Feijoeiro

(Phaseolus vulgaris L.) Visando a Resistência a Xanthomonas

axonopodis pv. phaseoli (Amaury da Silva dos Santos)

Testou três diferentes métodos de inoculação:

Agulhas múltiplas

Corte com tesoura

Lâminas paralelas