método de bradford (1976)

Método de Bradford (1976)

Quantificação de proteínas totais

Prof. Luiz Edson Mota de Oliveira

Fernanda Nery; Fernanda Soares; Francyane Braga; Samantha Dignart

Setembro - 2004

Introdução

As proteínas são os maiores constituintes de toda célula viva, e cada uma delas, de acordo com sua estrutura molecular, tem uma função biológica associada às atividades vitais.

Práticas de laboratório para purificação de proteínas requerem um método rápido e sensível para a quantificação destas.

Métodos mais utilizados

Reação de Biureto

Método de Lowry

Método de Bradford

Método micro-Kjeldahl

Reação de Biureto

O método por biureto foi proposto por Riegler em 1914, baseado na observação de que substâncias que contêm duas ou mais ligações peptídicas formam um complexo de cor roxa com sais de cobre em soluções alcalinas. A intensidade da cor formada é proporcional à quantidade de proteína, e a medida é feita num colorímetro.

Interferências:• Tris• Amônia• Glicerol

NH

CO

RC

CO

NH

RC

Cu2+H

OC

HN

CR

C O

HN

CR

H

HH

Procedimento de Lowry (1951)

Aumenta a sensibilidade da reação de Biureto: composto de proteína-Cu2+ reage com Folin-Ciocalteus = coloração azul (650 nm).

ComplejoProteína-Cu 2+

Reactivo Folin oxid.

AA red.

ComplejoProteína-Cu 2+

AA oxid.

Reactivo Folin

red.AZULAMARILLO

Interferências: íon potássio; íon magnésio; EDTA; Tris; Reagentes de Thiol; Carboidratos.

O corante que se liga à proteína é o Comassie Blue G–250;

É considerado mais simples e sensível do que o método de Lowry;

Lowry indicou menos proteínas do que os resultados obtidos com o de Bradford, mas estas diferenças não foram significativas (Pinto, 1982);

Métodos colorimétricos: são sensíveis a íons, tampões e mudanças no pH ou na temperatura;

Clorofila e outros pigmentos podem afetar os valores de absorbância;

Apesar dessas limitações, os métodos colorimétricos são efetivos e justificam sua utilização (Passos, 1996).

Método de Bradford

Comassie Blue G-250

azul vermelho

Ligação com proteína

Materiais e Métodos

Reagentes:

Coomassie Brilliant Blue G-250

2-Mercaptoethanol

Triton X-100

Dodecil Sulfato de Sódio

outros

Preparação da solução de proteína

Albumina de soro Bovino (2x cristalizada)

Quimiotripsinogênio A

Citocromo C (Coração de cavalo)

Albumina de Soro Humano

Hemoglobina

0,15 M NaCl

Espectrofotômetro

200 uv

Método Gravimétrico

Preparação do reagente Comassie-blue G-250

Dissolver 100 mg de Comassie blue em 50 mL de etanol 95%. Adicionar 100 mL de H3PO4 85% e completar para 1 L. Dessa forma, as concentrações finais serão: 0,01% de Comassie, 8,5% de ácido fosfórico e 4,7% de etanol.

Ensaio Protéico

10 a 100 µg de proteína

Pipetou em tubos volumes que foram ajustado para 0,1 mL com solução tampão

Adicionou 5 mL do reagente protéico e agitou em vórtex

Leitura de absorbância: 595 nm (depois de 2 minutos e antes de 1 hora)

Obtenção da Curva Padrão:

Concentração vs Absorbância

Resultados

Reprodutibilidade, sensibilidade e linearidade

BSA = alta reprodutibilidade

Sensibilidade de 5 µg de proteína/mL no volume final

Linearidade = Lei Lambert-Beer

Precisão do método

Bradford Lowry

Interferências de Componentes Não Protéicos

1) Reagentes

Comassie Blue G-250, H3PO4 e etanol

Soro Albumina Bovina (BSA) (1 mg/mL ou 10 µg/0,1 mL)

Marcha analítica seguida no Laboratório

2) Metodologia

Preparação do reagente Comassie-blue G-250

Dissolver 100 mg de Comassie blue em 50 mL de etanol 95%

Adicionar 100 mL de H3PO4 85%

Completar para 1 L

Deixar overnight com agitação constante e filtrar

Concentrações finais: 0,01% de Comassie, 8,5% de ácido fosfórico e 4,7% de etanol

Obs.: Ácido fosfórico deve ser adicionado ao Comassie dissolvido em etanol e nunca o contrário.

Procedimento para obtenção da curva padrão

Tubos BSA

(1 mg/mL) (mL)

Água (mL)

Comassie Blue G-250

(mL)

µg Protéina

1 0,00 0,10 5,0 0

2 0,02 0,08 5,0 20

3 0,04 0,06 5,0 40

4 0,06 0,04 5,0 60

5 0,08 0,02 5,0 80

6 0,10 0,00 5,0 100

Tabela 1. Procedimento para obtenção da curva padrão de proteínas utilizando-se como padrão BSA (1 mg/mL).

*Volume reacional = 5,1 mL

Erros de pipetagem podem ser minimizados utilizando-se alíquotas de 0,1 mL retiradas de soluções de 20, 40, 60, 80 e 100 µg de BSA / 0,1 mL. Se assim for, a curva seguirá o padrão mostrado na Tabela 2.

Tabela 2. Procedimento para obtenção da curva padrão de proteínas utilizando-se como padrão soluções diluídas de BSA.

*Volume reacional = 5,1 mL

Tubos BSA (X µg / 0,1 mL) (mL)

Comassie Blue G-250

(mL)

µg Proteína

1 0,1 de H2O 5,0 0

2 0,1 5,0 20

3 0,1 5,0 40

4 0,1 5,0 60

5 0,1 5,0 80

6 0,1 5,0 100

Após, agitar os tubos em vortex

Leitura no espectrofotômetro U.V. =

595 nm.

Curva Padrão

Método de Bradford

y = 0,0076x - 0,0043

R2 = 0,9888

00,20,40,60,8

1

0 20 40 60 80 100

Concentração (ug/mL)

Ab

s 5

95

nm

OBRIGADO!!