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RICARDO HSIEH
Melanoma primário da mucosa oral: estudo imunoistoquímico e molecular
da via da MAPK
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências Programa de Dermatologia Orientadora: Profa Dra. Silvia Vanessa Lourenço
São Paulo 2012
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
reprodução autorizada pelo autor
Hsieh, Ricardo
Melanoma primário da mucosa oral : estudo imunoistoquímico e molecular da
via da MAPK / Ricardo Hsieh. -- São Paulo, 2012.
Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
Programa de Dermatologia.
Orientadora: Silvia Vanessa Lourenço.
Descritores: 1.Melanoma 2.Mucosa oral 3.Quinases de proteína quinase
ativadas por mitógeno 4.Imunoistoquímica 5.Análise mutacional de DNA
6.Pirosequenciamento
USP/FM/DBD-123/12
DEDICATÓRIA _____________________________________________________________________
Dedicatória À Deus Aos meus pais
AGRADECIMENTOS _____________________________________________________________________
Agradecimentos À minha orientadora, Profa. Dra. Silvia Vanessa Lourenço, por acreditar no meu
potencial, pelo seu incentivo a sempre progredir e alcançar meus objetivos
profissionais, pelos seus ensinamentos e conselhos, pela paciência e dedicação
como orientadora e uma grande amiga.
A todos os professores, colegas, profissionais técnicos e administrativos do
Departamento de Dermatologia, pelos ensinamentos e suporte. Principalmente Dra.
Mirian que sempre me incentivou, me auxiliou com seus conhecimentos e me
ajudou a crescer profissionalmente.
A todos os professores, colegas, profissionais técnicos e administrativos do Instituto
de Medicina Tropical, por permitir que eu desenvolva parte do meu trabalho, pela
auxílio técnico, amizade e carinho de todos. Principalmente a Dirce, pois além dos
ensinamentos técnicos e sua companhia diária no laboratório, sempre foi muito
presente como amiga.
A todos os professores, colegas, profissionais técnicos do Hospital do Câncer A.C.
Camargo, por permitir usar a infraestrutura e me auxiliarem em toda parte técnica
de biologia molecular do meu trabalho. Principalmente, Cláudia, Marcilei, Renata e
Rodrigo, pois sempre pude contar com o apoio profissional deles.
Ao Departamento de Patologia Geral da Faculdade de Odontologia da USP, pela
oportunidade de estagiar pelo programa PAE na disciplina e contribuir com minha
formação acadêmica.
A todos os meus parentes, entes queridos, amigos, colegas pela paciência, pelo
carinho, pela amizade e por todo tipo de apoio que me deram durante todo a
jronada, por sempre torcerem sempre por mim e acompanhando mais uma etapa
profissional de minha vida, meu muito obrigado. Principalmente: Juliana, Sthefany,
Paulo, Rubens, Marisa, Alexandre, Andréia, Fabiana, Rose, Sabrina, Fabio, Mauricio e
outros que não citei, mas que moram no meu coração.
À FAPESP por acreditar e conceder auxílio à pesquisa para que este trabalho tenha
sido realizado com êxito.
À CAPES por me contemplar com a bolsa de doutorado da pós-graduação,
incentivando a minha formação profissional.
Esta tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta publicação:
Referências: sistema autor-data; adaptado de: International Committee of Medical
Journals Editors (Vancouver)
Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e
Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias.
Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F.
Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3a ed.
São Paulo: Divisão de Biblioteca e Documentação; 2011.
Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed in
Index Medicus.
SUMÁRIO _____________________________________________________________________
SUMÁRIO
Lista de abreviaturas
Lista de símbolos
Lista de figuras
Lista de gráficos
Lista de quadros
Resumo
Summary
1 INTRODUÇÃO ...........................................................................................................1
2 OBJETIVOS ................................................................................................................3
2.1 Objetivos gerais .....................................................................................................3
2.2 Objetivos especificos .............................................................................................3
3 REVISÃO DE LITERATURA ..........................................................................................4
3.1 Melanoma ..............................................................................................................4
3.1.1 Melanoma: referências históricas ......................................................................4
3.1.2 Aspectos gerais do melanoma ............................................................................7
3.2 Melanoma primário da mucosa oral (MPMO) .....................................................10
3.2.1 Epidemiologia ...................................................................................................10
3.2.2 Características clínicas e histológicas do MPMO ..............................................11
3.2.3 Etiologia do melanoma primário da mucosa oral .............................................15
3.3 Genética molecular do melanoma primário da mucosa oral ...............................16
3.3.1 Via da sinalização da MAPK (“mitogen activated protein kinase”) ..................18
3.3.2 Família RAS ........................................................................................................21
3.3.3 Família RAF ........................................................................................................22
3.3.3 Família ERK ........................................................................................................24
4 MATERIAL E MÉTODO .............................................................................................27
4.1 Etapa in situ de estudo da via MAPK em MPMO .................................................29
4.1.1 Análise imunoistoquímica dos TMAs de melanomas orais ..............................29
4.2. Etapa de estudo molecular da via MAPK em MPMO ..........................................32
4.2.1. Extração de DNA ..............................................................................................32
4.2.2 Quantificação de DNA .......................................................................................34
4.2.3 Amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) ................................34
4.2.4 Pirosequenciamento .........................................................................................35
4.2.5 Análise dos dados obtidos pelo pirosequenciamento.......................................38
5 RESULTADOS ...........................................................................................................39
5.1 Resultados clínicos e histopatológicos analisados ...............................................39
5.2 Resultados da análise imunoistoquímica dos TMAs de MPMO ...........................53
5.3 Resultados da análise molecular de MPMO ........................................................57
6 DISCUSSÃO ..............................................................................................................75
7 CONCLUSÕES ..........................................................................................................86
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................88
LISTAS _____________________________________________________________________
Lista de abreviaturas et al.: e outros
in situ: no local
in vitro: em vidro
RTK: receptor de tirosina quinase
GTPase: enzima guanosina trifosfato
MAPK: mitogen activated protein kinase
RAS: homólogo do vírus RAS (rat sarcoma)
NRAS: homólogo do oncogene viral RAS do neuroblastoma
KRAS: homólogo oncogene viral de sarcoma de Kirsten
HRAS: homólogo oncogene viral de sarcoma de Harvey
ARAF: V-raf murine sarcoma 3611 viral oncogene homolog
BRAF: v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1
CRAF: V-raf-1 murine leukemia viral oncogene homolog 1
MEK Mitogen-activated protein kinase kinase
ERK: quinase regulada por sinal extracelular
p27: Cyclin-dependent kinase inhibitor 1B
TMA: tissue microarray
H/E: hematoxilina/eosina
A.C.: antes de Cristo
PCR: reação em cadeia da polimerase
MPMO: melanoma primário da mucosa oral
WESTOP: Western Society of Teachers of Oral Pathology
DNA: ácido desoxirribonucléico
ATP: adenosina trifosfato
ADP: adenosina bifosfato
PPi: fosfato inorgânico
Pi: pirofosfato
m: meses
XNo: número de vezes
UV: ultravioleta
BSA: bovine serum albumin
TRIS hidroximetil aminometano
SFB: soro fetal bovino
DNTP: deoxinucleotídeo trifosfatado
Lista de símbolos %: pocentagem
ml: mililitros
l: microlitros
rpm: rotação por minuto
mM: milimolar
pmol: picomol
U: unidade
ºC : graus Celsius
Lista de figuras Figura 1 Representação esquemática da via de sinalização da MAPK ............20
Figura 2 Exemplos dos aspectos histopatológicos de melanoma oral .............45
Figura 3 Exemplos dos aspectos histopatológicos de melanoma oral .............47
Figura 4 Aspectos imunoistoquímicos da expressão das proteínas
componentes da via da MAPK nos MPMO..........................................54
Figura 5 Pirograma de BRAF, KRAS e NRAS do Caso 6 ......................................60
Figura 6 Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 7 ....................................61
Figura 7 Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 9 ....................................62
Figura 8 Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 12 ..................................63
Figura 9 Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 13 ..................................64
Figura 10 Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 14 ..................................65
Figura 11 Pirograma de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 17 ....................................66
Figura 12 Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 18 ..................................67
Figura 13 Pirograma de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 19 ....................................68
Figura 14 Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 23 ..................................69
Figura 15 Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 25 ..................................70
Figura 16 Pirogramas de BRAF, NRAS e /LRAS do Caso 26 .................................71
Figura 17 Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 31 ..................................72
Figura 18 Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 35 ..................................73
Figura 19 Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS dos controles positivos ...............74
Lista de Gráficos
Gráfico 1 Distribuição do melanoma primário da mucosa oral segundo o gênero
(homens (51.43%) e (48.57%) mulheres) ...........................................51
Gráfico 2 Distribuição do melanoma primário da mucosa oral por raça (brancos:
75% e não-brancos 25%).....................................................................51
Gráfico 3 Localização das lesões de melanoma primário da mucosa oral .........52
Gráfico 4 Análise do nível histológico dos melanomas primários da mucosa oral
.............................................................................................................52
Lista de Quadros
Quadro 1 Primeira descrição clínica no idioma inglês de um caso de melanoma
(William Norris, apud Davis e McLeod, 1998) ......................................5
Quadro 2 Fragmento de descrição de laudo de necropsia de um caso de
melanoma relatado por William Norris ................................................6
Quadro 3 Anticorpos primários, procedência, titulo e detalhes do protocolo ...31
Quadro 4 Detalhes clínicos derivados da revisão dos prontuários de cada caso
.............................................................................................................41
Quadro 5 Detalhes morfológicos dos melanomas analisados ............................43
Quadro 6 Resumo das informações clínicas e histopatológicas dos 35 casos de
melanoma primário da mucosa oral ..................................................49
Quadro 7 Relação entre recorrências e parâmetros histológicos dos melanomas
estudados ...........................................................................................50
Quadro 8 Associação entre expressão das proteína da via MAPK e os
parâmetros clínico-patológicos dos melanomas primários da mucosa
oral .....................................................................................................56
Quadro 9 Resultados do pirosequenciamento de BRAF; NRAS e KRAS nos 14
casos analisados .................................................................................59
RESUMO _____________________________________________________________________
Hsieh R. Melanoma primário da mucosa oral: estudo imunoistoquímico e molecular da via da MAPK [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2012.
INTRODUÇÃO: O melanoma primário da cavidade oral é uma neoplasia agressiva,
rara e originada a partir da proliferação de melanócitos malignos da mucosa. Ele
representa aproximadamente de 0,2 a 8% de todos os melanomas. Estudos recentes
apontam algumas vias moleculares tem sido encontradas por estarem envolvidas na
patogenia dos melanomas. Dentre essas vias destaca-se a via proliferativa da MAPK
(“mitogen activated protein kinase”), esta cascata de sinalização está envolvida no
controle do crescimento celular, proliferação e migração, e tem sido relacionada
com um papel importante no desenvolvimento e progressão do melanoma cutâneo.
OBJETIVOS: Analisar a expressão proteica e mutação pontual dos componentes da
via MAPK e correlacionar com os dados clínicos-histológicos. MATERIAL E
MÉTODOS: Através da imunoistoquímica avaliar a expressão proteica dos anticorpos
RAS; BRAF; MEK1; MEK2; ERK1 e ERK2 em 35 casos de melanomas orais organizados
em matriz (TMA: Tissue Microarray) e através de pirosequenciamento avaliar a
mutação pontual dos genes BRAF; NRAS; KRAS em 14 casos de melanomas orais.
RESULTADOS: Idade dos pacientes entre 9 e 91 anos, sem predileção por sexo, 75%
caucasianos, 71,42% acometeram o palato, 80% com aspecto histológico grau III. A
análise da expressão proteica foi: RAS (28,57%); BRAF (82,85%); MEK1 (0%); MEK2
(51,43%); ERK1 (20%)e ERK2 (74,28%). Na análise molecular observamos mutações
para BRAF (9/14 casos) e NRAS (2/14 casos). CONCLUSÃO: Todos os aspectos da via
MAPK necessita de outras elucidações em melanomas de áreas foto-protegidas e
melanomas de mucosa e comparando diferentes populações. Entretanto, os
resultados deste presente estudo apontam importante alterações na cascata RAS-
RAF-MEK-ERK e estes são indicadores de prognóstico ruim em melanomas primários
da mucosa oral, independente da exposição solar.
Descritores: 1) Melanoma 2) Mucosa oral 3) Quinases de proteína quinase
ativadas por mitógeno 4) Imunoistoquímica 5) Análise mutacional de DNA
6) Pirosequenciamento
SUMMARY _____________________________________________________________________
Hsieh R. Primary oral mucosal melanoma: an immunohistochemistry and molecular study of MAPK pathway [thesis]. São Paulo: Medicine School, University of São Paulo (Brazil); 2012.
BACKGROUND: Primary melanoma of the oral cavity is an aggressive and rare
neoplasm and originated from the proliferation of malignant melanocytes of the
mucosa. It represents approximately 0.2 to 8% of all melanomas. Recent studies
indicate some molecular pathways have been found to be involved in the
pathogenesis of melanomas. Among these means there is a proliferative MAPK
pathway ("mitogen activated protein kinase"), this signaling pathway is involved in
controlling cell growth, proliferation and migration, and it has been associated with
a role in the development and progression of melanoma skin. OBJECTIVES: To
analyze protein expression and mutation of components of the MAPK pathway and
to correlate with the clinical, histological data. MATERIALS AND METHODS: Using
immunohistochemistry to evaluate the protein expression of RAS, BRAF, MEK1,
MEK2, ERK1 and ERK2 antibodies in 35 cases of oral melanomas organized array
(TMA: Tissue Microarray) and using pyrosequencing to assess the mutation of the
BRAF, NRAS, KRAS in 14 cases of oral melanomas. RESULTS: Age of patients between
9 and 91 years, regardless of gender, 75% Caucasian, 71.42% in palate, 80% with
histologic grade III. Analysis of protein expression was: RAS (28.57%); BRAF
(82.85%); MEK1 (0%), MEK2 (51.43%); ERK1 (20%) and ERK2 (74.28%). Molecular
analysis we found BRAF mutations (9/14 cases) and NRAS (2/14 cases).
CONCLUSION: All aspects of the MAPK pathway requires further elucidation in
melanomas of photo-protected areas and mucosal melanomas and comparing
different populations. However, the results of this study indicate important changes
in the cascade RAS-RAF-MEK-ERK and these are indicators of poor prognosis in
primary melanomas of the oral mucosa, regardless of sun exposure.
Descriptors: 1) Melanoma 2) oral mucosa 3) kinases mitogen-activated
protein kinase 4) Immunohistochemistry 5) DNA mutational analysis
6) pyrosequencing
1
1. INTRODUÇÃO
O melanoma é um tumor maligno que se desenvolve a partir da transformação
maligna dos melanócitos, células produtoras de pigmento de melanina e derivadas da
crista neural, que residem na camada basal da epiderme (Chudnovsky et al., 2005;
Femiano et al., 2008). Mesmo compreendendo somente 3% de todos os tumores
malignos da pele, é responsável por 60% de todas as mortes por neoplasias cutâneas
(Kuphal e Bossenhoff, 2009). Embora a maior parte dos melanomas se desenvolvem na
pele, eles também podem se desenvolver em superfícies de mucosa ou em quaisquer
localizações em que as células da crista neural migram (Femiano et al., 2008).
Os melanomas de mucosa compreendem cerca de 1% de todos os melanomas
e mostram um caráter biológico mais agressivo comparado ao que se observa nos
melanomas cutâneos: apresentam maior taxa de comprometimento metastático para
linfonodos e outros órgãos regionais e distantes, resultando num índice maior de
mortalidade (Lengyel et al., 2003).
As mucosas mais comumente acometidas pelos melanomas estão na região da
cabeça e pescoço (55%), região anal/retal (24%), trato genital feminino (18%) e trato
urinário (3%), sendo a incidência do melanoma oral menor que 1,2 casos por 10
milhões de pessoas por ano (Hicks e Flaitz, 2000).
De acordo com Palmieri et al. (2009), mecanismos moleculares tem sido
estudados na patogenia do melanoma, por estarem envolvidos na alteração clonal
2
primária dos melanócitos neoplásicos, incluindo aqueles que induzem a proliferação
celular (via proliferativa) ou superação da senescência celular (via de senescência).
Dentre essas vias moleculares envolvidas na patogenia do melanoma, destaca-
se a via proliferativa a via do MAPK (“mitogen activated protein kinase”) (incluindo a
cascata de proteínas do NRAS, BRAF, MEK1/2 e ERK1/2). Esta via é apontada como a
principal cascata de sinalização envolvida no controle do crescimento da população
celular, proliferação e migração, e tem sido relacionada com um papel importante em
ambos, desenvolvimento e progressão do melanoma cutâneo.
Entretanto, pouco se sabe a respeito da patogenia e os aspectos biológicos dos
melanomas primários das mucosas, ao contrário dos diversos estudos encontrados
para melanomas cutâneos. A literatura mostra que a via MAPK é de fundamental
importância na proliferação de melanócitos de melanomas cutâneos. Nos melanomas
da mucosa oral não há informações sobre a participação dessa via em quaisquer
estágios da doença. Com a hipótese de que essa via possa ter abrigar importantes
mutações que acarretem um pior comportamento clínico e prognóstico dos
melanomas da mucosa oral, nosso trabalho se propõe a investigar seus componentes e
correlacionar os resultados obtidos com os dados clínico-evolutivos dos casos de
melanoma primário da mucosa oral que foram previamente selecionados pelo nosso
grupo de trabalho.
3
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais
Estudar os componentes RAS, BRAF, MEK e ERK da via de sinalização da MAPK em
melanomas primários da mucosa oral.
2.2 Objetivos específicos
1. analisar os padrões de expressão de: RAS, BRAF, MEK e ERK utilizando-se a
técnica de imunoistoquímica em uma coleção de casos de melanoma primário
da mucosa oral organizados em matriz (tissue microarray –TMA);
2. analisar mutação pontual dos genes BRAF, NRAS e KRAS em 14 casos de
melanomas orais, por meio da técnica de pirosequenciamento;
3. correlacionar os dados obtidos nos experimentos de análise dos componentes
da via MAPK com os dados clínico-evolutivos dos casos de melanoma primário
da mucosa oral incluídos no estudo.
4
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1 MELANOMA
3.1.1 MELANOMA: REFERÊNCIAS HISTÓRICAS (Gray-Schopfer et al., 2006)
Documentos de Hipócrates de cerca do século V A.C. sugerem que o melanoma
foi identificado em múmias incas. Estudos arqueológicos posteriores, descrevem a
neoplasia em múmias Incas do Peru e da região Andina, com metástases difusas em
ossos do crânio e das extremidades (Chin et al., 1998; Chudnovsky et al., 2005 ).
A primeira publicação acerca de um caso de melanoma foi de John Hunter
(cirurgião do St George’s Hospital Medical School de Londres), em 1787. O espécime
mantido no “Hunterian Museum of the Royal College of Surgeons” sob o número
original de 219 refere-se a doença de um homem de 35 anos com uma massa
recidivante no ângulo da mandíbula. Hunter descreveu a massa como uma
“excrescência fúngica cancerosa”. Apenas em 1968 o exame microscópico desse
espécime revelou tratar-se de um melanoma.
Entretanto, a primeira descrição do melanoma é reputada a René Laennec. Sua
descrição foi apresentada em forma de aula na Faculte de Medicine de Paris em 1804 e
publicada em 1806. Logo após, em 1820, William Norris publicou o primeiro caso de
melanoma na literatura de língua inglesa. Essa descrição original é reproduzida no
Quadro 1.
5
Quadro 1: Primeira descrição clínica no idioma inglês de um caso de melanoma
(William Norris, apud Davis e McLeod, 1998)
“Mr D., aged 59 years, of light and fair complexion, presented to Dr. Norris on
February 6, 1817 with a tumour on his abdominal wall midway between umbilicus and
pubis. There had always been a mole on this position, but nine months previously, it
began to grow and tumour developed. It was half the size of a hen’s egg, of deep
brown colour, of firm and fleshy feel, ulcerated, and discharging a highly foetid
ichthorous fluid. The apex of the tumour was broader than its base. Some months after
the tumour appeared, several distinct brown nodules sprang around it (satellites).”
The primary tumour was removed by the knife but then recurred in the scar in
less than six weeks. The glands of the groin were swollen and slightly tender to the
touch. Despite the disseminated nature of the tumour, the general health of the patient
was not so much impaired as to interfere with his excercise or business. Multiple
subcutaneous deposits developed with a distressing cough and dyspnea before he died.
Em 1857, Norris publicou uma coletânea de casos, sob o nome de “melanose”,
e concluiu que a doença ocorreria em pessoas com lesões em outras partes do corpo.
Ele ainda relatou nesse artigo, o comportamento metastático do tumor, geralmente
confirmado em necropsias (Quadro 2), e a possível tendência da predisposição
hereditária da doença.
6
Quadro 2: Fragmento de descrição de laudo de necropsia de um caso de
melanoma relatado por William Norris (apud, Davis e Mc Leod, 1998)
... thousands and thousands of coal black spots, of circular shapes and various
sizes on the shining mucous, serous and fibrous membranes of the vital organs as the
most dazzling sight ever beheld by a morbid anatomist.
Norris foi um grande estudioso dos melanomas no século XIX, e uma série de
princípios que envolvem sua epidemiologia e manejo clínico e análise histopatológica
ainda persistem baseados em seus estudos. Segundo o médico clínico geral William
Norris, melanoma se trata de uma doença hereditária, pois em seu manuscrito de
1820, ele descreveu uma família com numerosos sinais na pele e alguns membros da
família com lesões metastáticas. Esta foi feita quase meio século antes do paradigma
da genética articulada por Gregor Johann Mendel (Chin et al., 1998; Chudnovsky et al.,
2005 ).
Ainda no século XIX, outros médicos tiveram importantes contribuições no
estudo dos melanomas. Jean Cruveilier é autor das descrições originais de melanoma
nas mãos, pés, vulva e metástases na mama e intestino, no livro "Anatomic
Pathologique Du Corps Human", entre 1829 e 1842. Isaiah Parrish, em 1837, descreveu
o primeiro caso de melanoma nos Estados Unidos e Sir James Paget, em 1853 escreveu
uma de suas melhores peças no livro “Lectures on Surgical Pathology” a respeito de
7
melanoma amelanótico. Ao final do século XIX, Sir Jonathan Huchtinson, em 1892 e
1894, descreveu casos de melanoma subungueal.
Estudado ao longo dos séculos por numerosos pioneiros na história da
medicina, o melanoma foi retratado por desenhistas técnicos e até por Goya (o quadro
Infanta Dona Maria Josefa parece retratar uma lesão na têmpora correspondente ao
um lentigo maligno ou “Hutchinson’s melananotic freckle”). No século XX, as pesquisas
em melanomas floresceram, impulsionadas por avanços tecnológicos e hoje, oferecem
subsídios para o desenvolvimento de terapêuticas que futuramente poderão ter
impacto favorável na história natural da doença.
O avanço do conhecimento molecular nos últimos 20 anos confirmou a teoria
de Norris da significância da contribuição genética na etiologia do melanoma
(Chudnovsky et al., 2005 ).
3.1.2 ASPECTOS GERAIS DO MELANOMA
O melanoma é um tumor maligno que se desenvolve a partir da transformação
maligna dos melanócitos, células produtoras de pigmento de melanina e derivadas da
crista neural, que residem na camada basal da epiderme (Chudnovsky et al., 2005;
Femiano et al., 2008). Embora a maior parte dos melanomas se desenvolvam na pele,
eles também podem se desenvolver em superfícies de mucosa ou outros locais em que
as células da crista neural migram (Femiano et al., 2008).
8
O melanoma afeta igualmente homens e mulheres e é incomum em crianças. É,
portanto, uma doença da fase adulta, diagnosticada, em média, na quarta década de
vida. As localizações mais comuns dos melanomas da pele são o tronco (43.5%),
seguido pelas extremidades (33.9%), cabeça e pescoço (10.7%), e localização acral
(11.9%) (Kuphal e Bossenhoff, 2009).
Na maioria dos casos, o melanoma desenvolve-se como uma proliferação intra-
epidérmica de melanócitos neoplásicos que, por se mantém isolados na epiderme ou
na derme superficial. Neste estágio de desenvolvimento, o melanoma é quase sempre
curável com uma excisão cirúrgica adequada. As características biológicas essenciais da
fase de crescimento radial do melanoma aparecem vagarosamente, mas com intensa
proliferação de células atípicas na epiderme que podem ou não ser acompanhadas por
uma migração neoplásica para as papilas dérmicas (Clark et al.,1990).
Em um estágio mais avançado a lesão pode formar nódulos expansivos e
infiltrar a derme reticular ou gordura subcutânea. Nesta fase, denominada fase de
crescimento vertical, a lesão adquire a capacidade de metastatizar e seu prognóstico é
diretamente relativo à profundidade de invasão (Breslow, 1970). Outros parâmetros
histológicos são importantes na determinação do comportamento biológico da
neoplasia (Clark et al., 1969; Balch et al., 1980; Day et al., 1981; Day et al., 1982a; Day
et al., 1982b; Day et al., 1982c; Day et al., 1982d; Harrist et al., 1984; Leon et al., 1991).
Os melanomas de crescimento nodular e com fase de crescimento radial não
detectável são classificados como melanomas nodulares. Os melanócitos neoplásicos
9
dérmicos são grandes com núcleos proeminentes, muitas vezes nucléolos eosinofílicos,
mas sem tendência a maturação. O índice mitótico é variável. Há perda estrutural da
derme e perda da capacidade de formação de ninhos neoplásicos (Smoller et al.,
2006).
A descrição prévia das fases de crescimento vertical e horizontal do melanoma
pode ser aplicada em quase todos os exemplos de melanoma primário, embora, como
já notado, nem todos os melanomas exibirão cada um destes compartimentos
lesionais. Deste modo, aproximadamente 45% de casos novos são identificados na fase
de crescimento radial, considerando que 10% apresentam somente a fase de
crescimento vertical e os 45% restantes apresentam nódulo tumoral na fase de
crescimento vertical circundado por uma placa na fase de crescimento radial. Esta
hipótese de progressão de uma placa não-tumoral para um nódulo neoplásico que
pode ter a capacidade de metastatizar tem implicação para o controle de mortalidade
por melanoma desde que isto sugira que a progressão possa ser prevenida pela
remoção de melanomas na fase de crescimento radial, quando as lesões são
clinicamente placas não-tumorais e micro-invasivo histologicamente.
Aqueles melanomas que se apresentam com um nódulo tumoral na fase de
crescimento vertical e sem evidente placa de crescimento radial na epiderme e papila
dérmica adjacente (10% dos casos) parecem representar melanomas nodulares desde
o princípio, embora provavelmente a maioria deles tenha uma origem epidérmica
(Elder e Murphy, 1991).
10
3.2 MELANOMA PRIMÁRIO DA MUCOSA ORAL (MPMO)
3.2.1 EPIDEMIOLOGIA
O melanoma primário da mucosa oral é uma neoplasia de baixa ocorrência, de
características agressivas e originada a partir da proliferação de melanócitos malignos
da mucosa. Ele representa aproximadamente de 0,2 a 8% de todos os melanomas e
0,5% de todas neoplasias orais na Austrália, Estados Unidos, Europa (Rapini et al.,
1985; Hicks e Flaitz, 2000; Lee et al., 2002; Rapidis et al., 2003; Garzino-Demo et al.,
2004; Femiano et al., 2008; Aguas et al., 2009; Sortino-Rachou et al., 2009). A doença
tem sido relatada com maior frequência em asiáticos e negros; isso é atribuído
parcialmente pelos comuns achados de pigmentação melânica na mucosa oral dessas
raças (Aguas et al., 2009). Nos Estados Unidos, a proporção de melanomas de mucosa
é maior (8,8%) em afro-americanos e hispânicos do que na população em geral (1,3%),
enquanto Japão e Uganda revela-se uma doença relativamente freqüente (Lengyel et
al., 2003). A incidência do MPMO no Japão é aproximadamente 11 - 24%, maior do que
em países ocidentais (Lee et al., 2002). Na nossa população a doença parece acometer
com maior freqüência indivíduos brancos (Lourenço et al., 2009).
O melanoma primário da mucosa oral pode ocorrer em qualquer faixa etária
sendo muito incomum em pessoas abaixo dos 30 anos de idade, geralmente entre 30 e
90 anos, sendo a maior incidência na 6a década de vida (Lee et al., 2002; Aguas et al.,
11
2009; Sortino-Rachou et al., 2009). Geralmente não ocorre predileção ao sexo, porém
alguns autores referem uma leve predileção pelo sexo feminino, outros referem ao
masculino (Aguas et al., 2009).
Os locais de maior ocorrência são o palato e a gengiva superior (80% dos
melanomas orais) (Lourenço et al., 2009). Outras localizações incluem a gengiva
inferior, mucosa jugal, língua e soalho bucal (Rapini et al., 1985; Hicks e Flaitz, 2000;
Lee et al., 2002; Lengyel et al., 2003; Rapidis et al., 2003; Garzino-Demo et al., 2004;
Aguas et al., 2009; Sortino-Rachou et al., 2009 ).
3.2.2 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E HISTOLÓGICAS DO MELANOMA PRIMÁRIO
DA MUCOSA ORAL
O melanoma primário da mucosa oral é inicialmente assintomático e
geralmente não perceptível ao doente, o qual contribui para o diagnóstico tardio
(Femiano et al., 2008).
Seu aspecto clínico é variável sendo dividido em 5 tipos dependendo de suas
características morfológicas em: pigmentado nodular, não-pigmentado nodular,
pigmentado maculoso, pigmentado misto, não-pigmentado misto (Tanaka et al.,
2004a, Tanaka et al., 2004b).
Histologicamente os melanomas orais são compostos de células fusiformes,
plasmocitóides e epitelióides dispostas em lençóis, arranjos organóides, alveolar,
12
neurotrópico e desmoplásico. Pigmento de melanina é encontrado em 90% das lesões.
Maturação celular é ausente. Essas células mostram ainda alterações nucleares
importantes como núcleos grandes e hipercromáticos, angulosos e por vezes
múltiplos, com nucléolos proeminentes. Atividade mitótica é intensa. O padrão de
invasão é notório com células neoplásicas ocupando até os níveis mais profundos da
submucosa e destruindo e dissociando os tecidos subjacentes. (Smoller et al., 2006).
Muitos MPMO têm similaridade histológica com melanoma lentigo maligno na
fase de crescimento radial, entretanto, quando começa a invasão, as lesões são muito
agressivas e pode metastatizar semelhante à fase de crescimento vertical do
melanoma extensivo superficial. Alguns descrevem MPMO como os melanomas
palmar, plantar e subungueal, os quais são os tipos mais agressivos dos melanomas
cutâneos, devendo ser classificado como melanoma lentiginoso acral (Femiano et al.,
2008).
Os melanomas das mucosas da cabeça e pescoço têm comportamento
supostamente mais agressivo que os melanomas da pele; eles têm uma maior
tendência a metástases regionais e à distância, recorrências locais, regionais e em
áreas distantes (Lengyel et al., 2003). Os locais mais comuns de metástases são os
linfonodos, fígado e pulmão e acometimento generalizado nas fases avançadas da
doença (Garzino-Demo et al., 2004). Ainda, diferentemente dos melanomas cutâneos,
os melanomas mucosos exibem uma fase de crescimento vertical agressiva com rápido
acometimento da submucosa e pior prognóstico. Em geral são detectados já em fase
13
avançada e a maioria não apresenta fase radial de crescimento associada (crescimento
superficial).
Em 1995 foi proposta uma classificação histológica específica para essas lesões
primárias da cavidade oral na reunião anual da "Western Society of Teachers of Oral
Pathology" que compreende na divisão das lesões em melanoma in situ, melanoma
invasivo, melanomas combinados – in situ e invasivos, e proliferação melanocítica
atípica que inclui qualquer lesão que apresente histopatologia atípica como núcleos
hipercromáticos e angulados e atividade mitótica (Barker et al., 1997).
Parâmetros histopatológicos para avaliação da espessura dos melanomas
cutâneos são, como regra, empregados na análise dos espécimes e têm valor preditivo
da doença. Duas medidas fazem parte dos protocolos dos laudos dessas lesões –
medidas de Clark que analisam a profundidade da invasão tumoral, baseando-se nas
estruturas anatômicas da pele e Breslow que mede numericamente a espessura
tumoral a partir da superfície da pele. A análise desses parâmetros é recomendável
nos melanomas mucosos, segundo a reunião de WESTOP, 1995, entretanto essa
análise é difícil e nem sempre possível devido às características anatômicas regionais,
tamanho das lesões e das biopsias e principalmente à detecção tardia das lesões que
por ocasião de seu diagnóstico já se encontram em fases avançadas (Barker et al.,
1997).
Em 2004, Prasad et al., em análise histopatológica de uma casuística de
melanomas da cabeça e pescoço, propõe os seguintes critérios de estadiamento:
14
Nível I: melanoma in situ: sem evidência de invasão ou com apenas micro-
invasão (definido como invasão individual ou pequenos ninhos com menos de 10
melanócitos atípicos próximos à junção epitélio/ lamina própria);
Nível II: invasão limitada à lâmina própria;
Nível III: invasão de planos profundos (músculo, osso, cartilagem, tecido
adiposo).
Esta divisão de níveis representa os micro-compartimentos separados por
barreiras teciduais que são facilmente identificadas sob análise de microscopia óptica.
A progressão dos níveis microscópicos associa-se a piora clínica do quadro e sugere
maior agressividade do tumor, podendo ser importante marcador do prognóstico.
Diagnósticos histopatológicos diferenciais dos melanomas incluem carcinoma
epidermóide pouco diferenciado e linfomas. Análise imunoistoquímica para a detecção
de proteínas específicas dos melanócitos é importante na diferenciação dessas
possibilidades, sendo os melanomas positivos para S-100, vimentina, HMB-45, Melan-
A e tirosinase.
O prognóstico dos doentes com melanomas orais é sombrio com 5 anos de
sobrevida estimados em 5 a 20% dos doentes. A média de sobrevida para os
melanomas orais é em torno de 2 anos a partir do diagnóstico (Chidzonga et al., 2007).
Isto depende se há envolvimento de linfonodo (18 meses) ou não (46 meses) (Rapidis
et al.,2003). O fator mais significativo para o prognóstico parece ser o estadio clínico,
definido como: tumores localizados (Estadio I, TqualquerN0M0), tumores com metástase
15
em linfonodo regional (Estadio II, TqualquerN1M0), e tumores com metástases em locais
distantes (Estadio III, TqualquerNqualquerM1) (Prasad et al., 2004). Em geral, fatores
prognósticos para uma pior sobrevida incluem localização do tumor primário, estágio
no momento do diagnóstico, espessura tumoral maior que 5mm, presença ou ausência
de invasão vascular, e desenvolvimento de metástases em linfonodos ou à distância
(Garzino-Demo et al., 2004; Patel et al., 2002; Gu et al., 2003; Mendenhall et al., 2005).
Entretanto, recentemente tem sido mostrado que a espessura tumoral, invasão
vascular e necrose não têm influência significante na sobrevida (Prasad et al., 2004).
Maior espessura do tumor, nível e fase de crescimento vertical do tumor têm sido
associadas a um pior prognóstico (Garzino-Demo et al., 2004; Chidzonga et al., 2007).
3.2.3 ETIOLOGIA DO MELANOMA PRIMÁRIO DA MUCOSA ORAL
A etnia e exposição ao sol parecem ter grande influência no desenvolvimento
do melanoma cutâneo. A luz ultravioleta-B é considerado o fator mais importante
durante a exposição solar. Melanoma da mucosa, por outro lado, não tem associação
com exposição solar. Tabagismo, alcoolismo e irritação dentária são alguns fatores de
risco, mas a correlação é infundada e os fatores de riscos permanecem obscuros
(Chudnovsky et al., 2005; Femiano et al., 2008; Aguas et al., 2009).
Em contraste com os fatores etiológicos bem estabelecidos na participação da
evolução do melanoma da pele, tais fatores que não são levados em consideração
16
(exposição solar, fraca tendência em bronzear) ou aqueles ainda não foram estudados
extensivamente (história familiar, síndromes, defeitos citogenéticos) com melanoma
das mucosas da cavidade oral e região da cabeça e pescoço. Provavelmente a maior
razão para carência de conhecimento sobre melanoma de mucosa é a raridade dessa
malignidade (Hicks e Flaitz, 2000).
Embora existam informações na literatura sobre dados clínicos,
epidemiológicos e tentativas de classificação histopatológica dos melanomas da
mucosa, essas são escassas e, na sua grande maioria baseadas em relatos de casos.
Com relação aos mecanismos subcelulares que participam da biologia do melanoma da
mucosa oral, estes são quase que completamente desconhecidos, a despeitos dos
melanomas cutâneos, onde já se conhecem diversos mecanismos moleculares
alterados no tumor. Entre esses mecanismos, destaca-se a via da MAPK (“mitogen
activated protein kinase”), que está envolvida nos processos de crescimento,
sobrevivência e migração celular.
3.3 GENÉTICA MOLECULAR DO MELANOMA PRIMÁRIO DA MUCOSA ORAL
Nos dias atuais, as pesquisas mostram forte evidência do conceito de que o
melanoma tem correlação com eventos genéticos. Essa posição tem sido reforçada
pela identificação "hot spots" genômicos (e seus genes residentes) cuja alteração
estrutural se correlaciona com a gênese e/ou progressão do melanoma (Chin et al.,
17
2006). A força motriz por trás da iniciação e progressão do desenvolvimento do
melanoma é a aquisição de mutações somáticas nos genes reguladores de importantes
mecanismos de proliferação e senescência celular (Dahl e Guldberg, 2007).
Por mais de 20 anos, um grande número de laboratórios pelo mundo todo têm
participado na busca de genes relacionados ao desenvolvimento do melanoma,
reforçando a participação de eventos genéticos na fisiopatologia do tumor (mutação
de gene, deleção, amplificação ou translocação) e de epigenética (alteração
transmissível não sendo na sequência do DNA, geralmente modulação transcricional
pela metilação do DNA e/ou alteração da cromatina, como modificação da histona)
(Dahl e Guldberg, 2007; Palmieri et al., 2009).
Neste sentido, diversos estudos conduzidos ao longo de várias décadas em
espécimes de lesões melanocíticas benignas e malignas bem como em linhagens de
células de melanoma tem implicado numerosos genes no desenvolvimento e
progressão da doença (Chin et al., 2006). Estes fatores incluem iniciação do tumor
(mutações, perda de heterozigosidade, amplificação do gene, ganho ou perda de
cromossomos), crescimento (perda do controle do ciclo celular, fatores de
crescimento, neovascularização, resistência a apoptose (inativação das vias de morte
celular, ganho de fatores antiapoptóticos e de sobrevivência), invasão e metástase
(mobilidade celular, adesão celular, enzimas proteolíticas), e escapar da vigilância
imunológica (perda ou ganho de reguladores imunológicos). Todos estes fatores
distinguem melanócitos neoplásicos dos melanócitos normais (Carlson et al., 2005).
18
Segundo Palmieri et al. (2009), várias vias moleculares tem sido envolvidas na
alteração clonal primária dos melanócitos, incluindo aquelas que induzem a
proliferação celular (via proliferativa) ou a superação da senescência celular (via de
senescência).
Dentre estas vias, destaca-se a via proliferativa a via do MAPK (“mitogen
activated protein kinase”) (incluindo a cascata de proteínas do NRAS, BRAF, MEK1/2 e
ERK1/2), a principal cascata de sinalização envolvida no controle do crescimento
celular, proliferação e migração, tem sido reportada a desempenhar um papel
importante em ambos desenvolvimento e progressão do melanoma (o aumento da
atividade das proteínas ERK1/2, que tem sido encontrados ativados constitutivamente
em melanoma, principalmente como consequência de mutações dos componentes
"upstream" da via) e parece ser implicado no crescimento celular do melanoma rápido,
reforço na sobrevivência da célula e resistência a apoptose.
3.3.1 VIA DA SINALIZAÇÃO DA MAPK (“mitogen activated protein kinase”)
Em condições fisiológicas a via de sinalização MAPK regula o crescimento
celular, sobrevivência e migração através de transdução de sinais proliferativos
gerados pelos receptores da superfície celular e componentes de sinalização
citoplasmática para dentro do núcleo através de eventos de fosforilação (Fecher et al.,
2008; Halilovic e Solic, 2008; Smalley, 2010). A desregulação desta via através da
19
ativação constitutiva é um evento frequente em neoplasias humanas (Fecher et al.,
2008).
A sinalização da MAPK inicia-se pelos sinais extracelulares que se ligam nos
receptores de tirosina quinases (RTK) e subseqüente ativação do RAS, uma GTPase
ligada à membrana (Fecher et al., 2008; Smalley, 2010). O RAS ativa a proteína RAF,
uma serina/treonina proteína quinase, que fosforilam e ativam as MEK1 e MEK2 (MAP
quinase - quinases reguladas por sinais extracelulares), que por sua vez fosforilam e
ativam ERK1 e ERK2 (quinases reguladas por sinais extracelulares). O ERK ativado
regula expressão gênica pela fosforilação de inúmeros fatores de transcrição nuclear
ou indiretamente atingindo moléculas sinalizadoras intracelulares (Fecher et al., 2008;
Omholt et al., 2008; Smalley, 2010). Esta via é importante em diversos processos
celulares cruciais, como proliferação e diferenciação (Saldanha et al., 2006; Smalley,
2010) (Figura 1).
20
FIGURA 1: Representação esquemática da via de sinalização da MAPK
21
3.3.2 Família RAS
Historicamente, o homólogo do vírus RAS (rat sarcoma) foi o primeiro
oncogene descrito em câncer humano (Jarell et al., 2007). As proteínas RAS são
pequenas proteínas-G (21 quilodaltons) - ativas com GTP ligado e inativas com GDP
ligado. Embora o GTP possa se hidrolisar, existe uma classe de enzimas denominadas
GAPs (proteínas ativadoras de GTPase) que facilita essa hidrólise e atividade RAS
terminado (Jarell et al., 2007; Ghosh e Chin, 2009).
Os genes RAS são os genes mais frequentemente mutados em neoplasias
humanas, porém diferentes neoplasias mostram frequências e espectro de mutações
diferentes em NRAS, HRAS e KRAS, membros da superfamília RAS (Haluska et al.,
2006; Jarell et al., 2007).
O primeiro gene encontrado especificamente alterado em melanomas cutâneos
foi o NRAS (homólogo do oncogene viral RAS do neuroblastoma), cuja mutação ocorre
em 15 a 25% das linhagens celulares de melanoma e tumores primários (Dahl e
Guldberg, 2007). Foram encontradas mutações em NRAS em 56% nevo congênito, 33%
de tumores primários e 26% dos tumores metastáticos (Chin et al., 2006; Ghosh e Chin,
2009). No estudo de van't Veer et al. (1989), mutação de NRAS foi detectada em 20%
dos melanomas primários, maior parte das lesões com mutação RAS forem em sítios
expostos ao sol, sugerindo que a irradiação ultravioleta causou a mutação.
22
As mutações no RAS são comuns em cânceres de cólon e pancreático, bem
como em outras neoplasias humanas, mas estão presentes em 15% dos melanomas,
sendo o NRAS a isoforma mais comumente mutada em melanoma, com incidência
relacionada ao subtipo histológico e sítios primários. Semelhante à incidência dos
melanomas cutâneos, as mutações de NRAS estão presentes em apenas 14% de
melanomas não-cutâneos (incluindo cérebro, uveal) (Fecher et al., 2008). Segundo a
literatura, mutações do NRAS são raros em nevos displásicos, ativação do HRAS é
comumente associado ao nevo Spitz, enquanto que mutações do KRAS não tem sido
descrito em lesões melanocíticas humanas (Chin et al., 2006; Ghosh e Chin, 2009).
Melanomas humanos carregam mutações quase exclusivamente no NRAS,
aproximadamente, 80-90% delas localizadas no códon 61, sendo HRAS e KRAS menos
mutados (Edlundh-Rose et al., 2006; Haluska et al., 2006; Dahl e Guldberg, 2007; Jarell
et al., 2007; Jovanovic et al., 2008).
3.3.3 Família RAF
A família RAF de proteínas quinases serina/treonina consiste de três membros:
ARAF; BRAF; CRAF, os quais diferem em suas distribuições no tecido e os quais tem
sobreposição bem como funções reguladoras únicas (Houben et al., 2004; Dahl e
Guldberg, 2007; Dhomen e Marais, 2007; Jarell et al., 2007; Palmieri et al., 2007;
Fecher et. al., 2008; Ghosh e Chin, 2009). As moléculas de sinalização da quinase RAF
23
tem sido envolvida em uma variedade de processos celulares, como crescimento,
proliferação, sobrevivência, diferenciação e transformação (Jarell et al., 2007).
Desde a descoberta através do programa de sequenciamento amplo do
genoma do câncer (exemplo: Sanger Institute's Cancer Genome Project), mutações do
BRAF foram encontradas em uma variedade de tumores com a maior incidência em
melanoma (variando de 27 a 70%), seguido pelo carcinoma papilífero da tireóide,
carcinomas do cólon e de ovário (Chin et al., 2006; Dahl e Guldberg, 2007; Jarell et al.,
2007). Segundo Haluska et al., 2006, a mais importante mutação já descoberta em
melanomas ocorre no BRAF. As mutações em ARAF e CRAF são raras ou nunca
encontradas em cânceres humanos. O gene BRAF pode ser ativado pela substituição
de um único aminoácido, muito mais frequentemente mutado em câncer humano
(aproximadamente 7% de todos os tipos) (Palmieri et al., 2007).
Enquanto as mutações em BRAF são notadas em mais de 80% dos casos de
melanoma cutâneo primário, ele também está mutado na maioria dos casos de nevo
melanocítico benigno e displásico, sugerindo que ele representa um dos primeiros
eventos na neoplasia melanocítica (Goel et al., 2006; Dahl e Guldberg, 2007; Palmieri
et al., 2007; Ghosh e Chin, 2009). Esses nevos muitas vezes permanecem em
crescimento vida interrompida e raramente progride para melanoma. Isso sugere que
BRAFV600E promove um ponto de checagem para transformação maligna (Ghosh e Chin,
2009).
24
Especificamente, as mutações BRAF são comuns em melanomas cutâneos
decorrentes à exposição solar intermitente (59%), como tronco e braços, comparados
com somente 23% de melanomas acrais e 11% de melanomas das mucosas, porém
ausente em melanoma uveal (Chin et al., 2006).
A mutação mais comum em BRAF, a qual contabiliza mais de 90% dos casos de
câncer envolvendo este gene, é a substituição de acido glutâmico para valina na
posição 600 (V600E), classicamente não está associada à danos induzidos por UV
(Turner et al., 2005; Chin et al., 2006; Thomas, 2006; Dahl e Guldberg, 2007; Dhomen e
Marais, 2007; Palmieri et al., 2007; Halilovic e Solit, 2008; Jovanovic et al., 2008; Ghosh
e Chin, 2009; Smalley, 2010 ).
3.3.3 Família ERK
ERKs (quinase regulada por sinal extracelular) foram originalmente clonadas
por Melanie Cobb e colaboradores em 1991, através de estratégias bioquímicas
tradicionais. Elas compreendem uma família de proteínas quinases de 42/44
quilodaltons e ativados por fosforilação (Jarell et al., 2007), o qual regula funções
celulares essenciais como proliferação, diferenciação, sobrevivência da célula e morte
celular. ERK é ativado por inúmeros agentes extracelulares como fatores de
crescimento, citocinas, hormônios e promotores de tumor (Mirmohammadsadegh et
al., 2007).
25
Em células BRAF ou NRAS tipo selvagem, a ativação do ERK é bastante baixa
comparada com células mutantes e pode controlar proteínas envolvidas na aderência
extracelular, motilidade celular e angiogênese. Nos melanomas, ERK pode inibir
regulador do ciclo celular p27kip1, pode também alterar in vitro a capacidade de
invasão pela regulação da produção de metaloproteinase-1, entretanto pode também
regular sobrevivência e senescência (Ghosh e Chin, 2009).
Em melanoma, a atividade do ERK tem sido aumentada nos estágios iniciais até
os avançados da doença. Uma hipótese atrativa é que a mutagênese de NRAS ou BRAF,
a qual ocorre anteriormente ao ERK, é primariamente responsável pela ativação do
ERK observada. Entretanto, mutação de BRAF tem sido relatada em nevos e ERK ainda
é ativada somente na minoria desses espécimes, outro mecanismo regulador deve ser
no lugar de minimizar estimulação da MAPK indesejada. Não obstante, forte evidência
apoia o argumento de que mutações do BRAF oncogênicas acontecem na
superativação de MEK/ERK, o qual mantém o fenótipo transformado em melanoma
maligno (Jarell et al., 2007).
A ativação de ERK1/2 foi observada em 54% de melanomas primários por
imunoistoquímica (Mirmohammadsadegh et al., 2007). Em algumas pesquisas, a
ativação de ERK tem sido reportado 54-100% dos melanomas primários, sendo que
uma pesquisa mostra que 93% dos melanomas primários com mutações do BRAF no
códon 600 tem ativado o ERK. Contudo, estudos anteriores também identificaram um
subgrupo de melanomas sem mutação em genes NRAS e BRAF, o qual foi especulado
26
que a ativação de ERK ocorre através de efetores não identificados anteriormente
(Jovanovic et al., 2008).
A literatura supracitada mostra que a via MAPK é de fundamental importância
na proliferação de melanócitos de melanomas cutâneos. Nos melanomas da mucosa
oral não há informações sobre a participação dessa via em quaisquer estágios da
doença. Com a hipótese de que essa via possa ter importantes mutações que
acarretem um pior comportamento clínico e prognóstico dos melanomas da mucosa
oral, nós propomos a investigar seus componentes e correlacionar os resultados
obtidos com os dados clínico-evolutivos dos casos de melanoma primário da mucosa
oral que foram previamente selecionados pelo nosso grupo de trabalho.
27
4. MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizados os 35 casos de melanomas orais pertencentes aos arquivos da
Disciplina de Patologia Geral da Faculdade de Odontologia da Universidade de São
Paulo, do Departamento de Dermatologia da Faculdade e Medicina da Universidade de
São Paulo e do Departamento de Anatomia Patológica do Hospital do Câncer,
Fundação Antonio Prudente, São Paulo, já organizados em forma de matriz (“tissue
microarray” - TMA).
Dados dos pacientes relevantes para o estudo foram analisados quando
presentes nos prontuários: idade, sexo, raça, localização da lesão, e, quando possível,
modalidade de tratamento e evolução.
Cortes histológicos dos tumores corados pela técnica da hematoxilina e eosina
(H/E) foram analisadas para o estudo morfológico dos padrões arquiteturais e
celulares dos casos incluídos no estudo. Todos os casos encontrados no arquivo foram
incluídos no estudo, independente de seus padrões morfológicos ou
extensão/profundidade, devido à raridade da lesão e a existência de poucos casos
disponíveis para o estudo.
28
ESQUEMA: ESTUDO DA VIA DE SINALIZAÇÃO MAPK NOS MELANOMAS PRIMÁRIOS DA MUCOSA ORAL
29
4.1. Etapa in situ de estudo da via MAPK em melanomas primários da mucosa oral
4.1.1 ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA DOS TMAs DE MELANOMAS ORAIS
Cortes seriados de 4m dos espécimes selecionados foram utilizados para a
análise imunoistoquímica.
As reações imunoistoquímicas foram realizadas por meio da técnica da fosfatase
alcalina, cujo protocolo é descrito a seguir:
Os cortes de 4m foram desparafinados em dois banhos de xilol: o primeiro a
60oC por 30 minutos e o segundo à temperatura ambiente por 20 minutos. A seguir os
cortes foram re-hidratados em cadeia descendente de etanol (100%, 95%, 85%,
respectivamente) e imersos em solução de hidróxido de amônia a 10% durante 10
minutos para a remoção de pigmentos formólicos.
Na recuperação dos epítopos antigênicos foi utilizada tampão de ácido cítrico
pH 6,0 aquecido em panela de pressão durante 25 minutos (Tabela 1).
Repetida a lavagem com água corrente e água destilada, os cortes foram
imersos duas vezes em solução de TRIS pH 7,4, por dois minutos cada. Em seguida, os
cortes foram incubados com solução de 1% BSA (Sigma), 5% SFB (Cultilab) em TRIS, pH
7,4, por 60 minutos, a fim de se bloquear reações do soro primário com proteínas não-
específicas teciduais.
30
Em seguida, os cortes foram incubados com o soro primário diluído em solução
de 1% BSA (Sigma) em TRIS pH 7,4. Informações sobre os anticorpos e etapas
específicas do protocolo são descritas na Quadro 1. A incubação com todos os soros
primários foi realizada “overnight”.
Os procedimentos posteriores foram sempre precedidos de duas lavagens em
solução de Tween 20 a 1% em TRIS pH 7,4, durante 5 minutos cada.
Após a incubação com o soro primário, os espécimes foram incubados com os dois
reagentes En Vision fosfatase alcalina (Dako Cytomation) por 30 minutos cada
reagente.
Para a reação de revelação, os espécimes foram incubados com o revelador
permanente “Permanent Red” (Dako Cytomation), por 3 a 10 minutos, que evidencia a
reação por meio de coloração vermelha.
Os cortes foram então lavados em tampão TRIS pH 7,4; água corrente e água
destilada e contra-corados com hematoxilina de Carazzi por 5 minutos.
Posteriormente, os cortes foram desidratados em cadeia ascendente de etanóis,
diafanizados em três banhos de xilol, e montados em resina Entellan para o exame ao
microscópio de luz.
Controles negativos das reações supracitadas foram realizados por meio da
incubação de espécimes com soro não-imune, que substituiu o anticorpo primário.
Controles positivos pertinentes foram incluídos de acordo com as especificações de
cada anticorpo (Quadro 3).
31
As reações foram analisadas em microscópio óptico e os dados estudados de
forma qualitativa e semi-quantitativa por dois pesquisadores.
Os dados foram fotografados com equipamento fotográfico digital acoplado a
microscópio óptico convencional.
Quadro 3: ANTICORPOS PRIMÁRIOS, PROCEDÊNCIA, TITULO E DETALHES DO PROTOCOLO
SORO PRIMÁRIO
PROCEDÊNCIA E CLONE
TÍTULO CONTROLE POSITIVO
RECUPERAÇÃO ANTIGÊNICA
RAS
Abcam F132-62
1:10 Pele
normal Ácido cítrico/
Panela de Pressão
BRAF
Abcam 1H12
1:500 Pele
normal Ácido cítrico/
Panela de Pressão
MEK1
Abcam E342
1:100 Pele
normal Ácido cítrico/
Panela de Pressão
MEK2
Abcam Y78
1:150 Pele
normal Ácido cítrico/
Panela de Pressão
ERK1
Abcam ab57444
1:300 Pele
normal Ácido cítrico/
Panela de Pressão
ERK2
Abcam 5E8E1
1:500 Pele
normal Ácido cítrico/
Panela de Pressão
32
4.2. Etapa de estudo molecular da via MAPK em melanomas primários da mucosa
oral (Análise molecular de melanomas orais pelo pirosequenciamento)
4.2.1. Extração de DNA
As amostras de melanomas da mucosa oral incluídas em blocos de parafina
foram cortadas em micrótomo para a confecção 6 ou mais lâminas histológicas, com
espessura de 5m. Uma lâmina foi preparada através da técnica histoquímica
Hematoxilina e Eosina (HE) e analisada por um patologista que delimitou a região do
tumor a ser microdissecada. O restante das lâminas foi utilizado para a microdissecção,
através da raspagem (scrape) do tecido, obtenção de material desparafinado contendo
células tumorais para a extração do seu DNA.
As lâminas selecionadas foram desparafinadas da seguinte maneira: as lâminas
contendo o tecido foram submetidas ao aquecimento em estufa a 60oC por 30
minutos, posteriormente com dois banhos de xilol à temperatura ambiente de 5
minutos cada, seguida de dois banhos em álcool absoluto à temperatura ambiente de
2 minutos cada. Todo material já com a parafina removida ficou secando em
temperatura ambiente durante 5 minutos. O tecido contendo as células tumorais foi
raspado das lâminas com um bisturi estéril e todo material raspado foi acondicionado
em microtubo de 1,5 ml. Após realizado esta etapa, o tubo foi centrifugado, para que o
material raspado se concentrasse no fundo dos tubo.
33
Todo o material a ser extraído contido no microtubo foi submetido à etapa de
digestão enzimática: incubação com 20 l de Proteinase K e 90 l de tampão ATL,
ambos oriundos do QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA), em um agitador de
tubos a 57oC e 450 rpm durante 12 horas.
Após a etapa da digestão enzimática, foi iniciada a etapa de extração do DNA
com a neutralização do conteúdo dos tubos, adicionando neles 200 l de tampão AL e
1 l de RNA carrier (substância que separa o RNA do DNA), ambos providos do QIAamp
DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Em seguida, foram adicionados 200 l de etanol
absoluto e incubados a temperatura ambiente durante 5 minutos, antes de prosseguir
para próxima etapa.
A etapa seguinte consiste na separação do DNA genômico. Após a incubação
descrita anteriormente, todo conteúdo do microtubo foi transferido para coluna de
filtragem acoplada a tubos de coleta e centrifugado a 8000 rpm por 1 minuto.
Transfere-se a coluna para um tubo coletor novo, e foi adicionado 500 l de tampão
AW1, seguido de centrifugação a 8000 rpm por 1 minuto. Após este procedimento,
transfere-se a coluna para novo tudo coletor, e será adicionado 500 l de tampão AW2
e novamente centrifugado a 8000 rpm por 1 minuto. Todo material utilizado nesta
etapa, também foram fornecidos no QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA).
Para uma melhor eficiência, a coluna foi transferida para um tubo coletor novo,
foi adicionado 500 l de álcool a 70% e centrifugação a 8000 rpm por 1 minuto. Para
34
secar o conteúdo, descarta-se o álcool contido no tubo coletor, e centrifugou-se as
colunas a 14.000 rpm por 3 minutos.
Para finalizar, a obtenção do material genômico, transfere-se a coluna de
filtragem para microtubo de 1,5 l, adicionou-se 50 l de água Milliq autoclavada no
centro da membrana da coluna, incuba-se em temperatura ambiente por 1 minuto e
centrifuga-se a coluna posicionada no microtubo em 14.000 rpm por 1 minuto e meio.
4.2.2 Quantificação de DNA
O DNA extraído foi quantificado no Nanodrop (Nanodrop 1000 – Thermo
Scientific) em comprimento de onda 260/280, enquanto a qualidade e integridade do
DNA, foi analisado por eletroforese em gel de agarose a 1% e corados com Sybr Safer
(Invitrogen, Carlsbad, CA).
4.2.3 Amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR)
Para a confirmação da qualidade e integridade do material extraído, foi
realizada a amplificação por reação de PCR utilizando um gene constitutivo -actina, já
padronizada e analisado por eletroforese em gel de agarose a 2% e corados com Sybr
Safer (Invitrogen, Carlsbad, CA) para confirmar o sucesso da amplificação.
A região do exon 15 do gene BRAF, incluindo o sítio de mutação no códon 600;
35
região dos códons 12 e 13 do gene NRAS e a região dos códons 12 e 13 do gene KRAS
foram amplificados separadamente por PCR, utilizando-se iniciadores (primers)
PyroMark Q96 BRAF (96); NRAS Pyro Kit (24) e PyroMark Q96 KRAS (96) (QIAGEN,
Valencia, CA). Os primers anti-senso (reverse) eram biotinilados para facilitar o
isolamento da molécula simples fita de DNA para a reação de pirosequenciamento.
Cada reação de PCR continha 10 ng de DNA genômico, 10 pmol de cada primer, 1X
tampão de PCR, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada deoxinucleotídeo trifosfatado
(DNTP), 1,25 U de Taq Platinun (Invitrogen, Carlsbad, CA) em volume final de 50 µl. A
amplificação foi realizada com o seguinte ciclo: 95oC por 15 minutos para a
denaturação, 45 ciclos de 95°C por 20 segundos, 58°C por 20 segundos, 72oC por 20
segundos e extensão final de 72°C por 5 minutos. A PCR foi realizada em termociclador
PCR Eppendorf Mastercycler Gradient (Brinkman Instruments, Westbury, NY).
O produto amplificado por PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose
2% e corados com Sybr Safer (Invitrogen, Carlsbad, CA) para confirmar o sucesso da
amplificação.
4.2.4 Pirosequenciamento
A análise de mutação dos genes BRAF, NRAS e KRAS pode ser realizada por
várias metodologias, mas o pirosequenciamento tem sido considerado uma das
técnicas mais sensíveis e rápidas para esta finalidade. O pirosequenciamento é uma
abordagem baseada no monitoramento em tempo real da síntese do DNA. A reação de
36
pirosequenciamento é catalisada por 4 enzimas: DNA polimerase, ATP sulfurilase,
luciferase e apirase. Após o anelamento do iniciador, a cada nucleotídeo incorporado,
pela atividade da DNA polimerase, ocorre a liberação de fosfato inorgânico (PPi),
substrato da ATP sulfurilase para a produção de ATP. Este por sua vez reage com a
luciferase produzindo luz, cuja intensidade é proporcional à quantidade nucleotídeos
incorporados. A apirase degrada os nucleotídeos não incorporados e o excesso de ATP.
A preparação do DNA fita simples para o Pirosequenciamento foi realizada
usando o PSQ Vaccuun Prep Tool (Biotage, Uppsala, Sweden) de acordo com as
instruções do fabricante. 25 µl do produto de PCR foi imobilizado utilizando-se esferas
de agarose marcadas com estreptoavidina (Streptavidin Sepharose High Performace,
GE Healthcare, Piscataway, NJ). Em uma placa de 96 poços (Millipore, Bedford, MA)
foram transferidos 25 µl do produto amplificado por PCR e adiconado 55 µl da mistura
de beads de sefarose (3 µl de beads de sefarose, 40 µl de tampão de ligação e 15 µl de
água deionizada) em cada poço. A placa foi agitada por 15 minutos a 1350 rpm e em
seguida foi levada à bomba de vácuo (Vaccuun Prep Toll), onde o produto de PCR
ligado a beads foi precipitado com álcool 70%, desnaturado em tampão de
desnaturação e lavado em tampão de lavagem (Biotage, Uppsala, Sweden)
Em seguida os produtos purificados foram incubados com 0,4 µmol/L de
primers de sequenciamento dos genes BRAF, NRAS e KRAS, previamente diluídos em
38.6 µl de tampão de anelamento, a 80ºC por 2 minutos em placa de sequenciamento
(PSQ 96 plate), 5 minutos na placa aquecedora e 5 minutos a temperatura ambiente.
37
Os produtos purificados ligado ao primers de seqüência foram transferidos a
base do PSQ HS 96 A Pyrosequencer (Biotage, Uppsala, Sweden), onde o
sequenciamento em tempo real do códon 600 do gene BRAF, dos códons 12 e 13 do
gene NRAS e dos códons 12 e 13 do gene KRAS foi realizado usando PyroGold reagents
(Biotage, Uppsala, Sweden). A enzima, o substrato e os nucleotídeos A,T,C e G, foram
dispensados um de cada vez em cada poço, na ordem determinada pelo aparelho.
Após ser dispensado o nucleotídeo foi incorporado à fita simples de DNA e liberou um
Pi (pirofosfato), este Pi se ligará ao ADP, formando ATP, que por sua vez ao ser
degradado pela luciferina liberou um pico de luz que foi capturado pelo aparelho e
convertido em pico no pirograma (gráfico), o sinal fluorescente foi gerado
proporcionalmente a quantidade de nucleotídeo incorporado, os nucleotídeos não
incorporados foram degradados para depois ser dispensado o próximo nucleotídeo.
A reação de síntese por sequenciamento da fita complementar foi realizada
automaticamente pelo instrumento PyroMark MD (Qiagen) em temperatura ambiente
usando reagentes PyroGold (Qiagen). O sinal emitido durante a incorporação de cada
nucleotídeo foi detectado por uma câmera CCD e convertido em picos para formar um
pirograma.
38
4.2.5 Análise dos dados obtidos pelo pirosequenciamento:
(1) Análise da mutação do gene BRAF, códon 600 foi realizada por meio de
métodos de bioinformática através do programa PSQ 96MA SNP/Pyromark
ID. Foi utilizado como controle positivo das reações o DNA extraído de
linhagem de células WIDr, mutante para BRAF V600E e selvagem para KRAS.
(2) Análise da mutação do gene NRAS, códons 12 e 13 foi realizada por meio de
métodos de bioinformática através do programa PyromarkTM Software. Foi
utilizado como controle positivo das reações DNA não metilado fornecido
juntamente com o KIT comercial NRAS Pyro Kit (24) (QIAGEN, Valencia, CA).
(3) Análise de mutação do gene KRAS, códons 12 e 13, foi realizada por meio
de métodos de bioinformática com utilização do programa PyromarkTM
Software. Foi utilizado como controle positivo das reações o DNA extraído
de linhagem de células LS174T mutação para KRAS códon 12 e selvagem
para BRAF e HCT116 mutação para KRAS códon 13.
39
5. RESULTADOS
5.1 RESULTADOS CLÍNICOS E HISTOPATOLÓGICOS ANALISADOS
Seleção dos tumores
Foram selecionados 35 casos de melanoma da mucosa oral. Os casos foram
provenientes dos seguintes serviços de Anatomia Patológica:
Disciplina de Patologia Geral da Faculdade de Odontologia - FOUSP
Divisão de Anatomia Patológica do Hospital das Clínicas – FMUSP
Laboratório de Dermatopatologia da Divisão de Dermatologia HC-FMUSP
Divisão de Anatomia Patológica do Hospital AC Camargo
Informações dos prontuários associadas a laudos dos exames de imagens
asseguraram que todos os melanomas incluídos eram primários da mucosa oral. As
informações de cada caso estão listadas nos Quadros 4 e 5, sumarizados nos Quadros
6 e 7, e representados nos Gráficos 1 a 4. Exemplos dos aspectos histopatológicos dos
tumores estudados estão ilustrados nas Figuras 2 e 3.
A idade dos pacientes variou entre 9 e 91 anos e a idade média encontrada foi
61 anos ao serem diagnosticados da doença. Quanto ao gênero, encontramos 18
pacientes masculinos (51,43%) e 17 femininos (48,57%) e a maior prevalência dos
melanomas para caucasianos (21 pacientes ou 75%) em relação aos não-brancos (25%)
40
(5 melanodermas e 2 xantodermas). A maior parte dos pacientes (71,42%)
apresentavam lesões no palato e o aspecto histopatológico (grau III) foi observado em
80% dos espécimes. Metástase a distância foi encontrado em 60% dos casos.
41
Quadro 4: Detalhes clínicos derivados da revisão dos prontuários de cada caso
CASO SEXO IDADE RAÇA LOCALIZAÇÃO
DO TUMOR RECORRÊNCIA
LOCAL TRATAMENTO METÁSTASE SOBREVIDA
1 F 59 BRANCA PALATO DURO,
REBORDO ALVEOLAR
PALATO DURO, REBORDO
CRIOTERAPIA LINFONODOS CERVICAIS E PULMÕES
11m
2 M 56 NEGRA REBORDO ALVEOLAR INFERIOR
NÃO RESSECÇÃO CIRÚRGICA PARÓTIDA; PULMÕES
12m
3 F 37 BRANCA BORDA LATERAL
DA LÍNGUA NÃO QUIMIOTERAPIA PULMÕES
?
4 M 51 BRANCA SULCO
VESTIBULAR SUPERIOR
NÃO QUIMIOTERAPIA PULMÕES 15m
5 M 57 BRANCA PALATO DURO,
REBORDO ALVEOLAR
PELE RESSECÇÃO CIRÚRGICA+
QUIMIOTERAPIA
LINFONODOS SUBMANDIBULARES
E PULMÕES
25m
6 F 63 ORIENTAL PALATO DURO NÃO RESSECÇÃO CIRÚRGICA+
QUIMIOTERAPIA
LINFONODOS CERVICAIS E
SUBMANDIBULARES
14m
7 F 36 BRANCA PALATO DURO,
REBORDO ALVEOLAR
PALATO RESSECÇÃO CIRÚRGICA+
QUIMIOTERAPIA LINFONODOS
CERVICAIS
22m
8 M 60 MULATO
PALATO DURO, MOLE E
ASSOALHO BUCAL
DIFUSO NA MUCOSA ORAL
RESSECÇÃO CIRÚRGICA+ RADIOTERAPIA
NI
40m
9 F 61 BRANCA PALATO DURO,
REBORDO ALVEOLAR
PALATO DURO RESSECÇÃO CIRÚRGICA LINFONODOS CERVICAIS E PULMÕES
?
10 F 59 BRANCA PALATO DURO,
REBORDO ALVEOLAR
NÃO RADIOTERAPIA+ QUIMIOTERAPIA
LINFONODOS CERVICAIS E
SUBMANDIBULARES
3m
11 M 66 BRANCA PALATO DURO,
REBORDO ALVEOLAR
NÃO RESSECÇÃO CIRÚRGICA+
QUIMIOTERAPIA
LINFONODOS CERVICAIS E
CÉREBRO
9m
12 F BRANCA LÁBIO SUPERIOR
E SULCO VESTIBULAR
REBORDO ALVEOLAR
NI NI 30m
13 M 69 BRANCA PALATO DURO,
REBORDO ALVEOLAR
NÃO RESSECÇÃO CIRÚRGICA LINFONODOS CERVICAIS E PULMÕES
?
14 F 73 BRANCA PALATO DURO,
REBORDO ALVEOLAR
NÃO RESSECÇÃO CIRÚRGICA LINFONODOS
SUBMENTONIANOS E PULMÕES
8m
15 F 87 BRANCA
PALATO DURO, REBORDO
ALVEOLAR, MUCOSA JUGAL
NÃO RESSECÇÃO CIRÚRGICA LINFONODOS
SUBMENTONIANOS E PULMÕES
49m
16 F 56 BRANCA MANDÍBULA NI NI LINFONODOS
CERVICAIS; FOSSA INFRATEMPORAL
?
42
CASO SEXO IDADE RAÇA LOCALIZAÇÃO
DO TUMOR RECORRÊNCIA
LOCAL TRATAMENTO METÁSTASE SOBREVIDA
17 M 51 BRANCA PALATO DURO NÃO RESSECÇÃO CIRÚRGICA+
QUIMIOTERAPIA LINFONODOS
CERVICAIS 27m
18 M 61 NI
SOALHO DA BOCA, MUOCSA JUGAL, BORDA
LATERAL DA LÍNGUA E
PALATO MOLE
NÃO RESSECÇÃO CIRÚRGICA LINFONODOS
CERVICAIS
?
19 M 57 NI PALATO DURO,
REBORDO ALVEOLAR
NÃO RESSECÇÃO
CIRÚRGICA+RADIOTERAPIA NÃO
72m
20 M 78 NI
PALATO DURO, REBORDO
ALVEOLAR E MUCOSA JUGAL
DIFUSO NA MUCOSA ORAL
RESSECÇÃO CIRÚRGICA+ QUIMIOTERAPIA
LINFONODOS CERVICAIS E PULMÕES
?
21 M 91 NI PALATO DURO NI NI NI ?
22 F 46 MULATO REBORDO
INFERIOR E MUCOSA LABIAL
NÃO RESSECÇÃO CIRÚRGICA NI 12m
23 F 65 BRANCA PALATO DURO, E
MUCOSA VESTIBULAR
PALATO DURO RESSECÇÃO CIRÚRGICA LINFONODOS
CERVICAIS
17m
24 M 67 ORIENTAL PALATO DURO NI NI NI ?
25 M 9 BRANCA PALATO DURO PALATO DURO NI LINFONODOS
CERVICAIS 72m
26 M 87 BRANCA TRÍGONO
RETORMOLAR E PALATO MOLE
NI NI LINFONODOS
CERVICAIS
13m
27 M 47 BRANCA PALATO DURO NI NI NI ?
28 F 51 BRANCA PALATO DURO NI NI NI ?
29 F 46 BRANCA REBORDO SUPERIOR
NI NI NI ?
30 F 49 NI NI NI NI NI ?
31 M 63 NI MUCOSA LABIAL NI NI NI ?
32 F 71 NI PALATO DURO NI NI NI ?
33 F 83 BRANCA PALATO DURO,
REBORDO ALVEOLAR
PALATO DURO CRIOTERAPIA NÃO 48m
34 M 88 BRANCA PALATO DURO NÃO CRIOTERAPIA LINFONODOS
CERVICAIS ?
35 M 78 NEGRO PALATO DURO NÃO NENHUMA NÃO vivo
43
Quadro 5: Detalhes morfológicos dos melanomas analisados
Caso Variação Tipo e aspecto celular arquitetural, melanina Invasão
vascular/ neural
Necrose Regressão Angiogênese NÍVEL
1 Células epitélioides com citoplasma claro, núcleos grandes, hipercromáticos e irregulares. Disposição
em tecas ausente
Presente/ ausente
Ausente Ausente Presente III
2 células pequenas e rabdóides com intenso
pleomorfismo, núcleos hipercromáticos. Disposição em lençol
presente Presente/
ausente presente (extensa)
Ausente Presente III
3 células Poligonais com núcleos amplos, hipercromáticos. Disposição em lençol
escassa NA presente (extensa)
NA NA NI
4 células Poligonais pequenas com núcleos
hipercromáticos amplos presente
ausente / ausente
ausente Ausente Presente II
5 Células poligonais/ epitelióides com intenso
pleomorfismo, núcleos hipercromáticos, angulados, às vezes bilobulados. Disposição em lençol
intensa Presente/ presente
presente Ausente Escassa III
6 Células nevóides, com intenso pleomorfismo, núcleos hipercromáticos, nucléolos evidentes. Disposição em
tecas presente
ausente / ausente
presente (extensa)
presente (focal)
Presente III
7 Células com intenso pleomorfismo, núcleos
hipercromáticos, formatos e tamanhos variados. Disposição em lençol e tecas
escassa Presente/ presente
presente (extensa)
Ausente Presente III
8 células poligonais, com núcleos amplos e nucléolos
proeminentes. Disposição em lençol presente
Ausente/ ausente
ausente Ausente Presente III
9 Células fusiformes/ poligonais, com núcleos
hipercromáticos, pleomórficos, por vezes multilobulados. Disposição em tecas
presente Presente/ presente
ausente não detectada Presente III
10 células poligonais com intenso pleomorfismo e núcleos hipercromáticos. Disposição em lençol
intensa Presente/ ausente
ausente Ausente Presente III
11 células poligonais, com núcleos poligonais grandes, pleomórficos, hipercromáticos, mitoses freqüentes.
Disposição em lençol intensa
Presente/ ausente
ausente Ausente Presente III
12 células epitelióides/ nevóides, com intenso
pleomorfismo, núcleos hipercromáticos, formatos e tamanhos variados. Disposição em lençol
escassa Ausente/ ausente
presente não detectada Presente III
13 células fusiformes, pleomórficas, intenso número de mitoses, núcleos de tamanhos e formatos variados,
nucléolos proeminentes. Disposição em lençol escassa
Presente/ ausente
presente Ausente Presente III
14 Células epitelióides, com intenso pleomorfismo, núcleos hipercromáticos, formatos e tamanhos
variados. Disposição em lençol Intensa
Presente/ presente
presente não detectada Presente II
15 Células epitelióides, de morfologia não avaliável
devido a intensa deposição de melanina. Disposição em tecas
Intensa Ausente/ ausente
ausente Ausente Presente (intensa)
III
16 células nevóides,com intenso pleomorfismo, núcleos
hipercromáticos berrantes e núcleos bizarros. Disposição em lençol
escassa (focal)
Presente/ ausente
ausente NA Presente III
17
células fusiformes pequenas, com intenso pleomorfismo, núcleos grandes, hipercromáticos, com formatos e tamanhos variados, numerosas
mitoses, nucléolos proeminentes. Disposição em lençol
Intensa Presente/ presente
presente (extensa)
Ausente Presente III
44
Caso Variação Tipo e aspecto celular arquitetural, melanina Invasão
vascular/ neural
necrose Regressão Angiogênese
Nível
18 Células epiteliais e fusiformes, com intenso
pleomorfismo, hipercromasia nuclear, nucléolos proeminentes, núcleos vazados. Disposição em lençol
Intensa Presente/ ausente
presente Ausente Presente III
19
Células epiteliólides com intenso pleomorfismo,mitoses frequentes, núcleos
hipercromáticos, citoplasma eosinofílico amplo e nucléolos proeminentes. Disposição em lençol e tecas
Intensa Presente/ presente
ausente Ausente Ausente III
20 Células epitelióides com intenso pleomorfismo, núcleos irregulares, hipercromasia e, por vezes,
binucleação Disposição em lençol e tecas presente
Presente/ ausente
ausente Presente Presente (intensa)
III
21
Células fusiformes, epitelióides e nevóides, com intenso pleomorfismo, presença de mitoses bizarras,
núcleos grandes, hipercromáticos, com nucléolos proeminentes. Disposição em lençol e tecas
escassa
presente (linfática e
sanguínea)/ ausente
presente Ausente Presente (intensa)
III
22 células poligonais, com núcleos pleomórficos, de
difícil visualização. Disposição em lençol intensa
Ausente/ ausente
ausente Ausente Presente (intensa)
II
23 células fusiformes e nevóides, com intenso
pleomorfismo, presença de mitoses, com núcleos hipercromáticos. Disposição em lençol
presente Presente/ presente
presente Ausente Presente (intensa)
III
24 Células fusiformes com núcleos hipercromáticos,
pleomórficos. Disposição em lençol ausente
Ausente/ ausente
ausente NA Presente III
25 células fusiformes, com núcleos pleomórficos,
vazados, com nucléolos proeminentes. Disposição em tecas
escassa Presente/ ausente
ausente Ausente Presente (discreta)
III
26 células poligonais e fusiforemes, com citoplasma
claro, núcleos amplos e pleomórficos. Disposição em tecas
escassa Ausente/ ausente
ausente Ausente Presente III
27 Células poligonais pequenas. presente Ausente/ ausente
ausente Ausente Presente III
28 células grandes e nevóides, com citoplasma cheio de
melanina, núcleos pleomórficos, poligonais, hipercromáticos. Disposição em tecas
presente Ausente/ ausente
ausente Ausente Presente II
29 células grandes e nevóides, com citoplasma cheio de
melanina, núcleos pleomórficos, poligonais, hipercromáticos, Disposição em tecas
presente Ausente/ ausente
ausente Não
detectada Presente III
30 células pleomórficas, de núcleos amplos,
multilobulados, com mitoses freqüentes. Disposição em lençol
NI NI NI NI NI III
31 células poligonais, com núcleos hipercromáticos,
intenso pleomorfismo nuclear, com mitoses freqüentes. Disposição em lençol
Presente Presente/ ausente
presente (extensa)
Ausente Presente (intensa)
III
32 Células poligonais com núcleos amplos e nucléolos
proeminentes. Disposição em lençol intensa
Ausente/ ausente
ausente Ausente Presente II
33 Células fusiformes com núcleos pleomórficos
hipercromáticos. Mitoses presentes. Disposição em lençol
intensa presente
(linfática)/ presente
ausente Ausente Presente III
34 células poligonais, com núcleo amplo e
hipercromático e mitoses freqüentes. Disposição em lençol
presente Presente/ presente
presente NA Presente III
35 Células epitelióides grandes, com núcleos
hipercromáticos e disposição em tecas presente Ausente ausente Ausente NA II
45
FIGURA 2: EXEMPLOS DOS ASPECTOS HISTOPATOLÓGICOS DE MELANOMA
ORAL
46
LEGENDA DA FIGURA 2: EXEMPLOS DOS ASPECTOS HISTOPATOLÓGICOS DE
MELANOMA ORAL
A, B e C: Aspectos gerais de espécimes de melanoma oral: em A e B, melanomas de
nível III, com invasão de toda a faixa de lâmina própria e submucosa (medidas maiores
que 3mm. Em C, melanoma nível II, superficialmente invasivo, medindo cerca de
0,35mm (hematoxilina e eosina, aumento original X40).
D e E: Proliferação de ninhos de melanócitos neoplásicos intraepiteliais (hematoxilina e
eosina, aumento original X100 e X400, respectivamente).
F: Ninhos de melanócitos neoplásicos pigmentados na lâmina própria papilar
(hematoxilina e eosina, aumento original X400).
G: Lençol de melanócitos neoplásicos ocupando toda a lâmina própria. Epitélio de
revestimento com atrofia e retificação dos cones epiteliais (hematoxilina e eosina,
aumento original X100).
H: Melanócitos neoplásicos pigmentados próximos a vasos sanguíneos neoformados
na lâmina própria (hematoxilina e eosina, aumento original X400)
I, J, K e L: Aspectos morfológicos dos melanócitos neoplásicos: células com intenso
pleomorfismo nuclear e hipercromasia (I), melanócitos neoplásicos fusiformes (J) e
melanócitos neoplásicos pequenos organizados em ninhos pouco coesos em K e L
(hematoxilina e eosina, aumento original X400).
47
FIGURA 3: EXEMPLOS DOS ASPECTOS HISTOPATOLÓGICOS DE MELANOMA ORAL
48
LEGENDA DA FIGURA 3: EXEMPLOS DOS ASPECTOS HISTOPATOLÓGICOS DE
MELANOMA ORAL
A e B: Focos de necrose de permeio aos melanócitos neoplásicos (hematoxilina e
eosina, aumento original X400).
C: Ninhos neoplásicos separado por traves fibrosas pigmentadas. Notar o intenso
pleomorfismo celular (hematoxilina e eosina, aumento original X400).
D, E e F: Invasão tumoral: destruição das glândulas salivares mucosas (D), tecido
adiposo (E) e osso (F) (hematoxilina e eosina, aumento original X100 em D e X400 E e
F).
G – L: Relação do melanoma com vasos e nervos: angiogênese em G e H; invasão
perivascular – vaso linfático (I) e vaso sanguíneo (J); êmbolo vascular (K) e invasão
perineural (L) (hematoxilina e eosina, aumento original X400).
49
Quadro 6: Resumo das informações clínicas e histopatológicas dos 35 casos de melanoma primário da mucosa oral
Variáveis valores (n) (n%)
Informações clínicas
Idade (anos)
0-20 1 2.85 21-40 2 5.71 41-60 14 40 61-80 13 37.14 >80 5 14.28
Sexo Masculino 18 51.43 Feminino 17 48.57
Etnias Caucasianos 21 75
outros 7 25
Localização das lesões
Palato/rebordo superior 25 71.42 Trígono retromolara/soalho 3 8.57
Mucosa labial 3 8.57 Mucosa jugal/ mucosa vestibular 2 5,71
Língua 1 2.86 Não informada 1 2.86
Análise histopatológica
Nível
I 1 2.94 II 5 14.71 III 28 82.35
Não informada 1 2.94
Composição celular
Monomorfa 18 51.42 polimorfa 17 48.58
Melanina ausente 1 2.86 presente 34 97.14
Necrose ausente 19 54.29 presente 16 45.71
Invasão vascular
ausente 13 37.14 Presente 20 60.61
Não informada 2 2.24
Invasão perineural
Ausente 26 74.29 Presente 9 25.71
50
Quadro 7: Relação entre recorrências e parâmetros histológicos dos melanomas estudados
Variáveis Recorrência Valor p
Não (n%) Sim (n%)
Nível I 1 (33.33%) 0 0.142 II 0 2 (10%) III 2 (66.67%) 18 (90%)
Tipo celular Monomorfo 2 (66.67%) 8 (38.1%) 0.550 polimorfo 1 (33.33%) 13 (61.9%)
Melanina Ausente 1 (33.33%) 1 (4.76%) 0.239 Presente 2 (66.67%) 20 (95.24%)
Necrose Ausente 3 (100%) 10 (50%) 0.229 Presente 0 10 (50%)
Invasão vascular Ausente 1 (33.33%) 4 (20%) 0.539 Presente 2 (66.67%) 16 (80%)
Invasão perineural Ausente 2 (66.67%) 19 (95%) 0.249 presente 1 (33.33%) 1 (5%)
51
Gráfico 1: Distribuição do melanoma primário da mucosa oral segundo o gênero
(homens (51.43%) e (48.57%) mulheres)
Gráfico 2: Distribuição do melanoma primário da mucosa oral por raça (brancos: 75% e
não-brancos 25%)
18 17
52
Gráfico 3: Localização das lesões de melanoma primário da mucosa oral
Localização da lesão
Palato/gengiva superior
Mandíbula/gengiva inferior/assoalho
Mucosa Labial
Mucosa Jugal
Língua
Gráfico 4: Análise do nível histológico dos melanomas primários da mucosa oral
25 3
3 2 1 1
2,94%
14,71%
82,35%
53
5.2 RESULTADOS DA ANÁLISE IMUNOISTOQUÍMICA DOS TMAs DE MELANOMAS
PRIMÁRIOS DA MUCOSA ORAL
A análise semi-quantitativa da expressão proteica dos componentes da via
MAPK estudada foi realizada por dois pesquisadores, e os resultados foram
correlacionados com os aspectos clínico-histopatológico dos casos selecionados
através do teste exato de Fisher (vide Quadro 8).
A expressão das proteínas da cascata MAPK foi alterada na maioria dos casos.
RAS foi positivo para 28,57% (marcação em membrana e citoplasma) nos casos
estudados; BRAF e ERK2 foram superexpressos na maioria dos casos (82,85%
(marcação citoplasmática) e 74,28% (padrão citoplasmática e nuclear quando
presente), respectivamente); MEK2 apresentou positividade em 51,43% (padrão
citoplasmático) dos casos, enquanto ERK1 apresentaram uma expressão diminuída em
80% dos casos (predominantemente padrão citoplasmático e nuclear quando
presente). Expressão do MEK1 não foi detectada em nenhum caso. (Figura 4)
Sendo assim, a menor expressão das proteínas RAS e ERK1 e a positividade para
BRAF e ERK2 foram correlacionados com alto grau histológico, invasão vascular e
metástase a distância. Adicionalmente a expressão de MEK2 foi estatisticamente
significante ao correlacionar com a invasão vascular (p= 0,043).
54
Figura 4: Aspectos imunoistoquímicos da expressão das proteínas componentes da via
da MAPK nos melanomas primários da mucosa oral
FIGURA 4
55
LEGENDA DA FIGURA 4: ASPECTOS IMUNOISTOQUIMICOS DA EXPRESSÃO DAS
PROTEÍNAS COMPONENTES DA VIA DA MAPK NOS MELANOMAS PRIMÁRIOS DA
MUCOSA ORAL
A, B e C: Expressão imunoistoquímica da proteína RAS nos melanomas primários da
mucosa oral: presença de células isoladas positivas para RAS entre área pigmentada do
tumor (A); em B e C positividade difusa da proteína. A marcação foi localizada na
membrana celular e no citoplasma. Aumento original X 400).
D, E, e F: Expressão imunoistoquímica da proteína BRAF nos melanomas primários da
mucosa oral: melanócitos neoplásicos positivos no melanoma in situ (D) e em
melanomas francamente invasivos (E e F). A marcação foi localizada no citoplasma.
Aumento original X400.
G: Expressão da proteína MEK2 no componente in situ do melanoma primário da
mucosa oral. A marcação foi localizada no citoplasma. Aumento original X400.
H: Imunoexpressão da proteína ERK1 em áreas focais de melanoma primário da
mucosa oral nível II. A marcação foi localizada no citoplasma e no núcleo quando
presente. Aumento original X400.
I: Imunoexpressão da proteína ERK2 em células isoladas do melanoma primário da
mucosa oral. A marcação foi localizada no citoplasma e no núcleo quando presente.
Aumento original X400.
56
Quadro 8: Associação entre expressão das proteína da via MAPK e os parâmetros clínico-patológicos dos melanomas primários da mucosa oral
Casos Ras Neg (%) Pos (%) P value
BRAF Neg (%) Pos (%) P value
MEK2 Neg (%) Pos (%) P value
ERK1 Neg(%) Pos(%) P value
ERk2 Neg(%) Pos(%) P value
Gênero Feminino Masculino
17 18
11(69) 05(82) 0.909 12(71) 05(29)
03 (18) 14 (82) 1.000 04 (22) 14 (78)
10 (59) 07 (41) 0.1609 06 (35) 11 (65)
12 (75) 04 (25) 0.688 14 (82) 03 (18)
04 (27) 11 (73) 0,383 02 (12) 15 (88)
Recorrência Não Sim
14 11
10 (71) 04 (29) 0.734 06 (55) 05 (45)
03 (22) 11 (78) 0.626 01 (09) 10 (91)
06 (43) 08 (57) 0.405 04 (36) 07 (74)
13 (93) 01 (07) 1.000 06 (66) 03 (24)
01 (7) 13 (93) 0.543 02 (20) 08 (80)
Metástase Sem Com
04 21
01 (25) 03(75) 0.194 16 (76) 05 (24)
00 04 (100) 1.000 04 (19) 17 (81)
01(25) 03 (75) 0.266 9 (43) 12 (57)
03 (75) 01 1.000 18 (86) 03 (14)
00 04 (100) 1.000 03 (14) 18 (86)
Grau histológico II III
6
29
03 (60) 02 (40) 1.000 20 (71) 08 (29)
00 06 (100) 0.562 07 (24) 22 (76)
03 (50) 03 (50) 0.375 11 (41) 08 (59)
03 (60) 02 (40) 1.000 23 (82) 05 (18)
00 04 (100) 1.000 05 (18.5) 22 (81.5)
Tipo celular Monomorfico Polimorfico
15 16
08 (53) 07 (47) 0.097 13 (81) 03 (19)
04 (25) 12 (75) 0.398 02 (12) 15 (88)
10 (62.5) 06 (37.5) 0.220 14 (87.5) 02 (12,5)
10 (67) 05 (33) 0.220 14 (87.5) 02 (12.5)
03 (21) 11 (79) 1.000 03 (19) 13 (81)
Necrose Ausente Presente
20 15
11 (58) 08 (42) 0.099 11 (84) 02 (16)
03 (15) 17 (80) 1.000 04 (26) 11 (74)
10 (50) 10 (50) 1.000 06 (55) 05 (45)
13 (68) 06 (32) 0.066 13 (93) 01 (07)
03 (16) 15 (88) 0.622 05 (36) 09 (64)
Invasão vascular Ausente Presente
13 20
08 (61) 04 (39) 0.716 13 (68) 06 (32)
02 (15) 11 (85) 0.643 03 (16) 16 (84)
08 (62) 05 (38) 0.043 05 (30) 12 (70)
08 (66) 04 (36) 0.151 16 (89) 02 (11)
03 (27) 08 (73) 1.000 03 (16) 15 (84)
Invasão perineural Ausente Presente
25 08
16 (70) 07 (30) 0,353 05 (62) 03 (38)
05 (22) 18 (78) 0.156 00 08 (100)
10 (45) 12 (55) 0.235 02 (40) 06 (60)
17 (74) 06 (26) 0.145 08 (100) 00
04 (18) 18 (82) 0.622 02 (25) 06 (75)
Melanina Ausente Presente
10 12
10 (100) 0 0.010 12 (54.5) 10 (45.5)
04 (40) 06 (60) 0.157 03 (12.5) 21 (87.5)
05 (50) 05 (50) 0.730 10 (43.5) 13 (56.5)
09 (90) 01 (10) 0.393 17 (77) 05 (23)
03 (30) 07 (70) 0.296 02 (9.5) 19 (90.5)
57
5.3 RESULTADOS DA ANÁLISE MOLECULAR DE MELANOMAS PRIMÁRIOS DA
MUCOSA ORAL
Devido à raridade e escassez do material e a dificuldade da técnica de extrair
DNA íntegro de tecidos conservados em parafina, foi possível realizar o estudo da
mutação pontual dos genes BRAF, NRAS e KRAS apenas em 14 casos de melanomas
orais, através da técnica de pirosequenciamento. A análise dos dados obtidos foi
realizada por dois pesquisadores :
5.3.1 Análise da mutação do gene BRAF, códon 600 foi realizada por meio de
métodos de bioinformática através do programa PSQ 96MA SNP/Pyromark ID. O
tipo selvagem apresenta nesta região nucleotídeos T/T, porém observamos a
incorporação de A no lugar de T (T>A) em 9 casos (Quadro 9 e Figuras 5 a 19).
5.3.2 Análise da mutação do gene NRAS, códons 12 e 13 será realizada por meio de
métodos de bioinformática através do programa PyromarkTM Software. O tipo
selvagem apresenta nesta região nucleotídeos G/G nas posição 1 e G/G na posição
2. Porém foram observados incorporação de T no lugar de G (G>T) na posição 1 do
códon 12 do gene NRAS em 2 casos (Quadro 9 e Figuras 5 a 19).
5.3.3 Análise de mutação do gene KRAS, códons 12 e 13, posição 2 foi realizada por
meio de métodos de bioinformática com utilização do programa PyromarkTM
58
Software. Não foi observada nenhuma mutação neste gene em todos os casos
analisados, todos foram considerados selvagens (Quadro 9 e Figuras 5 a 19).
59
Quadro 9 : Resultados do pirosequenciamento de BRAF; NRAS e KRAS nos 14 casos analisados
Caso Sexo Localização da lesão Nível
histológico Necrose
Invasão vascular
Invasão perineural
Recorrência local
Metástase BRAF
Códon 600 NRAS
Códons 12 e 13 KRAS
Códons 12 e 13
6 F Palato duro III presente ausente ausente Não Sim Mutado Selvagem Selvagem
7 F Palato duro e rebordo
alveolar III presente presente presente Sim Sim Mutado Selvagem Selvagem
9 F Palato duro e rebordo
alveolar III ausente presente presente Sim Sim Mutado Selvagem Selvagem
12 F Lábio superior e sulco
vestibular III presente ausente ausente Sim
Não informado
Mutado Selvagem Selvagem
13 M Palato duro e rebordo
alveolar III presente presente ausente Não Sim Mutado Selvagem Selvagem
14 F Palato duro e rebordo
alveolar II presente presente presente Não Sim Selvagem Mutado Selvagem
17 M Palato duro III presente presente presente Não Sim Selvagem Mutado Selvagem
18 M Soalho, mucosa jugal, borda lateral da lingua
e palato mole III presente presente ausente Não Sim Selvagem Selvagem Selvagem
19 M Palato duro e rebordo
alveolar III ausente presente presente Não Não Mutado Selvagem Selvagem
23 F Palato duro e mucosa
vestibular III presente presente presente Sim Sim Mutado Selvagem Selvagem
25 M Palato duro III ausente presente ausente Sim Sim Mutado Selvagem Selvagem
26 M Trígono retormolar e
palato mole III ausente ausente ausente
Não informado
Sim Selvagem Selvagem Selvagem
31 M Mucosa labial III presente presente ausente Não
informado Não
informado Selvagem Selvagem Selvagem
35 M Palato duro II ausente ausente ausente Não Não Mutado Selvagem Selvagem
60
Figura 5: Pirogramas de BRAF, KRAS e NRAS do Caso 6
Pirosequenciamento BRAF
Códon 600 NRAS
Códon 12 e 13 KRAS
Códon 12 e 13
Caso 6 Mutado Selvagem Selvagem
SELVAGEM - BRAF Entry: BRAF V600E Position 1: A/A (Passed)
SELVAGEM - NRAS Entry: NRAS 12-13 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
SELVAGEM - KRAS Entry: KRAS 12/13 Position 1: G/G (Check), Position 2: G/G (Passed)
61
Figura 6: Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 7
Pirosequenciamento BRAF
Códon 600 NRAS
Códon 12 e 13 KRAS
Códon 12 e 13
Caso 7 Mutado Selvagem Selvagem
MUTADO - BRAF Entry: Braf codon 600 Position 1: A/T (Failed)
SELVAGEM - NRAS Entry: NRAS 12-13 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
SELVAGEM - KRAS Entry: KRAS codons 12 e 13 V2.0 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
62
Figura 7: Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 9
Pirosequenciamento BRAF
Códon 600 NRAS
Códon 12 e 13 KRAS
Códon 12 e 13
Caso 9 Mutado Selvagem Selvagem
MUTADO - BRAF Entry: Braf codon 600 Position 1: T/T (Check)
SELVAGEM -NRAS Entry: NRAS 12-13 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
SELVAGEM - KRAS Entry: KRAS codons 12 e 13 V2.0 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
63
Figura 8: Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 12
Pirosequenciamento BRAF
Códon 600 NRAS
Códon 12 e 13 KRAS
Códon 12 e 13
Caso 12 Mutado Selvagem Selvagem
MUTADO - BRAF Entry: Braf codon 600 Position 1: T/T (Check)
SELVAGEM - NRAS Entry: NRAS 12-13 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed) )
SELVAGEM - KRAS Entry: KRAS codons 12 e 13 V2.0 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
64
Figura 9: Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 13
Pirosequenciamento BRAF
Códon 600 NRAS
Códon 12 e 13 KRAS
Códon 12 e 13
Caso 13 Mutado Selvagem Selvagem
MUTADO - BRAF Entry: Braf codon 600 Position 1: A/T (Check)
SELVAGEM - NRAS Entry: NRAS 12-13 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
SELVAGEM - KRAS Entry: KRAS codons 12 e 13 V2.0 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
65
Figura 10: Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 14
Pirosequenciamento BRAF
Códon 600 NRAS
Códon 12 e 13 KRAS
Códon 12 e 13
Caso14 Selvagem Mutado Selvagem
SELVAGEM - BRAF Entry: Braf codon 600 Position 1: T/T (Passed)
MUTADO CODON 12 G/T 34% - NRAS
Entry: NRAS 12-13 Position 1: G/T (Failed), Position 2: G/G (Passed)
SELVAGEM - KRAS Entry: KRAS codons 12 e 13 V2.0 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
66
Figura 11: Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 17
Pirosequenciamento BRAF
Códon 600 NRAS
Códon 12 e 13 KRAS
Códon 12 e 13
Caso 17 Selvagem Mutado Selvagem
SELVAGEM - BRAF Entry: Braf codon 600 Position 1: T/T (Passed)
MUTADO CODON 12 G/T 23.8% - NRAS Entry: NRAS 12-13 Position 1: G/T (Failed), Position 2: G/G (Check) )
SELVAGEM - KRAS Entry: KRAS codons 12 e 13 V2.0 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
67
Figura 12: Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 18
Pirosequenciamento BRAF
Códon 600 NRAS
Códon 12 e 13 KRAS
Códon 12 e 13
Caso 18 Selvagem Selvagem Selvagem
SELVAGEM - BRAF Entry: Braf codon 600 Position 1: T/T (Passed)
SELVAGEM - NRAS Entry: NRAS 12-13 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
SELVAGEM - KRAS Entry: KRAS codons 12 e 13 V2.0 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
68
Figura 13: Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 19
Pirosequenciamento BRAF
Códon 600 NRAS
Códon 12 e 13 KRAS
Códon 12 e 13
Caso 19 Mutado Selvagem Selvagem
MUTADO - BRAF
Entry: Braf codon 600 Position 1: A/T (Failed)
SELVAGEM - NRAS Entry: NRAS 12-13 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
SELVAGEM - KRAS Entry: KRAS codons 12 e 13 V2.0 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
69
Figura 14: Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 23
Pirosequenciamento BRAF
Códon 600 NRAS
Códon 12 e 13 KRAS
Códon 12 e 13
Caso 23 Mutado Selvagem Selvagem
MUTADO - BRAF Entry: Braf codon 600 Position 1: A/T (Check)
SELVAGEM - NRAS Entry: NRAS 12-13 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
SELVAGEM - KRAS Entry: KRAS codons 12 e 13 V2.0 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
70
Figura 15: Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 25
Pirosequenciamento BRAF
Códon 600 NRAS
Códon 12 e 13 KRAS
Códon 12 e 13
Caso 25 Mutado Selvagem Selvagem
MUTADO - BRAF Entry: Braf codon 600 Position 1: T/T (Passed)
SELVAGEM - NRAS Entry: NRAS 12-13 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Failed)
SELVAGEM - KRAS Entry: KRAS codons 12 e 13 V2.0 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
71
Figura 16: Pirogramas de BRAF, NRAS e /LRAS do Caso 26 (98-10586-a)
Pirosequenciamento BRAF
Códon 600 NRAS
Códon 12 e 13 KRAS
Códon 12 e 13
Caso 26 Selvagem Selvagem Selvagem
SELVAGEM - BRAF Entry: Braf codon 600 Position 1: T/T (Passed)
SELVAGEM - NRAS Entry: NRAS 12-13 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
SELVAGEM - KRAS Entry: KRAS codons 12 e 13 V2.0 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
72
Figura 17: Pirograma de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 31 (23962)
Pirosequenciamento BRAF
Códon 600 NRAS
Códon 12 e 13 KRAS
Códon 12 e 13
Caso 31 Selvagem Selvagem Selvagem
SELVAGEM - BRAF Entry: Braf codon 600 Position 1: T/T (Check)
SELVAGEM - NRAS Entry: NRAS 12-13 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
SELVAGEM - KRAS Entry: KRAS codons 12 e 13 V2.0 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
73
Figura 18: Pirogramas de BRAF, NRAS e KRAS do Caso 35 (MO-01)
Pirosequenciamento BRAF
Códon 600 NRAS
Códon 12 e 13 KRAS
Códon 12 e 13
Caso 35 Mutado Selvagem Selvagem
MUTADO - BRAF
Entry: Braf codon 600 Position 1: T/T (Check)
SELVAGEM - NRAS Entry: NRAS 12-13 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
SELVAGEM - KRAS
Entry: KRAS codons 12 e 13 V2.0 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
74
Figura 19: Pirograma de BRAF, NRAS e KRAS dos controles positivos
CONTROLE - BRAF
Entry: Braf codon 600 Position 1: T/T (Passed)
CONTROLE - NRAS Entry: NRAS 12-13 Position 1: G/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
CONTROLE - KRAS
Entry: KRAS codons 12 e 13 V2.0 Position 1: A/G (Passed), Position 2: G/G (Passed)
75
6. DISCUSSÃO
A casuística desse estudo retrospectivo compreendeu 35 lesões de
melanoma primário da mucosa oral, selecionados dos arquivos da Disciplina de
Patologia Geral da Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo, do
Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo e do Departamento de Anatomia Patológica do Hospital do Câncer, Fundação
Antonio Prudente, São Paulo, já organizados em forma de matriz (tissue microarray -
TMA).
No presente estudo encontramos a idade dos pacientes variou entre 9 e 91 anos
e a idade média encontrada foi 61 anos ao serem diagnosticados da doença. O
melanoma primário da mucosa oral pode ocorrer em qualquer faixa etária sendo
muito incomum em pessoas abaixo dos 30 anos de idade, geralmente entre 30 e 90
anos, sendo a maior incidência na 6a década de vida (Lee et al., 2002; Aguas et al.,
2009; Sortino-Rachou et al., 2009).
Em relação ao gênero, encontramos 18 pacientes masculinos (51,43%) e 17
femininos (48,57%). Geralmente não ocorre predileção ao sexo, porém alguns
autores referem uma leve predileção pelo sexo feminino, outros referem ao
masculino (Aguas et al., 2009).
Segundo dados da literatura, a doença tem sido relatada com maior
frequência em asiáticos e negros; isso é atribuído parcialmente pelos comuns
achados de pigmentação melânica na mucosa oral dessas raças (Aguas et al., 2009).
Nos Estados Unidos, a proporção de melanomas de mucosa é maior (8,8%) em afro-
76
americanos e hispânicos do que na população em geral (1,3%), enquanto Japão e
Uganda revela-se uma doença relativamente frequente (Lengyel et al., 2003). A
incidência do MPMO no Japão é aproximadamente 11 - 24%, maior do que em
países ocidentais (Lee et al., 2002). Na nossa população a doença parece acometer
com maior freqüência indivíduos brancos (Lourenço et al., 2009). Observamos neste
estudo, maior prevalência dos melanomas para caucasianos (21 pacientes ou 75%)
em relação aos não-brancos (25%) (5 melanodermas e 2 xantodermas).
A maior parte dos pacientes (71,42%) apresentavam lesões no palato, de
acordo com outros estudos, os locais de maior ocorrência são o palato e a gengiva
superior (80% dos melanomas orais) (Lourenço et al., 2009). Outras localizações
incluem a gengiva inferior, mucosa jugal, língua e soalho bucal (Rapini et al., 1985;
Hicks e Flaitz, 2000; Lee et al., 2002; Lengyel et al., 2003; Rapidis et al, 2003;
Garzino-Demo et al, 2004; Aguas et al., 2009; Sortino-Rachou et al., 2009 ).
Nesta casuística aspecto histopatológico (grau III) foi encontrado em 80% dos
espécimes e metástases a distância foram relatadas em 60% dos casos. Estes dados
são compatíveis com as características descritas da lesão na literatura. Os
melanomas das mucosas da cabeça e pescoço têm comportamento supostamente
mais agressivo que os melanomas da pele (Lengyel et al., 2003). Os locais mais
comuns de metástases são os linfonodos, fígado e pulmão e acometimento
generalizado nas fases avançadas da doença (Garzino-Demo et al., 2004). Ainda,
diferentemente dos melanomas cutâneos, os melanomas mucosos exibem uma fase
de crescimento vertical agressiva com rápido acometimento da submucosa e pior
77
prognóstico. Em nossa experiência, esse tipo de comportamente se dá, em geral
pelo retardo do diagnóstico nas fases mais precoces da doença, já que em nosso
meio, os melanomas primários da mucosa oral são detectados já em fase avançada
sem a detecção da fase superficial (radial) de crescimento.
Recentemente, estudos tentaram entender a patogênese do melanoma
combinando a avaliação molecular com técnicas histológicas e epidemiológicas para
identificar fatores causais relacionados (Goel et al., 2006; Richmond-Sinclair et al.,
2008; Jovanovic et al., 2008; Buery et al., 2011). Eles forneceram evidências
convincentes que melanomas cutâneos poderiam se desenvolver através de
diferentes vias que dependem não somente a característica constitucional do
hospedeiro, assim como ambiente externo, onde ele está exposto (Richmond-
Sinclair et al., 2008).
O presente estudo teve como objetivo de elucidar os componentes da via da
MAPK, através da análise da expressão proteica dos componentes da via MAPK
estudada foi semi-quantitativa e a análise molecular dos genes BRAF; NRAS e KRAS
nos casos de melanomas primários da mucosa oral, cujos resultados foram
realizados por dois pesquisadores, e correlacionados com os aspectos clínico-
histopatológico dos casos selecionados através do teste exato de Fisher.
RAS
Os genes RAS são os genes mais frequentemente mutados em cânceres
humanos, porém diferentes neoplasias mostram frequências e espectro de
78
mutações diferentes em NRAS, HRAS e KRAS, membros da superfamília RAS
(Haluska et al., 2006; Jarell et al., 2007).
As mutações de NRAS estão presentes em apenas 14% de melanomas não-
cutâneos (incluindo cérebro, uveal) (Fecher et al., 2008). Segundo a literatura,
mutações do NRAS são raros em nevos displásicos, ativação do HRAS é comumente
associado ao nevo Spitz, enquanto que mutações do KRAS não tem sido descrito em
lesões melanocíticas humanas (Chin et al., 2006; Ghosh e Chin, 2009).
De acordo com alguns estudos mais recentes, os melanomas humanos
carregam mutações quase exclusivamente no NRAS, aproximadamente, 80-90%
delas localizadas no códon 61, sendo HRAS e KRAS menos mutados (Edlundh-Rose et
al., 2006; Haluska et al., 2006; Dahl e Guldberg, 2007; Jarell et al., 2007; Jovanovic et
al., 2008).
A expressão de RAS foi positivo para 28,57% nos casos estudados, foi
expresso tanto in situ como em melanoma da mucosa oral, com padrão semelhante
ao observado pelo Buery et al., 2011. A marcação foi localizada na membrana
celular e no citoplasma. Muitos casos apresentaram expressão negativa da proteína
RAS em lesões com metástase distante (16/21), em tumores com grau histológico II
e III (4/6 e 18/21, respectivamente) e em lesões com invasão vascular (14/20).
Foi observado mutação do códon 12 do gene NRAS em apenas dois casos
(2/14), onde ocorreu a incorporação de T no lugar de G (G>T) na posição 1,
enquanto que nenhum paciente apresentou mutação no gene KRAS em ambos os
códons. Estes resultados estão de acordo com os dados encontrados na literatura,
79
pois mutação em RAS, principalmente NRAS, é encontrada em melanomas cutâneos
e não-cutâneos, alguns autores relacionam a presença da mutação com sítios
expostos à radiação UV, porém os melanomas primários da mucosa oral são de
áreas foto-protegidas.
BRAF
Desde a descoberta através do programa de sequenciamento amplo do
genoma do câncer (exemplo: Sanger Institute's Cancer Genome Project), mutações
do BRAF foram encontradas em uma variedade de tumores com a maior incidência
em melanoma (variando de 27 a 70%), seguido pelo carcinoma papilífero da tireóide,
carcinomas do cólon e de ovário (Chin et al., 2006; Dahl e Guldberg, 2007; Jarell et
al., 2007). Segundo Haluska et al., 2006, a mais importante mutação já descoberta
em melanomas ocorre no BRAF.
As mutações em BRAF são notadas em mais de 80% dos casos de melanoma
cutâneo primário, ele também está mutado na maioria dos casos de nevo
melanocítico benigno e displásico, sugerindo que ele representa um dos primeiros
eventos na neoplasia melanocítica (Goel et al., 2006; Dahl e Guldberg, 2007;
Palmieri et al., 2007; Ghosh e Chin, 2009). Esses nevos muitas vezes permanecem
em crescimento vida interrompida e raramente progride para melanoma. Isso
sugere que BRAFV600E promove um ponto de checagem para transformação maligna
(Ghosh e Chin, 2009).
80
Especificamente, as mutações BRAF são comuns em melanomas cutâneos
decorrentes à exposição solar intermitente (59%), como tronco e braços,
comparados com somente 23% de melanomas acrais e 11% de melanomas das
mucosas, porém ausente em melanoma uveal (Chin et al., 2006).
A mutação mais comum em BRAF, a qual contabiliza mais de 90% dos casos
de câncer envolvendo este gene, é a substituição de acido glutâmico para valina na
posição 600 (V600E), classicamente não esta associada à danos induzidos por UV
(Turner et al., 2005; Chin et al., 2006; Thomas, 2006; Dahl e Guldberg, 2007;
Dhomen e Marais, 2007; Palmieri et al., 2007; Halilovic e Solit, 2008; Jovanovic et al.,
2008; Ghosh e Chin, 2009; Smalley, 2010 ).
Neste estudo a proteína BRAF foi superexpressa na maioria dos casos
(82,85%). A expressão de BRAF foi essencialmente citoplasmática e foi expressa em
todos os tumores melanocíticos com coloração de intensidade variável. BRAF pode
ser expresso na epiderme, glândulas sebáceas, fibroblastos e endotélio de forma
difusa ou tênue, mas em melanoma ele apresenta uma marcação mais difusa e
intensa (Uribe et al., 2006). A maioria dos casos deste estudo apresentou expressão
positiva de BRAF em lesões com metástase a distância (17/21), em tumores de grau
histológico II e III (6/6 e 22/27, respectivamente) e em lesões com invasão vascular
(18/20). Quanto à análise molecular, foram observados mutação no códon 600 do
gene BRAF em 9 casos (9/14), onde ocorreu a incorporação de A no lugar de T (T>A).
. A mutação de BRAF é observada em 80% dos melanomas cutâneos
primários, mas também está mutado na maioria dos nevos melanocíticos benignos,
81
e muitos deles progridem para melanoma (Goel et al., 2006). A presença de
mutação em BRAF em nevo fortemente sugere que a ativação de BRAF é necessária,
mas não suficiente para desenvolver o melanoma (Palieri et al., 2009). De acordo
com Uribe et al. (2006), a ausência da ativação da MAPK na presença de mutação de
BRAF, especialmente em nevo congênito e nevo atípico, não pode ser explicado pela
ausência da expressão de BRAF ou ERK1/2 total, mas pela existência de mecanismos
que induzem a ativação da via e/ou mecanismos inibitórios que reduzem a
expressão ou ativação da proteína BRAF ou outras proteínas associadas à ativação
das fosfatases da MAPK e inibidores de quinases RAF (Uribe et al., 2006).
Alguns estudos relatam que mutações em BRAF são as mais comuns dentre
os melanomas decorrentes de sítios onde a pele não está cronicamente exposta ao
sol. A frequência de mutações é baixa em aras anatômicas que recebem menos
exposição solar. Há uma evidência crescente que mutações em BRAF são eventos
iniciais no desenvolvimento do melanoma, e que pode surgir através da reparação
incorreta do DNA seguindo a formação de fotoproduto induzido pela radiação UV
(Moldonado et al., 2003; Richmond-Sinclair et al., 2008).
Estes resultados estão de acordo com aqueles encontrados na literatura, pois
além ocorrer a mutação de BRAF na maioria dos melanomas cutâneos,
principalmente referindo à substituição de acido glutâmico para valina na posição
600 (V600E), classicamente não esta associada à danos induzidos por UV, e o MPMO
são lesões que ocorrem numa áreas fotoprotegidas.
82
MEK
No presente estudo, MEK1 não foi expresso em todos os casos, enquanto
MEK 2 apresentou expressão com padrão citoplasmático em 51,43% dos casos,
sendo esta associada estatisticamente com invasão vascular (p= 0.043). A
sobreposição e função única das isoformas de cada nível da via de sinalização
RAS/RAF/MEK/ERK estão apenas começando a serem elucidadas. Frequentemente,
não há distinção entre as funções de MEK1 e MEK2 ou ERK1 ou ERK2, e poucos
estudos têm examinado a contribuição individual de cada isoforma para processos
biológicos. Está claro em estudos genéticos anteriores que MEK1 e MEK2 são
funcionalmente redundantes em alguns contextos (Scholl et al., 2009). Por outro
lado, de acordo com Emery et al.(2009), se a dependência de MEK observada em
melanoma BRAF-mutado está presente em outros contextos orientados por MAPK
permanece uma questão aberta. Estudos pré-clínicos sugerem que alguns
melanomas NRAS-mutado podem também exibir sensibilidade para inibição de RAF
ou MEK (Emery et al., 2009). Esta evidencia ainda não foi estudada em melanomas
de mucosas.
ERK
ERK regula funções celulares essenciais como proliferação, diferenciação,
sobrevivência da célula e morte celular. ERK é ativado por inúmeros agentes
extracelulares como fatores de crescimento, citocinas, hormônios e promotores de
tumor (Mirmohammadsadegh et al., 2007).
83
Em células BRAF ou NRAS tipo selvagem, a ativação do ERK é bastante baixa
comparada com células mutantes e pode controlar proteínas envolvidas na
aderência extracelular, motilidade celular e angiogênese. Nos melanomas, ERK pode
inibir regulador do ciclo celular p27kip1, pode também alterar in vitro a capacidade de
invasão pela regulação da produção de metaloproteinase-1, entretanto pode
também regular sobrevivência e senescência (Ghosh e Chin, 2009).
Em melanoma, a atividade do ERK tem sido aumentada nos estágios iniciais
até os avançados da doença. Uma hipótese atrativa é que a mutagênese de NRAS ou
BRAF, a qual ocorre anteriormente ao ERK, é primariamente responsável pela
ativação do ERK observada. Entretanto, mutação de BRAF tem sido relatada em
nevos e ERK ainda é ativada somente na minoria desses espécimes, outro
mecanismo regulador deve ser no lugar de minimizar estimulação da MAPK
indesejada.
Forte evidência apoia o argumento de que mutações do BRAF oncogênicas
acontecem na superativação de MEK/ERK, o qual mantém o fenótipo transformado
em melanoma maligno (Jarell et al., 2007). Mirmohammadsadegh et al. (2007),
observou a ativação de ERK1/2 em 54% de melanomas primários por
imunoistoquímica. Em algumas pesquisas, a ativação de ERK tem sido reportado 54-
100% dos melanomas primários, sendo que uma pesquisa mostra que 93% dos
melanomas primários com mutações do BRAF no códon 600 tem ativado o ERK.
Alguns autores associam a ativação de MEK/ERK com melanomas BRAF mutados
(Jovanovic et al., 2008).
84
Entretanto, estudos anteriores também identificaram um subgrupo de
melanomas sem mutação em genes NRAS e BRAF, o qual foi especulado que a
ativação de ERK ocorre através de efetores não identificados anteriormente
(Jovanovic et al., 2008).
Em nosso estudo, notamos que ERK1 apresentaram uma regulação
descendente (downregulated) (80% dos casos foram negativos). Foi observada a
expressão negativa de ERK1 em lesões com metástase distante (18/21), em tumores
de grau histológico II e III (4/5 e 21/27, respectivamente) e em lesões com invasão
vascular (18/20). Entretanto, ERK2 foi superexpresso na maioria dos casos (74,28%),
e foi observada a expressão positiva de ERK2 em lesões com metástase distante
(18/21), em tumores com grau histológico II e III (3/4 e 22/27, respectivamente) e en
kesões com invasão vascular (17/20). O padrão de imunomarcação observado foi
predominantemente citoplasmático, e nuclear em poucos casos quando estava
presente. De acordo com Houben et al. (2008), eles observaram que
aproximadamente 50% das amostras analisadas foram caracterizadas pela quase
completa ausência de fosforilação de ERK em células tumorais. Embora, em tumores
com falta de células tumorais fosfo-ERK positivas, eles detectaram células do
estroma fosfo-ERK positivas (como endotélio e macrófagos), servindo de controle
positivo interno. Notavelmente a falta de fosforilação de ERK não foi devido à baixa
expressão da proteína ERK, como coloração para ERK1/2 total em melanomas
primários e metastáticos, geralmente, demonstrava que expressão forte e
homogeneamente (Houben et al., 2008). Em outro estudo de expressão de
85
proteínas ERK1/2 por imunoistoquímica mostrou pouca marcação em nevo (5-10%
de células positivas), independente da presença de mutação de BRAF. Por outro
lado, os melanomas por eles estudados, geralmente apresentava forte expressão de
ERK 1/2 (50-70% células positivas), porém esta marcação não estava relacionada
com a presença de mutação de BRAF (Venesio et al., 2008). Além disso, a análise
multivariada apresentou a ausência de ativação citoplasmática de ERK foi marcador
de prognóstico independente desfavorável, opondo aos resultados que mostraram
sem impacto na expressão da proteína ERK em sobreviventes.
Pode-se especular que as diferentes isoformas de ERK (ERK1 e ERK2) podem
sugerir funções opostas. Recentemente, um estudo avaliou alguns modelos não-
melanoma, cuja proliferação induzida por RAS tem sido associado à expressão de
ERK2, enquanto que ERK1 tem sido proposto de desempenhar um papel de
regulador antagonista da atividade de ERK2 (Jovanovic et al., 2008).
86
7. CONCLUSÕES
1. Observamos importante expressão proteica na maioria dos casos para BRAF
e ERK2, enquanto que RAS, MEK2 e ERK1 apresentaram expressão na
minoria dos casos e MEK1 apresentou expressão negativa em todos os casos
analisados. Dessa maneira, conclui-se que existem alterações dos
componentes desta via, indicando participação deles na patogenia dos
melanomas primários da mucosa oral.
2. Os 9 casos que apresentaram mutação no códon 600 do BRAF, não
apresentaram mutação nos códons 12 e 13 de NRAS, ao mesmo tempo, os 2
casos que apresentaram mutação na posição 1 do códon 12 de NRAS, não
apresentaram mutação para BRAF, demonstrando dessa maneira que são
eventos independentes. Enquanto a ausência de mutação em ambos os
códons do gene KRAS, indica que ele não participa da patogenia dos
melanomas primários da mucosa oral.
3. BRAF e ERK2 foram correlacionados com alto grau histológico, invasão
vascular e metástase a distância. Adicionalmente a expressão de MEK2 foi
estatisticamente significante ao correlacionar com a invasão vascular (p=
0,043).
87
Todos os aspectos da via MAPK necessita de outras elucidações em
melanomas de áreas foto-protegidas e melanomas de mucosa e comparando
diferentes populações. Entretanto, os resultados deste presente estudo
apontam importante alterações na cascata RAS-RAF-MEK-ERK e estes são
indicadores de prognóstico ruim em melanomas primários da mucosa oral,
independente da exposição solar.
88
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