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CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
DOUTORADO EM SANIDADE ANIMAL
Listeria monocytogenes: OCORRÊNCIA NA CARNE
BOVINA, IDENTIFICAÇÃO DOS PRINCIPAIS PONTOS
DE CONTAMINAÇÃO EM PLANTAS DE
PROCESSAMENTO E RELAÇÃO COM A MICROBIOTA
ACOMPANHANTE.
Márcia de Aguiar Ferreira Barros
Londrina
2005
II
MÁRCIA DE AGUIAR FERREIRA BARROS
Listeria monocytogenes: OCORRÊNCIA NA CARNE
BOVINA, IDENTIFICAÇÃO DOS PRINCIPAIS PONTOS
DE CONTAMINAÇÃO EM PLANTAS DE
PROCESSAMENTO E RELAÇÃO COM A MICROBIOTA
ACOMPANHANTE.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciência Animal da Universidade Estadual de
Londrina como requisito parcial para obtenção do
título de DOUTOR.
Área de Concentração: Sanidade Animal
Orientadora: Profa. Dra. Vanerli Beloti
Londrina
UEL
2005
III
CANDIDATA:
MÁRCIA DE AGUIAR FERREIRA BARROS
TÍTULO DA TESE: Listeria monocytogenes: Ocorrência na carne bovina, identificação
dos principais pontos de contaminação em plantas de processamento e relação com
a microbiota acompanhante.
Comissão examinadora:
__________________________________________________________
Profa. Dra. Vanerli Beloti
Depto. de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Estadual de Londrina
__________________________________________________________
Dr. Ernesto Hofer
Depto. de Bacteriologia, Instituto Oswaldo Cruz
__________________________________________________________
Prof. Dr. Luís Augusto Nero
Depto. de Veterinária, Universidade Federal de Viçosa
__________________________________________________________
Prof. Dr. Ernst Eckehardt Müller
Depto. de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Estadual de Londrina
__________________________________________________________
Prof. Dr. Italmar Teodorico Navarro
Depto. de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Estadual de Londrina
Londrina, 10 de novembro de 2005.
IV
DEDICATÓRIA
AOS MEUS PAIS
(in memorium)
Aos meus amados pais, Vicente Ferreira e
Maria aparecida Nogueira Ferreira, pelo amor
incondicional que sempre me dedicaram, e que
ultrapassa qualquer tipo de distância aquecendo
o meu coração em todos os momentos.
V
AGRADECIMENTOS
Desde que iniciei meus estudos na Universidade Estadual de Londrina, tive o
privilégio de conhecer pessoas que de uma forma ou de outra, contribuíram para o meu
crescimento profissional e meu amadurecimento pessoal. E algumas dessas pessoas
talvez nem tenham noção disso porque muitas vezes, um simples sorriso, um
cumprimento, uma atenção ou um abraço, fazem toda a diferença e têm o poder de
mudar completamente a perspectiva de um dia!
Portanto, não pretendo aqui, classificar o grau de contribuição das pessoas que
fizeram e continuarão a fazer parte do meu dia a dia, pois todas são muito importantes
para mim! Uma frase, contida no livro “O Pequeno Príncipe” resume um dos princípios
básicos que procuro manter na minha vida: “És responsável por quem cativas”.
Assim, a todos os amigos, professores, colegas de pós-graduação, colegas
médicos veterinários responsáveis técnicos, funcionários do Depto. de Medicina
Veterinária Preventiva, residentes e estagiários do LIPOA, alunos, “agregados” e é claro
aos meus três filhos muito amados: MUITO OBRIGADA! E que eu consiga
corresponder às expectativas daqueles que acreditaram em mim!
VI
SUMÁRIO
REVISÃO DA LITERATURA - Listeria monocytogenes e Listeriose....................................1
RESUMO ...................................................................................................................................... 2
ABSTRACT .................................................................................................................................. 3
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 4
2. MICROBIOLOGIA DE Listeria SPP. ................................................................................... 5
2.1. IDENTIFICAÇÃO ................................................................................................................ 5
2.2. CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS .................................................................................... 5
2.3. CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS ..................................................................................... 6
2.4. SOROTIPOS ....................................................................................................................... 7
3. PATOGÊNESE ...................................................................................................................... 8
3.1. MECANISMOS DE INVASÃO E ESCAPE............................................................................... 8
3.2. FATORES DE VIRULÊNCIA ................................................................................................. 9
4. EPIDEMIOLOGIA............................................................................................................... 10
4.1. HABITAT ......................................................................................................................... 10
4.2. FORMAS DE TRANSMISSÃO ............................................................................................. 11
Origem não alimentar........................................................................................................... 11
Origem alimentar ................................................................................................................. 11
5. OCORRÊNCIA .................................................................................................................... 12
6. PATOGENIA ....................................................................................................................... 14
6.1. LISTERIOSE NOS ANIMAIS .............................................................................................. 14
6.2. LISTERIOSE EM HUMANOS ............................................................................................. 14
Forma invasiva..................................................................................................................... 14
Forma não invasiva .............................................................................................................. 15
7. DIAGNÓSTICO ................................................................................................................... 15
7.1. ANÁLISES EM ALIMENTOS .............................................................................................. 15
7.2. ANÁLISES CLÍNICAS........................................................................................................ 16
8. TRATAMENTO E PROFILAXIA....................................................................................... 16
9. SITUAÇÃO ATUAL............................................................................................................ 17
VII
10. CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 19
11. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 20
OBJETIVOS.............................................................................................................................. 28
OBJETIVO GERAL ................................................................................................................... 28
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................................... 28
ARTIGO 1 - Listeria monocytogenes : OCORRÊNCIA NA CARNE BOVINA E
IDENTIFICAÇÃO DOS PRINCIPAIS PONTOS DE CONTAMINAÇÃO EM PLANTAS
DE PROCESSAMENTO.......................................................................................................... 29
RESUMO .................................................................................................................................... 30
ABSTRACT ................................................................................................................................ 31
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 32
2. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................. 34
2.1. AMOSTRAS ..................................................................................................................... 34
2.2. PONTOS DE AMOSTRAGEM E PROCEDIMENTOS DE COLHEITA ........................................ 34
Produtos ............................................................................................................................... 34
Equipamentos....................................................................................................................... 35
Instalações............................................................................................................................ 35
2.3. DETECÇÃO DA PRESENÇA DE L. monocytogenes ............................................................ 35
2.4. IDENTIFICAÇÃO FENOTÍPICA DAS ESPÉCIES.................................................................... 36
2.5. IDENTIFICAÇÃO DOS SOROTIPOS DE L. monocytogenes.................................................. 36
3. RESULTADOS .................................................................................................................... 38
4. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO ........................................................................................... 43
5. AGRADECIMENTOS ......................................................................................................... 48
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 49
ARTIGO 2 - MICRORGANISMOS INDICADORES NA CARNE BOVINA E
IDENTIFICAÇÃO DOS PONTOS DE CONTAMINAÇÃO NO PROCESSAMENTO ... 56
RESUMO .................................................................................................................................... 57
ABSTRACT ................................................................................................................................ 58
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 59
VIII
2. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................. 62
2.1. AMOSTRAS ..................................................................................................................... 62
2.2. PONTOS DE AMOSTRAGEM E PROCEDIMENTOS DE COLHEITA ........................................ 62
Produtos ............................................................................................................................... 62
Equipamentos....................................................................................................................... 63
Instalações............................................................................................................................ 63
2.3. ENUMERAÇÃO DE MICRORGANISMOS INDICADORES ..................................................... 63
2.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................................................... 63
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................................... 64
4. CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 80
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 81
ARTIGO 3 - RELAÇÃO ENTRE A PRESENÇA DE LISTERIA SPP. E OS NÍVEIS DE
CONTAMINAÇÃO DA MICROBIOTA ACOMPANHANTE NA CARNE BOVINA,
PRODUTOS CÁRNEOS E EM PLANTAS DE PROCESSAMENTO.
RESUMO .................................................................................................................................... 85
ABSTRACT ................................................................................................................................ 86
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 87
2. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................. 88
2.1. ORIGEM DAS AMOSTRAS E ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS.............................................. 89
2.2. ANÁLISE DOS RESULTADOS ............................................................................................ 89
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................................... 90
4. CONCLUSÃO .................................................................................................................... 105
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 106
IX
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Características bioquímicas de Listeria spp. .................................................. 7
Tabela 2. Surtos e casos esporádicos suspeitos e comprovados de listeriose alimentar
(JAY, 2000) ................................................................................................................ 13
Tabela 1.1. Pontos de amostragem, origem, total de amostras colhidas e área de
superfície amostrada. .................................................................................................. 37
Tabela 1.2. Freqüência de Listeria spp. em amostras de equipamentos, instalações,
carnes e produtos cárneos provenientes de plantas de processamento de 11
estabelecimentos localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil.................... 40
Tabela 1.3. Freqüências das diferentes espécies de Listeria spp. identificadas de
amostras de equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos provenientes de
plantas de processamento de 11 estabelecimentos localizados na região norte do estado
do Paraná, Brasil. ........................................................................................................ 41
Tabela 1.4. Principais pontos de contaminação por Listeria spp. e L. monocytogenes em
equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos identificados em 11
estabelecimentos processadores de carne localizados na região norte do estado do
Paraná, Brasil.............................................................................................................. 42
Tabela 1.5. Ocorrência de sorotipos de L. monocytogenes em amostras colhidas de
equipamentos, instalações e produtos provenientes de 11 estabelecimentos
processadores de carne bovina da região norte do estado do Paraná, Brasil. ................ 42
Tabela 2.1. Pontos de amostragem, total de amostras colhidas e área de superfície. .... 63
Tabela 2.2. Médias das contagens de aeróbios mesófilos (log UFC/cm2 ou g.) de
amostras de equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos colhidas em 10 casas
de carnes e 01 abatedouro, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil. .... 72
Tabela 2.3. Médias das contagens de coliformes totais (log UFC/cm2 ou g.) de amostras
de equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos colhidas em 10 casas de carnes
e 01 abatedouro, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil..................... 73
Tabela 2.4. Médias das contagens de Escherichia coli (log UFC/cm2 ou g.) de amostras
de equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos colhidas em 10 casas de carnes
e 01 abatedouro, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil..................... 74
Tabela 2.5. Médias das contagens de bolores (log UFC/cm2 ou g.) de amostras de
equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos colhidas em 10 casas de carnes e
01 abatedouro, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil. ...................... 75
X
Tabela 2.6. Médias das contagens de leveduras (log UFC/cm2 ou g.) de amostras de
equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos colhidas em 10 casas de carnes e
01 abatedouro, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil. ...................... 76
XI
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema de ciclo intracelular de Listeria monocytogenes (fonte: VÁZQUEZ-
BOLAND, J.A. et al., 2001).......................................................................................... 9
Figura 2. Evolução entre 6 horas e 2 dias na formação de biofilme de Listeria
monocytogenes (fonte: CHAVANT, P. et al, 2002). .................................................... 11
Figura 2.1. Médias das contagens de microrganismos indicadores (log UFC/cm2 ou g.)
em amostras de equipamentos de 10 casas de carnes, localizadas na região norte do
estado do Paraná, Brasil. ............................................................................................. 77
Figura 2.2. Médias das contagens de microrganismos indicadores (log UFC/cm2 ou g.)
em amostras de equipamentos de abatedouro, localizado na região norte do estado do
Paraná, Brasil.............................................................................................................. 77
Figura 2.3. Médias das contagens de microrganismos indicadores (log UFC/cm2 ou g.)
em amostras de instalações de 10 casas de carnes localizadas na região norte do estado
do Paraná, Brasil. ........................................................................................................ 78
Figura 2.4. Médias das contagens de microrganismos indicadores (log UFC/cm2 ou g.)
em amostras de instalações de abatedouro localizado na região norte do estado do
Paraná, Brasil.............................................................................................................. 78
Figura 2.5. Médias das contagens de microrganismos indicadores (log UFC/cm2 ou g.)
em amostras de produtos de 10 casas de carnes localizadas na região norte do estado do
Paraná, Brasil.............................................................................................................. 79
Figura 2.6. Médias das contagens de microrganismos indicadores (log UFC/cm2 ou g.)
em amostras de produtos de abatedouro localizado na região norte do estado do Paraná,
Brasil. ......................................................................................................................... 79
Figura 3.1. Distribuição de amostras positivas e negativas para Listeria spp., em
relação a três níveis de contaminação por aeróbios mesófilos, isoladas de equipamentos,
instalações, carnes e produtos e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores
de situados na região norte do estado do Paraná, Brasil. .............................................. 95
Figura 3.2. Distribuição de amostras positivas e negativas para Listeria spp., em
relação a três níveis de contaminação por coliformes totais, isoladas de equipamentos,
instalações, carnes e produtos e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores
de situados na região norte do estado do Paraná, Brasil. .............................................. 96
Figura 3.3. Distribuição de amostras positivas e negativas para Listeria spp., em
relação a três níveis de contaminação por E. coli isoladas de equipamentos, instalações,
XII
carnes e produtos e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de situados
na região norte do estado do Paraná, Brasil. ................................................................ 97
Figura 3.4. Distribuição de amostras positivas e negativas para Listeria spp., em
relação a três níveis de contaminação por bolores isoladas de equipamentos, instalações,
carnes e produtos e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de situados
na região norte do estado do Paraná, Brasil. ................................................................ 98
Figura 3.5. Distribuição de amostras positivas e negativas para Listeria spp., em
relação a três níveis de contaminação por leveduras isoladas de equipamentos,
instalações, carnes e produtos e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores
de situados na região norte do estado do Paraná, Brasil. .............................................. 99
Figura 3.6. Distribuição de amostras positivas para as diferentes espécies de Listeria,
em relação a três níveis de contaminação por aeróbios mesófilos, isoladas de
equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos de 11 estabelecimentos
processadores de situados na região norte do estado do Paraná, Brasil....................... 100
Figura 3.7. Distribuição de amostras positivas para as diferentes espécies de Listeria,
em relação a três níveis de contaminação por coliformes totais, isoladas de
equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos de 11 estabelecimentos
processadores de situados na região norte do estado do Paraná, Brasil....................... 101
Figura 3.8. Distribuição de amostras positivas para as diferentes espécies de Listeria,
em relação a três níveis de contaminação por E. coli, isoladas de equipamentos,
instalações, carnes e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de situados
na região norte do estado do Paraná, Brasil. .............................................................. 102
Figura 3.9. Distribuição de amostras positivas para as diferentes espécies de Listeria,
em relação a três níveis de contaminação por bolores, isoladas de equipamentos,
instalações, carnes e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de situados
na região norte do estado do Paraná, Brasil. .............................................................. 103
Figura 3.10. Distribuição de amostras positivas para as diferentes espécies de Listeria,
em relação a três níveis de contaminação por leveduras, isoladas de equipamentos,
instalações, carnes e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de situados
na região norte do estado do Paraná, Brasil. .............................................................. 104
XIII
ANEXOS
1. ARTIGO CIENTÍFICO PUBLICADO.............................................................. 112
BARROS, M.A.F.; BELOTI, V.; HAGA, M.M.; CAVALETTI, L.; d’OVIDIO, L.;
AMORIM, F.A.; NERO, L.A. Listeria spp.: ocorrência em equipamentos e ambientes
de processamento de carne bovina. Semina: Ciências Agrárias, Londrina, v. 25, n.4, p.
341-48, out./dez., 2004
2. ARTIGO TÉCNICO PUBLICADO ................................................................... 120
BARROS, M.A.F. Listeria monocytogenes: ocorrência na carne bovina e em plantas de
processamento. Revista do Conselho Regional de Medicina Veterinária-PR, n.15, ano
III, Abr./Mai./Jun/, p.19, 2005
3. DIVULGAÇÃO EM EVENTOS CIENTÍFICOS. ............................................. 122
3.1. BARROS, M.A.F.; BELOTI, V.; HAGA, M.M.; CAVALETTI, L.; D’OVÍDIO, L.;
MONTEIRO, F.A.; SILVA, L.H.C. Detecção de Listeria spp. em carne in natura e
embutidos comercializados na região norte do Paraná. In: XXII Congresso Brasileiro de
Microbiologia, Novembro de 2003, Florianópolis, SC, Brasil................................123
3.2. BARROS, M.A.F.; BELOTI, V.; HAGA, M.M.; CAVALETTI, L.; D’OVÍDIO, L.;
MONTEIRO, F.A.; VILLAS-BÔAS, A.M. Listeria spp.: ocorrência em equipamentos e
ambientes de processamento da carne bovina. In: XXII Congresso Brasileiro de
Microbiologia, Novembro de 2003, Florianópolis, SC, Brasil......................................124
3.3. CAVALETTI, L.; BARROS, M.A.F.; BELOTI, V.; D’OVÍDIO, L.; MONTEIRO,
F.A.; HAGA, M.M.; VILLAS-BÔAS, A.M. Enumeração de Microrganismos Aeróbios
Mesófilos em Carcaças Bovinas e Cortes Comerciais Provenientes da Região Norte do
Paraná. In: III Mostra Acadêmica de Trabalhos Científicos do Curso de Medicina
Veterinária-UEL-Graduação/Pós-Graduação e XXV Ciclo de Estudos em Medicina
Veterinária, 01 a 05 de dezembro de 2003, Londrina, PR, Brasil.................................126
3.4. HAGA, M.M.; BARROS, M.A.F.; BELOTI, V.; CAVALETTI, L.; D’OVÍDIO, L.;
MONTEIRO, F.A.; VILLAS-BÔAS, A.M. Enumeração de Bolores e Leveduras em
Equipamentos Instalações Utilizados no Processamento da Carne Bovina. In: III Mostra
Acadêmica de Trabalhos Científicos do Curso de Medicina Veterinária-UEL-
Graduação/Pós-Graduação e XXV Ciclo de Estudos em Medicina Veterinária, 01 a 05
de dezembro de 2003, Londrina, PR, Brasil................................................................. 128
3.5. D’OVÍDIO, L.; BARROS, M.A.F.; BELOTI, V.; CAVALETTI, L.; MONTEIRO,
F.A.; HAGA, M.M.; VILLAS-BÔAS, A.M. Enumeração de Escherichia coli em Meias
XIV
Carcaças, Cortes Comerciais e Embutidos de Origem Bovina em Estabelecimentos da
Região Norte do Paraná. In: III Mostra Acadêmica de Trabalhos Científicos do Curso
de Medicina Veterinária-UEL-Graduação/Pós-Graduação e XXV Ciclo de Estudos em
MedicinaVeterinária, 01 a 05 de dezembro de 2003, Londrina, PR, Brasil................. 129
3.6. BARROS, M.A.F.; BELOTI, V. ; NERO, L.A.; TAMANINI, R.; VILLAS-BÔAS,
A.M. Principais Fontes de Contaminação de Listeria spp. no Processamento de
Lingüiça Tipo Frescal em Londrina, PR. In: II Congresso Latino-americano de
Higienistas de Alimentos/VIII Congresso Brasileiro de Higienistas de Alimentos/ I
Encontro Nacional de Centros de Controle de Zoonoses. 12 a 15 de abril de 2005,
Búzios,RJ, Brasil .........................................................................................................130
3.7. BARROS, M.A.F.; BELOTI, V.; NERO, L.A.; TAMANINI, R.; VILLAS-BÔAS,
A.M.; FAGNANI, R. Microrganismos Indicadores de Higiene no Processamento de
Carne moída Bovina em Casas de Carnes de Londrina, PR. In: II Congresso Latino-
americano de Higienistas de Alimentos/VIII Congresso Brasileiro de Higienistas de
Alimentos/ I Encontro Nacional de Centros de Controle de Zoonoses. 12 a 15 de abril
de 2005, Búzios, RJ, Brasil. ...................................................................................... 133
3.8. BARROS, M.A.F.; D’OVÍDIO, L.; CAVALETTI, L.; BELOTI, V.; NERO, L.A.;
TAMANINI, R.; FAGNANI, R. Identificação de Espécies de Listeria spp. Isoladas de
Plantas Processadoras de Carne Bovina por Testes Bioquímicos Tradicionais e pelo
Sistema API Listeria. In: XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia, 22 a 25 de
novembro de 2005, Santos, SP, Brasil. ...................................................................... 136
3.9. BARROS, M.A.F.; CAVALETTI, L.; D’OVÍDIO, L.; CAVALETTI, L.; BELOTI,
V.; NERO, L.A.; TAMANINI, R.; FAGNANI, R. Avaliação da Contaminação de
Carcaças Bovinas por Microrganismos Indicadores pela Utilização de Placas
Petrifilm™. In: XXIII Congresso Brasileiro de Microbiologia, 22 a 25 de novembro de
2005, Santos, SP, Brasil. ........................................................................................... 137
2
RESUMO
Listeria monocytogenes é uma bactéria Gram positiva, aeróbica, intracelular e
anaeróbica facultativa, amplamente distribuída no meio ambiente e agente etiológico da
listeriose humana e de animais. Em humanos, a doença pode manifestar-se de forma
grave e fatal em indivíduos susceptíveis como gestantes, recém nascidos, idosos e
imucomprometidos, causando meningite e septicemia. A patogênese da listeriose
consiste na internalização da bactéria por fagócitos profissionais e por células não
fagocíticas de diferentes tecidos e órgãos. A estratégia de invasão, célula a célula,
permite a sua disseminação no interior dos tecidos hospedeiros e a formação de focos
infecciosos ficando assim protegida das defesas do hospedeiro, como os anticorpos
circulantes. Cada etapa do parasitismo intracelular por L. monocytogenes dependerá da
produção de fatores de virulência, exercidos por diversas proteínas que estão envolvidas
nas fases do ciclo intracelular. Em relação às outras doenças de origem alimentar a
listeriose apresenta uma baixa incidência, mas com índices de mortalidade superiores a
50%. Apesar das outras formas de transmissão, os alimentos têm sido claramente
identificados como a mais importante fonte de infecção. Os produtos cárneos estão
envolvidos em diversos surtos e casos esporádicos de listeriose humana e pesquisas têm
comprovado a ocorrência de contaminação da carne e de plantas de processamento por
L. monocytogenes. A alta ocorrência do patógeno em diversos alimentos associada aos
altos índices de mortalidade, tornam L. monocytogenes um importante e complexo
problema de saúde pública que tem provocado perdas para a indústria de alimentos
devido aos inúmeros recolhimentos, voluntários e obrigatórios, realizados
principalmente nos Estados Unidos e Canadá. Diversos países têm estabelecido critérios
rígidos para a presença de L. monocytogenes em diversos alimentos prontos para o
consumo, como o de tolerância zero adotado nos Estados Unidos. No Brasil, nenhum
caso de listeriose foi associado ao consumo de alimentos contaminados, havendo
necessidade de mais pesquisas sobre o complexo Listeria-listeriose.
Palavras-chave: Listeria spp.; Listeria monocytogenes; listeriose.
3
ABSTRACT
LISTERIA MONOCYTOGENES AND LISTERIOSIS
Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterium, anaerobic and facultative
intracellular, widely distributed in the environment. It is the etiological agent of the
human and animal listeriosis. In humans the disease could occur in a serious and fatal
form in susceptible population as pregnant, neonate, elderly and immunosuppressed
causing meningitis and sepsis. The pathogenicity of listeriosis implicates in the
internalization of the bacterium for phagocytic and nonphagocytic cells. The invasion
strategy, cell to cell, allows the spread of infectious focuses that protects the bacterium
against the host defenses as circulating antibodies. Each stage of L. monocytogenes
intracellular parasitism will depend on the virulence factors production, used by several
proteins in the intracellular cycle. In relation to the other foodborne diseases listeriosis
presents a low incidence but high mortality rate, almost 50%. Foods have been clearly
identified the most important source of infection despite the other forms of
transmission. Meat and meat products have been involved in several outbreaks and
sporadic cases of listeriosis and researches has demonstrated that L. monocytogenes can
contaminate meat and processing plants. The high occurrence of L. monocytogenes in
several foods associated to the high mortality rate became L. monocytogenes an
important and complex problem of public health. It has been caused losses for the food
industry due to regular recalls, volunteers and obligatory, mainly in the United States
and Canada. Several countries have been establishing rigid criteria for the presence of L.
monocytogenes in ready-to-eat foods, just as the tolerance zero adopted in the United
States. In Brazil, listeriosis was not associated with the consumption of contamined
foods and more researches are neded to elucidate the complex Listeria-listeriosis.
Key words: Listeria spp.; Listeria monocytogenes; listeriosis.
4
1. INTRODUÇÃO
A emergência de L. monocytogenes como patógeno alimentar data de 1980
com a ocorrência de diversos surtos e casos esporádicos de listeriose ligados ao
consumo de alimentos contaminados e tem provocado inúmeras discussões em todo o
mundo, o que por sua vez, tem estimulado pesquisadores a buscar respostas para as
várias questões que têm surgido sobre a relação entre Listeria ssp. e listeriose
(SCHLECH et al, 1983; LINNAN et al, 1988; BULA et al, 1988; FARBER e
PETERKING, 1991; FENLON, et al., 1996; SILVA et al., 1998).
Diferentemente da maioria dos outros patógenos, apresenta características
psicrotróficas podendo desenvolver-se e multiplicar-se em alimentos mantidos sob
temperaturas de refrigeração (MEMBRÉ et al., 1999; DYKES, 2003). Ainda, a
resistência do microrganismo a agentes antimicrobianos (DYKES e MOORHEAD,
2001), a substâncias químicas como ácidos e álcalis e a capacidade de formação de
biofilmes sobre várias superfícies torna difícil sua eliminação (HOOD e ZOTTOLA,
1995; FENLON et al., 1996; BLOM et al., 1997; CHEROUTRE-VIALETTE et al.,
1998; LERICHE e CARPENTIER, 2000; TAKHISTOV e GEORGE, 2004).
Após um surto de listeriose ocorrido em 1985 na Califórnia, avaliou-se a
participação de produtos cárneos como veículos da infecção e o envolvimento desses
alimentos em surtos e casos esporádicos de listeriose humana ficou comprovado em
diversos países (KERR et al., 1988; CANTONI et al., 1989; FARBER e PETERKIN,
1991; BADER, 1993; GOULET et al., 1995; JACQUET et al., 1995). Embora exista
uma margem de risco para todos os consumidores, este patógeno pode causar abortos,
septicemia, encefalite e meningite com altas taxas de mortalidade entre neonatos, idosos
e imunocomprometidos (ROCOURT, 1994; HOFER, 1998).
No Brasil, pesquisas publicadas relatam a ocorrência de Listeria spp. em
alimentos como vegetais (HOFER, 1975a), camarão (HOFER e RIBEIRO, 1990;
DESTRO et al., 1996), carnes, leite e derivados (DESTRO et al.,1991; CASAROTTI et
al., 1994; SILVA et al., 1998; SILVA et al., 2004) e ambientes como esgotos (HOFER,
1975b) e solo (HOFER e PÓVOA, 1984) mas, até o momento, nenhum caso clínico foi
associado ao consumo de alimentos.
5
1. MICROBIOLOGIA DE LISTERIA SPP.
1.1. Identificação
O gênero Listeria está relacionado filogenéticamente aos gêneros
Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus e Brochotrix. Esta posição
filogenética é consistente com seu baixo conteúdo de mol % G+C (36 a 42) e
atualmente compreende seis espécies: L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii
(subespécies ivanovii e londoniensis), L. welshimeri, L. seeligeri e L. grayi, mas apenas
duas espécies são reconhecidamente patogênicas, assim L. monocytogenes pode infectar
uma variedade de espécies animais, incluindo o homem e L. ivanovii apresenta
patogenicidade restrita aos ruminantes (ROCOURT e COSSART, 1997; VÁZQUEZ-
BOLAND et al., 2001).
1.2. Características fisiológicas
Listeria spp. é um bacilo Gram positivo, com diâmetro de 0,4 a 0,5µm e
comprimento de 0,51 a 2,0µm (Seeliger e Jones, 1986), aeróbico e facultativamente
anaeróbico, não formador de esporos, e que apresenta motilidade característica em
forma de “guarda chuva” quando incubado em meio de cultura próprio entre 20 a 25oC.
As colônias formadas são acinzentadas brilhantes sob iluminação normal e de coloração
azul esverdeada quando observadas sob iluminação oblíqua (SCHUCHAT et al.,1991).
São microrganismos catalase positiva, oxidase negativa, sendo a faixa ótima
de pH para seu crescimento de 6 a 8, mas diversas pesquisas demonstraram seu
crescimento quando as faixas de pH variaram de 4,1 até 9,6. São capazes de crescer em
diferentes temperaturas, tempos de incubação e concentrações salinas (COLE et al.,
1990; CONNER et al., 1986; BUCHANAN e KLAWITTER, 1990). A temperatura
ótima de crescimento situa-se na faixa de 30 a 37oC, embora temperaturas extremas
como 1oC e 45oC permitam o crescimento de Listeria spp., e congelamentos a -18oC e
descongelamentos sucessivos parecem não promover a sua inativação (SCHUCHAT et
al., 1991).
O isolamento do microrganismo em de ambiente anaeróbico foi
demonstrado em pesquisa que avaliou amostras comerciais de carne processada e
embalada à vácuo, na qual 53% das amostras testadas estavam contaminadas com
6
L. monocytogenes e 4% apresentaram contagens superiores a 103UFC/g (GRAU e
VANDERLINE, 1990). Em pesquisa realizada com embutidos e presunto cozidos
adicionados em diferentes concentrações de lactatos e acetatos e embalados à vácuo,
Blom e colaboradores (1997) concluíram que a inibição do crescimento de L.
monocytogenes ocorreu quando as concentrações foram de 2,5% de lactato e de 0,25%
de acetato.
As exigências nutricionais para o crescimento de Listeria são praticamente
as mesmas das outras bactérias Gram positivas, crescendo bem em meios comuns como
Brain Heart Infusion (BHI) e Ágar Tripticase de Soja (TSA). Apesar da maioria das
descrições terem sido baseadas em L. monocytogenes, as exigências para as outras
espécies parecem ser as mesmas. Listeria spp. é capaz de hidrolisar a esculina e crescer
na presença de 10% ou até 40% de bile e em concentrações salinas a 10% . Embora o
ferro seja importante para o seu crescimento in vivo, L. monocytogenes aparentemente
não possui compostos específicos de ligação e esse íon seria obtido, quando necessário,
a partir da redução do ferro livre que se liga a receptores de superfície (JAY, 2000).
1.3. Características bioquímicas
A diferenciação bioquímica entre as diferentes espécies é baseada na
fermentação de alguns açucares como D-glucose, D-xilose, D-manitol e L-rhamnose e
na reação de hemólise que diferencia as espécies patogênicas da espécie não patogênica
L. innocua, mais frequentemente encontrada. L. monocytogenes apresenta reação de
β hemólise quando semeada em ágar sangue ovino ou equino formando uma estreita
zona de hemólise ao redor da colônia, já L. ivanovii forma uma acentuada zona de
hemólise. L seeligeri pode ou não apresentar reação de hemólise fraca, e as outras
espécies não são hemolíticas (SEELIGER e JONES, 1986) (Tabela 1).
A diferenciação entre as espécies hemolíticas, e entre L. innocua e
L. monocytogenes é feita através do teste Christie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP
teste), já que essas duas espécies apresentam reações bioquímicas similares. O CAMP
teste detecta reações sinergéticas de hemolisinas de Listeria spp. com a beta toxina de
Staphylococcus aureus e com exofator de Rhodococcus equi. L. monocytogenes
apresenta reação positiva com S. aureus, mas negativa com R. equi; L. ivanovii
apresenta reação inversa e L. innocua apresenta reação negativa ao CAMP teste
(McKELLAR, 1994) (Tabela 1).
7
Tabela 1. Características bioquímicas de Listeria spp.
Espécies
L.
monocytogenes
L.
ivanovii
L.
innocua
L.
welshimeri
L.
seeligeri
L.
grayi
β-hemólise em ágar sangue + ++ - - (+) - Redução do nitrato a nitrito - - - - - -
CAMP teste com Staphylococcus aureus + - - - (+) -
CAMP teste com Rhodococcus equi - + - - - - Produção de ácido a partir de:
D-manitol - - - - - + L-rhamnose + - V V - - D-xilose - + - + + - α-metil D-manosídeo + - + + V NE
+ = reação positiva ++ = reação positiva forte (+) = reação positiva fraca ( -) = reação negativa NE = não estabelecido
1.4. Sorotipos
L. monocytogenes está subdividida em sorotipos baseados em antígenos
somáticos (O) e flagelares (H). Atualmente treze sorotipos (1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c,
4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e,7) de L. monocytogenes têm sido identificados mas, apenas três
(1/2a, 1/2b e 4b) estão relacionados a casos de listeriose humana (SCHUCHAT et al.,
1991; SLADE, 1992; ROCOURT e COSSART, 1997).
8
2. PATOGÊNESE
2.1. Mecanismos de invasão e escape
L. monocytogenes é capaz de invadir macrófagos e uma variedade de células
não fagocíticas, como as endoteliais e os hepatócitos. Em todos estes tipos celulares, a
bactéria desenvolve um ciclo de vida intracelular característico. No caso de células não
fagocíticas o processo é disparado pela bactéria e denominado de fagocitose induzida.
Estudos realizados com L. monocytogenes em cobaias indicaram que a invasão de
enterócitos e/ou das células M das placas de Peyer, constitui a primeira etapa para
atravessar a barreira intestinal. As bactérias são então internalizadas por macrófagos da
lâmina própria alcançando a corrente linfática, a circulação sanguínea e atingindo o
fígado e o baço. Em camundongos, a infecção do fígado começa por uma fase inicial
durante a qual as bactérias são rapidamente fagocitadas pelas células de Kupffer, os
macrófagos do fígado, sendo que em menos de 6 horas são eliminadas 90% das
bactérias. Os microrganismos que sobrevivem infectam os hepatócitos adjacentes
iniciando uma infecção sistêmica (IRETON e COSSART, 1997).
Após a invasão da célula hospedeira e internalização em um fagossomo, em
cerca de 30 minutos ocorre a ruptura da membrana e liberação da bactéria para o
citoplasma, duplicando-se em cerca de uma hora; em seguida a bactéria se torna
progressivamente recoberta por uma camada de filamentos derivados da polimerização
de actina da célula hospedeira, que se arranjam no pólo posterior formando uma
estrutura semelhante a uma “cauda de cometa”, com cerca de 40µm de comprimento e
permitindo uma movimentação da bactéria em velocidade que varia de 0,1 a 1µm/s até a
extremidade da membrana interna da célula hospedeira. Nessa etapa formam-se longas
protusões, que são então, internalizadas pelas células vizinhas, originando um
fagossomo com dupla membrana que, após lisadas permitirão o reinício de um novo
ciclo. Cada ciclo bacteriano é completado em cerca de cinco horas (ROCOURT e
COSSART, 1997; MERZ e HIGGS, 2003). (Figura 1).
9
Figura 1. Esquema de ciclo intracelular de Listeria monocytogenes (fonte: VÁZQUEZ-
BOLAND et al., 2001)
2.2. Fatores de virulência
Cada etapa do parasitismo intracelular por L. monocytogenes dependerá da
produção de fatores de virulência. Diversas proteínas estão envolvidas nas fases do ciclo
intracelular desta bactéria, e seu papel como fatores de virulência tem sido estudado e
identificado nos últimos quinze anos pela biologia molecular. A entrada em células de
mamíferos é mediada por duas proteínas bacterianas de superfície, as internalinas InlA e
InlB. O mecanismo de escape do fagossoma primário envolve a ação de uma toxina
formadora de poros denominada de listeriolisina O (LLO) e de duas fosfolipases C
fosfatidilinositol (PI-PLC) (IRETON e COSSART, 1997; CABANES et al., 2002).
No citosol da célula hospedeira a proteína ActA é responsável pela formação
da cauda de actina e pela motilidade intracelular e a dupla membrana do fagossoma
secundário é rompida pela ação de LLO e uma lecitinase (PC-PLC) (SHEEHAN et al.,
1994; IRETON e COSSART, 1997; CABANES et al., 2002). A expressão dos genes
que codificam essas proteínas é modulada pelas condições ambientais, sendo reprimida
às baixas temperaturas e expressadas no máximo a 35oC. Ainda, esses fatores são
regulados pelo gene prfA, mas seu mecanismo de termoregulação para expressão ainda
não estão totalmente esclarecidos (ROCOURT e COSSART, 1997).
10
Assim a patogênese de L. monocytogenes implica na internalização pelos
fagócitos profissionais e pelas células não fagocíticas de diferentes tecidos e órgãos. A
estratégia de invasão célula a célula, permite a sua disseminação no interior dos tecidos
hospedeiros e a formação de focos infecciosos ficando assim protegida das defesas do
hospedeiro, como os anticorpos circulantes. Isto pode explicar porque os anticorpos não
exercem um papel importante na recuperação a partir de uma infecção, ou proteção
contra infecções secundárias (CABANES et al., 2002).
3. EPIDEMIOLOGIA
3.1. Habitat
L. monocytogenes pode ser encontrada na matéria orgânica em
decomposição, no solo, águas tratadas e residuais, forragens, fertilizantes, superfícies de
equipamentos e alimentos de origem animal e vegetal, já tendo sido isolada de mais de
40 espécies de mamíferos e 17 de aves (KONEMAN, 2001). Diferentemente da maioria
dos outros patógenos, apresenta características psicrotróficas podendo desenvolver-se e
multiplicar-se em alimentos mantidos sob temperaturas de refrigeração (DYKES, 2003).
A resistência do microrganismo a agentes antimicrobianos substâncias
químicas como ácidos e álcalis e a sua capacidade de adesão e formação de biofilmes
sobre várias superfícies, como plástico e aço inoxidável, torna difícil sua eliminação
(HOOD e ZOTTOLA, 1995; DYKES e MOORHEAD, 2001; TAKHISTOV e
GEORGE, 2004). Biofilmes são geralmente, comunidades multiespécies nas quais
diferentes microrganismos estão integrados em estruturas complexas. Estudos têm
demonstrado a capacidade de L. monocytogenes de formar biofilmes sobre materiais
comumentemente utilizados em indústrias de alimentos inclusive na presença de outros
microrganismos (BERESFORD et al., 2001) (Figura 2).
11
Figura 2. Evolução entre 6 horas e 2 dias na formação de biofilme de Listeria
monocytogenes em superfície de aço inoxidável (fonte: CHAVANT, P. et al, 2002).
3.2. Formas de transmissão
Origem não alimentar
A listeriose pode ser transmitida pelo contato direto com animais infectados,
mas essa via de transmissão é considerada rara. Nesta forma de doença surgem lesões
cutâneas, especialmente sobre os braços de pessoas que manipulam animais como
médicos veterinários e magarefes. McLauchlin (1996) relata a ocorrência de 17 casos na
literatura mundial.
Outra forma de transmissão é por contaminação cruzada durante o período
neonatal, com casos de infecção nosocomial descritos (HOF e LAMPIDIS, 2001;
COLODNER et al., 2003). Na maioria dos episódios relatados, as salas de parto, as
enfermarias, os equipamentos e o pessoal médico envolvido foram relacionados aos
casos de listeriose como fontes de infecção (SCHUCHAT et al., 1991; McLAUCHLIN,
1996).
Origem alimentar
Atualmente é aceito que a principal forma de transmissão da listeriose é o
consumo de alimentos contaminados (WHO Working Group, 1988). Diversos
alimentos, de origem animal e vegetal, têm sido relacionados a casos esporádicos e a
surtos de listeriose no mundo. L. monocytogenes é capaz de crescer e sobreviver tanto
12
em alimentos crus, quanto em alimentos processados (McLAUCHLIN e GILBERT,
1990).
4. OCORRÊNCIA
O primeiro surto de listeriose de origem alimentar comprovado na América
do Norte, aconteceu em 1981 em Nova Escócia, Canadá, com 41 doentes e 11 mortes.
Este surto foi relacionado com a ingestão de salada contendo repolho contaminado a
partir de adubo in natura proveniente de ovinos (SCHLECH et al., 1983). Em 1983
ocorreu um surto em Boston, nos Estados Unidos, (49 casos e 14 mortes) e
epidemiologicamente ligado ao leite pasteurizado, mas o microrganismo não foi isolado
do produto (FLEMING et al., 1985). Em 1985 um grande surto ocorreu no sul da
Califórnia, Estados Unidos, (142 casos e 48 mortes) e foi causado por um tipo de queijo
mole, denominado Mexican-style, produzido a partir de leite cru ou proveniente de
processo de pasteurização inadequada (LINNAN et al., 1988).
Com relação à listeriose causada por ingestão de produtos cárneos
contaminados, o primeiro surto comprovado envolveu um tipo de patê importado pelo
Reino Unido com 366 doentes e 63 mortes (McLAUCHLIN et al., 1991) e o primeiro
relato nos Estados Unidos foi de um caso esporádico relacionado ao consumo de
embutido de carne de peru, por uma paciente com câncer (MMWR, 1989). Uma grande
variedade de carnes e produtos cárneos, além de plantas de processamento, tem sido
associada à contaminação por L. monocytogenes (NG e SEAH, 1995; NESBAKKEN et
al., 1996; OJENIYI et al., 1996; NØRRUNG et al.,1999; PICCHI et al., 1999;
CORDANO e ROCOURT, 2001; PECCIO et al., 2003; BARBALHO et al., 2005;
GUDBJÖRNSDÓTTIR et al., 2004). Na Tabela 2 são apresentados casos de listeriose
relatados por Jay (2000) e associados a alimentos de diversas origens.
13
Tabela 2. Surtos e casos esporádicos suspeitos e comprovados de listeriose alimentar
(JAY, 2000).
Ano Origem Casos/Mortes Localização
1953 Leite cru 2/1 Alemanha
1959 Carne bovina/frango* 4/2 Suécia
1960-61 Vários/desconhecido 81/? Alemanha
1966 Leite/derivados 279/109 Alemanha
1979 Vegetais/leite† 23/3 Boston
1980 Mariscos 22/6 Nova Zelândia
1981 Repolho 41/18 Canadá
1983 Leite pasteurizado 49/14 Boston
1983-87 Queijo tipo Vacherin 122/34 Suíça
1985 Queijo Mexican style 142/48 Califórnia
1986-87 Vegetais† 36/16 Filadélfia
1987-89 Patê 366/63 Reino Unido
1987 Queijo 1 Reino Unido
1988 Queijo de leite de cabra 1 Reino Unido
1988 Frango assado 1 Reino Unido
1988 Frango assado 2 Reino Unido
1988 Embutido de peru 1 Oklahoma
1989 Embutido de porco 1 Itália
1988 Alfafa 1 Canadá
1989 Cogumelos salgados 1 Finlândia
1989 Camarão 9/1 Estados Unidos (Conn.)
1989 Embutido de porco 1 Itália
1990 Leite cru 1 Vermont
1990 Embutido de porco 1 Itália
1990 Patê 11/6 Austrália
1991 Mexilhão defumado 3/0 Austrália
1992 Mexilhão defumado 4/2 Nova Zelândia
1992 Carne de ovinos 1 Canadá
1992 Língua de porco 279/85 França
1993 Filetes de porco 39/0 França
1994 Achocolatado 52/0 Estados Unidos
1994 Azeitonas em conserva 1 Itália
1995 Queijo Brie 17/0 França
1998-99 Salsicha tipo hot-dog 101/21 Estados Unidos
*suspeito † epidemiologicamente relacionados (microrganismo não detectado)
14
5. PATOGENIA
5.1. Listeriose nos animais
As infecções por L. monocytogenes têm sido relatadas em mais de 40
espécies de animais domésticos e silvestres. Abortos esporádicos têm sido atribuídos à
infecção por L. ivanovii. A listeriose em ruminantes pode apresentar-se como encefalite,
aborto, septicemia ou endoftalmite e geralmente apenas uma forma da doença ocorre em
determinado grupo de animais afetados. Relatos de casos de mastite listerial em bovinos
são raros e geralmente ocorre na forma subclínica (GITTER et al., 1980; JENSEN et al.,
1996). Em ruminantes, a listeriose está associada à ingestão de silagem contaminada.
Em animais recém-nascidos frequentemente observa-se septicemia. Em cães, gatos,
eqüinos e suínos a listeriose pode provocar abortos além de encefalite (QUINN, 2005).
5.2. Listeriose em humanos
Forma invasiva
A listeriose na forma invasiva é caracterizada por apresentar quadros graves
em pessoas pertencentes aos grupos de risco. Em gestantes, a infecção é mais freqüente
no terceiro trimestre, geralmente assintomática ou com sintomas de gripe, já para o feto
ou recém nascido as conseqüências são extremamente graves, incluindo aborto, morte
fetal, parto prematuro, septicemia, meningite (ROCOURT e COSSART, 1997;
CRESPO et al., 1999; Di MAIO, 2000; COLODNER et al., 2003) e hidrocefalia
(LACIAR et al., 2000).
Em adultos L. monocytogenes apresenta tropismo pelo sistema nervoso
central, causando meningite e meningoencefalite. Em pacientes imunocomprometidos a
ocorrência de bacteremia é mais freqüente, e pode ser precedida por infecções focais
como endocardites, pneumonias, osteomielite, hepatite e peritonite além de outras
patologias (KERR et al., 1988; HOFER, 1998; HOFER et al., 1999; CRESPO et al.,
1999).
15
Forma não invasiva
Em indivíduos imunocompetentes L. monocytogenes pode causar uma
gastroenterite febril caracterizada por febre, diarréia, dor muscular e cefaléia com um
período de incubação que pode variar de 11horas a 1 semana. Em alguns casos, na
ausência de sintomas gastrintestinais, pode assemelhar-se a uma gripe. Surtos de
listeriose não invasiva têm envolvido uma série de alimentos prontos para o consumo
(SIM et al., 2002).
6. DIAGNÓSTICO
6.1. Análises em alimentos
As metodologias oficiais para análise microbiológica utilizadas para
detecção de L. monocytogenes em alimentos, são preconizadas pela Food and Drug
Administration (FDA, 1998) e pelo United States Department of Agriculture-Food
Safety and Inspection Service (USDA-FSIS, 1996), que são agências federais
regulamentadoras para alimentos. O USDA-FSIS é o órgão responsável pela
regulamentação de carnes, produtos cárneos, aves e ovos. A FDA é responsável pelos
outros alimentos, incluindo pescado. Ambas as agências desenvolvem metodologias e
estratégias de controle da qualidade em alimentos, que são adotadas em diversos países
(KLIMA e MONTVILLE, 1995; SILVA et al., 1997).
A metodologia para detecção de Listeria spp em amostras de carnes,
produtos cárneos e ambientes utiliza duas fases de enriquecimento em caldo, com
agentes seletivos como acriflavina, ácido nalidíxico e ciclohexamida. A acriflavina em
combinação com outros agentes seletivos como tiocianato de potássio e polimixina B
interrompe a síntese de RNA e mitocondriogênese inibindo o crescimento de
microrganismos Gram positivos. O ácido nalidíxico inibe a síntese de DNA e o
crescimento de microrganismos Gram negativos; a ciclohexamida (actidiona) inibe a
síntese protéica em células eucarióticas e previne o crescimento de bolores e leveduras
(SLADE, 1992; BEUMER e HAZELEGER, 2003).
Na fase de plaqueamento seletivo em meio sólido, não há diferenciação
entre as espécies, devendo-se selecionar cinco colônias para confirmação e identificação
das espécies, e essa seleção pode resultar na detecção apenas das espécies não
16
patogênicas, especialmente L. innocua que ocorre em maior frequência, em detrimento
da espécie patogênica em questão, L. monocytogenes (BEUMER e HAZELEGER,
2003). Esses autores sugerem o uso de meios de plaqueamento cromogênicos e de
meios à base de sangue para diferenciação das espécies hemolíticas.
Para identificação das espécies realiza-se uma série de testes bioquímicos
baseados nas características do gênero (Tabela 1), além da verificação de reação de
hemólise, motilidade a 25oC, coloração de Gram e catalase. Como alternativa,
apresentando maior praticidade na execução e rapidez nos resultados, podem ser
utilizados kits comerciais como o sistema miniaturizado de identificação bioquímica
API Listeria (bioMérieux) ( FDA, 1998). L. monocytogenes é subdividida em treze
sorotipos baseados em antígenos somáticos (O) e flagelares (H). A determinação
antigênica dos sorotipos de amostras positivas para L. monocytogenes amplamente
utilizada é a preconizada Seeliger e Höhne,(1979), que utiliza antissoros somáticos e
flagelares policlonais (ROCOURT, 1989; OJENIYI et al., 1996; HOFER et al., 2000;
HOFER e REIS, 2005).
6.2. Análises clínicas
O diagnóstico microbiológico clínico é feito a partir do cultivo de amostras
de sangue, de líquor ou de algum outro local normalmente estéril. O isolamento deve
ser feito preferencialmente em ágar sangue para verificação da reação de β-hemólise e a
identificação por provas bioquímicas, avaliando-se também a motilidade. O isolamento
de Listeria spp. de sítios não estéreis como placenta e líquido amniótico, em associação
com sintomas clínicos pode sugerir listeriose neonatal. Culturas de L. monocytogenes a
partir de fezes não auxiliam no diagnóstico já que o microrganismo pode ser eliminado
por portadores sadios. Da mesma forma, os testes sorológicos não contribuem para o
diagnóstico da listeriose, porque a reação dos anticorpos pode não ser específica (HOF
et al., 1997; JAY, 2000).
7. TRATAMENTO E PROFILAXIA
O ciclo intracelular e a capacidade de crescimento em diversos tipos
celulares, conferem à L. monocytogenes durante o curso da infecção, uma proteção
contra os mecanismos de defesa humoral e também contra a ação de antibióticos nos
17
fluídos extracelulares. Portanto, durante a listeriose, o antibiótico deve ser transportado
para o interior da célula hospedeira, por difusão passiva ou por transporte ativo (HOF et
al., 1997).
L. monocytogenes é susceptível in vitro, a uma série de antibióticos
incluindo penicilina G, ampicilina, eritromicina, sulfametoxazol-trimetoprim,
cloranfenicol, rifampicina, tetraciclinas e aminoglicosídeos. A associação de um
aminoglicosídeo, como a gentamicina, com um beta lactâmico produz sinergismo com
efeito bactericida, in vivo, sobre a bactéria e esta combinação tem sido a terapia de
escolha. Para pacientes alérgicos aos beta-lactâmicos, o co-trimoxazol representa uma
terapia alternativa (SCHUCHAT et al., 1991; HOF et al., 1997; KONEMAN, 2001).
As recomendações profiláticas são especialmente direcionadas para pessoas
pertencentes aos grupos de risco como gestantes, idosos e imunocomprometidos, no
sentido de evitar o consumo de produtos crus ou mal cozidos e relacionados a surtos de
listeriose. Tanto a FDA, USDA-FSIS e os Centers for Disease Control and Prevention
(CDC) têm conduzido estudos de avaliação de risco e estratégias para redução dos casos
de listeriose, especialmente para as populações de risco (SCHUCHAT et al., 1991;
FDA/USA/CDC, 2005).
Na produção de alimentos o monitoramento constante dos produtos e das
plantas de processamento, com a implantação de sistemas de Análises de Perigos e
Pontos Críticos de Controle (APPCC), tem sido obrigatório em países como Estados
Unidos, Canadá, Nova Zelândia e Austrália. O setor privado tem desenvolvido e
aperfeiçoado métodos de gerenciamento de perigos e controle, particularmente em
resposta aos incentivos e à constante e crescente regulação do mercado (UNNEVEHR e
ROBERTS, 2002).
8. SITUAÇÃO ATUAL
A dose mínima infectante de L. monocytogenes para humanos é
desconhecida. Os relatos de contagens do patógeno em alimentos contaminados
associados a surtos e casos esporádicos de listeriose, não fornecem muitas evidências de
que um baixo número de células de L. monocytogenes em alimentos cause doença.
Alguns países têm estabelecido limites legais e estabelecido padrões para a quantidade
do patógeno em alimentos, especialmente os prontos para consumo (LAHELLEC,
1995; KLIMA e MONTVILLE, 1995; FARBER e HARWIG, 1996).
18
O governo dos Estados Unidos tem a política mais rígida considerando
L. monocytogenes um “adulterante” e isto significa que, quando é detectada a presença
do patógeno em um alimento o mesmo é considerado adulterado e, portanto sujeito a
recall e/ou apreensão. É a política conhecida como “tolerância zero” determinada pela
ausência do patógeno em 25gr de amostra, que é equivalente a n=5, c=0 em um plano
de amostragem (KLIMA e MONTVILLE, 1995; JAY, 2000).
A diretiva da Comunidade Européia sobre leite e derivados determina o
padrão de “tolerância zero” para queijos moles e ausência de L. monocytogenes em 1gr
dos outros produtos. Na Grã Bretanha determinou-se padrões para alguns alimentos
prontos para o consumo estabelecendo grupos baseados no número de L.
monocytogenes presentes. Quando o microrganismo não é detectado em 25 g. o
alimento é considerado satisfatório; entre 102 e 103UFC/25g. é considerado
insatisfatório e acima de 103UFC/25g. o alimento é considerado inaceitável (JAY,
2000).
O Canadá adotou uma política regulatória baseada na redução do risco de
contaminação, já que o microrganismo nem sempre será erradicado do produto final ou
do meio ambiente. Essa política está direcionada para a inspeção e o cumprimento de
ações principalmente para alimentos prontos para o consumo que possam permitir ou
favorecer o crescimento de L. monocytogenes. Para tanto três categorias foram
estabelecidas, incluindo na categoria I alimentos geralmente relacionados a surtos e com
alta prioridade na inspeção e rigor nas ações, como recolhimento e alerta público; na
categoria II estão os alimentos com vida de prateleira maior do que 10 dias, os quais se
detectada a presença de L. monocytogenes, serão recolhidos e considerada a
possibilidade de alerta público e na categoria III estão aqueles alimentos com vida de
prateleira menor do que 10 dias (FARBER e HARWIG, 1996).
No Brasil, a legislação brasileira não prevê limites de tolerância para a
presença do microrganismo em carnes e produtos cárneos e a Resolução da Diretoria
Colegiada, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA-RDC no. 12/2001)
aprovou o Regulamento Técnico sobre Padrões Microbiológicos para Alimentos, e
somente estabeleceu a pesquisa de L. monocytogenes (ausência em 25g) para queijos de
média a muito alta umidade (BRASIL, 2001).
O United States Department of Health and Humans Services Healthy People
2010 objetiva reduzir a incidência de casos de listeriose, até o final desta década, para
2,5 casos em 1 milhão de pessoas. De acordo com dados da Foodborne Diseases Active
19
Surveillance Network (FoodNet) a incidência de casos confirmados de listeriose em
2004 foi de 2,7 em 1 milhão de pessoas, o que representou um decréscimo de 40% no
período entre 1996 a 2004. Em 2004 foram 15.806 casos confirmados de doenças
transmitidas por alimentos nas regiões abrangidas pela FoodNet, e destes 120 foram
casos de listeriose responsáveis pelo maior índice de hospitalizações (91%) e pela maior
taxa de mortalidade (17%), confirmando que apesar da baixa incidência apresenta uma
alta taxa de mortalidade quando comparada com outras enfermidades transmitidas por
alimentos, como salmonelose e campilobacteriose (MMWR, 2005).
9. CONCLUSÃO
A emergência da listeriose é o resultado de complexas interações de
diferentes fatores, como o avanço na área médica que tem aumentado a expectativa de
vida das populações incluindo os imunocomprometidos, a expansão da indústria
alimentícia e sistemas de estocagem a frio, assim como dos hábitos alimentares
verificado pelo aumento na demanda por alimentos prontos para o consumo.
A partir dos primeiros relatos associando a listeriose ao consumo de
alimentos, observou-se uma intensa busca por conhecimentos mais profundos sobre o
microrganismo Listeria e a doença listeriose, confirmado pelo volume de pesquisas
realizadas no mundo todo, principalmente nos países desenvolvidos.
Investigar o complexo Listeria–listeriose requer uma íntima colaboração de
profissionais de diversas áreas como epidemiologistas, clínicos, veterinários e
microbiologistas entre outros e dos órgãos governamentais responsáveis por assegurar a
qualidade dos alimentos e a saúde pública, sendo fundamental também o envolvimento
do setor privado.
20
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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28
OBJETIVOS
OBJETIVO GERAL
- Avaliar a ocorrência de Listeria monocytogenes no processamento da carne
bovina.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Avaliar a ocorrência das diferentes espécies de Listeria em plantas de
processamento de carnes e identificar os principais pontos de contaminação e
incorporação do patógeno.
- Identificar os principais sorotipos de L. monocytogenes envolvidos na
contaminação da carne bovina e em plantas de processamento.
- Identificar os principais pontos de contaminação e incorporação de
microrganismos indicadores no processamento da carne bovina, visando implantação
das boas práticas de fabricação nos estabelecimentos.
- Avaliar a microbiota presente na carne bovina e possíveis interferências no
isolamento de L. monocytogenes.
ARTIGO 1
Listeria monocytogenes: OCORRÊNCIA NA CARNE
BOVINA E IDENTIFICAÇÃO DOS PRINCIPAIS PONTOS
DE CONTAMINAÇÃO EM PLANTAS DE
PROCESSAMENTO
Márcia de Aguiar Ferreira Barros*1, Luís Augusto Nero2, Lívia Cavalletti
da Silva1, Loredana d’Ovídio1, Ronaldo Tamanini1, Rafael Fagnani1,
Ernesto Hofer3, Vanerli Beloti1
*Autor para correspondência: M.A.F. Barros, Laboratório de Inspeção de Produtos de Origem Animal,
DMVP, Universidade Estadual de Londrina. Caixa Postal 6001, 86051 990, Londrina, PR. Tel.: (43) 3371
4708, Fax: (43) 3371 4714. E-mail: mafer@folhaweb.com.br 1 Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Estadual de Londrina, Londrina PR. 2 Departamento de Veterinária, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa MG. 3 Departamento de Bacteriologia, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio de Janeiro RJ.
30
RESUMO
Listeria monocytogenes é uma bactéria Gram positiva, patogênica, cuja transmissão
ocorre principalmente pela ingestão de alimentos contaminados. Os principais relatos de
surtos e de casos esporádicos envolvem imunocomprometidos, gestantes e seus fetos,
recém-nascidos e idosos. Os perigos microbiológicos existentes na carne bovina in
natura são razoavelmente conhecidos, mas não se dispõe de dados epidemiológicos
seguros sobre a origem da contaminação por L. monocytogenes na carne bovina
brasileira. O objetivo desta pesquisa foi avaliar a ocorrência de Listeria spp.,
especialmente de L. monocytogenes e dos principais sorotipos, na carne bovina in
natura e em plantas de processamento. Foram colhidas 443 amostras de equipamentos,
instalações e de produtos como meias carcaças, cortes comerciais, carne moída e
embutidos provenientes de estabelecimentos processadores de carne (10 casas de carnes
e 01 abatedouro) localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil. Para a
pesquisa de L. monocytogenes utilizou-se a metodologia preconizada pelo United States
Department of Agriculture. A ocorrência de Listeria spp. nas amostras analisadas foi de
37,7% (167) e destas 51,4% (76) foram de equipamentos, 35,4% (23) de instalações e
29,6% (68) de carcaças, cortes comerciais e produtos cárneos. As espécies detectadas
foram L. monocytogenes (12,6%), L. innocua (78,4%), L. seeligeri (1,2%), L.
welshimeri (7,2%) e L. grayi (0,6%). Os sorotipos de L. monocytogenes identificados
foram 1/2a e 4b, sendo importante ressaltar que o sorotipo identificado no moedor
(1/2a) foi do mesmo grupo identificado na carne moída, o mesmo acontecendo com o
misturador (4b) e duas amostras de embutidos. A análise dos resultados permite
concluir que diversos equipamentos (moedores, amaciadores, misturadores,
embutideiras, mesas, caixas plásticas, serras e balanças) e instalações, especialmente
pisos, ralos e balcões representaram importantes pontos de incorporação do patógeno à
carne e aos produtos finais.
Palavras chaves: Listeria spp.; Listeria monocytogenes; carne bovina; planta de
processamento.
31
ABSTRACT
Listeria monocytogenes: occurrence in red meat and identification of the main
contamination points in processing plants.
Listeria monocytogenes is a pathogenic microorganism, Gram positive, which
transmission occurs mainly by ingestion of contaminated foods. The most of outbreaks
and sporadic cases of listeriosis involve immune-depressed patients, new born, pregnant
and elderly people. The microbiological hazards in raw meat are reasonably known, but
there is no consistent epidemiological data concerning the origin of L. monocytogenes
contamination in the red meat processing plant in Brazil. The goal of this work was
establish the occurrence of Listeria spp., especially L. monocytogenes and its main
serotypes, in bovine raw meat and in red meat processing plants. It was collected 443
samples of several equipments, installations, and products, such as carcasses,
commercial cuts, ground beef and sausages, in 11 meat processing establishments (10
meat retailers and 1 slaughterhouse), located at north region of Paraná state, Brazil. All
samples were submitted to detection of L. monocytogenes, according United States
Department of Agriculture Methodology. The occurrence of L. monocytogenes in the
samples were 37.7% (167), which 51.4% (76) were from equipments and transport
samples, 35.4% (23) from installations and 29.6% (68) from products. Considering all
Listeria spp. isolated, the following species were identified: L. monocytogenes (12.6%),
L. innocua (78.4%), L. seeligeri (1.2%), L. welshimeri (7.2%) and L. grayi (0.6%). The
L. monocytogenes serotypes identified were 1/2a and 4b. The serotype detected in
grinder (1/2a) was the same detected in the ground beef; the same relation occurred in
mixer and sausages, where the serotype 4b was isolated. The analysis of results allows
the conclusion that several equipments (grinders, smothers, mixers, packing machines,
tables, plastic boxes, saws and balances) and installations sites (floors, spouts,
balconies) are important points of L. monocytogenes incorporation in meat and final
meat products.
Key words: Listeria spp.; Listeria monocytogenes; red meat; meat processing plant.
32
1. INTRODUÇÃO
Listeria monocytogenes é um bacilo gram positivo, mesófilo, não
esporulado, aeróbio, e facultativamente intracelular e anaeróbio, patogênico para os
animais e seres humanos, podendo ser encontrado na matéria orgânica em
decomposição, no solo, águas tratadas e residuais, forragens, fertilizantes, superfícies de
equipamentos e alimentos de origem animal e vegetal, já tendo sido isolado de mais de
40 espécies de mamíferos e 17 de aves (KONEMAN, 2001).
Diferentemente da maioria dos outros patógenos, apresenta características
psicrotróficas podendo desenvolver-se e multiplicar-se em alimentos mantidos sob
temperaturas de refrigeração (DYKES, 2003). A resistência do microrganismo a agentes
antimicrobianos, substâncias químicas como ácidos e álcalis e a capacidade de formação
de biofilmes sobre várias superfícies torna difícil sua eliminação (HOOD e ZOTTOLA,
1995; DYKES e MOORHEAD, 2001; TAKHISTOV e GEORGE, 2004). Biofilmes são
geralmente, comunidades multiespécies nas quais diferentes microrganismos estão
integrados em estruturas complexas. Estudos têm demonstrado a capacidade de L.
monocytogenes de formar biofilmes sobre materiais comumentemente utilizados em
indústrias de alimentos inclusive na presença de outros microrganismos (BERESFORD
et al., 2001).
A emergência de L. monocytogenes como patógeno alimentar data de 1980
com a ocorrência de diversos surtos e casos esporádicos de listeriose ligados ao
consumo de alimentos contaminados (SCHLECH et al, 1983; LINNAN et al, 1988;
BULA et al, 1988; FARBER e PETERKING, 1991; MOURA et al., 1993). Após um
surto de listeriose ocorrido em 1985 na Califórnia, envolvendo 142 pessoas com 48
mortes, avaliou-se a participação de produtos cárneos como veículos da infecção, e o
envolvimento desses alimentos em surtos e casos esporádicos de listeriose humana ficou
comprovado em diversas pesquisas realizadas em diversos países (KERR et al., 1988;
(SCHWARTZ et al., 1988; CANTONI et al., 1989; BADER, 1993; GOULET et al.,
1995; JACQUET et al., 1995).
A listeriose assume grande importância entre as doenças de origem
alimentar, porque embora exista uma margem de risco para todos os consumidores, em
indivíduos pertencentes a grupos de risco como as gestantes, os recém nascidos, os
idosos e os imunocomprometidos, na forma invasiva essa doença está associada com
33
septicemia, encefalite, meningite, abortos e altos índices de mortalidade (ROCOURT,
1994; HOFER, 1998; HOFER et al., 1999).
Apesar de muitos indivíduos consumirem alimentos contaminados com o
microrganismo, a incidência de listeriose é relativamente baixa (HOF, 2003; OKUTANI
et al., 2004). Diversos fatores parecem estar envolvidos na ocorrência da doença, como
imunocompetência do hospedeiro e particularidades da cepa envolvida relacionadas
principalmente com a virulência dos diversos sorotipos (BUNCIC et al., 2001; AQUAJ
et al., 2002). L. monocytogenes é subdividida em sorotipos baseados em antígenos
somáticos (O) e flagelares (H). Treze sorotipos têm sido identificados, mas a maioria
dos casos de doenças em humanos tem sido causada por apenas três (1/2a, 1/2b e 4b)
(ROCOURT, 1989; OJENIYI et al., 1996).
No Brasil, pesquisas publicadas relatam a ocorrência de Listeria spp. em
alimentos como vegetais (HOFER, 1975a), camarão (HOFER e RIBEIRO, 1990;
DESTRO et al., 1996), carnes, leite e derivados (DESTRO et al.,1991; CASAROTTI et
al., 1994; SILVA et al., 1998; SILVA et al., 2004) e ambientes como esgotos (HOFER,
1975b) e solo (HOFER e PÓVOA, 1984). Até o momento, nenhum caso clínico de
listeriose foi associado ao consumo de alimentos contaminados, provavelmente devido
aos laboratórios clínicos não incluírem a pesquisa do patógeno na rotina.
Devido à gravidade das infecções, nas quais a taxa de mortalidade em
indivíduos pertencentes aos grupos de risco pode alcançar até 50%, e por não ser ainda
conhecida a dose mínima infectante (Di MAIO, 2000; LACIAR et al., 2000;
CABANES et al., 2002), nos Estados Unidos a Food and Drug Administration (FDA)
estabeleceu a norma de “tolerância zero” para a presença de L. monocytogenes em
alimentos prontos para o consumo, sendo seguida pelo United States Department of
Agriculture (USDA). Alguns países da Europa têm sido mais tolerantes, admitindo a
presença de até 100 células de L. monocytogenes por grama ou por mililitro de alimento
(ARCHER, 1996).
A legislação brasileira não prevê limites de tolerância para a presença do
microrganismo em carnes e produtos cárneos (BRASIL, 2001). Apesar do grande
volume de trabalhos realizados sobre L. monocytogenes, não há estudos que
estabeleçam a real ocorrência do microrganismo na carne bovina brasileira e que
forneçam dados para efetivar medidas de controle específicas na obtenção e
processamento da carne.
34
Neste estudo objetivou-se avaliar a ocorrência de L. monocytogenes no
processamento da carne, identificar os sorotipos envolvidos e os principais pontos de
contaminação e incorporação do patógeno, visando a implantação de práticas adequadas
de fabricação nos estabelecimentos, que contribuam para a redução e/ou eliminação do
microrganismo.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Amostras
As amostras foram colhidas em 11 estabelecimentos processadores de carne
(10 casas de carnes e 01 abatedouro) localizados na região norte do estado do Paraná, no
período de julho de 2003 a fevereiro de 2005, totalizando 443 amostras.
2.2. Pontos de amostragem e procedimentos de colheita
Para as colheitas utilizou-se, a técnica do esfregaço de superfície (ABNT,
1988) com swabs e moldes estéreis sendo as amostras resuspensas em 45mL de água
peptonada 0,1% (OXOID) e mantidas sob refrigeração até o seu processamento. Na
Tabela 1.1 são descritos todos os pontos analisados assim como as áreas amostradas
Produtos
- Meias carcaças refrigeradas: foram realizados swabs de meias carcaças
refrigeradas, selecionando-se 5 pontos de 10cm2. Os 5 swabs foram colocados em
bags estéreis contendo o diluente.
- Cortes comerciais: foram amostrados cortes que comercialmente são destinados
ao preparo de alimentos consumidos crus ou mal passados. O procedimento de
colheita foi o mesmo utilizado para as meias carcaças, mas utilizando-se dois
moldes de 25cm2.
- Embutidos e carnes moídas: 5g de cada amostra foram homogeneizados em
45mL de água peptonada 0,1%.
35
Equipamentos
Foram amostrados equipamentos como amaciadores, balanças, caixas
plásticas, cubas de aço inoxidável, embutideiras, estrados, facas, ganchos, mesas,
misturadores, moedores, serras e caminhões transportadores (paredes internas e piso).
Os pontos demarcados variaram de 2 a 3 conforme o tipo de equipamento, com exceção
dos ganchos, dos quais foi amostrada toda a área de superfície.
Instalações
Foram amostrados balcões refrigeradores, paredes, pisos, plataformas, ralos
e sistemas de refrigeração e os pontos demarcados variaram de 2 a 3 conforme o
tamanho do equipamento, com exceção dos ralos em que toda a área de superfície foi
amostrada.
2.3. Detecção da presença de L. monocytogenes
As amostras foram analisadas no Laboratório de Inspeção de Produtos de
Origem Animal (LIPOA) da Universidade Estadual de Londrina. A metodologia
utilizada para detecção de Listeria spp. foi a recomendada para carnes e equipamentos
pelo United States Department of Agriculture (USDA,1996), com modificação quanto
ao volume utilizado no enriquecimento primário que foi realizado em caldo base
seletivo Listeria – formulação Universidade de Vermont (UVM) (CM863-OXOID)
incubando 5mL das amostras em 45mL de UVM a 30oC/ 24h. Após essa fase procedeu-
se o enriquecimento seletivo secundário semeando 0,1mL do caldo UVM para tubos
contendo 10mL de caldo Fraser (CM 895-OXOID) e incubando a 35oC/24-48h. A partir
dos tubos positivos (escurecimento do meio) procedeu-se ao plaqueamento seletivo
diferencial em Ágar Oxford Modificado (OXM) (DIFCO) e incubação a 35oC/24-48h
para verificação de crescimento de colônias típicas (pequenas, cinzentas, rodeadas por
halo escuro devido à hidrólise de esculina).
Para a confirmação, cinco colônias típicas foram selecionadas
aleatóriamente e estriadas em placas de Ágar Tripticase de Soja (DIFCO) suplementado
com 0,6% de extrato de levedura (TSA-YE) e incubação a 30oC/24-48h. Após formação
das colônias, as mesmas eram observadas sob luz oblíqua (Sistema de Henry), e
36
selecionada colônia azulada típica. Essa colônia era então novamente estriada em TSA-
YE e incubada a 30oC/24h para realização das provas de identificação das espécies.
2.4. Identificação fenotípica das espécies
Todas as amostras positivas para Listeria spp. foram submetidas às análises
de coloração de Gram, prova da catalase, verificação de hemólise em ágar sangue
eqüino 7%, fermentação de carbohidratos (manitol, rhamnose, xilose e dextrose) e
motilidade a 25oC (PAGOTTO et al., 2004). Ainda, todas as culturas isoladas de
amostras identificadas como positivas para L. monocytogenes, L. welshimeri, L.
seeligeri, L. grayi e 17 de L. innocua, num total de 53 culturas, foram identificadas pelo
sistema API Listeria (bioMérieux).
2.5. Identificação dos sorotipos de L. monocytogenes
As amostras identificadas como positivas para L. monocytogenes foram
enviadas ao Laboratório de Zoonoses Bacterianas, do Departamento de Bacteriologia,
do Instituto Oswaldo Cruz, para determinação antigênica dos sorotipos conforme
descrito por Seeliger e Höhne,(1979) utilizando-se antissoros somáticos e flagelares
policlonais.
37
Tabela 1.1. Pontos de amostragem, origem, total de amostras colhidas e área de
superfície amostrada de equipamentos, instalações e produtos de 10casas de carnes e 01
abatedouro frigorífico situados na região norte do estado do Paraná, Brasil.
Descrição das amostras Casas de carnes
Abatedouro Total Área / quantidade amostrada
n n n cm2/ g Equipamentos
Amaciadores 8 - 8 30 cm2 Balanças 9 - 9 30 cm2 Caixas plásticas 26 2 28 30 cm2 Serras 10 - 10 30 cm2 Cubas de aço inoxidável 10 - 10 30 cm2 Embutideiras 2 1 3 30 cm2 Estrados 10 - 10 30 cm2 Facas 15 6 21 30 cm2 Ganchos 7 3 10 Área de superfície Mesas 20 1 21 60 cm2 Misturadores 3 1 4 30 cm2 Moedores 9 1 10 30 cm2 Caminhões 4 - 4 60 cm2
Instalações
Balcões refrigeradores 11 - 11 60 cm2 Paredes 10 - 10 60 cm2 Pisos 9 1 10 60 cm2 Plataformas - 5 5 60 cm2 Ralos 18 7 25 Área de superfície Sistemas de refrigeração 4 - 4 60 cm2
Produtos
Carcaças bovinas 142 9 151 50 cm2 Carcaças suínas - 3 3 50 cm2 Carnes Moídas 12 - 12 5 g Cortes comerciais 51 1 52 50 cm2 Embutidos - 2 2 5 g Lingüiças tipo frescal 10 - 10 5 g
Total 400 43 443
(-) não amostrados n = número de amostras
38
3. RESULTADOS
Na Tabela 1.2, verifica-se que a freqüência de Listeria spp. nas 443
amostras analisadas foi de 37,7% (167), e deste total 51,4% (76) foram isoladas de
equipamentos, 35,4% (23) de instalações e 29,6% (68) de produtos.
A análise individual dos estabelecimentos evidenciou maiores taxas de
freqüência de Listeria spp. em equipamentos (54,1%), instalações (36,5%) e produtos
(31,6%) das casa de carnes, enquanto que nas amostras do abatedouro as freqüências
foram de 26,7%, 30,8% e 0%, respectivamente.
As espécies identificadas (Tabela 1.3) nas casas de carnes foram:
L. monocytogenes (13,2%), L. innocua (77,4%), L. welshimeri (7,5%), L. seeligeri
(1,3%) e L. grayi (0,6%). No abatedouro detectou-se apenas L. innocua em 08 amostras
sendo 04 (50%) de equipamentos e 04 (50%) de instalações. Os sorotipos de
L. monocytogenes identificados foram 1/2a e 4b (Tabela 1.5).
Com exceção dos ganchos, em todos os tipos de equipamentos das casas de
carnes, detectou-se Listeria spp. com freqüência de 54,1% (72). No abatedouro, das 15
amostras de equipamentos colhidas foi detectada a presença de Listeria spp. em uma
caixa plástica, uma embutideira, um misturador e em um moedor, o que correspondeu a
uma freqüência total de 26,7% (Tabela 1.2). As freqüências observadas para as espécies
identificadas foram de 9,2% para L. monocytogenes (07), 75,% para L. innocua (57),
2,6% para L. seeligeri (02), 11,8% para L. welshimeri (09) e frequência de 1,3% para L.
grayi (01) isolada de amostras de equipamentos (Tabela 1.3).
Os principais pontos de contaminação são descritos na tabela 1.4 e pode-se
observar que as caixas plásticas, embutideiras, misturadores e moedores representaram
importantes fontes de contaminação por L. monocytogenes tanto no abatedouro quanto
nas casas de carnes, nas quais ainda detectou-se a contaminação em amaciador. Os
sorotipos identificados das amostras positivas para L. monocytogenes em equipamentos
foram 1/2a e 4b (Tabela 1.5).
A freqüência geral de Listeria spp. detectada em amostras de instalações foi
de 35,4% (23); quando analisados individualmente os resultados das casas de carnes e
do abatedouro as freqüências foram de 36,5% e 30,8% respectivamente (Tabela 1.2).
As espécies identificadas foram: L. monocytogenes em 02 amostras (8,7%),
L. innocua em 18 (78,3%) e L. welshimeri em 03 (13%). As amostras positivas para L.
39
monocytogenes foram provenientes de pisos de casas de carnes. L. innocua não foi
detectada nas amostras de plataformas do abatedouro e de sistemas de refrigeração das
casas de carnes (Tabela 1.3). Observando-se a Tabela 1.4 verifica-se que os balcões
refrigeradores, os pisos e os ralos constituíram os principais pontos de contaminação das
casas de carnes. No abatedouro, pelas amostras analisadas, as instalações não
representaram fontes de contaminação por L. monocytogenes. Os sorotipos identificados
nas amostras de pisos foram dos grupos 1/2a e 4b (Tabela 1.5).
A análise da Tabela 1.2 permite verificar que não foi detectada a presença
de Listeria spp. nas amostras de produtos colhidas no abatedouro. Nas casas de carnes,
19% (27) de amostras de meias carcaças bovinas, 47,1% (24) de cortes comerciais,
66,7% (08) de carnes moídas e 90% (09) de lingüiças do tipo frescal foram positivas
para Listeria spp. As espécies identificadas foram L. monocytogenes (17,6%) e L.
innocua (82,4%). Deste total, L. monocytogenes foi detectada em 25,9% (07) das
amostras de meias carcaças bovinas, em 4,2% (01) de corte comercial, em 25% (02) de
carnes moídas e em 22,2% (02) amostras de lingüiças do tipo frescal (Tabela 1.3). Os
sorotipos identificados nas amostras positivas para L. monocytogenes foram 1/2a (30%)
e 4b (70%) (Tabela 1.5).
40
Tabela 1.2. Freqüência de Listeria spp. em amostras de equipamentos, instalações,
carnes e produtos cárneos provenientes de plantas de processamento de 11
estabelecimentos localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil.
Número de amostras Amostras analisadas Positivas para Listeria spp. (%)
Amostras
I II Total I II Total Equipamentos
Amaciadores 8 - 8 4 (50,0) - 4 (50,0) Balanças 9 - 9 5 (55,6) - 5 (55,6) Caixas plásticas 26 2 28 20 (76,9) 1 (50,0) 21 (75,0) Serras 10 - 10 3 (30,0) - 3 (30,0) Cubas de aço inoxidável 10 - 10 7 (70,0) - 7 (70,0) Embutideiras 2 1 3 2 (100,0) 1 (100,0) 3 (100,0) Estrados 10 - 10 6 (60,0) - 6 (60,0) Facas 15 6 21 4 (26,7) 0 (0,0) 4 (19,0) Ganchos 7 3 10 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) Mesas 20 1 21 12 (60,0) 0 (0,0) 12 (57,1) Misturadores 3 1 4 2 (66,7) 1 (100,0) 3 (75,0) Moedores 9 1 10 6 (66,7) 1 (100,0) 7 (70,0) Caminhões frigoríficos 4 - 4 1 (25,0) - 1 (25,0) Subtotal 133 15 148 72 (54,1) 4 (26,7) 76 (51,4)
Instalações
Balcões 11 - 11 3 (27,3) - 3 (27,3) Paredes 10 - 10 1 (10,0) - 1 (10,0) Pisos 9 1 10 5 (55,6) 1 (100,0) 6 (60,0) Plataformas - 5 5 - 0 (0,0) 0 (0,0) Ralos 18 7 25 10 (55,6) 3 (42,9) 13 (52,0) Sistemas de refrigeração 4 - 4 0 (0,0) - 0 (0,0) Subtotal 52 13 65 19 (36,5) 4 (30,8) 23 (35,4)
Produtos
Carcaças bovinas 142 9 151 27 (19,0) 0 (0,0) 27 (17,9) Carcaças suínas - 3 3 - 0 (0,0) 0 (0,0) Carne Moída 12 - 12 8 (66,7) - 8 (66,7) Cortes comerciais 51 1 52 24 (47,1) 0 (0,0) 24 (46,2) Embutidos - 2 2 - 0 (0,0) 0 (0,0) Lingüiças frescais 10 - 10 9 (90,0) - 9 (90,0) Subtotal 215 15 230 68 (31,6) 0 (0,0) 68 (29,6)
Total 400 43 443 159 (39,8) 8 (18,6) 167 (37,7)
I: Casas de carnes II: Abatedouro
(-) não amostrado
41
Tabela 1.3. Freqüências das diferentes espécies de Listeria spp. identificadas de amostras de equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos
provenientes de plantas de processamento de 11 estabelecimentos localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil.
Número de amostras (%) Positivas para Listeria spp. Listeria monocytogenes Listeria innocua Listeria seeligeri Listeria welshimeri
Amostras
I II Total I II Total I II Total I II Total I II Total Equipamentos
Amaciadores 4 - 4 1 (25,0) - 1 (25,0) 2 (50,0) - 2 (50,0) 0 - 0 1 (25,0) - 1 (25,0)
Balanças 5 - 5 0 - 0 4 (80,0) - 4 (80,0) 0 - 0 1 (20,0) - 1 (20,0)
Caixas plásticas* 20 1 21 4 (20,0) 0 4 (19,0) 11 (55,0) 1 (100,0) 12 (57,1) 2 (10,0) 0 2 (9,5) 2 (10,0) 0 2 (9,5)
Serras 3 - 3 0 - 0 2 (66,7) - 2 (66,7) 0 - 0 1 (33,3) - 1 (33,3)
Cubas de aço inoxidável 7 - 7 0 - 0 6 (85,7) - 6 (85,7) 0 - 0 1 (14,3) - 1 (14,3)
Embutideiras 2 1 3 0 0 0 2 (100,0) 1 (100,0) 3 (100,0) 0 0 0 0 0 0
Estrados 6 - 6 0 - 0 6 (100,0) - 6 (100,0) 0 - 0 0 - 0
Facas 4 0 4 0 - 0 4 (100,0) - 4 (100,0) 0 - 0 0 - 0
Mesas 12 0 12 0 - 0 10 (83,3) - 10 (83,3) 0 - 0 2 (16,7) - 2 (16,7)
Misturadores 2 1 3 1 (50,0) 0 1 (33,3) 1(50,0) 1 (100,0) 2 (66,7) 0 0 0 0 0 0
Moedores 6 1 7 1 (16,7) 0 1 (14,3) 4 (66,7) 1 (100,0) 5 (71,4) 0 0 0 1 (16,7) 0 1 (14,3)
Caminhões frigoríficos 1 - 1 0 - 0 1 (100,0) - 1 (100,0) 0 - 0 0 - 0
Subtotal 72 4 76 7 (9,7) 0 7 (9,2) 53 (73,6) 4 (100,0) 57 (75,0) 2 (2,8) 0 2 (2,6) 9 (12,5) 0 9 (11,8)
Instalações
Balcões 3 - 3 0 - 0 2 (66,7) - 2 (66,7) 0 - 0 1 (33,3) - 1 (33,3)
Paredes 1 - 1 0 - 0 1 (100,0) - 1 (100,0) 0 - 0 0 - 0
Pisos 5 1 6 2 (40,0) 0 2 (33,3) 2 (40,0) 1 (100,0) 3 (50,0) 0 0 0 1 (20,0) 0 1 (16,7)
Ralos 10 3 13 0 0 0 9 (90,0) 3 (100,0) 12 (92,3) 0 0 0 1 (10,0) 0 1 (7,7)
Subtotal 19 4 23 2 (10,5) 0 2 (8,7) 14 (73,7) 4 (100,0) 18 (78,3) 0 0 0 3 (15,8) 0 3 (13,0)
Produtos
Carcaças bovinas 27 0 27 7 (25,9) - 7 (25,9) 20 (74,1) - 20 (74,1) 0 - 0 0 - 0
Carnes Moídas 8 - 8 2 (25,0) - 2 (25,0) 6 (75,0) - 6 (75,0) 0 - 0 0 - 0
Cortes 24 0 24 1 (4,2) - 1 (4,2) 23 (95,8) - 23 (95,8) 0 - 0 0 - 0
Lingüiças frescais 9 - 9 2 (22,2) - 2 (22,2) 7 (77,8) - 7 (77,8) 0 - 0 0 - 0
Subtotal 68 0 68 12 (17,6) - 12 (17,6) 56 (82,4) - 56 (82,4) 0 - 0 0 - 0
Total 159 8 167 21 (13,2)
0
21 (12,6)
123 (77,4)
8 (100,0)
131 (78,4)
2 (1,3)
0
2 (1,2)
12 (7,5)
0
12 (7,2)
* Detecção de Listeria grayi em 01 amostra de caixa plástica proveniente de casas de carnes (5,0%). Outras freqüências: 4,8% (total de caixas plásticas positivas); 1,4% (total de amostras positivas de equipamentos de casas de carnes); 1,3% (total de amostras positivas de equipamentos); 0,6% (total de amostras positivas de casas de carnes); 0,6% (total de amostras positivas).
I: Casas de carnes II : Abatedouro ( - ) não amostrado
42
Tabela 1.4. Principais pontos de contaminação por Listeria spp. e L. monocytogenes em
equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos identificados em 11
estabelecimentos processadores de carne localizados na região norte do estado do
Paraná, Brasil.
Origem Principais pontos de contaminação Listeria spp. Listeria monocytogenes
Equipamentos
I Amaciadores, balanças, caixas plásticas, cubas de aço inoxidável, embutideiras, mesas, misturadores, moedores e serras.
Amaciadores, caixas plásticas, misturadores e moedores.
II Caixas plásticas, embutideiras, misturadores e moedores.
--
Instalações
I Balcões refrigeradores, pisos e ralos.
Pisos
II Pisos e ralos. --
Produtos
I Carcaças bovinas, carnes moídas, cortes comerciais e lingüiças frescais.
Carcaças bovinas, carnes moídas e lingüiças frescais.
II -- --
I: Casas de carnes II: Abatedouro
Tabela 1.5. Ocorrência de sorotipos de L. monocytogenes em amostras colhidas de
equipamentos, instalações e produtos provenientes de 11 estabelecimentos
processadores de carne bovina da região norte do estado do Paraná, Brasil.
Origem N. de culturas testadas Sorotipos Equipamentos
Amaciador 1 4b Caixas plásticas 4 4b Misturador 1 4b Moedor 1 1/2a
Instalações
Pisos 2 1/2a, 4b Produtos
Carcaças bovinas 7 1/2a, 4b Carne Moída 1 1/2a Lingüiças frescais 2 4b
43
4. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
Para alguns autores a presença de L. monocytogenes em carcaças é
usualmente atribuída à contaminação por matéria fecal durante o abate, sendo estimada
uma alta porcentagem (11 a 52%) de animais portadores sadios (ROCOURT, 1994). Em
recente pesquisa, Hofer e Reis (2005) relatam freqüência de 57,6% (142) amostras
positivas para L. innocua, resultante principalmente de fezes de bovinos normais, e de
41,4% (102) positivas para L. monocytogenes das quais 30,4% (75) foram provenientes
de fezes e secreção nasal de bovinos normais do estado do Rio de Janeiro.
Nesbakken et al. (1996) consideram o meio ambiente das plantas de
processamento como importante fonte de contaminação, e citam pesquisa realizada por
Van den Elzen e Snijders (1993) em abatedouro de suínos que mostra uma maior
incidência de L. monocytogenes no ambiente das salas de cortes do que no início do
abate. Diversas pesquisas sobre a ocorrência desse microrganismo em plantas de
processamento de carnes também apontam o meio ambiente e os equipamentos como
fontes de contaminação de carnes e produtos cárneos (SLADE, 1992; PICCHI et al.,
1999; SUIHKO et al., 2002; PECCIO et al., 2003; BARBALHO et al., 2005; BARROS
et al., 2004; GUDBJÖRNSDÓTTIR et al., 2004).
Os resultados obtidos nessa pesquisa indicaram que a contaminação da
carne por Listeria spp. originou-se principalmente, do ambiente de processamento das
casas de carnes, e a contaminação do ambiente pode ter ocorrido a partir de carcaças
contaminadas e por manipuladores. Nas meias carcaças das casas de carnes verificou-se
a presença de L. monocytogenes e L. innocua. Como apenas um caminhão transportador
apresentou contaminação e nas casas de carnes foram identificados vários pontos
contaminados por diversas espécies de listeria, acreditamos que o ambiente tenha
favorecido essa contaminação já nas câmaras frias.
As caixas plásticas, nas quais ficam acondicionados diversos tipos de
produtos como cortes específicos, embutidos e até carnes moídas foram os
equipamentos que apresentaram as maiores freqüências de contaminação por
L. monocytogenes e por outras espécies. Esse tipo de equipamento é particularmente
difícil de ser higienizado adequadamente, pela própria natureza do material e formato
com várias reentrâncias resultando no acúmulo de matéria orgânica que favorece o
crescimento de microrganismos e a formação de biofilmes. O crescimento em biofilmes
pode conferir uma proteção contra a ação de desinfetantes com conseqüente
44
manutenção do microrganismo no ambiente e em equipamentos como fatiadores,
moedores e embutideiras que também são considerados de difícil higienização
(MØRETRØ e LANGSRUD, 2004).
Considerando os resultados obtidos, equipamentos similares (amaciadores,
moedores, embutideiras e misturadores) representaram importantes pontos de
contaminação por Listeria spp. e L. monocytogenes, principalmente os moedores que
participam da etapa final do processamento de embutidos e da carne moída que em
diversas regiões é adquirida e consumida na forma in natura. Todos os equipamentos,
com exceção dos ganchos apresentaram contaminação por Listeria spp. e com relação
às instalações, apenas nas plataformas do abatedouro e nos sistemas de refrigeração das
câmaras frias das casas de carnes o microrganismo não foi detectado. Evans et al.
(2004) avaliando a contaminação de sistemas de refrigeração de câmaras frias de 15
estabelecimentos processadores de diversos alimentos no Reino Unido, também não
detectaram a presença de Listeria spp. nesses equipamentos.
As carcaças suínas e os embutidos foram provenientes do abatedouro, sendo
que as primeiras estavam congeladas e os embutidos eram processados termicamente, o
que pode explicar a ausência do patógeno. De acordo com Nesbakken et al. (1996)
poucos, ou até nenhum, isolados de L. monocytogenes são recuperados a partir de
carcaças suínas. As freqüências para a presença de Listeria spp. (74,1%) e L.
monocytogenes (25,9%) em carcaças bovinas estabelecidas em nossa pesquisa foram
superiores às relatadas por outros pesquisadores.
Madden et al. (2001) não detectaram a presença do microrganismo em 200
amostras de carcaças na Irlanda do Norte. Fenlon et al. (1996) em pesquisa realizada no
Reino Unido encontraram 7% de amostras de carcaças positivas para L. monocytogenes.
Nos Estados Unidos, na análise de 2089 carcaças a freqüência de L. monocytogenes foi
de 4,1% (Mc NAMARA, 1995) e na Austrália foi de 0,77% (n=130) em carcaças
provenientes de abatedouros exportadores (VANDERLINDE et al., 1998). Na Itália,
Peccio et al. (2003) utilizando técnica de número mais provável (NMP) para análise
quantitativa em carcaças bovinas, encontraram 19% (n=26) positivas para L.
monocytogenes e em níveis abaixo de 50NMP/g.
No Brasil, Picchi et al.(1999) relatam a ocorrência de 96% (n=25) de
Listeria spp. e 20% de L. monocytogenes em amostras de quartos dianteiros de bovinos
desossados provenientes de abatedouros sob Inspeção Federal no estado de São Paulo.
Todos os estabelecimentos que fizeram parte do presente estudo recebem carcaças e
45
cortes prontos de abatedouros/frigoríficos sob serviço de Inspeção Federal e possuem
Médicos Veterinários como responsáveis técnicos.
Pesquisas avaliando a ocorrência do patógeno em carnes cruas e em
produtos cárneos em vários países enfatizam a questão da contaminação dos produtos
finais e prontos para o consumo (NG e SEAH, 1995; UYTTENDAELE et al., 1999;
NØRRUNG et al., 1999; GILLESPIE et al., 2000; OJENIYI et al., 2000; CORDANO et
al., 2001; RØRVIK et al., 2003; MENA et al., 2004; SILVA et al., 2004; VITAS et al.,
2004).
Neste trabalho, os cortes comerciais foram selecionados dentre aqueles que
são geralmente destinados ao preparo de alimentos consumidos crus, como o kibe cru e
o carpaccio, assim como os que por hábitos e preferências são consumidos mal
passados, como picanha e filé mignon. No Brasil, deve-se considerar a carne moída
como um produto cárneo e até como um alimento pronto para o consumo, já que serve
de base para pratos de origem árabe, muito apreciado nas regiões Sul e Sudeste.
Portanto, as freqüências observadas para Listeria spp. (75%) e para L. monocytogenes
(25%) nesse produto, devem ser consideradas importantes assim como os resultados
obtidos nas análises das lingüiças mistas do tipo frescal, que apresentaram
contaminação por L. monocytogenes (22,2%) e L. innocua (77,8%).
Mena et al. (2004) relatam que as freqüências do patógeno observadas em
produtos crus como carnes bovinas e de aves (17,7% e 60% respectivamente), em leites
crus (16,7%), em peixes crus (12%) e vegetais (12,9%) avaliados em Portugal, não são
considerados de risco já que esses alimentos geralmente são submetidos a tratamentos
térmicos antes do consumo. Na Dinamarca, estudo realizado por Nørrung et al. (1999)
mostrou que produtos cárneos não submetidos a tratamentos térmicos apresentavam
contagens maiores do que 100 células de L. monocytogenes/g, tornando o alimento
inaceitável para o consumo. Ng e Seah (1995) em Singapura analisaram diversos
alimentos, de origens animal e vegetal (n=606) e encontraram 14 amostras positivas
para L. monocytogenes, sendo 02 de saladas vegetais e 12 de produtos cárneos como
presuntos, salsichas, peixes, moluscos e sanduíches de carnes.
As freqüências das diferentes espécies de listeria estabelecidas nesse estudo
estão de acordo com as observadas por outros autores, especialmente sobre a
predominância de L. innocua sobre L. monocytogenes e outras espécies (SLADE, 1992;
PICCHI et al., 1999; CAPITA et al., 2001; BARBALHO et al., 2005;
GUDBJÖRNSDÓTTIR et al., 2004; SILVA et al., 2004; HOFER e REIS, 2005). Ainda,
46
L. welshimeri, L. seeligeri e L. grayi foram isoladas de amostras de equipamentos e
instalações, enquanto Hofer et al. (2000) destacam o isolamento de L. welshimeri e
L. seeligeri em amostras de alimentos de origem animal (lácteos e cárneos)
Diversos autores têm ressaltado que a presença das espécies de listeria não
patogênicas para o homem, em particular de L. innocua, não deve ser subestimada. Em
1988, autores como Seeliger, Feresu e Jones, citados por Slade (1992) afirmaram que a
presença de uma espécie, em um ambiente específico, poderia ser indicativa da presença
de outras espécies, inclusive de L. monocytogenes, e que L. innocua seria um excelente
indicador para esse patógeno.
Duffy et al. (2001), realizaram estudo para investigar se a maior freqüência
de recuperação de L. innocua em amostras de carnes poderia ser devida às metodologias
que utilizam meios seletivos de enriquecimento preconizados por diversos órgãos
internacionais, que resultariam em detecções “artificialmente” mais baixas da espécie
patogênica. Os autores concluíram que não houve diferença significativa na recuperação
das duas espécies em meios seletivos e não seletivos, e ainda argumentam que, o uso de
várias etapas em alguns procedimentos para isolamento do microrganismo pode ser
desnecessário.
Nessa pesquisa procedeu-se a uma alteração no protocolo referente ao
volume do diluente em que as amostras foram resuspensas, ou quantidade de alimento
amostrada, e do volume de caldo UVM reduzindo de 25mL ou g. de amostra em 225mL
de caldo UVM, para 5mL ou g. de amostra em 45mL de caldo mantendo-se, no entanto
a proporção entre amostra e meio de cultura utilizado. Essa alteração parece não ter
interferido na detecção de Listeria spp. nas amostras avaliadas tendo em vista as
freqüências obtidas. Outros pesquisadores comparando metodologias para isolamento e
identificação de L. monocytogenes efetuaram redução nas quantidades de amostras e
meios de enriquecimento utilizados não observando alterações na detecção do patógeno
(LEWIS e CORRY, 1991; DUFFY et al., 2001).
Kamat e Nair (1996) sugerem a utilização de L. innocua como um indicador
biológico para o controle de L. monocytogenes, em indústrias processadoras de produtos
cárneos, já que as duas espécies apresentaram respostas similares aos diversos
tratamentos físicos químicos a que foram submetidas, como o aquecimento à 75oC,
diferentes doses de irradiação, diversas concentrações de ácido lático e Cloreto de sódio.
Para os autores, L. innocua seria um indicador de higiene e de segurança apropriado
47
para ser utilizado no desenvolvimento de programas de Análise de Perigos e Pontos
Críticos de Controle (APPCC).
Os sorotipos identificados nessa pesquisa pertenceram aos grupos 1/2a
(35%) e 4b (65%) e a distribuição destes foi equivalente para amostras de carnes e
produtos assim como para equipamentos e instalações. Hofer et al. (2000) em estudo de
identificação de espécies e sorotipos de 3112 amostras de diferentes origens e estados
brasileiros mantidas em coleção durante 26 anos, relatam que os sorotipos mais
prevalentes de L. monocytogenes em amostras humanas e de produtos cárneos foram 4b,
1/2a e 1/2b e em amostras ambientais houve predomínio do sorotipo 1/2b.
Os mesmos autores apontam ainda a identificação do sorotipo 1c em
carcaças, carne de frango e produtos fatiados, mas com discreta ocorrência. Já Vitas et
al. (2004) identificaram em produtos cárneos da Espanha, além dos sorotipos 1/2a, 1/2b
e 4b, o sorotipo 1/2c que inclusive foi o de maior freqüência, salientando que o mesmo
não está relacionado a casos de listeriose.
A Resolução da Diretoria Colegiada, da Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA-RDC no. 12/2001) que aprovou o Regulamento Técnico sobre
Padrões Microbiológicos para Alimentos, somente estabeleceu a pesquisa de
L. monocytogenes (ausência em 25g) para queijos de média a muito alta umidade
(BRASIL, 2001). Com relação à carne e aos produtos cárneos, não há parâmetros para a
presença do patógeno e talvez isso se deva à idéia de que a carne seja um produto que
será consumido após cozimento, não se levando em consideração, como já mencionado,
que vários pratos têm como base de preparo a carne crua. Mesmo aqueles que são
termicamente preparados, não estão livres das contaminações cruzadas pela
manipulação inadequada e processamento com equipamentos e utensílios que, quando
não higienizados adequadamente, atuam como importantes fontes de contaminação do
produto final.
Como conclusão, ficou demonstrado que Listeria spp. e L. monocytogenes
estão amplamente distribuídas em equipamentos e instalações das plantas de
processamento, na carne bovina e nos produtos cárneos analisados. Os resultados
indicaram claramente que equipamentos e instalações como moedores misturadores,
embutideiras, amaciadores, caixas plásticas, cubas e pisos requerem atenção especial
com relação aos procedimentos de higienização e sanitização.
Neste estudo, os principais pontos de contaminação por Listeria spp. foram
identificados nas casas de carnes. Ainda, a freqüência do patógeno em produtos finais
48
como a carne moída e a lingüiça do tipo frescal podem representar risco à saúde do
consumidor, principalmente para as populações consideradas de risco, como os idosos,
as gestantes e os imunocomprometidos. A identificação dos sorotipos 1/2a e 4b de
L. monocytogenes identificados em amostras de equipamentos e instalações, sugere uma
contaminação ambiental persistente que pode comprometer a segurança alimentar de
todos os outros produtos comercializados nesses estabelecimentos, como carnes de
aves, de pescado e de outras espécies não avaliadas nessa pesquisa.
É necessária a implantação de práticas de higienização e sanitização
realmente eficientes, principalmente nas casas de carnes, e a adoção de uma política
regulatória quanto aos limites permitidos do patógeno na carne e produtos cárneos que
garantam a segurança alimentar.
5. AGRADECIMENTOS
A Dra. Cristhiane Moura Falavina dos Reis, do Laboratório de Zoonoses
Bacterianas do Departamento de Bacteriologia do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de
Janeiro, Brasil, pela identificação dos sorotipos das culturas de Listeria monocytogenes.
49
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ARTIGO 2
MICRORGANISMOS INDICADORES NA CARNE
BOVINA E IDENTIFICAÇÃO DOS PONTOS DE
CONTAMINAÇÃO NO PROCESSAMENTO
Márcia de Aguiar Ferreira Barros*1, Luís Augusto Nero2, Lívia Cavalletti
da Silva1, Loredana d’Ovídio1, Ronaldo Tamanini1, Rafael Fagnani1,
Douglas Magnani1, Vanerli Beloti1
*Autor para correspondência: M.A.F. Barros, Laboratório de Inspeção de Produtos de Origem Animal,
DMVP, Universidade Estadual de Londrina. Caixa Postal 6001, 86051 990, Londrina, PR. Tel.: (43) 3371
4708, Fax.: (43) 3371 4714. E-mail: mafer@folhaweb.com.br 1 Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Estadual de Londrina, Londrina PR. 2 Departamento de Veterinária, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa MG.
57
RESUMO
A pesquisa de microrganismos indicadores como aeróbios mesófilos, coliformes totais,
Escherichia coli, bolores e leveduras, é uma ferramenta útil no controle da qualidade da
carne. Nesta pesquisa objetivou-se avaliar a qualidade microbiológica da carne bovina
in natura e de produtos cárneos, além da identificação dos principais pontos de
contaminação em plantas de processamento de 10 casas de carnes e 01 abatedouro de
bovinos, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil. Para as análises
utilizou-se o sistema Petrifilm™ AC, EC e YM para aeróbios mesófilos (AM),
coliformes totais (CT) e E. coli (EC), bolores e leveduras, respectivamente. Os
resultados obtidos foram convertidos em log10 e as médias analisadas em níveis de
contaminação. Os equipamentos e dos estabelecimentos avaliados apresentaram médias
de contaminação por AM de 4,77 log UFC/cm2, por CT de 2,59 log UFC/cm2, por EC
de 1,84 log UFC/cm2, por bolores de 3,27 log UFC/cm2 e leveduras de 3,29 log
UFC/cm2. Os amaciadores, as caixas plásticas, as cubas de aço inoxidável, as
embutideiras, as facas, os ganchos, os misturadores e os moedores foram os
equipamentos que apresentaram os maiores níveis de contaminação. As médias de
contaminação das instalações para AM foram de 5,12 log UFC/cm2, para CT de 3,10
log UFC/cm2, para EC de 2,41 log UFC/cm2, para bolores e leveduras de 3,74 log
UFC/cm2 e 3,84 log UFC/cm2 respectivamente. Com exceção dos sistemas de
refrigeração, todos os tipos de instalações apresentaram altos níveis de contaminação
por todos os microrganismos pesquisados. Nos produtos verificaram-se médias para
AM de 3,93 log UFC/cm2 ou g., para CT de 1,73 log UFC/cm2 ou g., para EC de 1,13
log UFC/cm2 ou g., para bolores de 2,51 log UFC/cm2 ou g. e leveduras de 2,35 log
UFC/cm2 ou g. Os produtos que apresentaram as maiores contaminações foram as
amostras de carne moída e de lingüiças do tipo frescal indicando incorporação de uma
microbiota indesejável ao produto. Esta pesquisa identificou os principais pontos de
incorporação de microrganismos na carne e os resultados indicam a necessidade da
implantação de práticas de higienização e sanitização realmente eficientes nesses
estabelecimentos.
Palavras chaves: carne bovina; contaminação da carne; microrganismos indicadores;
processamento da carne; Escherichia coli.
58
ABSTRACT
Indicators microorganisms in red meat and identification of contamination points.
The research of indicators microorganisms (such as mesophilic aerobes - MA, total
coliforms - TC, Escherichia coli - EC, moulds and yeasts) is a useful tool in
microbiological quality control of food and meat, especially concerning the presence of
pathogens and spoilage microorganisms. In this work, the microbiological quality of red
raw meat and meat products was evaluated in 10 meat retailers and 1 slaughterhouse,
located in north of Paraná state, Brazil. The main contamination points of these
indicators microorganisms were also detected in the processing plants. Petrifilm™
plates (AC, EC and YM) were used to enumerate MA, TC, EC, moulds and yeasts. The
obtained counts were converted in log10 and the mean values were calculated,
considering each sample and sample class (equipments and transport, installations,
products). Equipments and transport samples showed the following contamination
means: 4.77 log UFC/cm2 MA, 2.59 log UFC/cm2 TC, 1.84 log UFC/cm2 EC, 3.27 log
UFC/cm2 moulds, 3.29 log UFC/cm2 yeasts. The smothers, plastic boxes, stainless steel
boxes, packing devices, knifes, hooks, mixers and grinders were the equipments that
showed the most contaminations levels. Installation samples showed: 5.12 log UFC/cm2
MA, 3.10 log UFC/cm2 TC, 2.41 log UFC/cm2 UFC, 3.74 log UFC/cm2 moulds, 3.84
log UFC/cm2 yeasts. All samples showed high contamination levels, except
refrigeration systems. Products samples showed: 3.93 log UFC/cm2 or g. MA, 1.73 log
UFC/cm2 or g. TC, 1.13 log UFC/cm2 or g. UFC, 2.51 log UFC/cm2 or g. moulds, 2.35
log UFC/cm2 or g. yeasts. Ground beef and fresh sausages showed the highest levels of
contamination indicating incorporation of undesirable microorganisms to these
products. This work identified the main points of contamination of microorganism in
red meat processing, showing the necessity of efficient cleaning and disinfection
practices in meat establishments.
Key words: red meat; meat contamination; indicators microorganisms; meat
processing; Escherichia coli;
59
1. INTRODUÇÃO
A carne é considerada uma importante fonte de proteínas, aminoácidos
essenciais, vitaminas especialmente as do complexo B e minerais como o ferro (PARDI
et al., 1993). Devido a essa composição rica em nutrientes constitui-se em um excelente
meio de cultura para o desenvolvimento de microrganismos, deteriorantes e patogênicos
(LANDGRAF, 1996; BORCH e ARINDER, 2002).
Embora não seja de consenso geral, admite-se que a carne de carcaças
provenientes de animais sadios pode ser considerada estéril (GILL, 1979). Na
transformação de carcaças em cortes comerciais e produtos cárneos, a contaminação
microbiana é um resultado indesejável e inevitável. A contaminação externa pode
ocorrer pela incorporação de microrganismos em diversas operações que são executadas
na sua obtenção, como no abate, desossa, processamento, armazenamento e distribuição
(GILL, 1998).
De acordo com Borch e Arinder (2002), a rota da contaminação cruzada
ocorre por deposição de matéria fecal em carcaças, pelo contato entre carcaças
contaminadas com não contaminadas, pelo ambiente de processamento, por meio de
equipamentos, operadores, instalações e ar. Os mesmos autores relataram a ocorrência
de Escherichia coli verotoxigênica em carcaças não refrigeradas e em amostras de fezes
dos bovinos, indicando contaminação direta das carcaças pelas fezes, e indireta a partir
dos equipamentos e dos operadores.
As carnes em geral, vermelhas e brancas, são reconhecidas como
deterioradas se alterações organolépticas as tornam inaceitáveis para o consumo. Os
fatores associados com a deterioração podem incluir as alterações na coloração ou na
textura, o desenvolvimento de sabores e odores estranhos e a formação de limosidade,
ou qualquer outra característica que torne o alimento indesejável para o consumidor
(LANDGRAF, 1996).
De acordo com a literatura, níveis de contaminação de até 105 UFC/cm2
indicariam que o abate ocorreu em condições higiênicas, e superiores que as condições
teriam sido insatisfatórias (GILL, 1998). Contaminações da carne em torno de 106
UFC/cm2 indicam processo de deterioração com odor desagradável e comprometimento
da vida de prateleira, e a partir de 107 UFC/cm2 a limosidade já é evidente
(LANDGRAF, 1996; GILL, 1998).
60
A carne pode tornar-se contaminada com uma grande variedade de
microrganismos patogênicos, como Clostridium botulinum e Staphylococcus aureus,
Salmonella, E. coli verotoxigênica, Campylobacter, Yersinia enterocolitica, Listeria
monocytogenes e Aeromonas hydrophila (FENLON et al., 1996; VANDERLINDE et
al., 1998; MADDEN et al., 2001). Os microrganismos do gênero Pseudomonas
geralmente estão associados à deterioração da carne vermelha (KOTULA e KOTULA,
2000)
A forma mais eficiente de reduzir a contaminação e o desenvolvimento
microbiano em alimentos é estabelecer programas de controle de qualidade como as
Boas Práticas de Manipulação (BPM) e a Análise de Perigos e Pontos Críticos de
Controle (APPCC). Com a impossibilidade de monitorar de forma eficiente a
contaminação da carne por todos os microrganismos, utiliza-se a pesquisa dos
microrganismos denominados indicadores, extremamente úteis no controle de qualidade
da carne quanto à presença de microrganismos patogênicos e deteriorantes (JAY,
2000).
Para produtos à base de carne in natura, a segurança e a qualidade podem
ser estimadas com o uso da contagem de microrganismos indicadores que incluem a
contagem de aeróbios mesófilos (AM), de coliformes totais (CT) e de E. coli (EC). A
contagem de AM fornece uma estimativa da população microbiana total e altas
contagens usualmente estão relacionadas à baixa qualidade e reduzida vida de prateleira
dos produtos (GILL, 1998; JAY, 2000).
A partir das contagens de CT e EC podem-se estimar falhas na higiene e
contaminação de origem fecal, sendo que altas contagens destes grupos de
microrganismos geralmente estão relacionadas a níveis significativos de
enteropatógenos (JAY, 2000; GILL et al., 1996a; EISEL et al., 1997). De acordo com
normas do USDA Pathogen Reduction Act (1996), entre os regulamentos para inspeção
de carnes bovina e de frango, a avaliação da E. coli em carcaças passa a ser obrigatória.
Bolores e leveduras são importantes organismos oportunistas deteriorantes
de carnes vermelhas e produtos cárneos e a rota de contaminação parece ser a mesma
das bactérias, sendo originários do meio ambiente e contaminando as plantas de
processamento durante o abate (DILLON, 1998).
A contagem de bolores em equipamentos tem sido usada como indicadora
da qualidade da sanitizacão em plantas de processamento de alimentos. Esses bolores
crescem rapidamente em resíduos de alimentos que aderem às superfícies dos
61
equipamentos e contaminam os alimentos que passam por esse local contaminado
(LANDGRAF, 1996). Diversos bolores, e possivelmente algumas leveduras podem
representar perigo para a saúde humana e animal por produzirem metabólitos tóxicos,
denominados de micotoxinas, que em sua maioria são compostos termoestáveis
mantendo-se ativas após tratamentos térmicos (DILLON, 1998).
Estudos sobre a ocorrência de bolores e leveduras na carne são
relativamente raros quando comparados com os referentes às bactérias. Contaminações
de alimentos por bolores e leveduras podem resultar em substanciais perdas econômicas
para os produtores, as indústrias e para os consumidores.
A legislação brasileira aprovou a regulamentação de parâmetros para a
contaminação por Salmonella spp. em carcaças bovinas e carnes moídas (ausência em
25g); para produtos cárneos crus refrigerados ou congelados, (hambúrguer, almôndegas,
quibe e similares) e embutidos frescais os padrões estabelecidos são para coliformes a
45oC (5 x 102UFC/g), estafilococos coagulase positiva (103UFC/g), clostrídios sulfito
redutores (5 x 102UFC/g) e ausência de Salmonella spp. em 25 g (BRASIL, 2001).
O Brasil atingiu em 2004 um novo recorde na exportação de carne, com um
volume de 1.156.770 toneladas de carne bovina, que correspondeu a uma participação
de 26,3%, de todo o volume exportado (4.392.252 toneladas). Entre as causas desse
desempenho favorável estão as mudanças nos fluxos de comércio motivadas pela
ocorrência de casos de Encefalopatia Espongiforme Bovina, no Canadá e nos Estados
Unidos, em maio e dezembro de 2003, respectivamente (Anônimo, 2005).
No Brasil são necessários estudos mais detalhados sobre as condições de
produção e processamento da carne bovina brasileira, que permitam a adoção de
medidas de controle específicas, que garantam a segurança e possam contribuir com a
melhoria da qualidade da carne visando uma maior valorização nos mercados nacional e
internacional.
O objetivo dessa pesquisa foi avaliar a qualidade microbiológica da carne
bovina in natura e as condições higiênico-sanitárias das plantas de processamento, pela
pesquisa de microrganismos indicadores na carne, em equipamentos e instalações de
estabelecimentos processadores. Ainda, pretendeu-se identificar os principais pontos de
contaminação e incorporação desses microrganismos, visando a implantação de boas
práticas de fabricação nos estabelecimentos, e conseqüente melhoria da qualidade
microbiológica do produto.
62
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Amostras
As amostras foram colhidas em 11 estabelecimentos processadores de carne
(10 casas de carnes e 01 abatedouro) localizados na região norte do estado do Paraná,
totalizando 443 amostras, no período de Julho de 2003 a Fevereiro de 2005, sendo as
análises realizadas no Laboratório de Inspeção de Produtos de Origem Animal (LIPOA)
da Universidade Estadual de Londrina. Nas casas de carnes foram colhidas 185
amostras de equipamentos e instalações, 142 de meias carcaças bovinas, 51 de cortes
comerciais, 10 de embutidos do tipo frescal e 12 de carnes moídas totalizando 400
amostras. No abatedouro/frigorífico foram colhidas 28 amostras de equipamentos e
instalações, 12 de meias carcaças bovinas e suínas e 03 de cortes e embutidos
totalizando 43 amostras. Na tabela 2.1 estão descritos todos os pontos analisados assim
como as áreas amostradas
2.2. Pontos de amostragem e procedimentos de colheita
Para as colheitas utilizou-se a técnica do esfregaço de superfície (ABNT,
1988) com swabs e moldes estéreis. As amostras foram diluídas em 45mL de água
peptonada 0,1% e processaram-se diluições seriadas em salina 0,85%.
Produtos
- Meias carcaças refrigeradas: foram realizados swabs de meias carcaças
refrigeradas, utilizando-se a técnica do esfregaço de superfície que consiste em
selecionar 5 pontos demarcados com moldes estéreis de 10cm2. Os 5 swabs foram
colocados em uma mesma bag estéril contendo 45mL de diluente (água peptonada
0,1%) formando um pool da amostra.
- Cortes comerciais: foram amostrados cortes que comercialmente são
destinados ao preparo de alimentos consumidos crus ou mal passados (lagarto, filé
mignon, picanha e cortes dianteiros) e o procedimento de colheita foi o mesmo utilizado
para as meias carcaças, mas utilizando dois moldes de 25cm2.
- Embutidos e carnes moídas: 5g de cada amostra foram homogeneizados
em stomacher, com 45 mL de água peptonada 0,1% .
63
Equipamentos
Consistiram de amaciadores, balanças, caixas plásticas, cubas de aço
inoxidável, embutideiras, estrados, facas, ganchos, mesas, misturadores, moedores,
serras e caminhões frigoríficos (paredes laterais internas e piso) e os pontos demarcados
variaram de 2 a 3 conforme o tamanho do equipamento, com exceção dos ganchos em
que toda a área de superfície foi amostrada.
Instalações
Consistiram dos balcões refrigeradores, paredes, pisos, plataformas, ralos e
sistemas de refrigeração e os pontos demarcados variaram de 2 a 3 conforme o tamanho
do equipamento, com exceção dos ralos em que toda a área de superfície foi amostrada.
2.3. Enumeração de microrganismos indicadores
Na pesquisa de microrganismos indicadores, utilizou-se o sistema
PetrifilmAC para aeróbios mesófilos (AM), Petrifilm EC para coliformes totais
(CT) e E. coli (EC) e Petrifilm YM para bolores e leveduras, conforme orientação do
fabricante. As contagens obtidas foram inicialmente padronizadas de acordo com a
diluição considerada e a área amostrada e expressos em UFC/cm2 ou g.
2.4. Análise estatística
Os resultados das contagens dos microrganismos pesquisados foram
convertidos em log10, e vários parâmetros estatísticos foram calculados considerando o
tipo de amostra, as classes e origem, utilizando-se o programa Statistica 6.0.
Tabela 2.1. Pontos de amostragem, total de amostras colhidas e área de superfície.
64
Descrição das amostras Casas de carnes
Abatedouro Total Área / quantidade amostrada
n n n cm2/ g Equipamentos
Amaciadores 8 - 8 30 cm2 Balanças 9 - 9 30 cm2 Caixas plásticas 26 2 28 30 cm2 Cubas de aço inoxidável 10 - 10 30 cm2 Embutideiras 2 1 3 30 cm2 Estrados 10 - 10 30 cm2 Facas 15 6 21 30 cm2 Ganchos 7 3 10 Área de superfície Mesas 20 1 21 60 cm2 Misturadores 3 1 4 30 cm2 Moedores 9 1 10 30 cm2 Serras 10 - 10 30 cm2 Caminhões frigoríficos 4 - 4 60 cm2
Instalações Balcões refrigeradores 11 - 11 60 cm2 Paredes 10 - 10 60 cm2 Pisos 9 1 10 60 cm2 Plataformas - 5 5 60 cm2 Ralos 18 7 25 Área de superfície Sistemas de refrigeração 4 - 4 60 cm2
Produtos
Carcaças bovinas 142 9 151 50 cm2 Carcaças suínas - 3 3 50 cm2 Carne Moída 12 - 12 5 g Cortes comerciais 51 1 52 50 cm2 Embutidos - 2 2 5 g Lingüiças tipo frescal 10 - 10 5 g
Total 400 43 443
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A média logarítmica das contagens de AM em amostras de equipamentos
das casas de carnes e do abatedouro foi de 4,68 log UFC/cm2 com níveis mínimos de
contaminação de 1,52 log UFC/cm2 e máximos de 8,56 log UFC/cm2. O desvio padrão
obtido foi de 1,61. Os ganchos, as cubas de aço inoxidável, as embutideiras, os
misturadores, os moedores e as caixas plásticas apresentaram médias de contaminação
superiores à geral para AM em equipamentos (Tabela 2.2).
A análise da Tabela 2.3 indica que a média dos níveis de contaminação por
CT dos equipamentos foi de 2,55 log UFC/cm2 com valores mínimos abaixo de 1 log
UFC/cm2 e máximos de 7 log UFC/cm2. O desvio padrão dessas médias foi 1,28. Os
65
ganchos, as cubas de aço inoxidável, os moedores, as embutideiras, os misturadores e as
caixas plásticas foram os equipamentos que apresentaram as maiores médias de
contaminação por CT (maiores do que 2,5 log UFC/cm2).
A média das contagens de contaminação por EC foi de 1,80 log
UFC/cm2, com níveis mínimos de -0,48 log UFC/cm2 e máximos de 5,72 log UFC/cm2.
Os equipamentos com as maiores médias de contaminação por EC foram os ganchos, os
misturadores, os moedores, as facas e as cubas de aço inoxidável (Tabela 2.4).
Nas Tabelas 2.5 e 2.6 são demonstradas as médias logarítmicas obtidas nas
contagens de bolores (3,20 log UFC/cm2) e leveduras (3,21 log UFC/cm2). Os ganchos,
as caixas plásticas e as cubas de aço inoxidável foram os equipamentos com maiores
médias de contaminação por esses microrganismos.
Pela análise das figuras 2.1 e 2.2 observa-se que visualmente, as
contaminações dos equipamentos por AM, bolores e leveduras foram superiores às de
CT e EC nas casas de carnes. No abatedouro, visualmente a média observada para CT
foi semelhante à observada para bolores. Os níveis de contaminação dos equipamentos
observados nessa pesquisa foram superiores aos relatados por outros pesquisadores.
Gill (1998) e Eisel et al. (1997) consideram que superfícies visivelmente
limpas ainda podem apresentar contagens totais de 10 a 103UFC/cm2. Hood e Zottola
(1995) consideram contagens a partir de 104UFC/cm2 como suficientes para iniciar a
formação de biofilmes. No presente estudo, com exceção dos sistemas de refrigeração,
todos os tipos de equipamentos apresentaram médias de níveis de contaminação por
AM superiores a esta. Há evidências de que os microrganismos quando aderidos às
superfícies de contato, representam um risco em potencial, pois durante o
processamento do alimento pode ocorrer deslocamento desses microrganismos para o
produto (HOOD e ZOTTOLA, 1995). Ainda, a presença de matéria orgânica reduz
significativamente a ação de compostos sanitizantes.
Siqueira et al. (2004) avaliando a contaminação por AM, CT, fungos
filamentosos, leveduras e Salmonella spp. em seis tipos de equipamento para
processamento de embutidos, relatam que as contagens foram abaixo de 2UFC/cm2 para
AM e CT e que 23,3% das amostras apresentaram contagens superiores a 2UFC/cm2
para fungos filamentosos e leveduras.
Eisel et al. (1997) avaliaram a contaminação de caminhões e consideraram
os mesmos adequadamente limpos e sanitizados, e concluíram que para produtos
cárneos crus, o contato com equipamentos de processamento provavelmente não
66
represente uma forma significativa de contaminação microbiana geral, exceto quando as
superfícies estão contaminadas por patógenos como E. coli O157:H7, que em baixos
níveis de contaminação pode causar doença.
Os resultados obtidos demonstraram exatamente o contrário, pois
observamos que as carcaças, mesmo apresentando médias de contaminação expressivas,
essas ainda foram menores quando comparadas com as dos produtos finais como os
cortes comerciais, as carnes moídas e os embutidos sugerindo incorporação de
microrganismos a partir dos equipamentos, caminhões e instalações.
Todos os equipamentos apresentaram altos níveis de contaminação pelos
microrganismos pesquisados, mas destacam-se as caixas plásticas, os amaciadores, as
embutideiras, os misturadores e os moedores. Esses equipamentos são de difícil
higienização e acumulam grande quantidade de matéria orgânica, favorecendo o
crescimento microbiano e diminuindo a eficácia da sanitização. Observamos, durante as
visitas, que em alguns estabelecimentos a limpeza desses equipamentos não era
realizada diariamente, apesar das recomendações dos responsáveis técnicos.
Borges André et al. (1999) em pesquisa avaliando os aspectos higiênicos
sanitários de quatro tipos de utensílios de matadouros de Goiânia, também observaram
níveis de contaminação por AM, CT e bolores e leveduras inferiores aos nossos. Os
autores constataram que as caixas plásticas apresentaram as maiores médias de
contaminação por AM (730UFC/cm2), por CT (140UFC/cm2) e por bolores e leveduras
(2UFC/cm2).
As cubas de aço inoxidável, apesar do formato retilíneo, também
apresentaram altas contagens, mesmo sendo de fácil limpeza. Portanto, ocorreram falhas
básicas nos procedimentos de higienização desses equipamentos.
Em nenhuma das dez casas de carnes visitadas observou-se, a higienização
das facas em uso durante os procedimentos de desossa e preparo de cortes. No
abatedouro somente em algumas plataformas (sangria, evisceração e linha de inspeção)
era realizada a imersão das facas em água quente.
Os ganchos amostrados foram os que mantêm as meias carcaças
armazenadas suspensas nas câmaras frias das casas de carnes e na linha de abate. Foi
observado que vários são mantidos nos pisos, tanto das câmaras frias quanto na linha de
abate, não tendo sido verificado nenhum procedimento de limpeza desses equipamentos.
Apesar de terem sido os equipamentos que apresentaram as maiores médias de
67
contaminação, o contato restringe-se à área de membros posteriores das carcaças, ao
contrário dos outros equipamentos.
A maioria dos estrados amostrados era de madeira, que por sua natureza
porosa permite infiltração de água e acúmulo de matéria orgânica nas reentrâncias, além
da proximidade com os pisos favorecendo a contaminação.
Nas amostras das instalações observou-se que a média logarítmica para
contagens de AM foi de 5,38 log UFC/cm2, com níveis mínimos de contaminação de
1,75 log UFC/cm2 e máximos de 8,95 log UFC/cm2. O desvio padrão foi 2,10 (Tabela
2.2). Os ralos, as plataformas e os pisos foram os pontos que apresentaram as maiores
médias de contaminação (7,26 log UFC/superfície; 6,60 log UFC/cm2; 4,76 log
UFC/CM2, respectivamente).
Com relação aos CT, a média do nível de contaminação foi de 3,28 log
UFC/cm2, com valores mínimos de -0,48 log UFC/cm2 e máximos de 7 log UFC/cm2. O
desvio padrão das médias foi 1,97 (Tabela 2.3). Também as plataformas, os ralos e os
pisos apresentaram as maiores médias de contaminação (5,30 log UFC/cm2, 4,90 log
UFC/ área de superfície e 2,26 log UFC/cm2, respectivamente).
A média logarítmica das contaminações por EC obtida das amostras de
instalações foi 2,59 log UFC/cm2 com níveis mínimos de -0,48 log UFC/cm2 e máximos
de 6,30 log UFC/cm2. Todos os tipos de instalações avaliados apresentaram médias de
contagens acima de 1 log UFC/cm2. As plataformas e os ralos foram os pontos que
apresentaram as maiores médias de contagens: 3,94 log UFC/cm2 e 3,88 log UFC/ área
de superfície, respectivamente (Tabela 2.4).
Para instalações as médias observadas para bolores e leveduras foram de
4,01 log UFC/cm2 e 4,10 log UFC/cm2 respectivamente. As plataformas, os ralos e os
pisos foram os pontos com as maiores médias de contagens para bolores e leveduras e
com exceção dos sistemas de refrigeração todos os tipos de instalações apresentaram
médias de contaminação, para esses microrganismos, maiores que 2 log UFC/cm2
(Tabelas 2.5 e 2.6). Nas figuras 2.3 e 2.4 as médias de contagens de AM, bolores e
leveduras são visualmente superiores às de CT e EC.
Eisel et al. (1997) analisaram amostras de superfícies de equipamentos, de
pisos e paredes utilizando as placas Petrifilm™ AC e EC para pesquisa de AM, CT e
EC, mas diferentemente dos nossos resultados, as contagens de CT e EC não foram
significativas, e esses microrganismos raramente foram isolados das amostras. Em
relação às contagens de AM, também relatam médias inferiores as nossas, assim, as
68
maiores contagens foram para pisos (5UFC/cm2) e para paredes (3UFC/cm2),
ressaltando que os autores consideraram as áreas que apresentaram essas contagens
como altamente contaminadas (câmara fria para cortes empacotados e área de recepção,
respectivamente).
A contaminação dos pisos deve ser considerada importante, pois a partir
destes tornam-se mais contaminados os calçados (botas de borracha) dos funcionários e
o trânsito interno é inevitável. Ainda, em diversos estabelecimentos, inclusive no
abatedouro, verificaram-se caixas armazenando cortes, em contato direto com o piso
nos diferentes ambientes (câmaras frias, salas de desossa, de corte e área de atendimento
para venda).
Os ralos, assim como os pisos, podem representar além de ambientes
propícios para o desenvolvimento microbiano, importantes fontes de propagação e
manutenção de microrganismos, principalmente se a higienização é realizada com água
sob pressão, o que pode provocar a suspensão dos microrganismos em gotículas e
disseminar a contaminação para outras áreas.
Na análise dos produtos verificou-se que, a média logarítmica para
contagens de AM foi de 3,93 log UFC/cm2 ou g. com níveis de contaminação mínimos
de 1,26 log UFC/cm2 ou g. e máximos de 8,81 log UFC/cm2 ou g. O desvio padrão foi
1,55. As lingüiças do tipo frescal e as carnes moídas foram os produtos com as maiores
médias (5,85 log UFC/g e 6,49 log UFC/g, respectivamente). As carcaças bovinas e os
cortes comerciais apresentaram médias de contagens de 3,6 log UFC/cm2 e 3,81 log
UFC/cm2, respectivamente (Tabela 2.2).
Para CT, observou-se média logarítmica de 1,73 log UFC/cm2 ou g., com
níveis mínimos abaixo de 1 log UFC/cm2 ou g. e máximos de 6 log UFC/cm2 ou g. O
desvio padrão dessas médias foi 1,28. Nas amostras de carne moída e lingüiça frescal
verificou-se a ocorrência das maiores médias (3,32 log UFC/g e 3,27 log UFC/g). As
amostras de carcaças bovinas e de cortes comerciais apresentaram médias de
contaminação de 1,49 log UFC/cm2 e 1,69 log UFC/cm2, respectivamente. Já, as
amostras de carcaças suínas congeladas apresentaram média de contaminação de 2,78
log UFC/cm2 (Tabela 2.3).
Para EC a média logarítmica de contaminação dos produtos foi de 1,13 log
UFC/cm2 ou g. As amostras de carcaças suínas congeladas apresentaram a maior média
de contaminação que foi de 2,78 log UFC/cm2; nas amostras de carne moída a média
69
verificada foi 2,13 log UFC/g. Todos os tipos de produtos avaliados apresentaram
médias de contagens de EC superiores a 1 log UFC/cm2 ou g.(Tabela 2.4).
A média logarítmica dos produtos para contagens de bolores foi de 2,51 log
UFC/cm2 ou g., e 2,35 log UFC/ cm2 ou g., para leveduras. As amostras de carne moída
apresentaram as médias mais altas de contagens tanto para bolores (4,3 log UFC/g)
quanto para leveduras (4,11 log UFC/g). Em todos os tipos de produtos pesquisados
observaram-se médias de contagens acima de 2 log UFC/cm2 ou g, para esses
microrganismos (Tabelas 2.5 e 2.6). As médias de contaminação dos produtos, por tipo
de estabelecimento, pelos microrganismos pesquisados podem ser visualizadas nas
figuras 2.5 e 2.6, verificando-se que as contagens de AM, bolores e leveduras foram
superiores às de CT e EC.
A literatura fornece poucos parâmetros e a maioria propostos para outros
países, que podem auxiliar na interpretação dos resultados das análises efetuadas, como
por exemplo, o de que contagens totais superiores a 105 UFC/cm2 na carne bovina
seriam indicativas de condições de obtenção não higiênicas. Contagens totais acima de
106UFC/cm2 seriam suficientes para provocar processo de deterioração (LANDGRAF,
1996; GILL, 1998; JACKSON et al., 1997).
Em estudo realizado em carcaças bovinas ao final do processamento em
10 estabelecimentos, Gill et al. (1997) estimaram médias de contagens para AM de 3,30
log UFC/cm2; para CT médias de 2 log UFC/100cm2 e para EC de 1,18 log
UFC/100cm2. Ainda, Gill (1998) preconiza que contagens abaixo de 1 log UFC/100cm2
seriam um critério aceitável e possível para EC, em carcaças bovinas obtidas em
condições higiênicas. Eisel et al. (1997) relatam que as contagens de EC observadas em
diversos pontos amostrados de carcaças bovinas foram em média de 1 log UFC/g.
A legislação brasileira não estabelece padrões para a contaminação por
AM, CT, EC e por bolores e leveduras, em carcaças bovinas e carnes moídas. Para
produtos cárneos crus refrigerados ou congelados (hambúrguer, almôndegas, quibe e
similares) e embutidos frescais, o padrão estabelecido é para coliformes a 45oC (5 x
102UFC/g) (BRASIL, 2001).
Os resultados das contagens obtidas nos produtos amostrados indicaram
níveis de contaminação por esses microrganismos, especialmente nos produtos finais
como os cortes comerciais, a carne moída e os embutidos, superiores aos encontrados
em outros estudos. Sumner et al. (2003) em pesquisa realizada em 159 carcaças bovinas,
de abatedouros de diferentes portes na Austrália, encontraram médias logarítmicas para
70
contaminação por AM de 1,82 log UFC/cm2, e por EC de 0,33 log UFC/cm2 também
utilizando o sistema Petrifilm para as análises microbiológicas. Phillips et al. (2001)
também avaliando carcaças bovinas (n=1268) em abatedouros australianos encontraram
médias logarítmicas de contaminação por AM de 2,42 log UFC/cm2 e de 0,41 log
UFC/cm2 por EC.
Um das principais fontes de contaminação das carcaças é o couro que
usualmente está associado com significativos níveis de contaminação e uma grande
variedade de microrganismos (HUDSON et al., 1998). Armstrong et al. (1996) afirmam
que o trato gastrointestinal de bovinos é considerado o principal reservatório de E. coli
O157, e a contaminação da carne pode ser atribuída à contaminação de carcaças quando
ocorre ruptura do intestino, contato com os pelos, o couro e patas dos animais durante o
abate. Small et al. (2005) realizaram trabalho que avaliou os níveis de contaminação de
couro de bovinos e métodos de descontaminação. A média de contaminação inicial foi
de 6,14 log UFC/cm2 de bactérias totais e o método de descontaminação mais eficiente
apresentou redução de 2 log em média.
Na Alemanha, em 1998 foi desenvolvido um programa governamental para
melhoria da higiene dos procedimentos de abate de bovinos, com o objetivo de eliminar
a contaminação por E. coli O157 VTEC em produtos cárneos instituindo o padrão de
“tolerância zero” para contaminação fecal durante o abate. A redução do microrganismo
em carcaças foi constatada já a partir do ano seguinte (HEUVELINK et al., 2001).
Gill et al. (1999) em pesquisa que avaliou a contaminação da carne bovina
de quatro plantas de processamento de abatedouros, consideraram os equipamentos
contaminados por bactérias aeróbicas, incluindo EC, como principais fontes de
contaminação das carcaças. Os autores alertam para a possibilidade da presença de
E. coli O157:H7 ou de outras amostras patogênicas de EC contaminar os produtos
durante o processo.
Neste estudo, as contaminações observadas nas amostras de carne moída e
lingüiça do tipo frescal foram superiores às relatadas por Gill et al. (1996b) que
avaliaram as condições higiênicas da carne processada para hambúrguer, constatando
que as médias de AM variaram de 3,5 a 4,9 log UFC/g, de CT variaram de 07 a 3,0 log
UFC/g e de EC de 0,2 a 2,6 log UFC/g.
Eisel et al. (1997) relatam médias de contaminação por AM em carne moída
de 4,6 log UFC/g, para CT contagens que variaram de 1,4 a 3,2 log UFC/g e para EC
contagens de 1 a 2 log UFC/g. Em pesquisa realizada com diferentes produtos cárneos
71
(n=3494) prontos para o consumo, Gillespie et al. (2000) relatam que 8% apresentaram
contagens de AM ≥ 107UFC/g, e 3% das amostras apresentaram contagens de
enterobactérias ≥104 UFC/g e de EC ≥ 102 UFC/g.
Pérez Chabela et al. (1999) analisaram cortes de carnes de cinco espécies
animais (bovina, ovina, frango, coelho e cavalo) comercializadas em açougues da
cidade do México e relatam que as amostras de carne bovina apresentaram médias de
contaminação por AM de 4,75 log UFC/cm2, por enterobactérias de 4,74 log UFC/cm2 e
por bolores e leveduras de 4,04 log UFC/cm2 atribuindo esses níveis à contaminações
cruzadas e práticas inadequadas de manipulação.
Gill et al. (2003) atribuem a contaminação de produtos finais como a carne
moída, à higienização inadequada de equipamentos utilizados na desossa. Schlegelová
et al. (2004) observaram a contaminação de carcaças bovinas durante o abate por
amostras poliresistentes de E. coli, sugerindo que a contaminação secundária, a partir
dos equipamentos das plantas de processamento seja a fonte dessa contaminação.
A análise das médias das contagens de todos os microrganismos
pesquisados nos produtos permite verificar que as contaminações aumentaram na
medida em que a carne foi sendo processada. As contaminações das carcaças e dos
cortes foram menores que as contaminações da carne moída e dos embutidos, indicando
incorporação destes microrganismos ao longo do processamento.
Identificar as fontes, os níveis e a distribuição da contaminação microbiana
durante os procedimentos de obtenção e processamento da carne bovina é fundamental
para o estabelecimento de programas que tenham por objetivos a qualidade e a
segurança alimentar (EISEL et al., 1997), e o uso de microrganismos indicadores pode
ser uma ferramenta extremamente útil na monitoração de pontos considerados críticos.
Os procedimentos de segurança alimentar precisam ser aplicados a toda a
cadeia alimentícia, desde a produção na propriedade até o consumidor. Para isso, é
fundamental a integração das ferramentas de qualidade: as boas práticas de fabricação e
de higiene, a análise de perigos e pontos críticos de controle, a avaliação de risco
microbiológico e o gerenciamento da qualidade.
72
Tabela 2.2. Médias das contagens de aeróbios mesófilos (log UFC/cm2 ou g.) de
amostras de equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos colhidas em 10 casas
de carnes e 01 abatedouro, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil.
Aeróbios Mesófilos Amostras
Média n Desvio padrão
Variância Erro padrão
Mínimo Máximo
Equipamentos
Amaciadores 4,60 8 1,86 3,47 0,66 2,18 8,48 Balanças 3,65 9 1,75 3,06 0,58 1,52 7,48 Caixas plásticas 5,01 28 0,99 0,99 0,19 2,64 6,82 Cubas de aço inoxidável 5,97 10 1,08 1,16 0,34 4,60 7,48 Embutideiras 5,43 3 2,43 5,89 1,40 2,64 7,05 Estrados 3,63 10 1,62 2,61 0,51 2,18 6,72 Facas 4,06 21 1,07 1,14 0,23 2,52 6,15 Ganchos 7,11 10 1,20 1,45 0,38 4,77 8,56 Mesas 4,42 21 1,06 1,13 0,23 2,87 7,06 Misturadores 5,24 4 2,83 8,03 1,42 2,18 8,48 Moedores 5,15 10 1,73 2,99 0,55 2,18 8,48 Serras 3,40 10 0,90 0,82 0,29 2,18 4,73 Caminhões frigoríficos 3,51 4 1,46 2,15 0,73 2,30 5,26 Subtotal 4,68 148 1,61 2,59 0,13 1,52 8,56
Instalações
Balcões 4,16 11 1,48 2,20 0,45 1,75 6,62 Paredes 3,25 10 0,73 0,54 0,23 2,18 4,67 Pisos 4,76 10 1,15 1,32 0,36 3,17 6,60 Plataformas 6,60 5 0,00 0,00 6,60 6,60 Ralos 7,26 25 1,33 1,76 0,27 4,00 8,95 Sistemas de refrigeração 2,29 4 0,29 0,09 0,15 1,92 2,52 Subtotal 5,38 65 2,10 4,40 0,26 1,75 8,95
Produtos
Carcaças bovinas 3,60 151 1,27 1,63 0,10 1,26 6,80 Carcaças suínas 4,85 3 1,02 1,04 0,59 3,78 5,80 Carnes moídas 6,49 12 1,73 2,99 0,50 4,44 8,81 Cortes comerciais 3,81 52 1,51 2,29 0,21 1,26 7,30 Embutidos 5,78 2 0,16 0,03 0,11 5,67 5,90 Lingüiças frescais 5,85 10 1,19 1,43 0,38 3,79 8,30 Subtotal 3,93 230 1,55 2,40 0,10 1,26 8,81
Total 4,39 443 1,74 3,02 0,08 1,26 8,95
73
Tabela 2.3. Médias das contagens de coliformes totais (log UFC/cm2 ou g.) de amostras
de equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos colhidas em 10 casas de carnes
e 01 abatedouro, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil.
Coliformes Totais Amostras
Média n Desvio padrão
Variância Erro padrão
Mínimo Máximo
Equipamentos
Amaciadores 2,50 8 0,79 0,63 0,28 1,18 3,31 Balanças 1,49 9 0,93 0,87 0,31 0,52 3,08 Caixas plásticas 2,60 28 1,03 1,07 0,20 0,37 5,52 Cubas de aço inoxidável 3,34 10 0,92 0,84 0,29 1,78 4,92 Embutideiras 3,04 3 2,86 8,20 1,65 -0,18 5,30 Estrados 1,52 10 0,64 0,40 0,20 0,52 2,52 Facas 2,36 21 1,25 1,55 0,27 -0,48 4,87 Ganchos 4,07 10 1,77 3,13 0,56 2,65 7,00 Mesas 2,50 21 0,90 0,80 0,20 -0,48 3,48 Misturadores 3,03 4 1,77 3,12 0,88 1,18 4,89 Moedores 3,11 10 1,29 1,66 0,41 1,18 5,30 Serras 1,95 10 0,99 0,97 0,31 0,52 3,70 Caminhões frigoríficos 1,89 4 1,38 1,92 0,69 1,00 3,95 Subtotal 2,55 148 1,28 1,65 0,11 -0,48 7,00
Instalações
Balcões 1,96 11 1,39 1,92 0,42 -0,48 3,81 Paredes 1,29 10 0,83 0,69 0,26 0,12 2,52 Pisos 2,26 10 1,23 1,52 0,39 0,90 5,30 Plataformas 5,30 5 0,00 0,00 5,30 5,30 Ralos 4,90 25 1,33 1,78 0,27 3,00 7,00 Sistemas de refrigeração 1,75 4 0,57 0,33 0,29 1,18 2,52 Subtotal 3,28 65 1,97 3,87 0,24 -0,48 7,00
Produto
Carcaças bovinas 1,49 143 1,15 1,33 0,10 -0,05 4,95 Carcaças suínas 2,78 3 0,00 0,00 2,78 2,78 Carnes moídas 3,32 12 0,98 0,96 0,28 2,54 6,00 Cortes comerciais 1,68 50 1,28 1,64 0,18 -0,05 5,58 Embutidos 0 Lingüiças frescais 3,27 10 1,13 1,29 0,36 1,00 4,88 Subtotal 1,73 218 1,28 1,64 0,09 -0,05 6,00
Total 2,25 431 1,52 2,30 0,07 -0,48 8,95
74
Tabela 2.4. Médias das contagens de Escherichia coli (log UFC/cm2 ou g.) de amostras
de equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos colhidas em 10 casas de carnes
e 01 abatedouro, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil.
Escherichia coli Amostras Média n Desvio
padrão Variância Erro
padrão Mínimo Máximo
Equipamentos
Amaciadores 1,57 8 0,99 0,97 0,35 -0,48 2,52 Balanças 0,89 9 0,56 0,31 0,19 -0,48 1,18 Caixas plásticas 1,79 28 0,97 0,94 0,18 -0,48 4,82 Cubas de aço inoxidável 1,92 10 0,92 0,85 0,29 1,18 4,18 Embutideiras 1,60 3 2,33 5,41 1,34 -0,48 4,11 Estrados 1,52 10 0,64 0,40 0,20 0,52 2,52 Facas 1,93 21 0,89 0,79 0,19 -0,48 3,43 Ganchos 3,30 10 1,12 1,25 0,35 2,65 5,72 Mesas 1,73 21 0,98 0,96 0,21 -0,48 3,00 Misturadores 2,31 4 1,18 1,40 0,59 1,18 3,96 Moedores 1,94 10 1,32 1,75 0,42 -0,48 4,60 Serras 1,29 10 0,88 0,77 0,28 -0,48 2,52 Caminhões frigoríficos 1,46 4 0,77 0,59 0,38 0,70 2,52 Subtotal 1,80 148 1,07 1,14 0,09 -0,48 5,72
Instalações
Balcões 1,38 11 0,96 0,92 0,29 -0,48 3,00 Paredes 1,23 10 0,94 0,88 0,30 -0,48 2,52 Pisos 1,79 10 1,21 1,45 0,38 -0,48 3,51 Plataformas 3,94 5 0,50 0,25 0,22 3,26 4,60 Ralos 3,88 25 1,23 1,51 0,25 1,00 6,30 Sistemas de refrigeração 1,54 4 0,70 0,49 0,35 0,92 2,52 Subtotal 2,59 65 1,61 2,58 0,20 -0,48 6,30
Produtos
Carcaças bovinas 1,01 143 0,86 0,74 0,07 -0,05 3,48 Carcaças suínas 2,78 3 0,00 0,00 2,78 2,78 Carnes moídas 2,13 12 0,94 0,88 0,27 1,00 4,85 Cortes comerciais 1,01 50 0,94 0,89 0,13 -0,05 4,76 Embutidos 0 Lingüiças frescais 1,73 10 0,75 0,57 0,24 1,00 3,48 Subtotal 1,13 218 0,93 0,87 0,06 -0,05 4,85
Total 1,58 431 1,22 1,49 0,06 -0,48 8,95
75
Tabela 2.5. Médias das contagens de bolores (log UFC/cm2 ou g.) de amostras de
equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos colhidas em 10 casas de carnes e
01 abatedouro, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil.
Bolores Amostras
Média n Desvio padrão
Variância Erro padrão
Mínimo Máximo
Equipamentos
Amaciadores 2,86 7 0,69 0,47 0,26 2,18 4,08 Balanças 1,91 9 0,84 0,71 0,28 0,52 2,95 Caixas plásticas 3,64 25 1,26 1,60 0,25 1,67 6,30 Cubas de aço inoxidável 3,42 10 0,96 0,92 0,30 2,18 4,95 Embutideiras 3,18 3 1,84 3,37 1,06 1,29 4,95 Estrados 3,25 9 1,16 1,35 0,39 2,18 4,99 Facas 2,78 19 0,56 0,32 0,13 2,00 3,52 Ganchos 5,21 10 1,25 1,56 0,39 3,65 7,78 Mesas 3,19 19 0,80 0,64 0,18 1,70 4,39 Misturadores 2,85 4 0,51 0,26 0,25 2,18 3,30 Moedores 3,04 9 0,98 0,97 0,33 1,64 4,67 Serras 2,30 9 0,85 0,72 0,28 0,52 3,44 Caminhões frigoríficos 3,19 4 1,03 1,07 0,52 2,60 4,73 Subtotal 3,20 137 1,20 1,43 0,10 0,52 7,78
Instalações
Balcões 2,63 11 0,86 0,73 0,26 1,07 3,78 Paredes 2,71 9 1,59 2,52 0,53 0,12 5,30 Pisos 3,42 9 1,36 1,84 0,45 1,83 6,08 Plataformas 5,50 5 1,23 1,52 0,55 3,30 6,08 Ralos 5,32 24 1,54 2,36 0,31 2,00 7,78 Sistemas de refrigeração 1,74 3 1,06 1,13 0,61 0,52 2,48 Subtotal 4,01 61 1,88 3,53 0,24 0,12 7,78
Produtos
Carcaças bovinas 2,24 134 1,13 1,28 0,10 -0,05 4,73 Carcaças suínas 3,78 3 0,00 0,00 3,78 3,78 Carnes moídas 4,30 12 0,95 0,91 0,28 3,00 5,78 Cortes comerciais 2,48 48 1,15 1,31 0,17 0,56 4,73 Embutidos 2,85 2 0,21 0,05 0,15 2,70 3,00 Lingüiças frescais 3,69 10 0,50 0,25 0,16 3,00 4,78 Subtotal 2,51 209 1,22 1,50 0,08 -0,05 5,78
Total 2,97 407 1,43 2,05 0,07 -0,48 8,95
76
Tabela 2.6. Médias das contagens de leveduras (log UFC/cm2 ou g.) de amostras de
equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos colhidas em 10 casas de carnes e
01 abatedouro, localizados na região norte do estado do Paraná, Brasil.
Leveduras Amostras
Média n Desvio padrão
Variância Erro padrão
Mínimo Máximo
Equipamentos
Amaciadores 2,53 7 1,53 2,35 0,58 -0,48 4,08 Balanças 1,72 9 0,97 0,94 0,32 -0,18 2,88 Caixas plásticas 3,80 25 1,31 1,72 0,26 0,60 6,52 Cubas de aço inoxidável 3,75 10 1,13 1,28 0,36 2,18 5,18 Embutideiras 3,45 3 3,41 11,63 1,97 -0,48 5,66 Estrados 3,03 9 1,00 1,00 0,33 2,18 4,64 Facas 2,62 19 0,83 0,68 0,19 0,92 3,52 Ganchos 5,91 10 1,28 1,63 0,40 3,65 8,00 Mesas 2,63 19 1,09 1,18 0,25 -0,48 4,15 Misturadores 3,46 4 1,41 1,99 0,71 2,18 5,42 Moedores 3,67 9 1,40 1,95 0,47 2,18 6,34 Serras 2,08 9 0,94 0,89 0,31 0,52 3,44 Caminhões frigoríficos 3,01 4 1,30 1,69 0,65 2,30 4,95 Subtotal 3,21 137 1,54 2,37 0,13 -0,48 8,00
Instalações
Balcões 2,68 11 1,29 1,68 0,39 -0,48 4,00 Paredes 3,11 9 1,45 2,11 0,48 0,92 5,52 Pisos 3,37 9 1,27 1,61 0,42 2,34 6,30 Plataformas 6,20 5 0,15 0,02 0,07 5,97 6,30 Ralos 5,26 24 1,36 1,84 0,28 3,08 8,00 Sistemas de refrigeração 1,64 3 0,97 0,94 0,56 0,52 2,22 Subtotal 4,10 61 1,82 3,32 0,23 -0,48 8,00
Produtos
Carcaças bovinas 2,16 134 1,29 1,67 0,11 -0,05 6,51 Carcaças suínas 3,78 3 0,00 0,00 3,78 3,78 Carnes moídas 4,11 12 1,55 2,41 0,45 2,00 6,00 Cortes comerciais 2,07 48 1,63 2,65 0,23 -0,05 6,94 Embutidos 2,85 2 0,21 0,05 0,15 2,70 3,00 Lingüiças frescais 3,52 10 1,37 1,87 0,43 1,00 5,00 Subtotal 2,35 209 1,48 2,19 0,10 -0,05 6,94
Total 2,90 407 1,68 2,81 0,08 -0,48 8,95
77
Média
±SD
±1,96*SD
Aeró
bio
s m
esófilo
s
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orm
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ota
is
E.
coli
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res
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s
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0
1
2
3
4
5
6
7
8
Média
s (
log U
FC
/cm
2)
Figura 2.1. Médias das contagens de microrganismos indicadores (log UFC/cm2 ou g.)
em amostras de equipamentos de 10 casas de carnes, localizadas na região norte do estado do Paraná, Brasil.
Média
±SD
±1,96*SD
Aeró
bio
s m
esófilo
s
Colif
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Bolo
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s
Microrganismo indicador
1
2
3
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5
6
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8
9
10
Média
s (
log U
FC
/cm
2)
Figura 2.2. Médias das contagens de microrganismos indicadores (log UFC/cm2 ou g.) em amostras de equipamentos de abatedouro, localizado na região norte do estado do
Paraná, Brasil.
78
Média
±SD
±1,96*SD
Aeró
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s
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s
Microrganismo indicador
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0
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6
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Média
s (
log U
FC
/cm
2)
Figura 2.3. Médias das contagens de microrganismos indicadores (log UFC/cm2 ou g.) em amostras de instalações de 10 casas de carnes localizadas na região norte do estado
do Paraná, Brasil.
Média
±SD
±1,96*SD
Aeró
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s m
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s
Colif
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E.
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s
Microrganismo indicador
2
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Média
s (
log U
FC
/cm
2)
Figura 2.4. Médias das contagens de microrganismos indicadores (log UFC/cm2 ou g.)
em amostras de instalações de abatedouro localizado na região norte do estado do Paraná, Brasil.
79
Média
±SD
±1,96*SD
Aeró
bio
s m
esófilo
s
Colif
orm
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Bolo
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Média
s (
log U
FC
/cm
2 o
u g
r.)
Figura 2.5. Médias das contagens de microrganismos indicadores (log UFC/cm2 ou g.) em amostras de produtos de 10 casas de carnes localizadas na região norte do estado do
Paraná, Brasil.
Média
±SD
±1,96*SD
Aeró
bio
s m
esófilo
s
Colif
orm
es t
ota
is
E.
coli
Bolo
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Levedura
s
Microrganismo indicador
1
2
3
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5
6
7
8
Média
s (
log U
FC
/cm
2 o
u g
r.)
Figura 2.6. Médias das contagens de microrganismos indicadores (log UFC/cm2 ou g.) em amostras de produtos de abatedouro localizado na região norte do estado do Paraná,
Brasil.
80
4. CONCLUSÃO
A carne bovina comercializada na região estudada não apresentou qualidade
higiênico-sanitária satisfatória, havendo possibilidade de veiculação de microrganismos
patogênicos e redução da vida de prateleira da carne in natura e dos produtos cárneos.
Desde a obtenção da carne, ainda durante o abate, ocorrem falhas no
processamento, relacionadas à higienização dos equipamentos e instalações, que se
agravam quando o produto chega ao estabelecimento de comercialização direta ao
consumidor.
Os níveis de contaminação detectados nos equipamentos e instalações são
suficientes para a formação de biofilmes, que quando não são removidos
adequadamente constituem-se em ambientes propícios para a manutenção de uma
microbiota indesejável que pode ser incorporada à carne.
Os principais pontos de contaminação nas casas de carnes foram cubas de
aço inoxidável, amaciadores, moedores, facas, misturadores, embutideiras, caixas
plásticas, pisos e ralos. No abatedouro, os principais pontos de contaminação foram os
equipamentos destinados à fabricação de embutidos, plataformas, pisos e ralos.
Os ganchos, apesar de apresentarem os maiores níveis de contaminação, não
representam pontos importantes de incorporação de microrganismos por apresentarem
um contato restrito à região de membros inferiores das carcaças no abatedouro e das
meias carcaças nas casas de carnes.
Os produtos mais contaminados foram a lingüiça frescal e a carne moída, e
com relação a esta última, indica sérios riscos à saúde do consumidor por ser
usualmente consumida in natura.
As altas contagens de E. coli indicam possível contaminação por outros
enteropatógenos.
81
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ARTIGO 3
RELAÇÃO ENTRE A PRESENÇA DE LISTERIA SPP. E OS
NÍVEIS DE CONTAMINAÇÃO DA MICROBIOTA
ACOMPANHANTE NA CARNE BOVINA, PRODUTOS
CÁRNEOS E EM PLANTAS DE PROCESSAMENTO.
Márcia de Aguiar Ferreira Barros*1, Luís Augusto Nero2, Lívia Cavalletti
da Silva1, Loredana d’Ovídio1, Ronaldo Tamanini1, Rafael Fagnani1,
Douglas Magnani1, Vanerli Beloti1
*Autor para correspondência: M.A.F. Barros, Laboratório de Inspeção de Produtos de Origem Animal,
DMVP, Universidade Estadual de Londrina. Caixa Postal 6001, 86051 990, Londrina, PR. Tel.: (43) 3371
4708, Fax.: (43) 3371 4714. E-mail: mafer@folhaweb.com.br 1 Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Estadual de Londrina, Londrina PR. 2 Departamento de Veterinária, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa MG.
85
RESUMO
As baixas freqüências de isolamento de patógenos em alimentos de origem animal
relatadas por alguns autores podem ser atribuídas, principalmente, à presença de uma
microbiota multiespécies com potencial inibitório ou capaz de interferir nas
metodologias de isolamento. As plantas de processamento de alimentos geralmente
abrigam diversos tipos de microrganismos, que podem ser incorporados aos alimentos.
Pesquisas avaliando, experimentalmente, a interferência de alguns microrganismos
sobre o crescimento de Listeria monocytogenes, têm apresentado resultados
conflitantes. O objetivo deste trabalho foi avaliar a interferência da microbiota presente
em amostras de carcaças bovinas, cortes comerciais, lingüiça frescal, carne moída e de
equipamentos e instalações de processamento da carne, na detecção de Listeria spp.
Foram determinados os níveis de contaminação por aeróbios mesófilos, coliformes
totais, E. coli, bolores e leveduras, utilizando o sistema Petrifilm™ e a presença de
L. monocytogenes pela metodologia preconizada pelo United States Department of
Agriculture. Os resultados obtidos nessa pesquisa indicam que a microbiota encontrada
em amostras de equipamentos, instalações e produtos, não interferiu de forma evidente
na detecção das diferentes espécies (L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri,
L. welshimeri e L. grayi). Observou-se que mesmo em altos níveis de contaminação por
todos os microrganismos indicadores pesquisados, foi possível a detecção de
L. monocytogenes e das outras espécies. A metodologia recomendada para isolamento
do patógeno em carnes e superfícies de equipamentos mostrou-se adequada permitindo
o isolamento de diferentes espécies de Listeria spp.
Palavras chaves: Listeria spp.; Listeria monocytogenes; microrganismos indicadores;
interferência microbiana; microbiota; carne bovina.
86
ABSTRACT
Relation among the presence of Listeria spp. and contamination levels of the
associated microbiote in red meat, meat products and processing plants.
Several authors explain the low incidence of pathogens in animal origin food due
microbial competition and isolation methodologies interference. Usually food
processing plants have several types of microorganisms, which can be incorporated to
food and in equipments and installations surfaces. Some researches show divergences in
results concerning the interference of food microbiote on the development of Listeria
monocytogenes. This work has the objective to evaluate if the natural microbiote from
bovine carcasses, commercial cuts, fresh sausage, ground beef meat and surface samples
of meat processing equipments and installations, has interference on Listeria spp.
detection. The contamination levels of indicators microorganisms (mesophilic aerobes,
total coliformes, Escherichia coli, moulds and yeasts) all using Petrifilm™ plates, and
the presence of Listeria spp. (according United States Department of Agriculture) was
evaluated in several samples from the described points. The results showed that
microbiote detected in the sampled points did not influence evidently the detection of
Listeria spp., independently of the specie detected. It was observed a tendency of
detection of Listeria spp. in samples that showed high levels of indicators
microorganisms contamination. The recommended methodology for Listeria spp.
isolation in meat and equipments, used in his study, showed adequacy and allowed the
isolation of the different species of the pathogen, even in samples with high levels of
microbial contamination.
Palavras chaves: Listeria spp.; Listeria monocytogenes; indicators microorganisms;
microbial interference; microbiote; red meat.
87
1. INTRODUÇÃO
A emergência de L. monocytogenes como patógeno alimentar data de 1980
com a ocorrência de diversos surtos e casos esporádicos de listeriose ligados ao
consumo de alimentos contaminados (SCHLECH et al., 1983; LINNAN et al., 1988;
BULA et al., 1988; FARBER e PETERKING, 1991). Embora exista uma margem de
risco para todos os consumidores, este patógeno na forma invasiva, está associado a
quadros clínicos graves como septicemia, encefalite, meningite e a altos índices de
mortalidade entre neonatos, idosos, imunocomprometidos e ainda a abortos
(SCHUCHAT et al., 1992; HOFER, 1998; HOFER et al., 1999).
Alguns autores têm relatado uma baixa freqüência de isolamento de
patógenos em alimentos, especialmente os de origem animal, que seria atribuída
principalmente à presença de uma microbiota com potencial inibitório e conseqüente
interferência nas metodologias de isolamento (FRANCO et al., 2003; NERO et al.,
2004).
As plantas de processamento de alimentos geralmente abrigam diversos
tipos de microrganismos (FRANK et al., 1990; BAGGE-RAVN et al., 2003), que
podem ser incorporados aos alimentos. Quando esta contaminação é alta, esses
microrganismos podem interferir na multiplicação do patógeno alvo da pesquisa pela
produção de condições insatisfatórias para a sua multiplicação, e de substâncias que
afetem de forma específica o seu crescimento (SUH e KNABEL, 2001).
Portanto nas análises microbiológicas de alimentos, são incluídas fases
seletivas de pré-enriquecimento com o objetivo de eliminar a microbiota competidora e
favorecer a multiplicação do patógeno em questão. Estudos têm avaliado o desempenho
de diferentes métodos de isolamento na detecção de baixos níveis de L. monocytogenes
em alimentos, assim como de células injuriadas (RYSER et al., 1996).
Um dos meios de enriquecimento seletivos mais utilizados para detecção de
Listeria spp. é o caldo Universidade de Vermont (UVM), recomendado pelo United
States Department of Agriculture (USDA, 1996) para amostras de carnes e
equipamentos que contém ácido nalidíxico, que inibe o crescimento de bactérias Gram
negativas, suplementado com acriflavina, para inibição de bactérias Gram positivas. De
acordo com diversos autores, a metodologia preconizada pelo USDA é a mais adequada
para a maioria das situações, especialmente quando há expectativa de uma microbiota
em altos níveis de contaminação (NØRRUNG et al., 1991; SLADE, 1992).
88
A hipótese de que uma microbiota em níveis elevados (>106 UFC/g.) em
alimentos exerceria efeito inibitório sobre microrganismos patogênicos, e que o
contrário, alimentos com baixos níveis de contaminação permitiriam a multiplicação de
patógenos é defendida por Jay (1995 e 1996).
As interações microbianas em alimentos têm sido estudadas em relação à
produção de agentes antimicrobianos, como ácidos, bacteriocinas e peróxidos
(KENNEDY et al., 2000). A atividade antagonista de bactérias ácido lácticas sobre
L. monocytogenes em leite foi verificada por NERO (2005) e a utilização destes
microrganismos em produtos cárneos fermentados têm efetivamente controlado a
multiplicação de patógenos (HAMMES e KNAUF, 1994; PRADO et al., 2000).
Ainda, diversos estudos têm demonstrado a capacidade de L.
monocytogenes de formar biofimes sobre materiais comumentemente utilizados em
indústrias de alimentos (MAFU et al., 1990; BERESFORD et al., 2001) inclusive na
presença de outros microrganismos (MIDELET e CARPENTIER, 2002). Biofilmes são
geralmente formados por comunidades multiespécies, nas quais diferentes
microrganismos estão integrados em estruturas complexas.
O conhecimento da interação entre L. monocytogenes e outros
microrganismos, patogênicos ou deteriorantes, isolados de alimentos e plantas de
processamento é escasso e mais pesquisas são necessárias para identificar essas
associações (MØRETRØ e LANGSRUD, 2004). A interferência de microrganismos dos
gêneros Pseudomonas e Staphylococcus sobre multiplicação e formação de biofilmes
por L. monocytogenes também têm sido avaliada em estudos experimentais
(BUCHANAN e BAGI, 1999; LERICHE e CARPENTIER, 2000)
Um fator adicional sobre o qual existem poucos trabalhos é o impacto
exercido por uma microbiota constituída por microrganismos denominados indicadores,
como aeróbios mesófilos, coliformes totais, Escherichia coli, bolores e leveduras sobre
a detecção de L. monocytogenes. Esses microrganismos normalmente são isolados de
alimentos e plantas de processamento, em vários níveis de contaminação.
O objetivo deste trabalho foi avaliar a interferência da microbiota
naturalmente presente em amostras de carne bovina, de produtos cárneos, de
equipamentos e instalações de processamento da carne, na detecção de Listeria spp. pela
metodologia preconizada pelo USDA.
2. MATERIAL E MÉTODOS
89
2.1. Origem das amostras e análises microbiológicas
Foram avaliadas 443 amostras provenientes de estabelecimentos
processadores de carne bovina (10 casas de carnes e 01 abatedouro) localizados na
região norte do estado do Paraná, no período de Julho de 2003 a Fevereiro de 2005.
Deste total, 167 amostras foram positivas para Listeria spp. (76 de equipamentos, 23 de
instalações e 68 de produtos). As amostras foram analisadas pela metodologia
preconizada pelo United States Department of Agriculture (1996). Das amostras
positivas identificaram-se as espécies: L. monocytogenes, L. innocua, L. welshimeri,
L. seeligeri e L. grayi pela análise das características bioquímicas como coloração de
Gram, prova da catalase, verificação de hemólise em ágar sangue eqüino 7%,
fermentação de carboidratos (manitol, rhamnose, xilose e dextrose) e motilidade a 25oC
(PAGOTTO et al., 2004).
Para a pesquisa de microrganismos indicadores, utilizou-se o sistema
PetrifilmAC para aeróbios mesófilos, Petrifilm EC para coliformes totais e E. coli e
Petrifilm YM para bolores e leveduras, conforme orientações do fabricante. As
contagens obtidas foram padronizadas de acordo com as diluições consideradas e
expressas em UFC/cm2 ou g., sendo posteriormente convertidas em log10. As análises
microbiológicas foram realizadas no Laboratório de Inspeção de Produtos de Origem
Animal (LIPOA) da Universidade Estadual de Londrina.
2.2. Análise dos resultados
Os resultados das contagens dos microrganismos indicadores de higiene
obtidos foram agrupados de acordo com a presença ou não de Listeria spp. A partir
disso, as freqüências foram calculadas considerando o tipo de amostra (equipamentos,
instalações e produtos), utilizando-se o programa Excell 2003 (Microsoft).
90
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
As freqüências de níveis de contaminação pelos microrganismos
indicadores pesquisados para amostras positivas e negativas para Listeria spp. são
demonstrados nas Figuras de 3.1 a 3.5. Considerando todas as amostras positivas para
Listeria spp, observou-se que a microbiota acompanhante apresentou predomínio de
níveis de contaminação por AM maiores do que 5 log UFC/cm2 ou g.; para CT os níveis
de contaminação predominantes foram de 2 a 4 log UFC/cm2 ou g., e por EC foram
menores do que 2 log UFC/cm2 ou g. Para bolores e leveduras, entre as amostras
positivas para Listeria spp. observou-se níveis de contaminação mais freqüentes entre
3 a 4 log UFC/cm2 ou gr (37,4% e 43, 2%, respectivamente).
Entre as amostras negativas para Listeria spp., observou-se que a microbiota
acompanhante apresentou maiores freqüências de níveis de contaminação por AM entre
3 e 5 log UFC/cm2 ou g. (43,1%); para CT e EC houve predominância de níveis de
contaminação menores do que 2 log UFC/cm2 ou g. Para bolores e leveduras os níveis
de contaminação mais freqüentes, entre as amostras negativas para Listeria spp., foram
menores do que 3 log UFC/cm2 ou g. (63,9% e 66,1%, respectivamente). Esses
resultados demonstram uma correspondência entre os níveis de contaminação pelos
microrganismos indicadores e a presença de Listeria spp.
As freqüências de níveis de contaminação pelos microrganismos
indicadores pesquisados nas amostras positivas para as diferentes espécies detectadas
(L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri e L. grayi) são demonstradas
nas Figuras de 3.6 a 3.10. As amostras positivas para L. monocytogenes (21) e L.
innocua (131) provenientes de equipamentos, instalações e produtos, apresentaram
níveis de contaminação pelos microrganismos indicadores avaliados, em faixas menores
do que 2 log UFC/cm2 ou g. a maiores do que 5 log UFC/cm2 ou g.
Considerando todas as amostras positivas para L. monocytogenes observou-
se que a microbiota acompanhante apresentou níveis de contaminação por aeróbios
mesófilos entre 3 a 5 log UFC/cm2 ou g. (52,4%) e maiores do que 5 log UFC/cm2 ou g.
(47,6%); por coliformes totais houve predomínio de níveis de contaminação entre 2 a 4
log UFC/cm2 ou g. (60,0%); por E. coli níveis menores do que 2 log UFC/cm2 ou g.
(80,0%). A microbiota constituída por bolores e leveduras apresentou freqüências
similares entre os três níveis de contaminação, assim nas amostras positivas para L.
monocytogenes, observou-se níveis de contaminação menores do que 3 log UFC/cm2 ou
91
g. (47,4% para bolores e 36,8% para leveduras) e maiores do que 4 log UFC/cm2 ou g.
(21,1% para bolores e 31,6% para leveduras).
Entre as amostras positivas para L. innocua observou-se que a microbiota
acompanhante apresentou níveis de contaminação por aeróbios mesófilos maiores do
que 5 log UFC/cm2 ou g. (49,6%) e entre 3 a 5 log UFC/cm2 ou g. (43,5%); em relação
a coliformes totais os níveis de contaminação predominantes foram entre 2 a 4 log
UFC/cm2 ou g. (54,3%); por E. coli menores do que 2 log UFC/cm2 ou g. (71,7%). Da
mesma forma como para a espécie patogênica, a microbiota constituída por bolores e
leveduras apresentou freqüências similares entre os três níveis de contaminação, assim
L. innocua foi freqüente em níveis de contaminação por bolores e leveduras menores do
que 3 log UFC/cm2 ou g. (32,2% para bolores e 40,5% para leveduras), a maiores do
que 4 log UFC/cm2 ou g. (27,3% para bolores e 29,8% para leveduras).
L. monocytogenes foi isolada de 07 amostras de equipamentos nas quais se
observou predomínio de níveis de contaminação por aeróbios mesófilos superiores a 5
log UFC/cm2 (71,4%). Da mesma forma, em relação a coliformes totais ocorreu
predomínio de contagens entre 2 a 4 log UFC/cm2 (71,4%) e por E. coli menores do que
2 log UFC/cm2 (57,1%). Por bolores e leveduras ocorreu predomínio de níveis de
contaminação entre 3 e 4 log UFC/cm2 (66,7% e 50,0 %, respectivamente).
L. innocua foi isolada de 57 amostras de equipamentos nas quais se
observou predomínio de níveis de contaminação por aeróbios mesófilos entre 3 a 5 log
UFC/cm2 (47,4%); por coliformes totais os níveis de contaminação mais freqüentes
foram entre 2 a 4 log UFC/cm2 (52,6%); por E. coli foram menores do que 2 log
UFC/cm2 (75,4%). Por bolores e leveduras, L. innocua foi mais frequentemente isolada
de amostras com níveis de contaminação menor do que 3 log UFC/cm2 (40% e 45,5%,
respectivamente).
As duas amostras positivas para L. monocytogenes provenientes de
instalações apresentaram níveis de contaminação por aeróbios mesófilos menores do
que 3 log UFC/cm2 (50%) e entre 3 a 5 log UFC/cm2 (50%); para coliformes totais
essas amostras apresentaram níveis de contaminação menores do que 2 log UFC/cm2
(50%) e entre 2 a 4 log UFC/cm2 (50%); para E. coli essas duas amostras apresentaram
níveis de contaminação menores do que 3 log UFC/cm2 (100,0%)e para bolores e
leveduras entre menores do que 3 log UFC/cm2 (50%) e maiores do que 4 log UFC/cm2
(50%).
92
Listeria innocua foi isolada de 18 amostras de instalações, nas quais se
observaram predomínio de níveis de contaminação por aeróbios mesófilos maiores do
que 5 log UFC/cm2 (83,3%); em relação a coliformes totais os níveis de contaminação
mais freqüentes, nessas amostras, foram maiores do que 4 log UFC/cm2 (66,7%). Da
mesma forma, L. innocua foi isolada de amostras de instalações nas quais se observou
predomínio de níveis de contaminação por E. coli acima de 3 log UFC/cm2 (50%), e
acima de 4 log UFC/cm2 para bolores (64,7%) e leveduras (70,6%). As freqüências dos
níveis de contaminação por microrganismos indicadores em amostras de equipamentos
e instalações positivas para L. welshimeri, L. seeligeri e L grayi são demonstradas nas
Figuras de 3.6 a 3.10.
Hood e Zottola (1995) consideram contagens a partir de 104 UFC/cm2 como
suficientes para iniciar a formação de biofilmes. A partir dos resultados obtidos
observou-se contagens superiores a essa, sugerindo o estabelecimento de biofilmes
sobre as superfícies de equipamentos, instalações e produtos analisados. Estudo
conduzido por Jeong e Frank (1994) avaliando o crescimento de L. monocytogenes a
21oC em biofilmes com diversos microrganismos isolados de plantas de processamento
de carne e de leite, verificou que nenhuma das culturas testadas foi capaz de eliminar o
patógeno e inclusive que a cultura de Flavobacterium spp. utilizada na pesquisa
estimulou ou o crescimento de L. monocytogenes.
A ampla distribuição de L. monocytogenes na natureza, a sua resistência a
condições adversas e sua persistência em biofilmes, podem explicar a dificuldade de
eliminar esse patógeno do ambiente de processamento de alimentos. A produção de
glicocálix pelas microcolônias aderidas às superfícies ocorre em torno de 48 horas, e
pode proteger as células da ação de substâncias inibitórias produzidas por culturas
competidoras, (HOYLE, 1990; WIRTANEN e MATTILA-SANDHOLM, 1992).
Assim, superfícies inadequadamente higienizadas e a presença de resíduos orgânicos
conferem proteção ao patógeno.
Diversos autores têm ressaltado que a presença das espécies de listeria não
patogênicas para o homem, em particular de L. innocua, não deve ser subestimada. Já
em 1988, autores como Seeliger, Feresu e Jones, citados por Slade (1992) afirmaram
que, a presença de uma espécie, em um ambiente específico, poderia ser indicativa da
presença de outras espécies, inclusive de L. monocytogenes, e que L. innocua seria um
excelente indicador para esse patógeno.
93
Pesquisas realizadas sugerem uma maior recuperação de L. innocua em
caldo UVM e em outros meios de enriquecimento em detrimento à espécie patogênica
(PETRAN e SWANSON, 1993; CURIALE e LEWUS, 1994; MacDONALD e
SUTHERLAND, 1994). A metodologia recomendada pelo USDA, para isolamento de
L. monocytogenes de amostras de carnes e de meio ambiente, tem sido considerada
significativamente melhor quando comparada com outras (LEWIS e CORRY, 1991;
SLADE, 1992). Os resultados obtidos nesse estudo confirmam que essa metodologia
promoveu eliminação da microbiota acompanhante permitindo o isolamento do
patógeno.
Nas amostras de produtos foram identificadas apenas L. monocytogenes (12)
e L. innocua (52). Nas amostras positivas para L. monocytogenes ocorreu predomínio de
níveis de contaminação por aeróbios mesófilos entre 3 a 5 log UFC/cm2 ou g. (66,7%);
por coliformes totais entre 2 a 4 log UFC/cm2 ou g. (54,5%). Por E. coli os níveis de
contaminação predominantes foram menores do que 2 log UFC/cm2 ou g. (90,9%) e
para bolores e leveduras menores do que 3 log UFC/cm2 ou g. nas freqüências de 63,6%
e 45,5%, respectivamente.
Nas amostras de produtos positivas para L. innocua ocorreu predomínio de
níveis de contaminação por aeróbios mesófilos entre 3 a 5 log UFC/cm2 ou g. (51,8%);
por coliformes totais os níveis de contaminação predominantes estiveram entre 2 a 4 log
UFC/cm2 ou g. (71,2%); para E. coli foram menores do que 2 log UFC/cm2 ou g.
(86,5%). Por bolores ocorreu predomínio dos níveis contaminação entre 3 a 4 log
UFC/cm2 ou g. (51,0%) e para leveduras menores do que 3 log UFC/cm2 ou g. (42,9%).
Jay (1995 e 1996) sustenta a hipótese de que carnes frescas com contagens
de aeróbios mesófilos em torno de 100.000 a 1.000.000 UFC/g não são, provavelmente,
veículos responsáveis por surtos de doenças de origem alimentar, ao contrário de carnes
“limpas”. O autor baseia sua hipótese no conceito de interferência microbiana publicado
por Sir Howard Florey em 1946 e proposto por R. Dubos em 1960. Ainda, cita estudo
realizado por Goepfert e Kim (1975) que “mostra que microrganismos perigosos são
incapazes de competir efetivamente com a flora natural de carne moída crua em
diversos limites de temperatura”.
Embora não seja de consenso geral, admite-se que a carne de carcaças
provenientes de animais sadios pode ser considerada estéril (GILL, 1979). Na
transformação de carcaças em cortes comerciais e produtos cárneos, a contaminação
microbiana é um resultado indesejável e inevitável. A contaminação externa pode
94
ocorrer pela incorporação de microrganismos em diversas operações que são executadas
na sua obtenção, como no abate, desossa, processamento, armazenamento e distribuição
(GILL, 1998). Gill et al. (2003) atribuem a contaminação de produtos finais como a
carne moída, à higienização inadequada de equipamentos utilizados na desossa.
Nesse estudo, a presença de L. monocytogenes e das outras espécies,
associada a altos níveis de contaminação da microbiota avaliada, indicam que esses
microrganismos provavelmente não inibiram a sua multiplicação na carne bovina.
Pesquisas avaliando, experimentalmente, a interferência de alguns microrganismos
sobre o crescimento de L. monocytogenes, têm apresentado resultados conflitantes. Em
produtos lácteos, carne de frango e meios de cultura microbiológicos, Pseudomonas
fluorescens estimulou o crescimento de L. monocytogenes (MARSHALL et al., 1992),
inibiu o crescimento (CHENG et al., 1995) ou não afetou o crescimento de L.
monocytogenes (FARRAG e MARTH, 1989). Essas diferenças de comportamento
também foram observadas por Buchanan e Bagi (1999).
9595
44,7
31,9
73,9
45,241,2
15,4
47,3
24,3
46,1
44,4
17,4
38,154,4
43,8
45,5
43,1
9,2
23,6
8,716,7
4,4
40,7
7,2
32,6
0%
100%
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ófil
os
< 3 log UFC/cm2 ou gr.
3 - 5 log UFC/cm2 ou gr.
> 5 log UFC/cm2 ou gr.
Equipamentos Instalações Produtos Total
Figura 3.1. Distribuição de amostras positivas e negativas para Listeria spp., em relação a três níveis de contaminação por aeróbios mesófilos,
isoladas de equipamentos, instalações, carnes e produtos e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de carne situados na região
norte do estado do Paraná, Brasil.
9696
14,58,3
52,2
28,6
4,8 3,9
16,08,9
55,3
51,4
17,4
33,3
68,3
24,5
54,9
33,1
30,3
40,3
30,438,1
27,0
71,6
29,0
58,0
0%
100%
Lis
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tota
is
< 2 log UFC/cm2 ou gr.
2 - 4 log UFC/cm2 ou gr.
> 4 log UFC/cm2 ou gr.
Equipamentos Instalações Produtos Total
Figura 3.2. Distribuição de amostras positivas e negativas para Listeria spp., em relação a três níveis de contaminação por coliformes totais,
isoladas de equipamentos, instalações, carnes e produtos e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de carne situados na região
norte do estado do Paraná, Brasil.
9797
6,6 6,9
39,1
28,6
3,2 2,69,9 7,8
18,4
38,9
26,1
28,6
9,5 13,5
16,0 22,7
75,0
54,2
34,842,9
87,3 83,9
74,169,5
0%
100%
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heric
hia
coli
< 2 log UFC/cm2 ou gr.
2 - 3 log UFC/cm2 ou gr.
> 3 log UFC/cm2 ou gr.
Equipamentos Instalações Produtos Total
Figura 3.3. Distribuição de amostras positivas e negativas para Listeria spp., em relação a três níveis de contaminação por E. coli isoladas de
equipamentos, instalações, carnes e produtos e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de carne situados na região norte do
estado do Paraná, Brasil.
9898
20,5 23,4
54,5
35,9
20,0
2,0
25,2
12,7
35,623,4
22,7
28,2
45,0
22,1
37,4
23,4
43,8
53,1
22,7
35,9 35,0
75,8
37,4
63,9
0%
100%
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min
ação
por
bo
lore
s
< 3 log UFC/cm2 ou gr.
3 - 4 log UFC/cm2 ou gr.
> 4 log UFC/cm2 ou gr.
Equipamentos Instalações Produtos Total
Figura 3.4. Distribuição de amostras positivas e negativas para Listeria spp., em relação a três níveis de contaminação por bolores isoladas de
equipamentos, instalações, carnes e produtos e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de carne situados na região norte do
estado do Paraná, Brasil.
9999
24,7 25,0
59,1
35,9
21,7
3,4
28,4
13,9
27,420,3
13,6
33,3
35,0
18,1
28,4
21,0
47,954,7
27,3 30,8
43,3
78,5
43,2
65,1
0%
100%
Lis
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min
ação
por
leved
ura
s
< 3 log UFC/cm2 ou gr.
3 - 4 log UFC/cm2 ou gr.
> 4 log UFC/cm2 ou gr.
Equipamentos Instalações Produtos Total
Figura 3.5. Distribuição de amostras positivas e negativas para Listeria spp., em relação a três níveis de contaminação por leveduras isoladas de
equipamentos, instalações, carnes e produtos e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de carne situados na região norte do
estado do Paraná, Brasil.
100100
71,4
45,6
11,1
100,0
0,0
50,0
83,3
33,3 33,3
42,947,6 49,6
16,7
100,0
0,0
28,6
47,4
55,6
0,0
100,0
50,0
5,6
66,7 66,751,8
52,443,5
58,3
0,0
100,0
0,07,0
33,3
0,0 0,0 0,0
11,1
0,0 0,05,4
0,06,9
25,0
0,0 0,0
0%
100%
L.
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os
< 3 log UFC/cm2 ou gr.
3 - 5 log UFC/cm2 ou gr.
> 5 log UFC/cm2 ou gr.
Equipamentos Instalações Produtos Total
Figura 3.6. Distribuição de amostras positivas para as diferentes espécies de Listeria, em relação a três níveis de contaminação por aeróbios
mesófilos, isoladas de equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de carne situados na região
norte do estado do Paraná, Brasil.
101101
14,3 17,5
0,0 0,0 0,0 0,0
66,7
0,0 0,05,8 5,0
19,7
0,0 0,0 0,0
71,4
52,6
44,4
100,0 100,0
50,0
11,1
33,3
54,5
71,2
60,0
54,3
41,7
100,0 100,0
14,3
29,8
55,6
0,0 0,0
50,0
22,2
66,7
45,5
23,1
35,026,0
58,3
0,0 0,0
0%
100%
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tais
< 2 log UFC/cm2 ou gr.
2 - 4 log UFC/cm2 ou gr.
> 4 log UFC/cm2 ou gr.
Equipamentos Instalações Produtos Total
Figura 3.7. Distribuição de amostras positivas para as diferentes espécies de Listeria, em relação a três níveis de contaminação por coliformes
totais, isoladas de equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de carne situados na região norte
do estado do Paraná, Brasil.
102102
0,08,8
0,0 0,0 0,0 0,0
50,0
0,0 0,03,8
0,0
12,6
0,0 0,0 0,0
42,915,8
0,0
100,0
0,0 0,0
33,3
0,09,1
9,6 20,0
15,7
0,0
100,0
0,0
57,1
75,4
100,0
0,0
100,0 100,0
16,7
100,090,9
86,580,0
71,7
100,0
0,0
100,0
0%
100%
L.
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richia
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li< 2 log UFC/cm2 ou gr.
2 - 3 log UFC/cm2 ou gr.
> 3 log UFC/cm2 ou gr.
Equipamentos Instalações Produtos Total
Figura 3.8. Distribuição de amostras positivas para as diferentes espécies de Listeria, em relação a três níveis de contaminação por E. coli,
isoladas de equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de carne situados na região norte do
estado do Paraná, Brasil.
103103
16,721,8
0,0
100,0
0,0
50,0
64,7
0,0
18,2 20,4 21,127,3
0,0
100,0
0,0
66,7
38,2
11,1
0,0
0,0
0,0
17,6
66,7
18,2
51,0
31,6
40,5
25,0
0,0
0,0
16,7
40,0
88,9
0,0
100,0
50,0
17,6
33,3
63,6
28,6
47,4
32,2
75,0
0,0
100,0
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ação
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bolo
res
< 3 log UFC/cm2 ou gr.
3 - 4 log UFC/cm2 ou gr.
> 4 log UFC/cm2 ou gr.
Equipamentos Instalações Produtos Total
Figura 3.9. Distribuição de amostras positivas para as diferentes espécies de Listeria, em relação a três níveis de contaminação por bolores,
isoladas de equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de carne situados na região norte do
estado do Paraná, Brasil.
104104
33,325,5
0,0
100,0
0,0
50,0
70,6
0,0
27,320,4
31,6 29,8
0,0
100,0
0,0
50,0
29,1
11,1
0,0
0,0
0,0
11,8
33,3
27,336,7
31,629,8
16,7
0,0
0,0
16,7
45,5
88,9
0,0
100,0
50,0
17,6
66,7
45,5 42,936,8
40,5
83,3
0,0
100,0
0%
100%
L.
mo
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co
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min
ação p
or
leved
ura
s< 3 log UFC/cm2 ou gr.
3 - 4 log UFC/cm2 ou gr.
> 4 log UFC/cm2 ou gr.
Equipamentos Instalações Produtos Total
Figura 3.10. Distribuição de amostras positivas para as diferentes espécies de Listeria, em relação a três níveis de contaminação por leveduras,
isoladas de equipamentos, instalações, carnes e produtos cárneos de 11 estabelecimentos processadores de carne situados na região norte do
estado do Paraná, Brasil.
105
4. CONCLUSÃO
Os resultados obtidos sugerem que não houve interferência da microbiota
constituída pelos microrganismos indicadores pesquisados, na detecção de L.
monocytogenes, nas amostras analisadas, mesmo quando esta microbiota apresentou
contagens superiores a 5 log UFC/cm2 ou g.
A metodologia oficial para isolamento do patógeno em carnes e superfícies
de equipamentos mostrou-se adequada permitindo o isolamento de diferentes espécies
de Listeria spp., apesar da altas contagens da microbiota associada.
A presença do patógeno em associação com uma contaminação
multiespécies em níveis elevados, indica a necessidade de outros estudos sobre o
fenômeno da competição microbiana considerando-se a ecologia microbiana e as
características específicas do alimento e do ambiente de processamento envolvido.
São necessários estudos mais aprofundados que esclareçam a real
interferência da microbiota presente na carne e em outros alimentos sobre
microrganismos patogênicos, que gerem dados para viabilização de programas de
segurança alimentar.
106
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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