introdução ao pcr reação da polimerase em cadeia outubro de 1985 (idéia em 1983) american...

Introdução ao PCR

• Reação da Polimerase em Cadeia

• Outubro de 1985 (idéia em 1983)• American Society of Human Genetics• criado por Kary B. Mullis

http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/

Características do PCR

• Amplificação de Seqüências

• Processo Cíclico– 15 a 40 ciclos– realizado por mudança de

temperatura

Produção de DNA por PCR

• Produção de 2 a 4 g DNA em 1-3 hs• específico = amplifica sequência-alvo

na presença de DNA genômico• sensível = detecta até apenas 1

sequência de molde• flexível = muitas variações da técnica

básica de PCR

Requerimentos Básicos do PCR

1. Molde - DNA ou RNA2. DNA polimerase3. dNTPs4. Iniciadores de

Oligonucleotídeos (Primers)

Função dos Iniciadores Primers

• fornecer grupo 3’ OH para iniciação de síntese de DNA

• definir os limites do segmento de DNA-alvo a ser amplificado

• estabelecer especificidade

Função dos Primers

Oligos IniciadoresPrimers

• sintetizados quimicamente• tipicamente entre 15 a 25 bases • define limites de alvo a amplificar

– prévio conhecimento da sequência alvo

– tradução reversa de uma sequência de PTN

– primer de seqüências aleatórias

Ciclos de Temperatura no PCR

Anelamentodo Primer Tm

Desnaturação Extensão

94oC do Primer

72oC

Desnaturação do DNA94 a 100oC

• desnaturar DNA alvo• desnaturar produtos de ciclos

prévios• 4 a 10 min de desnaturação inicial• duração de 30 s a 1 min

Anelamento do Primer40 a 70oC

• temperatura de “hibridização”• otimização da temperatura para

cada par de primer– composição = %G+C

Tm = 81.5 + 16.6(log10([M Na+])) + 0.41*(%GC) - 600/length

– determina especificidade do produto amplificado

• tipicamente 30 s a 2 min

Anelamento do Primer%G+C• Tm = 81,5o + 16,6 * (log10([M Na+])) + 0,41*(%GC) -

600/comprimento– [Na] em concentração Molar {PCR usa-se KCl}– %GC em percentual– comprimento em bases

• Primer3 - 600/length• GCG - 674/length

– formamida: subtrair 65*(% formamida)

• Primers > 10 bases em 0,05 M sal (PCR)Tm = 59,9 + 0.41*(%GC) - 675/comprimento

http://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/netprlaunch.html

Extensão do Primer72oC

• Taq polimerase– faixa de atividade: 20oC a 85oC– atividade varia 100x nessa faixa

• Tempo de extensão varia de acordo com tamanho do produto desejado

Exponencialidade do PCR

Caso ideal:

N = No 2n

• N = número de moléculas amplificadas

• No = número inicial de moléculas

• n = número de ciclos de amplificação

Amplificação Geométrica

Ciclo Número Fita Duplas produzidas 1 0 5 8 10 256 15 8.192 20 262.144

25 8.388.608 30 268.435.456

35 8.589.934.58940 274.877.906.800

PCR

Cinética do PCR

• Fase inicial (screening)– Primers procuram o DNA molde com

sequências complementares (como sondas)– Primers em considerável excesso.

• Fase exponencial– acúmulo exponencial do fragmento de DNA– várias cópias das sequências alvos

• Fase tardia ou plateau– amplificação já é sub-ótima

Efeito “Plateau”• Desvio do ideal teórico

– reassociação do produto compete com anelamento do primer

– polimerase torna-se limitante – perda de atividade

– acúmulo de inibidores da polimerase (pirofosfato)

– Limitação de outros componentes– Competição entre produtos– Pareamento produto x molde -

amplificação não específica

DNA molde

• número de cópiastipicamente 105 a 106 moléculas-alvo

Quantidade de DNA = equivalente a 3 x 105 cópiasFONTE Genoma Haplóide (pb) QuantidadeHumano 3 x 109 1 gLevedura 2 x 107 10 ngE.coli 4 x 106 1 ngplasmídeo 3 x 103 1 pg

DNA molde• Número de cópias• DNA genômico: 50 a 250 ng

– 1 g de DNA genômico humano = 3 X 105 moléculas de um gene único

• O mesmo número de moléculas está presente em:– 10 ng de DNA genômico de levedura– 1 ng de DNA genômico de E. coli– 1-2 pg de plasmídeo– 2 pg de bacteriofago

Taq DNA Polimerase

• Proteína de 94 kDa• Temperatura ótima: 75 a 80oC• Termoestabilidade limitada• Ausência de função de edição

sem exonuclease 3’ para 5’

Concentração de enzima = 1 a 2,5 U / 100 L

Efeito da Temperatura na Taxa de Síntese de DNA

Temperatura Taxa de Síntese(nucleotídeos /seg)

22oC 0,2537oC 1,555oC 2470oC > 6075oC > 150

Estabilidade da Taq sob Altas Temperaturas

Temperatura T 1/2 (minuto)

92,5oC 130 95,0oC 40 97,5oC 5

Frequência de Erro de DNA Polimerases Termoestáveis

Enzima Taxa de Mutaçãopor 10-6 inserções de

base

Taq 300Vent (NEB) 57

Fatores Promotoresda Fidelidade da Taq e

Especificidade dos Primers

• baixar a concentração de dNTPs (menos 200 M)

• concentração de Mg++ - inversa/

[Magnésio]

• Concentração de Mg2+ afeta:– anelamento dos primers– temperatura de desnaturação do DNA

molde e dos produtos amplificados• Especifidade da reação • Formação de dímeros de primers• Atividade e fidelidade da enzima

• Usualmente – inicia com 1,5 mM

Considerações na Seleção de Primers

• Especificidade: primer deve formar duplex estável no sítio alvo específico

• Primer não forma duplex estável com si próprio ou com o outro primer

• Primer não possui sítios falsos no DNA alvo

Estabilidade dos Primers

• Comprimento - número de bases• Relação GC/AT

• Temperatura de desnaturação Tm

– análises do vizinho mais próximo– energia livre de formação de duplex

Tm x GC%

Critérios para desenho de primers

• Composição de bases: – GC% = 40 a 60%– distribuição homogênea ao longo

do primer• Comprimento:

– 18 a 25 bases do primer complementar ao molde

– Ambos primers = mesmo comprimento (até 3 bases)

Critérios para desenho de primers

•Seqüências repetidas ou auto-complementares: – Sem repetições invertidas no primer

ou seqüências auto-complementares com + 3 bases seguida

•Complementaridade entre par de primers:– 3’ de primer não pode ligar a qualquer

ponto do outro primer – Primers presentes em alta concentração e

formação de híbridos com amplificação de dímeros de primers

- Temperatura de fusão:O Tm calculado dos dois membros do par de “primers” não deve diferir em mais que 5oC O Tm do produto amplificado não deve diferir dos valores de Tm dos “primers”em mais que 10oC.-

Temperatura de Separação de Duplexes de

DNA

Tm = 81,5 + 16,6 log [Na+] + 0,41 (%G + %C) - 0,65 (% formamida) - 675/comprimento - % erro de pareamento

http://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/netprlaunch.html

Especificidade dos Primers

• Teoricamente 15 bases estabelecem especificidade

1/4 15 = 1,1 x 10 -9

• Famílias de genes relacionados• Duplicações• assume toda sequência do primer

envolvida seleção de sítio-alvo

Problemas comuns no Desenho de Primers

• Auto-complementariedade• Complementariedade entre

primers• Establidade térmica excessiva

Auto Complementariedade

• Formação de alça

GAACTACCACTGAAGATACTTCAGT

HOTGACTTC Tm = 71oC

ACTGAA

Auto Complementariedade

• Formação de alça sem problema

GAACTACCTACGAAGATACTTCAGTOH

Tm = 24oC CTTC GAAG

Complementariedade entre Primers

• Formação de “primer dimer”

5’ GAACTACCATAGACACACTGAAGGOH

5 ‘ CTTCAGGTCAAGAACTTCCTTCAGTOH

OHTGACTTCCTCAAGAACTGGACTTC

GAACTACCATAGACACACTGAAGGOH

Excesso de Estabilidade Térmica em 3’OH

TTTACTTAGTCGGACGCGGC OH

CGCGGC OH

-------------GCGCCG--------------------Extremidade 3’ crucial = preferir 3’ como G ou C. Não recomendável que seja ...NNGG ou ...NNCC

-> gerar dímeros de primers

A extremidade 5’ não precisa ser complementar à seqüência alvo = permite adicionar seqüências com

propósitos específicos na extremidade 5’

- sítio para enzima de restrição, mais 3 a 4 bases adicionais- promotores para transcrição in vitro- promotores de seqüências consenso para inicío de tradução para transcrição e tradução in vitro

Para o cálculo do Tm considera-se apenas a região complementar à seqüência alvo.

Primers com sítios para enzimas de restrição:

Estabilidade Interna

• Melhores primers possuem terminal5’ estável e terminal 3’ instável– reduz pareamento falso

• Baixa estabilidade 3’ previne a formação de DNA duplexes que podem iniciar a síntese de DNA– terminal 5’ deve parear para formar

duplex estável

Mal-pareamento pré-PCR

• Causas:– DNA fita simples complexo na

amostra molde– mistura de reação completa incubada

a temperatura com atividade da Taq

• Solução - “Hot Start”

Prevenção de Mis-priming

PCR ConvencionalMix de reação completo

20 a 25 oCTransferir para termociclador

Ciclos

Produto amplificado

PCR “Hot Start”Mix de reação completo

20 a 25 oCTransferir para termociclador

desnaturação 100 oCmanter a 80 oC

Adicionar Taq polimerase

Ciclos

Produto amplificado

Enzimas para “Hot-Start”

• AmpliTaq Gold– enzima recombinante– forma inativada - ativação 10 min

94oC

• Platinum Taq Polymerase– ligação com inibidor termolábil

contendo anticorpo monoclonal

http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi

http://genomics.biotech.ufl.edu/~wgf/primer/index.htm

Parâmetros dos ciclos:

1. Temperatura e Tempo de desnaturação

• Falta de desnaturação da template é uma causa comum de falha na PCR

• Tipicamente 94oC por 30 s

• Tempo de desnaturação muito longo reduz a meia vida da enzima

Parâmetros dos ciclos:

2. Temperatura e Tempo de anelamento

• Temperatura de anelamento = 5oC abaixo do Tm real dos primers

• Tempo de anelamento = 15 a 30 s

• Tempo de extensão função tamanho do AMPLICON– 1 minuto é suficiente 1,2 kb– Longo reduz a meia vida da enzima

A Tm do produto amplificado não deve exceder ~85oC.

Temperatura de desnaturação em PCR é definida como a temperatura na qual há separação irreversível das fitas de uma população homogênea de moléculas.

A temperatura de separação irreversível das fitas é vários graus acima do Tm

(tipicamente, 92oC para DNA com 50% de G+C).

DNA Polimerases

Sintetizam uma fita nova de DNA extendendo um primer pela

incorporação de NTPs na direção 5’ -> 3’ tendo como orientação a

informação contida na fita molde (template).

DNA Polimerases• As DNA polimerases normalmente

têm também atividade exonuclease

• 3’ -> 5’ = atividade proof reading

• 5’ -> 3’ = atividade corretiva – necessidade de remoção de um

segmento de DNA que está a frente da enzima

DNA Polimerases Termoestáveis

• Thermos aquaticus (Taq polymerase)– 1ª descoberta e + usada– Síntese 5’-> 3’ / Exonuclease 5’-> 3’

• Thermus thermophilus (rthpol) = similar à subunidade da DNA pol-III de E. coli. – rTth pol atividade de transcriptase reversa na

presença de Mn2+

• DNA polimerases adicionam base a mais na 3’ – > adição > [Mg2+] e de [enzima].– A base a mais adicionada é quase sempre A

DNA Polimerases Termoestáveis

Thermos aquaticus (Taq polymerase)

• Taxa de incorporação de bases erradas pode variar entre 10-3 a 10-6, dependendo das concentrações de Mg2+ e dNTPs

• A incorporação de base errada (mismatch) reduz a estabilidade da interação da enzima com o DNA, favorecendo a interrupção da polimerização.

• Baixa temperatura de extensão e elevada concentração de dNTPs favorecem a extensão de primers com pareamento imperfeito e a extensão após mismatch.

DNA Polimerases Termoestáveis

• Pyrococcus furiosus (Pfu) - com 2 subunidades codificadas por 2 genes de único operon– Forte atividade exonuclease 3’->5’

(atividade proof reading)

• Enzimas com atividade proof reading não adicionam A na extremidade 3’OH, independentemente do molde

DNA Polimerases Termoestáveis

Polimerases com função corretiva• Pyrococcus furiosus (Pfu)• Thermoccocus litoralis (Tli) Promega• Vent DNA polymerase = Tli

recombinante New England Biolabs– Atividade exonucleásica 3’-> 5’– Mais termoestáveis que a Taq – Meia vida de 6,7 h a 95oC)– Sintetizam fragmentos de até 13 kpb.

Variações de Taq polymerase

• AmpliTaq: Taq polimerase produzida em E. coli. Reprodutibilidade maior que enzima nativa [Applied Biosystems]

• AmpliTaq Gold: forma modificada da AmpliTaq fornecida em forma inativa. Requer aquecimento a 94-95 oC por 10 min para ser ativada

• Stoffel fragment: forma amputada da Taq sem 289 amino ácidos terminal N, sem atividade exonuclease 5’ --> 3’. Cerca de 2 vezes mais termoestável que a Taq [Applied Biosystems]

Variações de Taq polymerase

• Taq 2000 : Taq recombinate altamente purificada [Stratagene]

• AdvanTaq: sem amino ácidos N-terminais com maior termorresistência, melhor atividade em faixa ampla de [Mg] e maior afinidade pelo molde – uso concentração de DNA alvo muita baixa [Clontech]

• AGSGold DNA polymerase: maior capacidade de síntese de DNA (3 vezes mais produto que a Taq) [Hybaid]

PCR de longa distância• Mistura de enzimas = melhor que uma

única enzima para amplificar fragmentos longos– KlenTaq / Pfu (ex.: 160:1 a 640:1)– Taq / Pfu

Existem várias misturas disponíveis comercialmente• Elongase (Invitrogen)• Expand DNA Polymerase (Boehringer)• Advantage (Clontech)

Modelo de

funcionamento da

mistura de enzimas

Elongase (Invitrogen)

Taq/Pfu