introdução a enzimologia e processos fermentativos

Msc J.Gabriel Roderjan

Aula 1 e 2 – Farmácia 8ºP 2009

Plano de TrabalhoPROGRAMA TEÓRICO:

1. Plano de trabalho Apresentação da bibliografia; sorteio dos seminários

2. Introdução e Histórico; catálise; atividade enzimática; cinética enzimática;

3. Aplicação clínica das enzimas;

4. Microrganismos e Enzimas de importância aos processos fermentativos

5. Obtenção de enzimas e produtos de digestão enzimática

6. Introdução aos processos fermentativos

7. Seminários: Fermentação alcoólica: Aguardentes e outras bebidas

8. Seminários: Fermentação acética: vinagres

9. Seminários: Fermentação alcoólica: cervejas e vinhos

10. Seminários: Fermentação láctica: vegetais

11. Seminários: Fermentação láctica: leite e derivados

12. Seminários: Fermentação láctica: pescados e ensilados

13. Seminários: Processos biotecnológicos

Aula teórica

Apresentação dos tópicos

Leitura de bibliografia Discussão dos tópicos Perguntas

Plano de TrabalhoPROGRAMA PRÁTICO:

1. Plano de trabalho de aulas práticas; Preparação de processos fermentativos Produção de microrganismos

2. Obtenção, caracterização e quantificação de enzimas; Biorreatores e transferência de oxigenio em biorreatores

3. Imobilização de enzimas4. Purificação de enzimas5. Preparação para fermentação láctica do leite6. Fermentação láctica: leite7. Preparação para produção de cerveja 8. Fermentação alcoólica: cervejas

Preparação de processos fermentativos Produção de microrganismos Tutorial Formulação de protocolos de

procedimento; Formulação do plano de ação; Check-list; Documentação e legislação Procedimento operacional padrão Resultados e modificações

AVALIAÇÕES 

AULAS PRÁTICAS

Avaliação de desempenho nas aulas práticas Trabalhos em sala de aula Valor 2,0

PROVAS

1ª prova 1° bimestre - 09/09/2009 - valor 8,0 2ª prova 1°bimestre - 07/10/2009 - valor 8,0 3ª prova 2°bimestre - 04/11/2009 - valor 5,0 4ª avaliação - relatório aulas práticas 2°bimestre - 02/12/2009 - valor 10,0 Provas de 10 à 15 questões, com 1 à 3 questões discursivas

SEMINÁRIOS Trabalho impresso Apresentação Valor 5,0

BibliografiaLEHNINGER, Albert L.; NELSON, David L.; COX, Michael M. Lehninger princípios de bioquímica. 4. ed. São Paulo: Sarvier, 2006.

xxviii, 1202 p. ISBN 85-7378-166-1 (enc.) ALBERTS, Bruce. Fundamentos da biologia celular. Porto Alegre: ArTmed, 2006. 1 v. (várias paginações) ISBN 78-85-363-0679-7 BRUCHMANN, Ernest-Erich. Bioquímica técnica: Ernst-Erich Bruchmann ; traducido por Aurora Perez Torrome. Zaragosa: Acribia,

1980. 233 p. ISBN 84-200-0437-5 LIMA, Urgel de Almeida; AQUARONE, Eugênio; BORZANI, Walter. Tecnologia das fermentações. São Paulo: E. Blücher, c1975. 285 p. AQUARONE, Eugênio; LIMA, Urgel de Almeida; BORZANI, Walter. Alimentos e bebidas produzidos por fermentação. São Paulo: E.

Blücher, 1983. 227 p. (Biotecnologia ; v. 5) CARVALHO, Geraldo Camargo de. Aulas de quimica. São Paulo: Nobel, 1979.v.1 CRUEGER, Wulf; CRUEGER, Anneliese. Biotecnología: manual de microbiología industrial. Zaragosa: Acribia, 1993. 413 p. ISBN 84-

200-0743-9 BORZANI, Walter; LIMA, Urgel de Almeida; AQUARONE, Eugênio. Engenharia bioquímica. São Paulo: E. Blücher, 1975. 300 p.

(Biotecnologia ; v. 3) AMORIM, Henrique Vianna de; LEÃO, Regina Machado. Fermentação alcoólica: ciência e tecnologia. Piracicaba: Fermentec, 2005.

xv, 434 p. ISBN 85-99011-01-04 (enc.)

WISEMAN, Alan. Manual de biotecnología de los enzimas. Zaragosa: Acribia, 1991. 444 p. ISBN 84-200-0705-6

http://www.bireme.br/php/index.phpwww.anvisa.gov.br/www.fda.govwww.biotecnologia.com.br/www.atcc.org/www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme

Modelo de relatório de seminárioSUMÁRIO1. Introdução2. Aplicação3. Método (como se utiliza e quais vias

bioquímicas envolvidas)4. Organograma (seqüência de eventos)5. Legislação e Controle de qualidade6. Referências7. Anexos

Aspectos gerais

Vida= fn(matéria x energia)

Fn é a transformação de partículas, átomos e moléculas;

Reações químicas Estabilidade Conversão da matéria em energia e da

energia em matéria Fonte principal: Sol Meio: água

Reações químicas

A + B ↔ AB AOH + HB ↔ AB +H2O

Relação entre a constante de equilíbrio e a variação de energia livre de uma reação

S PReação:

Keq = [P]/[S]

G = - RT ln KeqReações com G’ grande e negativo significa que o equilíbrio é favorável à formação dos produtos

S P

Reação = colisão de moléculas em uma determinada orientação com uma quantidade definida de energia denominada ΔG (energia de ativação do estado de transição ou energia livre de ativação)

Facilitadores de reação

Catálise = alteração na velocidade da reação

William P. Jencks, article in Advances in Enzymology, 1975

Redução na energia de ativação (ΔG); Sem um catalisador : A + B ↔ AB

em 20 minutos e X de ΔG Com um catalisador : A + B ↔ AB

em 20 milésimos de segundo e X/5 de ΔG

Tabela da relação entre constante de equilíbrio e energia livre de ativação ΔG

A velocidade de uma reação e a energia de ativação

a) Reação de 1ª ordem:

b) Reação de 2ª ordem:

V = k [S]

V = k [S1][S2]

k M-1 S-1

Obs. uma pequena diminuição na energia de ativação, corresponde a um grande aumento na velocidade da reação

(uni molecular)

(bi molecular)

A lei de velocidade

Vantagem da catálise Reação com vários passos: velocidade é

determinada pelo passo com a mais alta ∆G++

Energia de ativação: barreira energética para as reações químicas.

Seletividade celular: reações necessárias para sobrevivência da célula: ∆G++ menores;

Quem faz a catálise? Catalisador = qualquer molécula que

facilite a reação.

Participa da reação, mas ao final é recuperado de forma a não ser alterado nem consumido na reação.

○ Os reagentes e o catalisador encontram-se na mesma fase, geralmente é líquida;

○ A reação evolui através de espécies intermédios com menor energia de ativação;

○ A reação tem mais do que um passo.

E + S ES EP E + P

Tipo de catálise

Biomoléculas e a catálise

○Carboidratos○Lipídeos○Proteínas

Proteínas funcionais

Seqüência amino acídica é quase infinita Combinação de 20 aminoácidos sem limite

de número e repetições Formação estrutural multivariável Adaptação a vários estados e ambientes

Enzimas = Proteínas funcionais

Proteínas altamente especializadas com extraordinário poder catalítico.

As enzimas reduzem a energia de ativação sem alterar a constante de equilíbrio acelerando o processo da reação.

O Estado de Transição de produto e substrato na ausência de um catalisador ou enzima.

O que há de especializado na função da enzima?

Alto grau de especificidade pelo substrato;

Aceleram as reações;

Atividade depende da temperatura, pH, substrato, co-fatores e produto;

São as principais responsáveis para cada processo bioquímico:

catabolismo e Anabolismo

O que confere a enzima catalisar reações bioquímicas? Estrutura especializada voltada ao

substrato A forma complementar, carga e

características hidrofílicas/hidrofóbicas, são responsáveis por esta especificidade.

Catálise enzimática

O Ajuste Induzido

Mudança conformacional na hexoquinase induzida pela ligação da glicose em seu sítio ativo, faz com que a enzima seja ativada.

A Enzima é Complementar a seu Substrato no Estado de Transição

História da EnzimologiaPasteur declarou que "a fermentação alcoólica é

um ato correlacionado com a vida e organização das células do fermento (levedura), e não com a sua morte ou putrefação".

Enzima – do grego ενζυμον, “levedar” ou fermentar – Kuhne 1878;

Buchner provou que extratos de levedura tinham a capacidade de fermentar - 1897

Histórico Sumner provou que as enzimas

eram proteínas através da cristalização da urease – 1926;

John Northrop e Wendell Meredith Stanley confirmaram as enzimas como proteínas pelo estudo da tripsina, quimotripsina e pepsina – 1930.

Próximo passo é o estudo da catálise enzimática ao nível quântico.

Especificidade Eficiência

Ação da enzima no substrato é dependente de:

○ Presença de substrato em concentração adequada;

○ pH○ Temperatura○ Concentração de produto;○ Cofatores○ Meio (sólido ou líquido)

Coenzima: quando o cofator não se liga covalentemente à enzima

Grupo prostético: quando o cofator se liga covalentemente à enzima

COFATORES necessários para o funcionamento da enzima

Holoenzima: enzima + cofator (enzima cataliticamente ativa)

Apoenzima ou apoproteína: refere-se somente a parte protéica da enzima

As enzimas reguladas por modificações não-covalentes são chamadas de alostéricas.

Cofatores inorgânicos: íons

A Catálise Enzimática e o Complexo Enzima-Substrato

Quimiotripsina

Sítio ativo – porção da estrutura protéica da enzima onde liga-se o substrato

O centro ativo: região da enzima onde ocorre a catálise

Coenzimas

ATP + GLICOSE ADP + GLICOSE-6-FOSFATO

Nome comum da enzima: Hexoquinase

Nome sistemático: ATP:Glicose fosfotransferase

Classificação: E.C.2.7.1.1

ATP:Glicose fosfotransferase

E.C.2.7.1.1

[EC number]: número de comissão da enzima

2 transferase7 sub-classe: fosfotransferase

1 grupo hidroxil (como grupo aceptor)

1 D- glicose que aceita o grupo fosforil.

Nomenclatura da união internacional Bioquímica e Biologia Molecular.

www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme.

Nomenclatura das enzimasATP:Glicose fosfotransferase

E.C.2.7.1.1[EC number]: número de comissão da enzima

2 transferase

7 sub-classe: fosfotransferase

1 grupo hidroxil (como grupo aceptor)

1 D- glicose que aceita o grupo fosforil.

Nomenclatura da união internacional Bioquímica e Biologia Molecular.

www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme.

Cinética enzimática

Efeito da Concentração do Substrato na Velocidade Inicial de uma Reação

Enzimática

Equação de Michaelis-Menten

[E] = constante e limitante

Quando [S] tende a zero(reação de 1ª ordem)

Quando [S] tende para infinito(reação de ordem zero)

Constante de Michaelis-Menten (Km)

É a concentração do substrato [S], quando Vo = Vmax/2

A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN

k1 k2

Modelo Cinético: E + S ES E + P k-1 K-2

Aproximações:

1. Admitindo-se a reação em seu início: k1 k2

E + S ES E + P k-1

2. Considerando-se a segunda etapa como passo limitante, tem-se que a velocidade inicial da reação (Vo) é dada por:

Vo = k2 [ES] (eq. 1)

A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN

3. Considera-se que a concentração de S é muito maior que a de enzima e despreza-se a quantidade de substrato complexada com a enzima, em relação à concentração total de substrato

Note que, numa reação enzimática, a enzima se encontra na forma livre (EL) e na forma complexada com o substrato (ES), daí:

[EL] = [ET] - [ES]

4. Considerando-se estado estacionário, a concentração de ES permanece constante, ou seja, a velocidade de sua formação (Vf) é igual à de seu desaparecimento (Vd)

Vf = k1 [EL][S] ou Vf = k1 ([ET] – [ES]) [S] (eq. 2)

Vd = k2 [ES] + k-1 [ES] ( eq. 3)

A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN

Igualando a eq. 2 com a eq. 3 e rearranjo os termos, temos:

[ET] [S] [ES] = (eq. 4)

[S] + Km

onde, Km = (k-1+k2)/k1 (Constante de Michaelis-Menten)

Combinando a eq. 1 com a eq. 4, temos: k2[ET] [S] Vmax [S]Vo = ou Vo = [S] + Km [S] + Km

O gráfico de 1/vo x 1/[S]

A forma dos inversos da equação de Michaelis-Menten ou equação de Lineweaver-Burk

Modo mais correto de se determinar Vmax e Km

O significado de Km e a afinidade enzimática

Se k2 << k-1, tem-se que Km = k-1/k1 e, portanto a constante de dissociação do complexo ES

Reações que ocorrem em várias etapas em que o passo EP E + P é o limitante

kcat = k3 e [EP] ~[Et]

Passo limitante

kcat é denominado de número de renovação: equivale ao n° de moléculas de substrato convertidas em produto por uma única enzima em uma dada unidade de tempo, quando a enzima está saturada com o substrato

Para [S] << Km

A Relação kcat/Km

Vo depende da concentração de dois reagentes e o termo kcat/Km é um constante de 2ª ordem. É considerado o melhor parâmetro cinético para comparar eficiência catalítica

Reações com Dois ou Mais Substratos

(Mecanismo de dupla troca ou pingue-pongue)

Cinética envolvendo um complexo ternário

Cinética de dupla troca ou pingue-pongue

Inibição Reversível

KI é a constante de dissociação do complexo EI

a) Inibição Competitiva

Cinética de uma Inibição

Competitiva

KI é a constante de dissociação do complexo EI

EI E + I

Não altera a velocidade máxima da reação, porém aumenta a constante de Michaelis-Menten ou seja:

V’max = VmaxK’m > Km

Inibidor Competitivo

Inibição competitiva pode ser revertida por aumentos na concentração do substrato

Admitindo-se que o inverso de Km represente a afinidade enzimática, pode afirmar que este inibidor diminui a afinidade da enzima pelo substrato

b) Inibição não-competitiva

K’I é a constante de dissociação do complexo ESI

Cinética de uma Inibição não -competitiva

K’I é a constante de dissociação do complexo ESI

ESI ES + I

Diminui a velocidade máxima da reação e a constante de Michaelis-Menten ambos por um mesmo valor ’)

V’max < VmaxK’m < Km

Inibidor não-competitivo

Note que independentemente do valor de ’ o coeficiente angular da reta 1/Vo x 1/[S] será sempre o mesmo, daí as retas serem paralelas

Quando KI = K’I, temos a inibição não competitiva

c) Inibição Mista

K’I é a constante de dissociação

do complexo ESI

Inibição não competitiva

[I]

1/[S]

1/vo

Sem inibidor

= ’Inibição Mista

(Vmax/ [S[Vo = Km + [S]

- 1/Km

Inibição Não Competitiva MISTA

Não altera a constante de Michaelis-Menten, porém diminui a velocidade máxima da reação

V’max < Vmax

K’m = Km

Admitindo que o inverso de Km represente a afinidade enzimática, pode afirmar que este inibidor não afeta a afinidade da enzima pelo substrato

Numa inibição mista Vmax diminui e Km aumenta

Inibição da quimotripsina com o diisopropilfluorofosfato (DIFP), leva à conclusão que a Ser195 é um resíduo chave na catálise

Inibição Irreversível

Inibidores irreversíveis são importantes ferramentas no estudo do mecanismo de uma reação enzimática

Inibidores Suicidas: classe de inibidores irreversíveis pouco reativos, mas que no centro ativo da enzima são modificados e reagem irreversivelmente com a enzima inativando-a. São substâncias utilizadas na industria farmacêutica como remédios ou drogas de poucos efeitos colaterais

Efeito do pH na Atividade Enzimática

Os grupos laterais dos aminoácidos podem se encontrar com carga positiva, negativa ou neutra, dependendo do pH

Efeito da Temperatura na Atividade Enzimática

10 20 30 40 50 60 70Temperatura (°C)

Vo

A atividade aumenta com a temperatura até o ponto onde a enzima não se desnatura

Efeito da Concentração de Enzima na Atividade Enzimática

Concentração de Enzima (mM)

Vo

(mmol/s) [S] em excesso

Se o substrato não estiver em excesso, a velocidade da reação atinge um valor máximo e permanece constante

As Enzimas Reguladoras

Enzimas que têm sua atividade catalítica aumentada ou diminuída em resposta a determinados sinais

Enzimas Alostéricas: são reguladas por ligações não covalentes

1º Tipo:

A Aspartato Transcarbamilase

R

R (2 cadeias)

R

Inibição por Retroalimentação ou Feedback da Conversão de L-Treonina em L-Isoleucina

E1 é a enzima desidratase da L-treonina, que é inibida de forma alostérica por L-isoleucina

Cinética Sigmoidal das Enzimas Alostéricas

O substrato é um modulador positivo

Com um modulador positivo e um ne-gativo, sem alterar Vmax

Com um modulador negativo que não altera K0,5

Algumas Enzimas Reguladoras Sofrem Modificações Covalentes

Regulação Covalente da Fosforilase do Glicogênio

Regulação alostérica por AMP (secundária)

Ser-P

Ser-P

AMP

AMP

glicose

Piridoxal-P

Piridoxal-P

glicose

Regulação enzimática por clivagem proteolítica

Ativação do zimogênio por clivagem proteolítica

Estrutura da quimiotripsina