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INSTITUTO AGRONÔMICO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA
TROPICAL E SUBTROPICAL
FISIOLOGIA DE CANA-DE-AÇÚCAR SOB DÉFICIT HÍDRICO:
PLASTICIDADE FENOTÍPICA, TRANSPORTE DE ÁGUA,
METABOLISMO ANTIOXIDANTE E FOTOSSÍNTESE
PAULO EDUARDO RIBEIRO MARCHIORI
Orientador: Rafael Vasconcelos Ribeiro
Tese submetida como requisito parcial
para obtenção do grau de Doutor em
Agricultura Tropical e Subtropical, Área
de Concentração em Tecnologia da
Produção Agrícola.
Campinas, SP
Outubro, 2014
iv
Aos meus pais, Paulo e Maria Elisa,
DEDICO
OFEREÇO
Às minhas irmãs Bruna e Berta
e à vó Binda (in memoriam)
v
AGRADECIMENTOS
- Ao Dr. Rafael Vasconcelos Ribeiro, que é mais que orientador, é amigo.
- Ao Dr. Eduardo Caruso Machado pela excelente convivência, conversas, sugestões,
oportunidades e pela amizade.
- À Bárbhara, por estar sempre ao meu lado em todos os momentos.
- Ao Severino S. Nogueira pelas conversas e ajuda na instalação dos experimentos.
- Aos amigos do “Laboratório de Fisiologia Vegetal Coaracy Moraes Franco” Erick
Espinoza-Núñez, Cristina R. G. Sales, Fernanda Correa C. Marcos, José R. Magalhães
Filho, Neidiquele Maria Silveira, Karina I. Silva, Guilherme G. Roberto, Daniela F. São
Pedro Machado, Pedro Rampazzo e Ricardo S. Machado pela indispensável ajuda
durante a realização dos experimentos, nas análises laboratoriais e especialmente pela
ótima convivência.
- À Dra. Regina Célia M. Pires pelo auxílio na adaptação e manejo da irrigação do
sistema de rizotrons.
- Ao Dr. Fernando B. Zambrosi pela ajuda na implantação do sistema de hidroponia.
- À Dra. Silvana Creste e à doutoranda Larissa M. Andrade pelo auxílio com as análises
de expressão gênica.
- Ao Dr. Marcos Landell pelo auxílio com a escolha das variedades utilizadas.
- Aos amigos do IAC, em especial ao Guilherme Augusto P. Silva, Alex Paulo
Mendonça, Andre Luiz B. O. Silva, Vinicius Andrade e Anderson (Fogo).
- À PG/IAC especialmente à Célia, Carol e Tati.
- Aos professores da PG-IAC pelos ensinamentos transmitidos.
- Aos amigos Marcelo, Priscila, Ana Julia e Angelina pelo apoio e ótima convivência
durante esses quatro anos.
- Ao Programa de Pós-Graduação e ao Instituto Agronômico pela oportunidade.
- Aos amigos da república Kurva-d-Rio.
- À FAPESP pelo financiamento do projeto através do Programa BIOEN (Proc.
2008/57495-3).
- Ao CNPq pelo suporte financeiro.
- À todos aqueles que de uma forma direta ou indireta contribuíram para a realização
desse trabalho.
vi
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIAÇÕES ......................................................................................... vii
ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................................... x
ÍNDICE DE TABELAS ................................................................................................ xiv
RESUMO ....................................................................................................................... xv
ABSTRACT ................................................................................................................. xvii
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 1
2 ESTRUTURA DA TESE .............................................................................................. 7
CAPÍTULO I .................................................................................................................... 8
RESUMO ......................................................................................................................... 9
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 10
2 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 13
3 RESULTADOS ........................................................................................................... 19
4 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 32
5 CONCLUSÃO ............................................................................................................. 37
CAPÍTULO II ................................................................................................................. 38
RESUMO ....................................................................................................................... 39
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 40
2 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 42
3 RESULTADOS ........................................................................................................... 52
4 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 68
5 CONCLUSÃO ............................................................................................................. 73
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 74
vii
LISTA DE ABREVIAÇÕES
AF Área foliar cm2
AFE Área foliar específica cm2 g
-1
AN Assimilação de CO2 µmol m-2
s-1
AQP Aquaporinas
AQP% Contribuição das aquaporinas na condutância
hidráulica das raízes %
APX Ascorbato peroxidase µmol AsA g-1
MF min-1
AR Área radicular cm2
ARE Área radicular específica cm2 g
-1
ART Área radicular total m2
ATP Adenosina trifosfato
Ca Concentração de CO2 da atmosfera Pa
CAT Catalase nmol g-1
MF min-1
CI Concentração intercelular de CO2 Pa
CP Componente principal
CR Comprimento radicular M
CRE Comprimento radicular específico cm g-1
CRT Comprimento radicular total M
DAT Dias após o transplantio Dia
DH Tratamento de déficit hídrico
DR Diâmetro médio das raízes Mm
DHAR Deidroascorbato redutase
E Transpiração mmol m-2
s-1
ERO Espécie reativa de oxigênio
ETR Taxa de transporte de elétrons µmol m-2
s-1
EUA Eficiência do uso da água mol mmol-1
EUAi Eficiência intrínseca do uso da água µmol mol-1
ETR/AN Razão entre taxa de transporte de elétrons e CO2
assimilado molmol
-1
Fm Fluorescência máxima no escuro unid. rel.
Fm’ Fluorescência máxima na luz unid. rel.
Fo Fluorescência mínima no escuro unid. rel.
Fo’ Fluorescência mínima na luz unid. rel.
viii
Fq’/Fm’ Eficiência quântica efetiva do fotossistema II unid. rel.
Fq’/Fv’ Coeficiente de extinção fotoquímica unid. rel.
Fs Fluorescência no estado de equilíbrio dinâmico unid. rel.
FSI Fotossistema I
FSII Fotossitema II
Fv/Fm Eficiência quântica potencial do fotossistema II unid. rel.
Fv’ Fluorescência variável na luz unid. rel.
gM Condutância do mesofilo mol m-2
s-1
GR Glutationa redutase
gS Condutância estomática mol m-2
s-1
H Altura da planta cm
k Eficiência instantânea de carboxilação µmol m-2
s-1
Pa-1
Lpr Condutância hidráulica das raízes mmol m-2
s-1
MPa-1
MDA Aldeído malônico
MDHAR Monodeidroascorbato redutase
MS R/PA Razão entre a matéria seca da raiz e parte aérea
MSPA Matéria seca da parte aérea g
MSR Matéria seca da raiz g
MST Matéria seca total g
MSTR Matéria seca total das raízes g
NADPH Fosfato de dinucleotido de nicotinamida e adenina
NP Número de perfilhos unid.
NPQ Coeficiente de extinção não-fotoquímico
NFV Número de folhas verdes da touceira unid.
O2●-
Ânion superóxido
PEP Fosfoenolpiruvato
PEPCase Fosfoenolpiruvato carboxilase
PF Plasticidade fenotípica
PIP Proteína intrínseca de membrana plasmática
Q Radiação fotossinteticamente ativa μmol m-2
s-1
QEXC Excesso relativo de energia
Rd Respiração no escuro μmol m-2
s-1
RDPI Índice de plasticidade de distâncias relativas
ix
RDPIf Índice de plasticidade de distâncias relativas de
parâmetros fisiológicos
RDPIm Índice de plasticidade de distâncias relativas de
parâmetros morfológicos
REF Tratamento referência
Rubisco Ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase
RuBP Ribulose-1,5-bisfosfato
SM Tratamento de seca moderada
SOD Superóxido dismutase U.A. g-1
MF min-1
SS Tratamento de seca severa
TME Coleta realizada no máximo estresse
TR Coleta realizada 48 h após a reidratação
T48h Coleta realizada 48 h após indução do estresse hídrico
VR Volume das raízes mm3
CO2 Eficiência quântica da fixação de CO2 μmol μmol
-1
Potencial da água na folha MPa
me Potencial da água na folha medido no máximo estresse MPa
8h Potencial da água na folha medido 18 h após a
reidratação MPa
x
ÍNDICE DE FIGURAS
CAPÍTULO I
Figura 1. Posicionamento das mangueiras de irrigação com os gotejadores instalados em
três profundidades (em A). Detalhe do sensor WaterMark® posicionado no raio de 3 cm
do gotejador (em B). Registros para individualizar a saída de água para os gotejadores
(em C). ............................................................................................................................ 15
Figura 2 - Sistema radicular antes de ser fracionado para as análises de imagem. As
raízes foram seccionadas a cada 30 cm, considerando as três faixas de profundidade do
solo (0 a 30 cm; 30 a 60 cm; 60 a 90 cm). Em cada uma das frações, amostras de 8,0 cm
de comprimento foram excisadas, digitalizadas e avaliadas pelo programa Safira®...... 17
Figura 3. Assimilação de CO2 (AN, em A), eficiência instantânea de carboxilação (k, em
B), condutância estomática (gS, em C), eficiência do uso da água (EUA, em D),
transpiração (E, em E) e eficiência intrínseca do uso da água (EUAi, em F) das
variedades de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 expostas aos
tratamentos referência (REF), seca moderada (SM) e seca severa (SS) desde o
transplante das mudas para os rizotrons. Cada histograma representa o valor médio
(n=15)±desvio padrão. As médias são representativas de cinco dias de avaliações.
Letras maiúsculas comparam os regimes hídricos e letras minúsculas comparam as
variedades (t-student, p<0,05). ....................................................................................... 21
Figura 4. Eficiência potencial do fotossistema II (Fv/Fm, em A), excesso relativo de
energia (QEXC, em B), eficiência quântica aparente de fotossistema II (Fq’/Fm’, em C),
taxa aparente de transporte de elétrons (ETR, em D) e coeficiente de extinção
fotoquímico (Fq’/Fv’, em E) das variedades de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e
IACSP95-5000 expostas aos tratamentos referência (REF), seca moderada (SM) e seca
severa (SS) desde o transplante das mudas para os rizotrons. Cada histograma
representa o valor médio (n=15)±desvio padrão. As médias são representativas de cinco
dias de avaliações. Letras maiúsculas comparam os regimes hídricos e letras minúsculas
comparam as variedades (t-student, p<0,05). ................................................................. 23
Figura 5. Matéria seca total (MST, em A), matéria seca da parte aérea (MSPA, em B) e
razão matéria seca das raízes e da parte aérea (MS R/PA, em C) das variedades de cana-
de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 submetidas aos tratamentos de
disponibilidade hídrica referência (REF), seca moderada (SM) e seca severa (SS). Cada
histograma representa a média (n=3)±desvio padrão. Letras maiúsculas comparam os
regimes hídricos e letras minúsculas os tratamentos de variedades (t-student, p<0,05). 24
Figura 6. Área foliar (AF, em A) e área foliar específica (AFE, em B) das variedades de
cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 submetidas aos tratamentos referência
(REF), seca moderada (SM) e seca severa (SS). Cada histograma representa a médias
(n=3)±desvio padrão. Letras maiúsculas comparam os tratamentos de disponibilidade
hídrica e letras minúsculas os tratamentos de variedades (t-student, p<0,05). ............... 25
Figura 7. Área (AR, em A,B), comprimento (CR, em D,E) e matéria seca das raízes
(MSR, em G,H) no perfil do solo (0 a 30, 30 a 60 e 60 a 90 cm) e área radicular total
(ART, em C), comprimento radicular total (CRT, em F) e matéria seca total das raízes
(MSTR, em I) nas variedades de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (A,D,G) e IACSP95-
5000 (B,E,H) submetidas aos tratamentos referência (REF), seca moderada (SM, o) e
seca severa (SS, Δ). Cada símbolo ou barra indica o valor médio (n=3)±desvio padrão
xi
comparadas pelo teste t-student (p<0,05), seguidas por letras iguais não diferem entre si.
Letras maiúsculas comparam os tratamentos de disponibilidade hídrica e letras
minúsculas os tratamentos de variedades. ...................................................................... 26
Figura 8. Índice de plasticidade de distâncias relativas (RDPI) das características
fisiológicas (A; n=378), morfológicas (B; n=351) e total (C; n=729) em variedades de
cana-de-açúcar submetidas à deficiência hídrica. * indica diferença significativa entre as
variedades (p<0,05, Mann-Whitney). ............................................................................. 28
Figura 9. Índice de plasticidade de distâncias relativas (RDPI) das variáveis fisiológicas
(RDPIf, em A; n=27), agrupadas em trocas gasosas [assimilação de CO2 (AN),
condutância estomática (gS), concentração intercelular de CO2 (CI), transpiração (E),
eficiência da fixação de CO2 (CO2), eficiência do uso da água (EUA), eficiência
intrínseca do uso da água (EUAi) e eficiência instantânea de carboxilação (k)] e
fotoquímica [eficiência quântica aparente do fotossistema II (Fq’/Fm’), coeficiente de
extinção fotoquímico (Fq’/Fv’), taxa de transporte de elétrons (ETR), eficiência quântica
potencial do fotossistema II (Fv/Fm), coeficiente de extinção não-fotoquímico (NPQ) e
excesso relativo de energia (QEXC)] e morfológicas (RDPIm, em B; n=27) [área (AR),
volume (VR), comprimento (CR), matéria seca (MSR) e diâmetro (DR) da raiz, matéria
seca da parte aérea (MSPA), área foliar (AF), área foliar específica (AFE), razão
matéria seca raiz/parte aérea (MS R/PA), altura (H), matéria seca total (MST),
comprimento radicular específico (CRE) e área radicular específica(ARE)]. * indica
diferença significativa entre as variedades (p<0,05, Mann-Whitney). ........................... 29
Figura 10. Análise de componentes principais (CP) considerando os parâmetros
fisiológicos (em A), morfológicos (em B) e total (em C) utilizados no cálculo de RDPI
(Figura 8) das variedades de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (□) e IACSP95-5000 (Δ).
Os símbolos abertos representam o tratamento referência (REF), os símbolos azuis
parcialmente fechados representam o tratamento de seca moderada (SM) e os símbolos
vermelhos fechados representam os tratamento de seca severa (SS). A percentagem de
explicação de cada componente principal é mostrada. ns
indica não significância do
componente principal. .................................................................................................... 31
CAPÍTULO II
Figura 1. Ilustração do método de avaliação da condutância hidráulica das raízes (Lpr).
(Adaptado de SILVA, 2014). ......................................................................................... 51
Figura 2. Assimilação de CO2 (AN, em A,B), condutância estomática (gS, em C,D) e
eficiência instantânea de carboxilação (k, em E,F) nos genótipos de cana-de-açúcar
IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos aos tratamentos referência (REF) e déficit
hídrico (DH). DAT indica dias após o início do déficit hídrico. Cada símbolo representa
as médias (n=5±dp). *indica diferença significativa (p<0,05) entre os tratamentos
comparados pelo teste t-student. As setas indicam os dias de amostragem de tecidos
vegetais: T48h, 48 h após a redução do potencial osmótico da solução nutritiva; TME,
máximo déficit hídrico; e TR, 48 h após a reidratação.................................................... 53
Figura 3. Eficiência quântica aparente de fotossistema II (Fq’/Fm’, em A,B), taxa de
transporte de elétrons (ETR, em C,D) e ETR/AN (E,F) nos genótipos de cana-de-açúcar
IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos aos tratamentos referência (REF) e déficit
hídrico (DH). DAT indica dias após o início do déficit hídrico. Cada símbolo representa
as médias (n=5±dp). *indica diferença significativa (p<0,05) entre os tratamentos
comparados pelo teste t-student. As setas indicam os dias de amostragem de tecidos
xii
vegetais: T48h, 48 h após a redução do potencial osmótico da solução nutritiva; TME,
máximo déficit hídrico; e TR, 48 h após a reidratação.................................................... 55
Figura 4. Coeficiente de extinção fotoquímico (Fq’/Fv’, em A,B), coeficiente de
extinção não-fotoquímico (NPQ, em C,D) e excesso relativo de energia (QEXC, em E,F)
nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos aos
tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). DAT indica dias após o início do
déficit hídrico. Cada símbolo representa as médias (n=5±dp). *indica diferença
significativa (p<0,05) entre os tratamentos comparados pelo teste t-student. As setas
indicam os dias de amostragem de tecidos vegetais: T48h, 48 h após a redução do
potencial osmótico da solução nutritiva; TME, máximo déficit hídrico; e TR, 48 h após a
reidratação. ..................................................................................................................... 56
Figura 5. Concentração de aldeído malônico (MDA) em folhas (em A,B) e raízes (em
C,D) dos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos aos
tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). Cada histograma representa a
média (n=4±dp). * indica diferença significativa entre os tratamentos pelo teste t-
student. T48h representa a coleta realizada 48 h após redução do potencial osmótico da
solução nutritiva; TME indica a coleta realizada no máximo déficit hídrico; e TR a coleta
realizada 48 h após a reidratação. ................................................................................... 58
Figura 6. Concentração de peróxido de hidrogênio (H2O2) em folhas (em A,B) e raízes
(C,D) dos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos
aos tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). Cada histograma representa a
média (n=4±dp). * indica diferença significativa entre os tratamentos pelo teste t-
student. T48h representa a coleta realizada 48 h após redução do potencial osmótico da
solução nutritiva; TME indica a coleta realizada no máximo déficit hídrico; e TR a coleta
realizada 48 h após a reidratação. ................................................................................... 59
Figura 7. Atividade de superóxido dismutase (SOD) em folhas (em A,B) e raízes (em
C,D) dos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos aos
tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). Cada histograma representa a
média (n=4±dp). * indica diferença significativa entre os tratamentos pelo teste t-
student. T48h representa a coleta realizada 48 h após redução do potencial osmótico da
solução nutritiva; TME indica a coleta realizada no máximo déficit hídrico; e TR a coleta
realizada 48 h após a reidratação. ................................................................................... 60
Figura 8. Identificação de isoformas de superóxido dismutase (SOD) em PAGE-nativo
em folhas e raízes dos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065
submetidos aos tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). TME indica a coleta
realizada no máximo déficit e TR a coleta realizada 48 h após a reidratação. Cada gel é
resultante de uma amostra composta de quatro repetições, representativo de três
corridas. .......................................................................................................................... 61
Figura 9. Atividade de catalase (CAT) em folhas (em A,B) e raízes (em C,D) dos
genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos aos
tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). Cada histograma representa a
média (n=4±dp). * indica diferença significativa entre os tratamentos pelo teste t-
student. T48h representa a coleta realizada 48 h após redução do potencial osmótico da
solução nutritiva; TME indica a coleta realizada no máximo déficit hídrico; e TR a coleta
realizada 48 h após a reidratação. ................................................................................... 62
Figura 10. Atividade de ascorbato peroxidase (APX) em folhas (em A,B) e raízes (em
C,D) dos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos aos
xiii
tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). Cada histograma representa a
média (n=4±dp). * indica diferença significativa entre os tratamentos pelo teste t-
student. T48h representa a coleta realizada 48 h após redução do potencial osmótico da
solução nutritiva; TME indica a coleta realizada no máximo déficit hídrico; e TR a coleta
realizada 48 h após a reidratação. ................................................................................... 63
Figura 11. Condutância hidráulica das raízes (Lpr, em A) e contribuição das aquaporinas
em Lpr (AQP%, em B) em genótipos de cana-de-açúcar submetidos a condição de boa
disponibilidade hídrica (REF) e 48 h após a exposição ao déficit hídrico (DH).*indica
diferenças significativas entre genótipos pelo teste t-student (p<0,05). Médias (n=3±dp).
........................................................................................................................................ 64
Figura 12. Expressão relativa dos transcritos das aquaporinas ScPIP2;1 (em A),
ScPIP2;3 (em B), ScPIP2;5 (em C) e ScPIP2;6 (em D) nos genótipos de cana-de-açúcar
IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos ao déficit hídrico. A expressão foi
quantificada por qPCR e calculada pelo método 2-ΔΔCt
. Cada histograma representa a
média (n=4±ep) e *indica diferença significativa entre os tratamentos referência e
déficit hídrico (p<0,05). T48h indica a coleta realizada 48 h após a redução do potencial
osmótico da solução nutritiva; TME representa a coleta realizada no máximo déficit
hídrico; e TR a coleta realizada 48 h após a reidratação. ................................................ 66
Figura 13. Acúmulo de matéria seca no colmo, folha, raiz e total em genótipos de cana-
de-açúcar IACSP94-2094 (A) e IACSP97-7065 (B) submetidos aos tratamentos
referência (REF) e déficit hídrico (DH). Quantificação realizada após 48 h da
reidratação. Cada histograma representa a média (n=5±dp) e * indica diferença
significativa (p<0,05) entre os tratamentos pelo teste t-student. .................................... 67
xiv
ÍNDICE DE TABELAS
CAPÍTULO I
Tabela 1. Diâmetro médio das raízes (DR), volume médio das raízes (VR), crescimento
radicular específico(CRE) e área radicular específica (ARE) das variedades de cana-de-
açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 submetidas aos tratamentos referência (REF),
seca moderada (SM) e seca severa (SS). ........................................................................ 27
CAPÍTULO II
Tabela 1. Potencial da água na folha () em genótipos IACSP94-2094 e IACSP97-7065
submetidos aos tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). Medidas realizadas
na antemanhã, no máximo déficit hídrico (me) e 18 h após a reidratação (18h). ......... 57
Tabela 2. Sequência (5’-3’), concentração dos primers, eficiência da amplificação (E) e
variação da expressão de cinco genes constitutivos nas raízes de dois genótipos de cana-
de-açúcar, IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos à restrição hídrica. ................ 65
Tabela 3. Número de perfilhos (NP), número de folhas verdes da touceira (NFV) e área
foliar (AF) avaliados 48 h após a reidratação dos genótipos IACSP94-2094 e IACSP97-
7065 submetidos aos tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). .................. 67
xv
Fisiologia de cana-de-açúcar sob déficit hídrico: plasticidade fenotípica, transporte
de água, metabolismo antioxidante e fotossíntese
RESUMO
A limitação na disponibilidade de água é a principal causa da perda de produção em
cana-de-açúcar. A busca por variedades resistentes à seca é fundamental para a
manutenção da produtividade e economia de recursos. O sistema radicular é órgão
chave para a resistência à seca, no entanto há poucos estudos que relacionam as
respostas do sistema radicular com as da parte aérea em cana-de-açúcar submetidas à
seca. O objetivo deste estudo foi identificar mecanismos envolvidos com a resistência à
seca em mudas de cana-de-açúcar e avaliar se a resistência está associada ao melhor
desempenho do sistema radicular em manter o status hídrico da parte aérea, favorecendo
a fotossíntese. O desempenho das raízes foi avaliado através de respostas fisiológicas e
morfológicas. Foram realizados dois estudos, no primeiro as variedades de cana-de-
açúcar, IACSP94-2094 (tolerante à seca) e IACSP95-5000 (responsiva e altamente
produtiva) foram submetidas a três condições hídricas e foi avaliada a plasticidade
fenotípica de características morfológicas e fisiológicas. Plantas de ambas as variedades
submetidas ao déficit hídrico severo apresentaram redução da fotossíntese se
comparadas às plantas referência, porém, a redução foi menor em IACSP94-2094 se
comparada a IACSP95-5000. O maior acúmulo de matéria seca total de IACSP94-2094
ocorreu no tratamento referência, ao passo que o maior crescimento de IACSP95-5000
foi sob déficit hídrico moderado. Os resultados revelaram que IACSP94-2094
apresentou menor plasticidade fisiológica que IACSP95-5000 em todos os parâmetros,
exceto na eficiência quântica potencial do fotossistema II e no coeficiente de extinção
não-fotoquímico. Sob déficit hídrico as duas variedades apresentaram mecanismos de
resistência à seca, com IACSP95-5000 evitando o déficit hídrico com o maior
crescimento das raízes sob estresse moderado. Em condição de seca severa, IACSP94-
2094 apresenta tolerância, com menor sensibilidade da fotossíntese. O maior acúmulo
de biomassa sob déficit hídrico em IACSP95-5000 foi associado à maior plasticidade
fenotípica, com o componente fisiológico (trocas gasosas) sendo determinante se
comparado ao morfológico. No segundo estudo foram utilizadas IACSP94-2094 e
IACSP97-7065 (sensível à seca) e analisadas as relações entre a condutância hidráulica
das raízes (Lpr), a fotossíntese e o metabolismo antioxidante. Os resultados sugerem que
xvi
o genótipo resistente IACSP94-2094 apresenta menor redução no crescimento devido a
menor sensibilidade da fotossíntese no período inicial de seca, dada pela menor
sensibilidade da condutividade hidráulica das raízes à restrição hídrica e manutenção da
contribuição das aquaporinas em Lpr (~80%). O padrão de expressão das aquaporinas
não foi associado à variação de Lpr. Não foi possível estabelecer uma relação entre o
teor de H2O2 no sistema radicular e a atividade das aquaporinas nas raízes. As respostas
do sistema antioxidante na raiz variaram entre os genótipos, mas os teores de H2O2
permaneceram inalterados em condição de déficit hídrico. Em geral, as enzimas
superóxido dismutase, catalase e ascorbato peroxidase foram mais responsivas ao déficit
hídrico em IACSP94-2094 no máximo estresse e na recuperação. São discutidos os
mecanismos fisiológicos relacionados com a sensibilidade ou resistência diferencial à
seca entre os genótipos.
Palavras-chave: Saccharum ssp., aquaporina, condutividade hidráulica, seca, raiz.
xvii
Physiology of sugarcane under water deficit: phenotypic plasticity, water transport
antioxidant metabolism and photosynthesis
ABSTRACT
Low water availability is the main cause of yield losses in sugarcane. The search for
drought-resistant varieties is crucial for maintaining productivity and saving water
resources. The root system plays a key role in drought resistance, however studies
relating root and shoot responses in sugarcane under drought are scarce. The aim of this
study was to identify mechanisms related to drought resistance in sugarcane and assess
if drought resistance is associated with better performance of root system, maintaining
shoot water status and favoring photosynthesis. The performance of roots was assessed
by morphological and physiological responses. In the first experiment, varieties of
sugarcane IACSP94-2094 (drought tolerant) and IACSP95-5000 (responsive and highly
productive) were subjected to three water conditions and the phenotypic plasticity of
morphological and physiological traits were evaluated. Plants of both varieties subjected
to severe water stress showed reductions in photosynthesis compared to reference
plants, however, the reduction was smaller in IACSP94-2094 compared to IACSP95-
5000. Higher accumulation of dry matter in IACSP94-2094 occurred under reference
treatment, whereas the highest growth in IACSP95-5000 was found under moderate
drought. The results revealed that IACSP94-2094 showed less physiological plasticity
than IACSP95-5000 in all parameters, except the potential quantum efficiency of
photosystem II and the non-photochemical quenching. Under drought stress the two
varieties showed resistance mechanisms against drought, with IACSP95-5000 avoiding
drought due to higher root growth under moderate stress. In conditions of severe
drought, IACSP94-2094 showed tolerance given by less sensitivity of photosynthesis.
The higher biomass accumulation under water deficit in IACSP95-5000 was associated
with higher phenotypic plasticity, with the physiological component (gas exchange)
being decisive when compared to morphological one. In the second experiment,
IACSP94-2094 and IACSP97-7065 (sensitive to drought) were studied and the relations
between root hydraulic conductance (Lpr), photosynthesis and antioxidant metabolism
were analyzed. The results suggest that the resistant genotype IACSP94-2094 shows
less reduction in growth due to lower sensitivity of photosynthesis during the initial
xviii
period of drought, given by the lower sensitivity of root hydraulic conductance and
maintenance of aquaporin contribution to Lpr (~80%). The pattern of aquaporins
expression was not associated with changes in Lpr. There was not possible to establish a
relation between root H2O2 concentration and aquaporin activity. The responses of root
antioxidant system varied between cultivars, but H2O2 levels remained unchanged in
water stress conditions. In general, the enzymes superoxide dismutase, catalase and
ascorbate peroxidase were more responsive to water deficit in IACSP94-2094 as
compared to IACSP97-7065, regarding the maximum stress and recovery. The
physiological mechanisms related to differential sensitivity to drought resistance among
genotypes were discussed.
Keywords: Saccharum ssp., aquaporin, hydraulic conductance, drought, root.
1
1 INTRODUÇÃO
O interesse mundial na produção de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) tem
crescido significativamente na última década devido à sua importância para a produção
de energia renovável (CHEAVEGATTI-GIANOTTO et al., 2011). Os biocombustíveis
são alternativas importantes aos combustíveis fósseis e apresentam grande potencial de
mitigação dos prejuízos causados pelos gases de efeito estufa (MOREIRA et al., 2014).
O aumento de produtividade e da eficiência do uso de recursos é importante para a
sustentabilidade da produção, mas para atingirmos esse objetivo é essencial o
entendimento das respostas das plantas às condições estressantes (PARRY &
HAWKESFORD, 2010).
A situação de estresse ocorre quando há desvio significativo das condições
ótimas para o desenvolvimento e as respostas das plantas ocorrem em todos os níveis
organizacionais (LARCHER, 2000). O déficit hídrico ocorre quando a demanda de água
da planta é maior que o suprimento pelas raízes (VADEZ et al., 2013), sendo
considerado a principal causa de perda de produção da agricultura (CATIVELLLI et al.,
2008). No entanto, além de ser genótipo-dependente, a severidade dos danos está
relacionada ao tempo de exposição, a intensidade da seca e ao estádio fenológico da
planta no momento da falta de água (LOPES et al., 2011). A seca pode prejudicar
aspectos fisiológicos, alterando o metabolismo, crescimento e desenvolvimento da
planta (JANGPROMMA et al., 2012). Para minimizar os prejuízos da falta de água, as
plantas apresentam diferentes mecanismos para superar a limitação hídrica, que
conferem diferentes níveis de resistência à seca. Os mecanismos são separados
didaticamente em (i) escape, (ii) evitamento e (iii) tolerância ao dessecamento. O escape
ocorre em plantas que completam o ciclo de vida antes do período seco. O evitamento
envolve todas as respostas que evitam a desidratação dos tecidos e a tolerância está
associada à capacidade da planta em manter a homeostase celular mesmo com baixos
conteúdos de água nos tecidos (LARCHER, 2000). De um modo geral, as plantas
utilizam mecanismos de evitamento e tolerância de maneira associada para superar o
estresse hídrico.
A alteração no fenótipo das plantas em resposta às variações no ambiente é
definida como plasticidade fenotípica (VALLADARES et al., 2007) e está associada à
capacidade de aclimatação da planta ao meio (NICOTRA et al., 2010). A plasticidade
fenotípica é espécie e genótipo-dependente e considera tanto aspectos morfológicos
2
como fisiológicos (VALLADARES et al., 2002). A plasticidade de determinadas
características funcionais das plantas pode ser traduzida em vantagem para a
sobrevivência e manutenção da produção em condição ambiental adversa (MATESANZ
et al., 2010). Desta forma, identificar quais são essas características é importante para a
compreensão da natureza da resistência à seca em plantas.
O sistema radicular é responsável pela absorção de água do solo, estando
diretamente relacionado à manutenção do status hídrico da planta. As raízes fazem parte
do sistema solo-planta-atmosfera, favorecendo a manutenção do fluxo de água através
da planta. A manutenção da homeostase da planta é dependente deste sistema, portanto
o fluxo de água deve ser mantido em variadas condições ambientais (JAVOT &
MAUREL, 2002), sendo a eficiência de absorção e transporte de água pelas raízes
características importantes para a resistência à seca (SALIENDRA & MEINZER, 1992)
e associadas com a regulação estomática. Com o início da restrição hídrica, o sistema
radicular percebe o secamento do solo e ocorre o desencadeamento de sinais químicos,
hidráulicos e moleculares que permitem a regulação do fluxo de água para manutenção
do status hídrico (TARDIEU, 1996; WILKINSON & DAVIES, 2002).
A condutância hidráulica do sistema radicular (Lpr) é ajustada a fim de regular o
fluxo de água para a parte aérea (CLARKSON et al., 2000; NORDEN et al., 2012).
Sabe-se que Lpr é variável ao longo do dia e responde ao balanço entre a demanda
hídrica e o suprimento de água via solo (HACHEZ et al., 2012; STEUDLE, 2000), com
sua variação estando diretamente ligada à atividade das aquaporinas (JAVOT &
MAUREL, 2002). Aquaporinas (AQP) são proteínas integrais que formam canais
transmembrana e facilitam o fluxo de água e/ou de solutos apolares, como ureia e
glicerol e os gases CO2 e amônia em células e organelas (HEINEN et al., 2009). Essas
proteínas regulam até 95% da condutância hidráulica celular (HENZLER et al., 2004).
Em plantas, já foram identificadas mais de 30 isoformas de AQPs, que são classificadas
em cinco subgrupos baseados na similaridade da sequência de aminoácidos: (i)
proteínas intrínsecas da membrana plasmática (PIP), (ii) proteínas intrínsecas do
tonoplasto (TIP), (iii) proteínas intrínsecas tipo nodulina (NIP), (iv) pequenas proteínas
intrínsecas básicas (SIP) e (v) proteínas intrínsecas X (XIP), estas ultimas não ocorrem
em monocotiledôneas (HEINEN et al., 2009; KATSUHARA et al., 2008). As PIPs são
as principais AQPs envolvidas no transporte de água célula-célula e compõe até 20% da
fração proteica das membranas plasmáticas. São divididas em duas famílias, que atuam
em conjunto, PIP1 e PIP2, sendo as PIP2 as que apresentam maior capacidade de
3
transporte de água (CHAUMONT et al., 2000; JOHANSSON et al., 1996). Dentro de
cada grupo de PIPs há as isoformas específicas que diferem na localização subcelular e
na seletividade de transporte de solutos (KATSUHARA et al. 2008). No entanto, as
AQPs podem ser inativadas pelo peróxido de hidrogênio (BENEBDELAH et al., 2009;
KTITOROVA et al. 2002). Mesmo sabendo-se da relação entre a atividade de
aquaporinas e a condutância hidráulica das raízes, ainda não há consenso no meio
científico sobre a regulação das AQPs e da Lpr quando as plantas são submetidas à seca.
Sob estresse abiótico, já foram identificadas reduções (AROCA et al., 2005; SILVA,
2014; VANDELEUR et al., 2009) ou aumentos (LIAN et al., 2004) no fluxo de água em
diferentes espécies de plantas.
Em situações de estresses pode ocorrer o aumento da geração de espécies
reativas de oxigênio (ERO) nas raízes, como H2O2. Dado o potencial efeito inibitório do
H2O2 sobre a atividade das AQPs é esperado que plantas que apresentem raízes com
sistema antioxidante mais eficiente acumulem menor quantidade de H2O2, favorecendo
a manutenção da atividade de AQPs e, portanto, a hidratação da parte aérea. No entanto,
em relação ao desempenho do metabolismo antioxidante no sistema radicular, órgão que
inicialmente é afetado pela baixa disponibilidade hídrica, não há estudos que revelem a
importância deste sistema enzimático em plantas de cana-de-açúcar submetidas à
restrição hídrica.
Se, apesar dos mecanismos de prevenção da desidratação, houver redução na
turgescência das folhas, ocorrerá menor crescimento foliar (INMAN-BAMBER et al.
2008). A posterior redução da condutância estomática (gS) e restrição na difusão de CO2
da atmosfera promoverá limitações difusivas da fotossíntese (GHANNOUM et al.,
2009; LOPES et al., 2011). A limitação difusiva promove desbalanço entre a produção
(atividade fotoquímica) e o consumo (atividade bioquímica) de produtos como
adenosina trifosfato (ATP) e nicotinamida adenina dinucleotídeo de piridina fosfato
reduzida (NADPH), levando à fotoinibição nos centros de reação do fotossistema II
(LAWLOR, 2002). A limitação metabólica é resultante da redução na atividade das
enzimas do metabolismo fotossintético C4, especialmente a ribulose-1,5-bisfosfato
carboxilase/oxigenase (Rubisco) e a fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPcase)
(GHANOOUM, 2009; LOPES et al., 2011) associadas a redução na síntese de ATP e
NADPH e consequentemente menor regeneração de ribulose-1,5-bisfosfato (RuBP) e
fosfoenolpiruvato (PEP) (LAWLOR, 2002). As limitações fotoquímicas são
dependentes da redução na síntese de ATP, causada pela redução na taxa de transporte
4
de elétrons entre os fotossistemas e por danos nas membranas dos tilacóides (LAWLOR
& CORNIC, 2002).
Associado às limitações na fotossíntese, uma vez que a energia luminosa
continua sendo absorvida pelas folhas, ocorre alteração no status redox das células. Com
isso, há o desencadeamento do estresse oxidativo que é consequência da redução no
consumo de elétrons nas reações de assimilação de CO2. As EROs são produzidas
continuamente no metabolismo de seres vivos nas cadeias de transporte de elétrons, por
isso as plantas evoluíram com mecanismos de defesa antioxidante que atuam
constantemente para mitigar os efeitos negativos dessas espécies reativas. No caso de
desbalanço entre produção e eliminação das EROs, há acúmulo de superóxido (O2•-),
peróxido de hidrogênio (H2O2) e radicais hidroxila (OH•) (ARBONA et al., 2003;
MITTLER, 2002; VAIDYANATHAN et al., 2003). Baixas concentrações de EROs
podem atuar como agentes sinalizadores, porém o acúmulo dessas moléculas reativas
pode levar à desestabilização de membranas lipídicas, danos ao DNA e proteínas
celulares (MITTLER, 2002), com consequente colapso do metabolismo celular,
causando a morte da célula e redução no crescimento (MITTLER, 2002; NEILL et al.,
2002).
O sistema antioxidante nas células é composto por mecanismos enzimáticos e
não-enzimáticos. O sistema não-enzimático é composto por moléculas de ascorbato,
glutationa, flavonoides, carotenóides e tocoferóis, enquanto que o sistema enzimático
compreende diversas enzimas presentes nos diferentes compartimentos celulares. As
principais são a superóxido dismutase (SOD), ascorbato-peroxidase (APX) e a catalase
(CAT), além da monodeidroascorbato redutase (MDHAR), deidroascorbato redutase
(DHAR) e glutationa redutase (GR). O radical O2•- é produzido principalmente nas
mitocôndrias, cloroplastos, peroxissomos, sendo dismutado à H2O2 pela SOD, que é
rapidamente eliminado pelas CAT e APX, produzindo H2O + O2 ( PARIDA et al., 2004;
FOYER & NOCTOR, 2005).
Em cana-de-açúcar, a seca é o principal fator abiótico de perdas de
produtividade (LISSON et al., 2005) e as plantas apresentam diversos mecanismos para
minimizar os efeitos negativos da seca. A alteração do ângulo de inserção, enrolamento
e redução da área foliar, redução da abertura estomática, redução da transpiração,
alteração na condutividade hidráulica das raízes, redução na atividade de enzimas do
metabolismo de nitrogênio e de carboidratos e acúmulo ativo de açúcares solúveis e
aminoácidos são alterações morfológicas e fisiológicas encontradas em plantas quando
5
expostas ao déficit hídrico (CHAVES et al.,2009; GHANNOUM, 2009; INMAM-
BAMBER & DE JAGER, 1986; LOPES et al., 2011; SINCLAIR & LUDLOW, 1986).
A sensibilidade da condutância estomática à falta de água é uma característica
fisiológica importante relacionada à resistência à seca em cana-de-açúcar (RIBEIRO et
al., 2013). Há variedades consideradas resistentes à seca que reduzem a condutância
estomática (gS) logo no início da desidratação, minimizando reduções no teor relativo
de água das folhas (MACHADO et al., 2009). No entanto, há genótipos de cana-de-
açúcar resistentes à seca que apresentam menor redução na abertura estomática que os
genótipos sensíveis, quando expostos à condição de déficit hídrico (SMIT & SINGELS,
2006). Também foi relatado que em condições de deficiência hídrica, o potencial da
água na folha em cana-de-açúcar apresenta rápido decréscimo, mas posteriormente
permanece praticamente constante à medida que a desidratação do solo aumenta
(SALIENDRA & MEINZER, 1989). Tal variação de respostas é possivelmente
explicada pelo caráter genótipo-dependente da coordenação entre o sistema radicular e
parte aérea, que compreende propriedades hidráulicas e a eficiência de absorção de água
das raízes (SMITH et al., 2005).
A capacidade de manter a maquinaria fotossintética ativa durante o déficit
hídrico é uma das principais características encontradas em plantas resistentes à seca
(ZLATEV & YORDANOV, 2004). Esta característica pode estar associada à
capacidade de manutenção da absorção de água sob diferentes condições ambientais,
que também é uma característica relacionada com a resistência a estresses
(BENABDELAH et al., 2009). Há ampla variação genotípica para resistência à seca em
cana-de-açúcar (MACHADO et al., 2013; RIBEIRO et al., 2013; SALES et al., 2013;
SMITH et al., 1999), por isso a compreensão das respostas das plantas ao déficit hídrico
é fundamental para a escolha e manejo das variedades a fim de otimizar a exploração
dos recursos disponíveis (SMIT & SINGELS, 2006).
Em plantas com metabolismo fotossintético C4, como a cana-de-açúcar, as
principais limitações da fotossíntese em condição de seca não são estomáticas
(TAYLOR et al., 2011). Os processos bioquímicos são os principais limitantes
(MACHADO et al., 2009; MACHADO et al., 2013), no entanto também foram
identificadas importantes limitações fotoquímicas do metabolismo fotossintético
(SALES et al., 2013). A eficiência de dissipação do excesso de energia através do
sistema antioxidante é uma importante característica para a resistência ou tolerância à
seca (CIA et al., 2012; SALES et al., 2013). A variedade de cana-de-açúcar tolerante à
6
seca exibiu menor sensibilidade à restrição hídrica, conferida pela melhor capacidade do
metabolismo antioxidante, sendo que essas alterações no metabolismo fotossintético
permitiram a manutenção do crescimento e melhor recuperação das trocas gasosas após
a reidratação (SALES et al., 2013).
A busca por genótipos com maior eficiência do uso da água é uma das
alternativas para a manutenção da produtividade em ambientes com baixa
disponibilidade hídrica (SINCLAIR et al., 2008). Sugere-se que a resistência ou
tolerância à seca seja maior em variedades que apresentem tendência de aprofundar o
sistema radicular e que essa característica está associada à maior eficiência do uso da
água (SMITH et al., 2005). O bom desenvolvimento do sistema radicular para a
manutenção de altas produtividades é considerada característica importante nos
programas de melhoramento genético que visam plantas resistentes à ambientes
limitantes (BODNER et al., 2013). Além das respostas morfo-fisiológicas que ocorrem
na parte aérea, as respostas à seca em cana-de-açúcar englobam mudanças no sistema
radicular, pois a dinâmica de crescimento e a distribuição das raízes de variedades de
cana-de-açúcar respondem às características do solo (SMITH et al., 2005). No entanto
são poucos os estudos que exploram as respostas do sistema radicular de cana-de-açúcar
frente a situações de restrição hídrica (JANGPROMMA et al., 2012). Os mecanismos
de resistência à seca são variados nos diferentes genótipos e a sua importância para o
melhor desempenho das plantas ainda é pouco conhecida (INMAN-BAMBER et al.,
2005). A falta de conhecimento é reflexo dos poucos estudos que sugerem os
mecanismos de resistência à seca de cana-de-açúcar, mesmo sabendo-se que o
conhecimento de características-chave para a resistência à seca é de grande importância
para os programas de melhoramento genético (BASNAYAKE et al., 2012).
Embora o estudo dos mecanismos envolvidos com a resistência à seca seja
fundamental para aumentar o conhecimento sobre a fisiologia dos estresses, menos
ainda se conhece quando a interação entre os metabolismos do sistema radicular e das
folhas é considerada.
7
2 ESTRUTURA DA TESE
A tese foi organizada em dois capítulos, com o primeiro intitulado “Plasticidade
fenotípica em cana-de-açúcar sob déficit hídrico: características morfológicas e
fisiológicas associadas à resistência à seca” no qual o objetivo do estudo foi identificar
os mecanismos predominantes de resistência à seca em duas variedades de cana-de-
açúcar. A hipótese deste trabalho é que a plasticidade fenotípica está relacionada com a
resistência à seca de variedades de cana-de-açúcar, sendo necessário estabelecer a
importância relativa da plasticidade fisiológica e morfológica na resposta das plantas à
baixa disponibilidade de água. No segundo capítulo é apresentado o estudo intitulado
“Integrando o transporte de água, fotossíntese e metabolismo antioxidante para
compreender a sensibilidade diferencial de genótipos de cana-de-açúcar ao déficit
hídrico”, no qual testamos a hipótese que a resistência à seca em cana-de-açúcar está
associada à menor sensibilidade da condutância hidráulica das raízes em condição de
restrição hídrica. Esta habilidade estaria associada a um efetivo sistema antioxidante nas
raízes, que inibe a produção de H2O2 em condição de déficit hídrico e mantém a
atividade das aquaporinas, favorecendo a fotossíntese em condições limitantes.
8
CAPÍTULO I
PLASTICIDADE FENOTÍPICA EM CANA-DE-AÇÚCAR SOB DÉFICIT HÍDRICO:
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS E FISIOLÓGICAS ASSOCIADAS À
RESISTÊNCIA À SECA
9
Plasticidade fenotípica em cana-de-açúcar sob déficit hídrico: características
morfológicas e fisiológicas associadas à resistência à seca
RESUMO
O objetivo do estudo foi identificar os mecanismos predominantes de resistência à seca
em duas variedades de cana-de-açúcar. Mudas pré-brotadas das variedades de cana-de-
açúcar (Saccharum spp.) IACSP95-5000 e IACSP94-2094 foram transplantadas para
rizotrons. As plantas foram submetidas a três regimes hídricos, com o potencial
matricial do solo sendo -3±1, -14±1 e -75±4 kPa nos tratamentos referência, déficit
moderado e severo, respectivamente. Trinta e cinco dias após o transplantio, depois das
primeiras raízes alcançarem a base dos rizotrons (95 cm de profundidade), o
experimento foi finalizado. As características biométricas (parte aérea e sistema
radicular), trocas gasosas foliares e a atividade fotoquímica foram avaliadas e a
plasticidade fenotípica, considerando parâmetros fisiológicos (trocas gasosas e atividade
fotoquímica) e morfológicos (raízes e parte aérea) calculada. Plantas de ambas as
variedades submetidas ao déficit hídrico moderado ou severo apresentaram redução da
fotossíntese se comparadas às plantas referência, porém, a redução foi menor em
IACSP94-2094 se comparada a IACSP95-5000 sob déficit hídrico severo. O maior
acúmulo de matéria seca total de IACSP94-2094 ocorreu no tratamento referência, ao
passo que o maior crescimento de IACSP95-5000 foi sob déficit hídrico moderado. Os
resultados revelaram que IACSP94-2094 apresentou menor plasticidade fisiológica que
IACSP95-5000 em todos os parâmetros, exceto na eficiência quântica potencial do
fotossistema II e no coeficiente de extinção não-fotoquímico. Sob déficit hídrico as duas
variedades apresentaram mecanismos de resistência à seca, com IACSP95-5000
evitando o déficit hídrico com o maior crescimento das raízes sob estresse moderado.
Em condição de seca severa, IACSP94-2094 apresenta tolerância, com menor
sensibilidade da fotossíntese. O maior acúmulo de biomassa sob déficit hídrico em
IACSP95-5000 foi associado à maior plasticidade fenotípica, com o componente
fisiológico (trocas gasosas) sendo determinante se comparado ao morfológico.
Palavras-chave: Saccharum ssp., fotossíntese, raiz, seca.
10
1 INTRODUÇÃO
O interesse mundial na produção de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) vem
crescendo significativamente desde a última década devido à sua importância como
matéria-prima para a produção de energia renovável (CHEAVEGATTI-GIANOTTO et
al., 2011; WALTER et al., 2014). Com a crescente busca pelo aumento de
produtividade e eficiência do uso de recursos é essencial a compreensão dos aspectos
fisiológicos e morfológicos associados ao crescimento e desenvolvimento das plantas de
cana-de-açúcar em condição de deficiência hídrica (PARRY & HAWKESFORD,
2010). A busca por genótipos com maior resistência a seca é uma das alternativas para a
manutenção da produtividade em ambientes com baixa disponibilidade hídrica. Neste
sentido, estudos que ajudem na compreensão das respostas de plantas de cana-de-açúcar
expostas à seca devem ser prioritárias (INMAN-BAMBER et al., 2005).
A seca é o principal fator ambiental responsável pela redução na produtividade
na cana-de-açúcar (LISSON et al., 2005; BASNAYAKE et al., 2012). A deficiência
hídrica ocorre quando a demanda de água pela planta é maior do que a capacidade de
absorção e transporte da água pelas raízes (AROCA et al., 2011). Quando a desidratação
celular atinge níveis críticos que interfere no status fisiológico e na homeostase celular,
ocorrem alterações no metabolismo e consequentemente no desenvolvimento da planta
(JANGPROMMA et al., 2012). A severidade dos efeitos da restrição hídrica nas plantas
é relacionada ao tempo de exposição, à intensidade e ao estádio fenológico da planta no
momento da falta de água (LOPES et al., 2011). Porém as respostas à seca estão
associadas com a capacidade da planta em perceber e responder à falta de água
(CHAVES et al., 2009).
De um modo geral as variedades de cana-de-açúcar reduzem a condutância
estomática (gS) logo no início do evento de seca, minimizando reduções no teor relativo
de água das folhas (INMAN-BAMBER et al., 2005; MACHADO et al., 2009).
Comparativamente às plantas C3, plantas C4 como a cana-de-açúcar apresentam maior
eficiência do uso da água. No entanto, com o decorrer da seca o processo fotossintético
passa a ser limitado pela menor difusão de CO2 no mesofilo (gM) (LOPES et al., 2011).
Além das limitações da fotossíntese dadas pelo menor suprimento de CO2 dada por
limitações difusivas (menor gS e gM), a desidratação dos tecidos desencadeia limitações
metabólicas. A limitação metabólica é resultante da redução na atividade das enzimas
do metabolismo fotossintético C4, especialmente a Rubisco e a PEPcase (LAWLOR &
11
CORNIC, 2002; LAWLOR, 2002). Ocorre também redução na produção de ATP,
NADPH e consequentemente nas taxas de regeneração de ribulose-1,5-bisfosfato
(RuBP) e fosfoenolpiruvato (PEP) (LAWLOR, 2002). A redução na síntese de ATP está
relacionada à redução na taxa de transporte de elétrons entre os fotossistemas e também
a danos nas membranas dos tilacóides (LAWLOR & CORNIC, 2002). Somadas a essas
limitações, também foram observadas perdas na eficiência quântica do fotossistema II
em variedades de cana-de-açúcar submetidas ao déficit hídrico (SALES et al., 2013;
RIBEIRO et al., 2013).
Além das respostas fisiológicas das plantas de cana-de-açúcar expostas à seca,
também ocorrem alterações em características morfológicas. Com o início da restrição
hídrica ocorre redução da expansão foliar (INMAN-BAMBER et al., 2005) em
consequência de prejuízos da divisão e alongamento celular. Com o decorrer da seca a
área foliar verde é reduzida, dada pelo aumento da senescência foliar associado ao
aumento do filocrono (SMIT & SINGELS, 2006). Observa-se em determinadas
variedades de cana-de-açúcar o enrolamento das folhas, que se inicia quando o potencial
da água na folha na antemanhã atinge valores ao redor de -1,0 MPa (INMAN-
BAMBER & DE JAGER, 1986). Com a redução da área foliar exposta, ocorre redução
da perda de água por transpiração, da interceptação de radiação e da temperatura foliar
(SILVA et al., 2007).
Associado a alterações morfo-fisiológicas na parte aérea, as respostas à seca em
cana-de-açúcar englobam mudanças no sistema radicular. A dinâmica de crescimento e
a distribuição das raízes de variedades de cana-de-açúcar respondem às características
do solo (SMITH et al., 2005). SALES et al. (2012) observaram que uma variedade de
cana-de-açúcar considerada tolerante à seca não apresentou alteração no acúmulo de
raízes quando submetidas à restrição hídrica. Também foi observado redução da
condutância hidráulica em variedades submetidas à restrição hídrica em cana-de-açúcar
(SALIENDRA & MEINZER, 1989; MEINZER & GRANTZ, 1990). É importante
salientar que essas alterações impactam o status hídrico da parte aérea. No entanto são
poucos os estudos que exploram as respostas do sistema radicular de cana-de-açúcar
frente a situações de restrição hídrica (JANGPROMMA et al., 2012).
As respostas de cana-de-açúcar à seca podem variar entre genótipos
(BASNAYAKE et al., 2012; MACHADO et al., 2009; SALES et al., 2013). Desta
forma, há variedades de cana-de-açúcar mais eficientes que outras em condições de
seca. No entanto os mecanismos de resistência à seca são variados nos diferentes
12
genótipos (INMAN-BAMBER et al., 2005). Estudos distintos utilizando a mesma
variedade resistente de cana-de-açúcar concluíram que esta apresentou menor redução
da fotossíntese durante a seca, associado à recuperação mais rápida da assimilação de
CO2 após a reidratação (MACHADO et al., 2009; SALES et al., 2013). A recuperação
da fotossíntese foi relacionada à maior atividade das enzimas superóxido dismutase e
ascorbato peroxidase (SALES et al., 2013). No entanto pouco são os estudos que
sugerem os mecanismos de resistência, mesmo sendo de fundamental importância para
os programas de melhoramento genético o conhecimento de características-chave para a
resistência à seca (BASNAYAKE et al., 2012). INMAN-BAMBER et al. (2012)
afirmaram que o aprofundamento das raízes, manutenção da área foliar verde,
condutância hidráulica e eficiência de transpiração são características importantes para o
aumento da resistência à seca e manutenção da produtividade em cana-de-açúcar.
Para minimizar os prejuízos da seca, as plantas apresentam diferentes
mecanismos para superar a limitação de água, que conferem diferentes níveis de
resistência à seca. Estes mecanismos são separados didaticamente em (i) “evitamento” e
(ii) tolerância ao dessecamento. O “evitamento” envolve todas as repostas que
minimizam a desidratação dos tecidos e a tolerância à dessecação é a capacidade da
planta em manter a homeostase celular mesmo com baixos conteúdos de água nos
tecidos (LARCHER, 2000). De um modo geral, as plantas utilizam mecanismos de
evitamento e tolerância de maneira associada para superar o estresse hídrico.
A planta não pode ser considerada isolada do contexto ambiental
(BRADSHAW, 1965) e assim a resistência ou tolerância à seca dependem da
capacidade da planta em perceber e responder aos estímulos ambientais. Esta habilidade
para expressar fenótipos alternativos em resposta a variações ambientais é chamada de
plasticidade fenotípica (PF). A plasticidade fenotípica está associada à capacidade de
aclimatação da planta ao meio (NICOTRA et al., 2010; VALLADARES et al., 2002).
Didaticamente, a PF pode ser separada em plasticidade morfológica e fisiológica
(VALLADARES et al., 2002), sendo o conhecimento da plasticidade das
características-chave envolvidas com a eficiência do uso da água importante para se
entender a resistência e a tolerância à seca (COUSO & FERNÁNDEZ, 2012). Assim, a
plasticidade de determinadas características funcionais das plantas pode ser traduzida
em vantagem para a sobrevivência e manutenção da produtividade em condição
ambiental adversa (MATESANZ et al., 2010). Em estudo realizado com três espécies de
gramíneas, a espécie que apresentou maior plasticidade fenotípica foi a mais sensível à
13
seca, dada pela redução de 50% na produção de biomassa. A espécie mais resistente foi
a que menos apresentou prejuízos em aspectos funcionais e morfológicos (COUSO &
FERNÁNDEZ, 2012). Esse resultado foi semelhante ao obtido por CLIFTON-BROWN
& LEWANDOWSKI (2000), que identificaram o Miscanthus sinensis como mais
tolerante à seca que o M. x giganteus devido à manutenção da produção sob condições
de seca.
Neste contexto, o objetivo do estudo foi identificar quais os mecanismos
predominantes de resistência à seca em duas variedades de cana-de-açúcar. A hipótese
deste trabalho é que a plasticidade fenotípica está relacionada com a resistência à seca
de variedades de cana-de-açúcar, sendo necessário estabelecer a importância relativa da
plasticidade fisiológica e morfológica na resposta das plantas à baixa disponibilidade de
água.
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Material Vegetal
Foram utilizadas mudas de duas variedades de cana-de-açúcar (Saccharum spp.)
provenientes do Programa de Melhoramento Genético do Instituto Agronômico (IAC).
A variedade IACSP94-2094 é classificada como rústica e seu sistema radicular descrito
como superficial (LANDELL et al., 2005). Em relação a diversas variedades de cana-
de-açúcar, se submetida a condições de restrição hídrica apresenta menor perda na
produção de biomassa, sendo considerada resistente à seca (MACHADO et al., 2009;
SALES et al., 2013). A variedade IACSP95-5000 é considerada responsiva a insumos,
tendo alta produção de biomassa quando cultivada em condições adequadas, com
sistema radicular também concentrado nas camadas superficiais do solo (LANDELL et
al., 2007).
2.2 Condições Experimentais
O experimento foi conduzido em estufa com condições ambientais semi-
controladas, com a temperatura média do ar de 23,8±2,7 °C e radiação
fotossinteticamente ativa (Q) máxima de aproximadamente 1100 mol m-2
s-1
. Para a
14
produção das mudas, colmos maduros de ambas as variedades foram coletados no
Centro Experimental Central – Fazenda Santa Elisa/IAC (CEC/IAC), Campinas/SP.
Mini-toletes contendo uma gema intacta foram obtidos após a secção de colmos em
frações de três a quatro centímetros e plantados em bandejas contendo substrato
comercial (Carolina Soil®, Vera Cruz RS, Brasil).
Após 20 dias da brotação, as mudas foram transplantadas para rizotrons
preenchidos com 28 L (95 cm de altura x 26 cm de diâmetro x 13 cm de raio) de mistura
de terra e areia na proporção (2:1). A terra utilizada no estudo foi coletada de solo do
tipo Latossolo vermelho-amarelo distrófico típico (DOS SANTOS et al., 2013). Após a
mistura com areia, a terra ficou com a seguinte constituição física: 59% de areia grossa;
13% de areia fina; 22% de silte e 6% de argila. Os rizotrons foram montados com uma
janela fixa de vidro e uma cobertura móvel de acrílico negro, que tem a função de
manter o sistema radicular na ausência de luz. As avaliações visuais do
desenvolvimento radicular foram feitas retirando a cobertura de acrílico. Os rizotrons
foram posicionados em ângulos de 45° com a horizontal para forçar o crescimento das
raízes junto à janela de vidro.
Foram utilizados 18 rizotrons para a realização do estudon nos quais foram
plantadas uma muda. Em cada rizotron foram instaladas três mangueiras de irrigação e
em cada mangueira foi instalado um gotejador autocompensante com vazão de 2,0 L h-1
(Netafim Ltd., Kibutz Hatzerim, Negev, Israel) em três profundidades distintas: 15, 45 e
70 cm a partir da superfície do solo (Figura 1A). Considerando o raio de três
centímetros a partir de cada gotejador (em cada profundidade), na região do bulbo
úmido, foi instalado um sensor WaterMark® 200SS (Irrometer, Riverside CA, EUA)
(Figura 1B). Na linha principal de irrigação foram instalados registros de água que
permitiam a abertura de cada gotejador de forma individual e cada registro permitia
liberar água de dois gotejadores localizados na mesma profundidade de dois rizotrons
adjacentes (Figura 1C). O sistema de irrigação foi acionado por motobomba elétrica
Hydrobloc P500 (KSB, Várzea Paulista SP, Brasil) com potência de 0,5 hp.
/
15
Figura 1. Posicionamento das mangueiras de irrigação com os gotejadores instalados
em três profundidades (em A). Detalhe do sensor WaterMark® posicionado no raio de 3
cm do gotejador (em B). Registros para individualizar a saída de água para os
gotejadores (em C).
Desde o momento do transplantio das mudas até o final do experimento, a
disponibilidade hídrica nos rizotrons foi mantida sempre a mesma. As plantas foram
submetidas a três condições de disponibilidade de água, baseadas no potencial mátrico
do solo, que foi monitorado diariamente através dos sensores WaterMark®
200SS.
Durante todo o período experimental o solo do tratamento referência (REF) foi mantido
a -3±1 kPa, o tratamento de seca moderada (SM) a -14±1 kPa e o tratamento de seca
severa (SS) a -75±4 kPa ao longo do perfil do solo nos rizotrons. A reposição da água
era feita apenas nas profundidades que estavam fora das faixas pré-definidas de tensão
de água.
2.3 Trocas gasosas e fluorescência da clorofila a
Aos 22 dias após o transplantio (DAT) iniciaram-se as medidas de trocas
gasosas realizadas com analisador de gases por infravermelho Li-6400 (Licor Inc.
Lincoln NE, EUA). As avaliações foram realizadas na folha +1 segundo o sistema de
nomenclatura Kuijper (VAN DILLEWIJN, 1952) aos 22, 24, 26, 29 e 35 DAT entre
10:00 e 12:00 horas, com radiação fotossinteticamente ativa (Q) fixada em de 2000
mol m-2
s-1
e pressão parcial de CO2 do ambiente (Ca) de 39,2±0,1 Pa. Foram avaliadas
a assimilação de CO2 (AN), transpiração (E), condutância estomática (gS), eficiência do
16
uso da água (EUA, AN/E), eficiência intrínseca do uso da água (EUAi, AN/gS),
concentração intercelular de CO2 (CI) e a eficiência instantânea de carboxilação (k,
AN/CI). A temperatura foliar e o déficit de pressão de vapor folha-ar foram monitorados
durante as medidas.
A fluorescência da clorofila a foi medida com o fluorômetro modulado 6400-40
LCF (Licor Inc. Lincoln NE, EUA) acoplado ao Li-6400, concomitantemente com as
medidas de trocas gasosas. Usando os sinais emitidos antes e após o pulso de saturação
(710 nm, Q ~ 8000 mol m-2
s-1
, 0,8 s) e após a excitação do fotossistema I (FSI) por
luz vermelho-distante (=735 nm, Q ~ 5 mol m-2
s-1
, 3,0 s), os seguintes parâmetros
foram monitorados: fluorescência em estado de equilíbrio (Fs) e máxima (Fm’) captadas
em tecidos adaptados a luz (Q = 2000 mol m-2
s-1
) e a fluorescência mínima (Fo’) após
a excitação do fotossistema I (VAN KOOTEN & SNEL, 1990). A partir destes
parâmetros, foram calculadas a fluorescência variável na luz (Fv’=Fm’–Fs), eficiência
quântica efetiva do fotossistema II (FSII) [Fq’/Fm’=(Fm’-Fs)/Fm’], o transporte aparente
de elétrons (ETR=Fq’/Fm’*f*Q*αfolha), onde f é a fração da energia absorvida usada pelo
fotossistema II, assumido como 0,4 em plantas C4 (EDWARDS & BAKER, 1993) e
αfolha é a absorbância da folha (0,85). A eficiência da fixação de CO2 (CO2) foi
calculada por CO2=(AN+Rd)/(Q*f), sendo Rd a respiração no escuro. O coeficiente de
extinção fotoquímica (Fq’/Fv’) foi calculado por Fq’/Fv’=(Fm’-Fs)/(Fm’-Fo’). Ao final do
experimento, foram avaliadas também a fluorescência máxima (Fm) e a fluorescência
mínima (Fo) em tecidos adaptados ao escuro, sendo calculados o coeficiente de extinção
não-fotoquímica [NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’] e o excesso relativo de energia [QEXC=(Fv/Fm–
Fq’/Fm’)/Fv/Fm] (BILGER et al., 1995; EDWARDS & BAKER, 1993; MAXWELL &
JOHNSON, 2000; MURCHIE & LAWSON, 2013).
2.4 Potencial da Água nas Folhas
Medidas de potencial da água nas folhas () foram realizadas na antemanhã aos
35 DAT. Discos foliares de 0,6 cm² foram excisados do terço final das lâminas foliares,
desconsiderando a nervura central, e imediatamente dispostos em câmaras de medida C-
52 (Wescor Inc., Logan UT, EUA). Após alcançar o equilíbrio termodinâmico, foi
estimado pelo método higrométrico, com o auxílio de um microvoltímetro HR-33T
(Wescor Inc., Logan UT, EUA).
17
2.5 Biometria
Ao longo do experimento a altura (H) das plantas (colo até a inserção da folha
+1) foi monitorada com uso de régua comum. No dia seguinte após as primeiras raízes
alcançarem a base dos vasos, foi realizado o desmonte do experimento, sendo retirado
cuidadosamente todo o solo dos rizotrons para manter as plantas íntegras. Após a coleta
das plantas, foi realizada a separação em parte aérea e sistema radicular. A
quantificação do número de folhas verdes e secas foi feita e a área foliar (AF) foi
medida com planímetro Li-3000C (Licor Inc., Lincoln NE, EUA). A parte aérea (folhas,
nó e colmo) foi seca em estufa de circulação forçada de ar modelo MA032 (Marconi,
Piracicaba SP, Brasil) a 60 °C até estabilização do peso para determinação da matéria
seca da parte aérea (MSPA). A área foliar específica (AFE) é dada como a razão entre a
AF e a matéria seca das folhas.
As raízes foram armazenadas em solução aquosa de etanol (30%, v/v) em
refrigerador até o momento das análises de imagem. As raízes intactas foram
gentilmente dispostas ao lado de uma fita métrica para determinação do comprimento
máximo e então separadas em até três frações (0 a 30, 30 a 60 e 60 a 90 cm). Uma sub-
amostra de 8,0 cm de comprimento da porção mediana de cada fração foi retirada para a
análise de imagem (Figura 2).
Figura 2 - Sistema radicular antes de ser fracionado para as análises de imagem. As
raízes foram seccionadas a cada 30 cm, considerando as três faixas de profundidade do
solo (0 a 30 cm; 30 a 60 cm; 60 a 90 cm). Em cada uma das frações, amostras de 8,0 cm
de comprimento foram excisadas, digitalizadas e avaliadas pelo programa Safira®.
As amostras foram cuidadosamente separadas e dispostas em scanner de mesa
Scanjet G2410 (Hewlett-Packard, Palo Alto CA, EUA) evitando a sobreposição de
raízes. Após a digitalização, as imagens foram analisadas com auxílio do programa
SAFIRA® (JORGE & SILVA, 2010) e estimativas de comprimento (CR), área (AR),
8 cm 8 cm8 cm
Prof. 60 – 90 cm Prof. 30 – 60 cm Prof. 0 – 30 cm
18
volume (VR) e diâmetro (DR) das raízes foram obtidas. Após a análise de imagem, as
sub-amostras e o restante das raízes foram secas (MSR) para que os parâmetros fossem
estimados com base na matéria seca. A determinação da matéria seca total (MST) da
planta foi obtida com a somatória da MSPA e MSR. O comprimento radicular
específico (CRE) foi obtido pela razão entre o CR/MSR e a área radicular específica
(ARE) foi obtida pela razão AR/MSR (MEIER & LEUSCHNER, 2008).
2.6 Plasticidade Fenotípica
A partir dos dados obtidos ao término do experimento, calculou-se o índice de
plasticidade de distâncias relativas (relative distance plasticity index, RDPI), para todas
as variáveis analisadas no estudo. O RDPI indica a distância fenotípica entre indivíduos
do mesmo genótipo expostos a diferentes ambientes e varia de 0 (sem plasticidade) a 1
(plasticidade máxima) e foi calculado de acordo com o método proposto por
VALLADARES et al. (2006).
Foram estimados o RDPI para as características fisiológicas (RDPIf) AN, gS, E,
CI, EUA, CO2, k, EUAi, Fq’/Fm’, Fq’/Fv’, NPQ, ETR, Fv/Fm e QEXC e para as
características morfológicas (RDPIm) AR, VR, CR, MSR, DR, MSPA, AF, AFE, MS
R/PA, H, MST, CRE e ARE. Também foi estimado o RDPI total, considerando todas as
variáveis analisadas.
2.7 Análise Estatística
O desenho experimental adotado foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial
2x3, sendo os fatores de variação as variedades (dois níveis) e a disponibilidade hídrica
(três níveis), considerando três repetições. Para os parâmetros de trocas gasosas e de
fluorescência da clorofila a avaliados ao longo do experimento, a análise estatística não
revelou diferenças entre as cinco avaliações e então foi realizada análise em arranjo
fatorial 2x3 considerando 15 repetições. Com apoio do programa Assistat 7.6 beta®
(UFCG, Brasil), a normalidade dos dados foi checada e os mesmos submetidos à análise
de variância. Quando detectadas diferenças significativas, as médias foram comparadas
pelo teste t-student (p<0,05).
19
Para a análise estatística de RDPI, como não foi observada normalidade dos
dados, foi utilizado o teste não-paramétrico de Mann-Whittney (p<0,05).
A análise de componentes principais (ACP) foi realizada considerando todos os
parâmetros utilizados nas estimativas de RDPI (AN, gS, E, CI, CO2, EUA, k, EUAi,
Fq’/Fm’, Fq’/Fv’, NPQ, ETR, Fv/Fm, QEXC, AR, VR, CR, MSR, DR, MSPA, AF, AFE,
MS R/PA, H, MST, CRE e ARE). A significância do componente principal foi
determinada pelo método broken-stick e considerado seu autovalor (eigenvalue). A
importância das variáveis em cada componente principal foi dada por seu peso (loading,
l). Foram consideradas apenas as variáveis que apresentaram os cinco maiores valores
de l. Para essa análise foi utilizado o programa PC-ORD v.4.10 (McCUNE &
MEFFORD, 1999).
3 RESULTADOS
3.1 Avaliações Fisiológicas
O potencial da água na folha () avaliado na antemanhã foi menor (p<0,05) nas
plantas do tratamento SM, atingindo valores próximos a -0,53±0,14 MPa nas duas
variedades estudadas. Já as plantas REF e SS mantiveram ao redor de -0,28±0,09 e
-0,26±0,09 MPa, respectivamente em ambas as variedades (dados não apresentados).
Ao longo do período experimental, as plantas submetidas aos tratamentos SM e
SS de ambas as variedades apresentaram redução significativa (p<0,05) em AN, se
comparadas às plantas REF. Considerando a variedade IACSP94-2094, a redução em
AN foi de 42% nas plantas SM e de 70% nas plantas SS (Figura 1A). Já a variedade
IACSP95-5000 apresentou menor prejuízo em AN (-17%) no tratamento de seca
moderada e maior redução sob seca severa (-87%) se comparada à IACSP94-2094
(Figura 3A,B). As plantas da IACSP95-5000 submetidas aos tratamentos REF e SM
apresentaram maior AN (p<0,05) durante o período experimental em relação às plantas
da variedade IACSP94-2094, porém a fotossíntese foi similar nas duas variedades
(p>0,05) quando submetidas à seca severa.
Em ambas as variedades, os maiores (p<0,05) valores de gS foram registrados no
tratamento referência (Figura 3C). Os valores de gS foram similares (p>0,05) entre as
plantas SM e SS da variedade IACSP94-2094, padrão distinto do observado em
20
IACSP95-5000. Nesta, as plantas SM apresentaram maiores valores de gs (p<0,05) do
que as plantas SS (Figura 3C). A redução média em gS de IACSP94-2094 foi da ordem
de 45% e 62% nas plantas SM e SS, respectivamente. Tal redução em IACSP95-5000
foi de 31% e 81% em SM e SS, respectivamente. A transpiração das plantas mostrou
padrão de resposta similar ao detectado em gS, sendo a redução média em E da
IACSP94-2094 de 39% e 58% nas plantas expostas à seca moderada e seca severa,
respectivamente, e de 28% e 76% nas plantas de IACSP95-5000 em SM e SS
respectivamente (Figura 3E).
Apenas nas plantas dos tratamentos de seca severa foram observados efeitos em
EUA e em EUAi, com reduções de 38% e 31% respectivamente em IACSP94-2094 e de
55% e 50% em IACSP95-5000 (Figura 3D,F). Na IACSP95-5000 foi observada
redução média em k quando submetida à seca severa, com decréscimo de 95% (Figura
3B).
21
0
10
20
30
40
aC
aB
aA
aC
bB
bA
AN
(m
ol m
-2 s
-1)
REF
SM
SS
A
0
2
4
6
8
aB
aAaA
aB
bAaA
D
EU
A
(m
ol m
mol -1)
0
75
150
225
aB
aAaA
aB
bAaA
F
EU
Ai
(m
ol m
ol -1
)
0
5
10
15
aAaA
aA
aA
aB
bA
bA
B
k
(m
ol m
-2 s-1 P
a-1)
0,0
0,1
0,2
aC
aB
aA
aBbB
C
gS
(mol m
-2 s
-1)
0
2
4
6
Variedades
aC
aB
aA
aBbB
bA
IACSP94-
2094
IACSP95-
5000IACSP95-
5000
IACSP94-
2094
E
E
(mm
ol m
-2 s
-1)
Figura 3. Assimilação de CO2 (AN, em A), eficiência instantânea de carboxilação (k, em
B), condutância estomática (gS, em C), eficiência do uso da água (EUA, em D),
transpiração (E, em E) e eficiência intrínseca do uso da água (EUAi, em F) das
variedades de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 expostas aos
tratamentos referência (REF), seca moderada (SM) e seca severa (SS) desde o
transplante das mudas para os rizotrons. Cada histograma representa o valor médio
(n=15)±desvio padrão. As médias são representativas de cinco dias de avaliações.
Letras maiúsculas comparam os regimes hídricos e letras minúsculas comparam as
variedades (t-student, p<0,05).
Apenas o tratamento de seca severa causou aumento (p<0,05) de CI em
IACSP94-2094 (+35%) e IACSP95-5000 (+63%). No tratamento de seca moderada não
foram observadas diferenças neste parâmetro, que variaram em torno de 11,8±4,0 Pa em
IACSP94-2094 e 7,2±4,0 Pa em IACSP95-5000. As plantas referência da IACSP94-
2094 apresentaram CO2 de 0,009±0,002 µmol µmol-1
e os tratamentos de seca
22
causaram redução em CO2 de 33% em SM e 44% em SS. Já na variedade IACSP95-
5000 o padrão de resposta foi distinto, com redução significativa de CO2 (-81%)
apenas nas plantas sob seca severa (dados não apresentados).
O déficit hídrico não causou alteração em NPQ e as variedades IACSP94-2094 e
IACSP95-5000 apresentaram valores similares de 1,35±0,66 e 1,44±0,70,
respectivamente. Apenas IACSP95-5000 apresentou redução (p<0,05) em Fv/Fm quando
submetida a seca severa (Figura 4A). Foi detectado aumento em QEXC nas plantas
IACSP94-2094 submetidas aos tratamentos de restrição hídrica, sendo esse aumento
mais expressivo em IACSP95-5000 (Figura 4B). Foram detectadas reduções em
Fq’/Fm’, ETR e em Fq’/Fv’ causados pelos tratamentos de restrição hídrica.
Considerando as plantas IACSP94-2094, Fq’/Fm’ e ETR foram reduzidos em 32% nas
plantas submetidas à seca moderada e em 48% nas plantas sob seca severa. Também
foram observadas reduções médias de 20% e 35% em Fq’/Fv’ nas plantas SM e SS,
respectivamente. Já nas plantas IACSP95-5000 a reduções médias Fq’/Fm’ foram de
12% nas plantas sob seca moderada e de 67% em seca severa. A redução em Fq’/Fv’ foi
de 11% em SM e de 46% em SS (Figura 4C,D,E).
23
0,00
0,05
0,10
0,15
aC
aB
aA
aC
bB
bA
bAB
bA
C
Fq'/F
m'
REF
SM
SS
0
30
60
90
120
aC
bB
bA
aC
aBaA
D
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
aC
aB
aA
aB
E
Fq'/F
v'
0510
80
85
90
95
100
aA
bB
bC
aAaA
aB
ET
R
(m
ol m
-2 s-1)
B
QE
XC
(%)
0,00,10,2
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
bBaAaAaA
bB
Variedades
Variedades
IACSP95-
5000
IACSP95-
5000IACSP94-
2094
IACSP94-
2094
Fv/F
mA
aAB
Figura 4. Eficiência potencial do fotossistema II (Fv/Fm, em A), excesso relativo de
energia (QEXC, em B), eficiência quântica aparente de fotossistema II (Fq’/Fm’, em C),
taxa aparente de transporte de elétrons (ETR, em D) e coeficiente de extinção
fotoquímico (Fq’/Fv’, em E) das variedades de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e
IACSP95-5000 expostas aos tratamentos referência (REF), seca moderada (SM) e seca
severa (SS) desde o transplante das mudas para os rizotrons. Cada histograma
representa o valor médio (n=15)±desvio padrão. As médias são representativas de cinco
dias de avaliações. Letras maiúsculas comparam os regimes hídricos e letras minúsculas
comparam as variedades (t-student, p<0,05).
3.2 Biometria
Apenas a ocorrência de seca severa promoveu redução significativa em MST
(p<0,05) nas duas variedades, com decréscimos de 77% em IACSP94-2094 e 60% em
IACSP95-5000. Foi detectada a manutenção da MST na variedade IACSP94-2094,
24
enquanto a IACSP95-5000 apresentou maior acúmulo de biomassa sob seca moderada
(Figura 5A). Nas duas variedades o acúmulo de MSPA foi menor (p<0,05) apenas nas
plantas que foram submetidas à seca severa (Figura 5B). Considerando a variedade
IACSP94-2094, a razão MS R/PA foi menor nas plantas submetidas à seca severa. Em
IACSP95-5000, houve manutenção da razão MS R/PA sob seca severa e aumento
(p<0,05) nas plantas submetidas à seca moderada (Figura 5C).
0
1
2
3
4
5 B
aB
aAaA
bB
bAbA
MS
PA
(g)
0
1
2
3
4
5 REF
SM
SS
A
bAbA
bB
aB
aA
aCMS
T
(g)
IACSP94-2094 IACSP95-5000
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Variedades
C
aB
aA
aB
bB
bA
MS
R/P
A
aA
Figura 5. Matéria seca total (MST, em A), matéria seca da parte aérea (MSPA, em B) e
razão matéria seca das raízes e da parte aérea (MS R/PA, em C) das variedades de cana-
de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 submetidas aos tratamentos de
disponibilidade hídrica referência (REF), seca moderada (SM) e seca severa (SS). Cada
histograma representa a média (n=3)±desvio padrão. Letras maiúsculas comparam os
regimes hídricos e letras minúsculas os tratamentos de variedades (t-student, p<0,05).
25
Foram detectadas reduções de 34% em AF (Figura 6A) e 23% em AFE (Figura
6B) de IACSP94-2094 expostas à seca moderada e redução de 92% em AF e 53% em
AFE quando submetidas à seca severa. Já nas plantas IACSP95-5000 não foram
observadas reduções, tanto em AF quanto em AFE, quando as plantas foram expostas à
SM, no entanto as plantas submetidas à SS apresentaram redução de 68% em AF
(Figura 6A) e de 21% em AFE (Figura 6B).
IACSP94-2094 IACSP95-50000
50
100
150
200
250A
AF
(cm
²)
REF
SM
SS
B
bA
bB
bC
aAaA
aB
IACSP94-2094 IACSP95-50000
40
80
120
160
aB
aAaA
bC
bB
aA
AF
E (c
m2 g
-1)
Variedades
Figura 6. Área foliar (AF, em A) e área foliar específica (AFE, em B) das variedades de
cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 submetidas aos tratamentos referência
(REF), seca moderada (SM) e seca severa (SS). Cada histograma representa a médias
(n=3)±desvio padrão. Letras maiúsculas comparam os tratamentos de disponibilidade
hídrica e letras minúsculas os tratamentos de variedades (t-student, p<0,05).
3.2.1 Distribuição do sistema radicular no perfil do solo
A distribuição do sistema radicular no solo foi diferente entre as duas
variedades, enquanto a IACSP94-2094 apresentou sistema radicular menos
desenvolvido e mais superficial nos três regimes hídricos (Figura 7A,D,G), IACSP95-
5000 apresentou sistema radicular maior e mais aprofundado (Figura 7B,E,H). As
plantas da IACSP94-2094 foram afetadas negativamente apenas pelo tratamento de seca
severa, com redução em AR (Figura 7C). Já IACSP95-5000 apresentou aumento
(p<0,05) de AR em superfície e em 45 cm de profundidade quando submetida ao
estresse moderado. Houve redução de AR em IACSP95-5000 apenas sob seca severa,
assim como observado em IACSP94-2094 (Figura 7C). Os dois tratamentos de seca
promoveram redução em CR na IACSP94-2094 e apenas a seca severa afetou
26
negativamente IACSP95-5000 (Figura 7F). IACSP95-5000 quando exposta à seca
moderada apresentou aumento (p<0,05) em CR (Figura 7E). As plantas desta variedade
quando foram submetidas à seca moderada apresentaram aumento (p<0,05) na produção
de raízes na camada superficial do solo (Figura 7H). IACSP94-2094 foi afetada
negativamente pelo déficit hídrico apenas em condição de seca severa, com redução de
84% em MSR (Figura 7I). Já IACSP95-5000 apresentou aumento (p<0,05) de MSR
quando submetida ao estresse moderado e redução de 80% sob seca severa (Figura 7I).
As plantas da variedade IACSP95-5000 apresentaram maior (p<0,05) MSR se
comparadas à IACSP94-2094 em condição de boa disponibilidade hídrica e seca
moderada (Figura 7I).
Figura 7. Área (AR, em A,B), comprimento (CR, em D,E) e matéria seca das raízes
(MSR, em G,H) no perfil do solo (0 a 30, 30 a 60 e 60 a 90 cm) e área radicular total
(ART, em C), comprimento radicular total (CRT, em F) e matéria seca total das raízes
(MSTR, em I) nas variedades de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (A,D,G) e IACSP95-
5000 (B,E,H) submetidas aos tratamentos referência (REF), seca moderada (SM, o) e
0,0 0,4 0,8 1,2
80
60
40
20
0
0,0 0,4 0,8 1,2 IACSP94-2094 IACSP95-50000,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
aC
aA
aB
bB
bA
aA
C
AR
T (m
²)
REF
SM
SS
AR (m²)
SMA REF.
IACSP95-5000
SS
IACSP94-2094
*
*
B
-80
-60
-40
-20
0
0 2 4 6 80 2 4 6 8 IACSP94-2094 IACSP95-50000
4
8
12
16
Pro
fun
did
ade
do s
olo
(cm
)
aC
aA
aB
bC
bB
aA
F
CR
T (m
)
D
*
E
*
CR (m)
0 200 400 600 8000 200 400 600 800
-80
-60
-40
-20
0H
*
Variedades
MS
TR
(mg
)
MSR (mg)
G
IACSP94-2094 IACSP95-50000
500
1000
1500
2000
aC
aA
aB
aB
bA
I
bA
27
seca severa (SS, Δ). Cada símbolo ou barra indica o valor médio (n=3)±desvio padrão
comparadas pelo teste t-student (p<0,05), seguidas por letras iguais não diferem entre si.
Letras maiúsculas comparam os tratamentos de disponibilidade hídrica e letras
minúsculas os tratamentos de variedades.
A seca, em nenhum dos dois tratamentos, afetou DR e ARE (p>0,05) das
variedades de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 (Tabela 1). Foi
observado redução em CRE na IACSP94-2094 sob condição de seca severa, porém o
CRE aumentou quando esta planta foi exposta à condição de seca moderada. A seca não
afetou CRE em IACSP95-5000 (Tabela 1). Enquanto na variedade IACSP94-2094 o
VR foi reduzido apenas em seca severa, em IACSP95-5000 ele foi reduzido sob seca
moderada e severa (Tabela 1).
Tabela 1. Diâmetro médio das raízes (DR), volume médio das raízes (VR), crescimento
radicular específico(CRE) e área radicular específica (ARE) das variedades de cana-de-
açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 submetidas aos tratamentos referência (REF),
seca moderada (SM) e seca severa (SS).
Var. Trat. DR (mm)
VR (mm³)
CRE (m g
-1)
ARE (m
2 g
-1)
IACSP94-2094
REF 0,39±0,03ns
15,2±5,8 bA
140,6±6,0 aB
0,16±0,07ns
SM 0,39±0,03 18,2±3,1 aA
282,5±48,9 aA
0,20±0,05
SS 0,47±0,08 3,4±2,4 aB
92,7±31,8 aC
0,15±0,07
IACSP95-5000
REF 0,39±0,02 45,2±3,4 aA
91,3±20,5 bA
0,15±0,03
SM 0,43±0,05 26,0±8,9 aB
89,5±8,9 bA
0,14±0,01
SS 0,49±0,15 10,4±1,2 aC
117,9±9,5 aA
0,20±0,03
Valor médio (n=3) ± desvio padrão. Médias comparadas pelo Teste t-student seguidas por letras iguais
não diferem entre si (p<0,05). Letras maiúsculas comparam os tratamentos de disponibilidade hídrica e
minúsculas comparam os tratamentos de variedades. ns
indica que não houve diferença significativa.
3.3 Índice de Plasticidade de Distâncias Relativas (RDPI)
O índice de plasticidade e distâncias relativas (RDPI) das variáveis fisiológicas
foi maior (p<0,05) em IACSP95-5000, ao passo que o RDPI das variáveis morfológicas
foi maior em IACSP94-2094. O RDPI total que reúne variáveis fisiológicas e
morfológicas foi maior em IACSP95-5000 (Figura 8).
28
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0 *
IACSP95-5000
RD
PI
IACSP94-2094
A *B
*C
TotalMorfológicaFisiológica
Figura 8. Índice de plasticidade de distâncias relativas (RDPI) das características
fisiológicas (A; n=378), morfológicas (B; n=351) e total (C; n=729) em variedades de
cana-de-açúcar submetidas à deficiência hídrica. * indica diferença significativa entre as
variedades (p<0,05, Mann-Whitney).
Considerando as variáveis fisiológicas, IACSP95-5000 apresentou maior RDPI
das trocas gasosas (AN, gS, CI, E, φCO2, EUA, EUAi, k) e fotoquímica (Fq’/Fm’, Fq’/Fv’,
ETR, QEXC) que IACSP94-2094 (Figura 9A). Diferenças significativas entre as
variedades quando se considera o RDPI das variáveis morfológicas foram notadas
apenas em AF, AFE e CRE, que foi maior (p<0,05) em IACSP94-2094 (Figura 9B).
29
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0ns
ns *
***
**
*
**
**
*
**
Fotoquímica
Q EXC
F q'/F
v'
RD
PIf
AR V
RCR
MSR
DR
MSPA A
FAFE
MS R
/PA
H MST
CRE
ARE
A N g S C I E
CO 2
EUA E
UA i
k
F q'/F
m'
ETR
F v/F m
NPQ
A
Trocas Gasosas
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
nsns
nsB
ns
*
*ns
*ns
nsnsnsns
RD
PIm
IACSP94-2094 IACSP95-5000
Figura 9. Índice de plasticidade de distâncias relativas (RDPI) das variáveis fisiológicas
(RDPIf, em A; n=27), agrupadas em trocas gasosas [assimilação de CO2 (AN),
condutância estomática (gS), concentração intercelular de CO2 (CI), transpiração (E),
eficiência da fixação de CO2 (CO2), eficiência do uso da água (EUA), eficiência
intrínseca do uso da água (EUAi) e eficiência instantânea de carboxilação (k)] e
fotoquímica [eficiência quântica aparente do fotossistema II (Fq’/Fm’), coeficiente de
extinção fotoquímico (Fq’/Fv’), taxa de transporte de elétrons (ETR), eficiência quântica
potencial do fotossistema II (Fv/Fm), coeficiente de extinção não-fotoquímico (NPQ) e
excesso relativo de energia (QEXC)] e morfológicas (RDPIm, em B; n=27) [área (AR),
volume (VR), comprimento (CR), matéria seca (MSR) e diâmetro (DR) da raiz, matéria
seca da parte aérea (MSPA), área foliar (AF), área foliar específica (AFE), razão
matéria seca raiz/parte aérea (MS R/PA), altura (H), matéria seca total (MST),
comprimento radicular específico (CRE) e área radicular específica(ARE)]. * indica
diferença significativa entre as variedades (p<0,05, Mann-Whitney).
30
3.4 Análise de Componentes Principais
A análise de componentes principais (ACP) foi realizada considerando-se as 27
variáveis utilizadas na estimativa de RDPI e revelou um padrão interessante da resposta
das variedades de cana-de-açúcar frente ao déficit hídrico. A ACP realizada com os
parâmetros fisiológicos revelou forte proximidade entre as plantas REF e SM da
IACSP95-5000, porém com uma grande distância das plantas SS. Já na IACSP94-2094
foi observado maior aproximação entre as plantas submetidas aos três tratamentos
(Figura 10A). O CP1 explicou 78,9% da variância total e os cinco parâmetros com os
maiores loadings foram AN (l = 0,3085), seguido por CO2 (l = 0,3081), ETR (l =
0,3044), Fq’/Fm’ (l = 0,3043) e k (l = 0,3025). A ACP realizada com os parâmetros
morfológicos sugere um forte agrupamento entre as plantas dos tratamentos referência e
seca moderada (Figura 10B). O CP1 representou 58,3% da variância total dos dados e
os cinco principais parâmetros foram MST (l = 0,3553), VR (l = 0,3545), MSR (l =
0,3537), AR (l = 0,3526) e CR (l = 0,3524). Considerando os parâmetros morfológicos e
fisiológicos foi possível identificar a proximidade entre as plantas dos tratamentos
referência e de seca moderada da IACSP95-5000. Por outro lado, as plantas de ambas as
variedades submetidas ao tratamento de seca severa se agruparam do lado esquerdo do
gráfico. Também foi possível observar grande distância entre as plantas submetidas à
seca severa e à referência na IACSP95-5000, sugerindo grande sensibilidade desta
variedade à restrição hídrica severa (Figura 10C). O CP1 representou 61,1% da
variância total do estudo, sendo AN a principal variável para a separação das plantas
(l=0,2400), seguido por k (l=0,2396), CO2 (l=0,2395), AF (l=0,2337) e ETR
(l=0,2318).
31
A
CP
2 n
s
(11
,1%
)
CP1*(78,9%)
B
CP
2 n
s
(15
,2%
)
CP1*(58,3%)
C
CP1*(61,1%)
CP
2 n
s
(10
,5%
)
IACSP94-2094 - Ref. SM SS
IACSP95-5000 - Ref. SM SS
Figura 10. Análise de componentes principais (CP) considerando os parâmetros
fisiológicos (em A), morfológicos (em B) e total (em C) utilizados no cálculo de RDPI
(Figura 8) das variedades de cana-de-açúcar IACSP94-2094 (□) e IACSP95-5000 (Δ).
Os símbolos abertos representam o tratamento referência (REF), os símbolos azuis
parcialmente fechados representam o tratamento de seca moderada (SM) e os símbolos
vermelhos fechados representam os tratamento de seca severa (SS). A percentagem de
explicação de cada componente principal é mostrada. ns
indica não significância do
componente principal.
32
4 DISCUSSÃO
Os resultados deste trabalho sugerem que as variedades de cana-de-açúcar
estudadas apresentam resistência diferencial ao déficit hídrico e que o nível de
resistência varia de acordo com a intensidade do estresse. A resistência à seca está
relacionada com a capacidade da planta, quando exposta ao agente estressor, em manter
ou minimizar a restrição do crescimento.
Nas duas variedades, o das plantas expostas à seca severa foi similar ao das
plantas referência. Esta situação pode ter ocorrido devido ao baixo consumo de água
dado pelo maior fechamento estomático e menor área foliar (Figuras 3C e 6A). As
plantas IACSP95-5000 apresentaram maior redução em EUA (Figura 3D) e EUAi
(Figura 4F), indicando menor capacidade de aclimatação à baixa disponibilidade de
água. Associado a essas respostas fisiológicas foi detectado menor perda na AF da
IACSP95-5000 (Figura 6A). A redução na área foliar é considerada uma resposta de
aclimatação à seca, promovendo redução da área transpirante e da interceptação de
radiação, minimizando a pressão energética nos fotossistemas (CHAVES et al., 2009;
GHANOOUM, 2009).
Na condição de déficit hídrico severo, as duas variedades apresentaram reduções
significativas no metabolismo fotossintético. No entanto, a variedade IACSP95-5000
mostrou-se mais sensível devido a maior redução de AN em comparação às plantas da
referência (Figura 3A). Embora os estômatos estivessem parcialmente fechados (Figura
3C) a fotossíntese não foi limitada por aspectos difusivos, pois foi detectado aumento de
CI nas plantas submetidas à seca severa. Em condição de seca severa também é
esperado que ocorra redução na condutância do mesofilo (gM), prejudicando o processo
fotossintético (GHANOOUM, 2009). MACHADO et al. (2013) identificaram que
aproximadamente 90% da limitação fotossintética em plantas de cana-de-açúcar
submetidas à seca foi causada por aspectos metabólicos, dada pela redução nas
velocidades de carboxilação da PEPCase e Rubisco. A redução na atividade destas
enzimas provavelmente foi maior na IACSP95-5000, dada pela maior redução em k
(Figura 3B) e de CO2. As limitações não-estomáticas são as principais causas da
redução de fotossíntese em plantas C4 submetidas à estresse hídrico e ocorrem
principalmente pela redução na síntese e acúmulo de ATP nos cloroplastos (LAWLOR,
2002).
33
Associado à limitação bioquímica, a fotossíntese também foi limitada pela
atividade fotoquímica (Figura 4). A fase fotoquímica da fotossíntese também foi mais
sensível à seca na IACSP95-5000, dado pelas maiores reduções de Fq’/Fm’, ETR e
Fq’/Fv’ (Figura 4). Em ambas as variedades foi detectado aumento em QEXC em
decorrência da seca (Figura 4B), que pode ser explicado pela menor Fq’/Fm’ (Figura 4C)
e está associada à redução da energia direcionada para a etapa fotoquímica, indicada
pela redução em Fq’/Fv’ (Figura 4E). Apesar de ter havido redução de Fv/Fm, estes
foram sempre maiores que 0,750 (Figura 4A), sugerindo que os fotossistemas II não
sofreram danos fotoquímicos permanentes nas duas variedades (BOLHÁR-
NORDENKAMPF & LECHNER, 1990) e confirmando a alta resistência do aparato
fotoquímico à seca (YORDANOV et al., 2000).
Porém quando as plantas foram submetidas à seca moderada, a maior
sensibilidade foi observada na IACSP94-2094. Apesar de ambas as variedades terem
apresentado redução significativa na fotossíntese (Figuras 3 e 4), a variedade IACSP95-
5000 apresentou menor redução em AN quando comparada a IACSP94-2094, 17% vs.
42%, respectivamente (Figura 3A). Nas duas variedades foi observada manutenção de
CI, EUA e EUAi nas plantas SM (Figura 3D,F). Considerando as características
morfológicas das plantas submetidas à seca moderada, a IACSP95-5000 apresentou o
melhor desempenho, acumulando mais biomassa do que na condição referência (Figura
5A), especialmente nas raízes (Figura 7I).
A grande maioria dos estudos sobre efeitos da seca em cana-de-açúcar abordam
apenas as respostas na parte aérea (BOARETTO et al., 2014; SALES et al., 2013;
BASNAYAKE et al., 2012; INMAN-BAMBER et al., 2005; RAMESH, 2000), mesmo
sabendo-se que o sistema radicular tem grande importância na percepção e no
desencadeamento das respostas frente ao secamento do solo (MASLE, 2002). No caso
deste trabalho, o maior acúmulo de biomassa em IACSP95-5000 submetida à seca
moderada ocorreu em função do maior crescimento das raízes (Figura 7I). Com isso,
houve aumento de duas vezes na razão de MS R/PA (Figura 5C), indicando uma
resposta de aclimatação à seca. Após o transplantio das mudas para os rizotrons não foi
observado aumento em H (dados não mostrados) na variedade IACSP95-5000
sugerindo que esta variedade apresenta crescimento inicial lento da parte aérea, pois
investe os produtos da fotossíntese no aprofundamento das raízes (Figura 7B,E,H),
explorando maior volume de solo, confirmado pelo maior VR (Tabela 1). Assim, a
capacidade de utilização dos recursos do solo na fase inicial de crescimento deve ser
34
maior em comparação a IACSP94-2094. A maximização do uso da umidade do solo é
um componente crucial na resistência à seca (BLUM, 2005). INMAN-BAMBER et al.
(2012) preveem aumentos de até 21% na produção de biomassa em plantas de cana-de-
açúcar com sistema radicular mais aprofundado em situações de restrição hídrica.
Assim, as plantas IACSP95-5000 apresentam vantagem sobre a IACSP94-2094 em
ambiente com déficit hídrico brando a moderado, pois o aprofundamento do sistema
radicular é uma estratégia importante para evitar a desidratação das plantas em
ambientes com limitação hídrica (BLUM, 2011; HUND et al., 2009).
O crescimento das raízes é dependente da respiração dos fotoassimilados que são
transportados para as raízes. A respiração pode ser separada em respiração de
crescimento e de manutenção (VAN OIJEN et al., 2010), sendo os esqueletos
carbônicos produzidos incorporados em biomassa. O maior crescimento da IACSP95-
5000 em relação a IACSP94-2094 pode ser explicado pela maior fotossíntese quando
submetidas à condição referência e de seca moderada (Figura 3A). Já o maior
crescimento das raízes da IACSP95-5000 submetida à seca moderada não foi explicado
pela AN, pois houve redução neste parâmetro. Tampouco pode ser explicado por
variações na fotossíntese global do dossel, visto que houve manutenção de AF (Figura
6A). Portanto, podemos considerar a hipótese de que as plantas IACSP95-5000
apresentam maior capacidade de translocação de fotoassimilados para as raízes do que a
IACSP94-2094. De fato, a fração de carboidratos translocados e metabolizados nas
raízes varia entre as espécies, estádio fenológico e condição ambiental (LAMBERS et
al., 2002). Associado à translocação de açúcares, a respiração de crescimento ou a
eficiência da respiração em condições de estresses pode ser maior na IACSP95-5000
que na IACSP94-2094. MACHADO & PEREIRA (1990) determinaram que a eficiência
de conversão de carboidratos nas raízes (YR) é alterada por estresses abióticos. Plantas
de arroz (Oryza sativa L.) e milho (Zea mais L.) apresentaram aumento em YR quando
foram expostas à estresse por alumínio. Logo, é esperado variação entre os genótipos de
cana-de-açúcar quando se considera o balanço de carbono sob condições de seca. Nesse
sentido, há a necessidade de pesquisas futuras para revelar a associação entre respiração
e o crescimento de raízes expostas à seca.
A plasticidade fenotípica (PF) é uma ferramenta usada para a análise da
aclimatação das plantas às alterações no ambiente (NICOTRA et al., 2010). Portanto,
para entender a capacidade da planta de crescer em ambiente adverso, é necessário
compreender a habilidade dela para resistir à limitação dos recursos (COUSO &
35
FERNÁNDEZ, 2012). A variedade IACSP95-5000 apresentou maior RDPIf (Figura
9A), pois as variações em todos os parâmetros, exceto Fv/Fm e NPQ, foram maiores que
na IACSP94-2094. A maior plasticidade fisiológica traduziu-se em vantagem para o
acúmulo de biomassa em IACSP95-5000. Essa estratégia é interessante, pois as
respostas fisiológicas podem ocorrer em curto prazo, são reversíveis e os custos
energéticos envolvidos com as respostas plásticas morfológicas são maiores (MEIER &
LEUSCHNER, 2008). Considerando a RDPIm, não foram detectadas diferenças
significativas (p>0,05) na maioria dos parâmetros analisados, exceto em AF, AFE e
CRE (Figura 9B) que foram maiores em IACSP94-2094. No entanto, nem sempre alta
plasticidade é sinônimo de vantagem adaptativa (COUSO & FERNÁNDEZ, 2012), p.e.,
a grande redução no acúmulo de matéria seca total das raízes observada na IACSP94-
2094 (Figura 7I) em função da seca não pode ser considerada uma vantagem. As plantas
IACSP94-2094 apresentaram maior plasticidade em AF e AFE devido à grande redução
(Figura 6A,B) com o aumento da intensidade do estresse. A redução em AF está
envolvida com economia de água devido à redução da área transpirante, conforme já
abordado. A redução na AFE pode estar relacionada com outra estratégia de economia
de água e preservação do aparato fotossintético, pois ao se reduzir a área foliar e manter
a massa do tecido ocorre concentração de proteínas e redução da área superficial
transpirante. O maior aumento em CRE sugere que a variedade IACSP94-2094, quando
submetida ao estresse hídrico, investe em ramificação do sistema radicular, e não no
aumento da produção em biomassa das raízes (Figura 7I). Aparentemente, tal
característica (maior RDPIm) é menos efetiva do que as fisiológicas.
Ambas as variedades estudadas apresentaram características de resistência à seca
quando foram submetidas à condição de estresse hídrico moderado, pois mantiveram a
produção de biomassa (Figura 5A). Porém, os mecanismos de resistência envolvidos
foram diferentes: enquanto IACSP94-2094 tem o processo fotossintético menos sensível
à seca, sendo esse um mecanismo de tolerância a IACSP95-5000 apresenta o
mecanismo de “evitação” da seca, dado pelo aumento do crescimento radicular. Com
isso, a IACSP95-5000 apresentou maior eficiência do uso da água (Figura 3D,F) e
maior acúmulo de biomassa (Figura 5A) sob condição de seca moderada.
Para determinarmos as principais características da cana-de-açúcar envolvidas
com a resistência à seca foi realizada a análise de componentes principais. Essa análise
ajuda a classificar a variedade IACSP95-5000 como resistente à seca, porque há
agrupamento das plantas submetidas aos tratamentos referência e seca moderada e um
36
grupo distante das plantas expostas à seca severa (Figura 10C). Este grande
distanciamento dos grupos ocorreu quando a condição de seca foi severa, com isso deve
ter havido quebra da homeostase das plantas da variedade IACSP95-5000, que
causaram danos expressivos no crescimento. No entanto, a IACSP94-2094 foi
classificada como tolerante à seca, pois esta variedade aparentemente reduz o
metabolismo, economizando energia para um possível período de reidratação. Porém
esta estratégia penaliza o crescimento das plantas durante o período de seca. Esta
hipótese pode ser confirmada pela analise de ACP, em que todos os indivíduos da
IACSP94-2094 estão separados, porém o distanciamento entre eles é menor do que da
IACSP95-5000 (Figura 10C). Com esta análise foi possível identificar que as cinco
características mais importantes na separação dos grupos de plantas foram as
características relacionadas às fases bioquímica e fotoquímica da fotossíntese, além da
área foliar.
RIBEIRO et al. (2013) identificaram que a variedade IACSP94-2094 apresenta
tolerância à seca devido à menor sensibilidade da fotossíntese durante o período de
restrição hídrica. No entanto ainda não se sabe quais os mecanismos responsáveis pela
proteção do processo fotossintético em condição de restrição hídrica. Uma hipótese que
pode explicar a manutenção da fotossíntese é a presença de proteínas específicas que
atuam protegendo as estruturas celulares da desidratação (WAHID & CLOSE, 2007).
De acordo com o modelo da compensação (trade-off), é esperado que uma planta
produtiva apresente comprometimento da produção quando exposta à seca. No entanto
nem sempre o trade-off entre produção e resistência à seca ocorre. Neste estudo, a
variedade IACSP95-5000, considerada altamente produtiva (LANDELL et al., 2007), se
mostrou resistente à seca moderada. Outros estudos também não confirmaram o trade-
off entre produção e resistência à seca em variedades de gramíneas C4 submetidas à
restrição hídrica (COUSO et al., 2010; FERNÁNDEZ & REYNOLDS, 2000). Esses
resultados demonstram que é possível aliar a resistência à seca a alta produtividade em
um único genótipo, sendo uma importante constatação para a sustentabilidade da
agricultura.
37
5 CONCLUSÃO
Sob baixa disponibilidade hídrica, as duas variedades apresentam mecanismos
de resistência, com IACSP95-5000 evitando o déficit hídrico com o maior crescimento
das raízes sob estresse moderado. Em condição de seca severa, IACSP94-2094
apresenta tolerância, com menor sensibilidade da fotossíntese. O maior acúmulo de
biomassa sob déficit hídrico em IACSP95-5000 foi associado à maior plasticidade
fenotípica, com o componente fisiológico prevalecendo em relação ao morfológico. A
regulação das trocas gasosas determinou esta maior plasticidade fisiológica.
38
CAPÍTULO II
INTEGRANDO O TRANSPORTE DE ÁGUA, FOTOSSÍNTESE E METABOLISMO
ANTIOXIDANTE PARA COMPREENDER A SENSIBILIDADE DIFERENCIAL DE
GENÓTIPOS DE CANA-DE-AÇÚCAR AO DÉFICIT HÍDRICO
39
Integrando o transporte de água, fotossíntese e metabolismo antioxidante para
compreender a sensibilidade diferencial de genótipos de cana-de-açúcar ao déficit
hídrico
RESUMO
A hipótese do trabalho é que a resistência à seca em cana-de-açúcar está associada à
menor sensibilidade da condutância hidráulica das raízes em condição de restrição
hídrica. Esta habilidade estaria relacionada a um efetivo sistema antioxidante nas raízes,
que inibiria a produção de H2O2 em condição de déficit hídrico e manteria a atividade
das aquaporinas, favorecendo a fotossíntese em condições limitantes. Genótipos de
cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065 foram cultivados em hidroponia e
submetidos ao déficit hídrico pela adição de polietilenoglicol (PEG-8000) à solução
nutritiva. Trocas gasosas e a atividade fotoquímica foram monitoradas a cada dois dias e
as enzimas do metabolismo antioxidante em folhas e raízes e a expressão relativa de
transcritos das isoformas ScPIP2;1, ScPIP2;3, ScPIP2;5 e ScPIP2;6 de aquaporinas das
raízes analisadas em três momentos: 48 h após a adição de PEG-8000 (T48h); após nove
dias de restrição hídrica, no máximo estresse (TME) e 48 h após a reidratação (TR). Em
T48h também foram avaliadas a condutância hidráulica das raízes (Lpr) e a contribuição
das aquaporinas no fluxo de água (AQP%). O genótipo resistente IACSP94-2094
apresenta menor redução no crescimento devido a menor sensibilidade da fotossíntese
no período inicial de seca, dada pela menor sensibilidade de Lpr à restrição hídrica e
manutenção de AQP% (~80%). O padrão de expressão das aquaporinas não foi
associado à variação de Lpr. Não foi possível estabelecer uma relação entre o teor de
H2O2 no sistema radicular e a atividade das aquaporinas nas raízes. As respostas do
sistema antioxidante na raiz variaram entre os genótipos, mas os teores de H2O2
permaneceram inalterados em condição de déficit hídrico. Em geral, as enzimas
superóxido dismutase, catalase e ascorbato peroxidase foram mais responsivas ao déficit
hídrico em IACSP94-2094. São discutidos os mecanismos fisiológicos relacionados
com a sensibilidade ou resistência diferencial à seca entre os genótipos.
Palavras-chave: Saccharum, spp., aquaporina, condutância hidráulica, seca, sistema
radicular
40
1 INTRODUÇÃO
A limitação na disponibilidade hídrica representa o principal fator abiótico que
causa redução da produtividade na cultura da cana-de-açúcar (LISSON et al., 2005),
pois causa importantes prejuízos no metabolismo da planta (RIBEIRO et al., 2013;
SALES et al., 2013). Nas situações em que a demanda de água para a manutenção e
crescimento da planta não é suprida pela absorção de água pelas raízes ocorre o déficit
hídrico (VADEZ et al., 2013). A manutenção do status hídrico da planta é dependente
da capacidade de absorção de água pelo sistema radicular associado à eficiência de
transporte da água para a parte aérea (SALIENDRA & MEINZER, 1992). Devido à
característica séssil, as plantas desenvolveram ajustes complexos para a regulação do
balanço hídrico e a condutância hidráulica das raízes (Lpr) tem importante papel neste
processo (NORDEN et al., 2012).
Sabe-se que a Lpr não é constante ao longo do dia e varia em função do balanço
entre a demanda hídrica da atmosfera e o suprimento de água via solo (HACHEZ et al.,
2012; STEUDLE, 2000), sendo regulada pelas aquaporinas (AQP) de membrana
plasmática (JAVOT & MAUREL, 2002). Sob estresse abiótico, já foram identificadas
reduções (AROCA et al., 2005; SILVA, 2014; VANDELEUR et al., 2009) ou aumentos
(LIAN et al., 2004) no fluxo de água em diferentes espécies de plantas, com o aumento
em Lpr sendo relacionado com o aumento na expressão dos genes de AQP nas raízes
(LIAN et al., 2004). As proteínas intrínsecas da membrana plasmática (PIPs) são as
principais AQPs envolvidas no transporte de água célula-célula e compõe até 20% da
fração proteica das membranas plasmáticas. São divididas em PIP1 e PIP2, mas as PIP2
apresentam maior capacidade de transporte de água (CHAUMONT et al., 2000;
JOHANSSON et al., 1996). Sabe-se que há maior expressão de genes de AQPs nas
raízes do que nas folhas (HEINEN et al., 2009) e em raízes de cana-de-açúcar foram
identificadas por Northen Blot Virtual sete isoformas da ScPIP2 (ScPIP2;1, ScPIP2;2,
ScPIP2;3, ScPIP2;4, ScPIP2;5, ScPIP2;6, ScPIP2;7) (FRIGEL, 2011). Dentre diversos
fatores internos que podem afetar a atividade de AQP, o peróxido de hidrogênio foi
identificado como eficaz inibidor de AQPs (BENEBDELAH et al., 2009;
KTITOROVA et al. 2002).
Com o início da restrição hídrica, o sistema radicular é responsável por perceber
o secamento do solo e desencadear sinais químicos para que a planta se ajuste à situação
de menor disponibilidade de água (TARDIEU, 1996; WILKINSON & DAVIES, 2002).
41
No caso de seca prolongada e/ou severa, o sistema radicular pode sofrer danos
metabólicos que causam prejuízos na eficiência da cadeia de transporte de elétrons,
especialmente nas mitocôndrias. Assim, o desbalanço no status redox das células
promove o acúmulo das espécies reativas de oxigênio (ERO), como superóxido (O2•-),
radicais hidroxila (OH•) e H2O2, sendo iniciado o estresse oxidativo (FOYER &
NOCTOR, 2005). Para prevenir ou amenizar os danos causados pelo acúmulo de EROs
nos tecidos, as plantas evoluíram com um sistema antioxidante composto por processos
não-enzimáticos, mediados por determinadas moléculas (ascorbato, glutationa,
flavonoides, carotenóides e tocoferóis) e enzimáticos, que envolvem principalmente as
enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e ascorbato peroxidase (APX)
(FOYER & NOCTOR et al., 2005). Considerando a atividade das enzimas do
metabolismo antioxidante nas folhas de cana-de-açúcar expostas à limitação de água, há
relatos de maior atividade e maior quantidade de isoformas de SOD e maior atividade
de APX em variedade resistente à seca (BOARETTO et al., 2014; SALES et al., 2013).
Em relação ao desempenho do sistema antioxidante no sistema radicular, órgão que
inicialmente é afetado pela baixa disponibilidade hídrica, há poucos estudos que
revelem a importância do sistema enzimático em plantas de cana-de-açúcar submetidas
à restrição hídrica (SILVA, 2014).
Sabe-se que há ampla variação genotípica em relação às respostas das plantas de
cana-de-açúcar ao déficit hídrico e que a manutenção da capacidade de absorção de
água sob diferentes condições ambientais está relacionada com a resistência a estresses
(BENABDELAH et al., 2009). Embora o estudo dos mecanismos envolvidos com a
proteção à seca seja fundamental para aumentar o conhecimento sobre a resistência à
estresses, pouco se conhece quando a interação entre os metabolismos do sistema
radicular e das folhas é considerado.
Neste contexto, a hipótese do trabalho é que a resistência à seca em cana-de-
açúcar está associada à menor sensibilidade da condutância hidráulica das raízes em
condição de restrição hídrica. Esta habilidade estaria associada a um efetivo sistema
antioxidante nas raízes, que inibe o acúmulo de H2O2 em condição de déficit hídrico e
mantém a atividade das aquaporinas, favorecendo a fotossíntese em condições
limitantes.
42
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Material vegetal e condições experimentais
Foram utilizados uma variedade e um clone de cana-de-açúcar provenientes do
Programa de Melhoramento Genético do Instituto Agronômico (IAC). A variedade
IACSP94-2094 foi escolhida como padrão tolerante à seca (MACHADO et al., 2009;
RIBEIRO et al., 2013) e o clone IACSP97-7065 foi selecionado por ser considerado
sensível à seca (SALES et al., 2013). Os colmos maduros utilizados para retirada dos
minitoletes com as gemas íntegras para formação das mudas da variedade IACSP94-
2094 foram coletados no Centro Experimental Central, Instituto Agronômico,
Campinas/SP. Os colmos do genótipo IACSP97-7065 foram coletados na Usina Jalles
Machado, Goianésia/GO e trazidos inteiros para Campinas, onde foram seccionados em
minitoletes de três a quatro centímetros contendo uma gema.
Mudas pré-brotadas em substrato comercial (Carolina Soil®, Vera Cruz RS,
Brasil) com 15 dias foram passadas para caixas plásticas com 12 L de solução nutritiva.
Em cada caixa foram colocadas três plantas de cada genótipo, presas com espuma pelo
tolete em uma placa de isopor perfurada, de modo que apenas o sistema radicular
ficasse mergulhado na solução nutritiva. O experimento foi conduzido em casa de
vegetação com condições ambientais semi-controladas. Durante o período experimental
a temperatura média do ar foi de 24,1±4,2 °C e a radiação fotossinteticamente ativa
máxima aproximadamente 1100 µmol m-2
s-1
.
A solução nutritiva (SARRUGE, 1975) era composta por (mmol L-1
para
macronutrientes e mol L-1
para os micronutrientes: 15 de N (7% como NH4+); 4,8 de
K; 5,0 de Ca; 2,0 de Mg; 1,0 de P; 1,2 de S; 28,0 de B; 54,0 de Fe; 5,5 de Mn; 2,1 de
Zn; 1,1 de Cu; e 0,01 de Mo. Na primeira semana após o transplantio, as plantas foram
mantidas em solução com ¼ da força iônica. Na semana seguinte, mantidas em solução
nutritiva com ½ força e após a terceira semana foram cultivadas em solução com 100%
da força iônica. A cada dois dias o volume da solução nutritiva era reposto com água
destilada e a cada cinco dias a solução era totalmente substituída. A aeração do sistema
hidropônico foi realizada com compressor de ar. O pH da solução foi avaliado com
pHmetro Tec-3MPp (Tecnopon, Piracicaba SP, Brasil), mantido em 5,5±0,3. A
condutividade elétrica, avaliada com condutivímetro Tec-4MPp (Tecnopon, Piracicaba
43
SP, Brasil) foi mantido em 1,83±0,11 mS cm-1
. Já o potencial osmótico foi -0,11 MPa,
sendo medido pelo método higrométrico, com microvoltímetro HR-33T (Wescor Inc.,
Logan UT, EUA) e câmara de medida C-52 (Wescor Inc., Logan UT, EUA).
Para simular efeito de estresse hídrico por seca foi utilizado o osmólito
polietilenoglicol 8000 (PEG-8000), que induz a redução da disponibilidade de água para
as raízes via redução do potencial osmótico da solução nutritiva. Trinta e seis dias após
o transplantio das mudas para o sistema hidropônico foi realizada a primeira adição de
PEG-8000 Carbowax Sentry (Dow Chemical Comp, Midland MI, EUA) à solução
nutritiva. A adição de PEG-8000 foi realizada em dois dias para evitar choque osmótico
nas raízes. No primeiro dia o potencial osmótico da solução nutritiva foi reduzido para
-0,29 MPa, e no dia seguinte reduzido para -0,55 MPa. O volume das caixas foi
completado com a mesma solução nutritiva com PEG-8000 a cada dois dias. Após nove
dias de tratamento com PEG-8000, foi realizada a substituição da solução nutritiva com
potencial osmótico de -0,55 MPa por solução com potencial osmótico de -0,11 MPa,
simulando a reidratação das plantas.
2.2 Avaliação da fotossíntese
Foi realizado o acompanhamento das trocas gasosas e atividade fotoquímica a
cada dois dias a partir do 33° dia após o transplantio. As medidas foram realizadas entre
10:00 e 12:00 horas, com radiação fotossinteticamente ativa (Q) de 2000 mol m-2
s-1
e
pressão parcial de CO2 do ambiente (Ca) de 39,6±0,7 Pa. Em relação às trocas gasosas,
foram consideradas a assimilação de CO2 (AN), a transpiração (E), a condutância
estomática (gS), a eficiência do uso da água (EUA, AN/E), a eficiência intrínseca do uso
da água (EUAi, AN/gS), a concentração intercelular de CO2 (CI) e a eficiência
instantânea de carboxilação (k, AN/CI). A temperatura foliar e o déficit de pressão de
vapor folha-ar foram monitorados durante as medidas. A fluorescência da clorofila a foi
medida com um fluorômetro modulado 6400-40 LCF (Licor Inc., Lincoln NE, EUA)
acoplado ao Li-6400, concomitantemente com as medidas de trocas gasosas. Antes e
após um pulso de saturação (710 nm, Q ~ 8.000 mol m-2
s-1
, 0,8 s) e após a
excitação do fotossistema I por luz vermelha-distante (=735 nm, Q ~ 5 mol m-2
s-1
,
3,0 s), os seguintes parâmetros foram monitorados: fluorescência em estado de
equilíbrio (Fs) e máxima (Fm’) captadas em tecidos adaptados a luz (Q = 2000 mol m-2
44
s-1
) e a fluorescência mínima (Fo’) após a excitação do fotossistema I (VAN KOOTEN
& SNEL, 1990). A partir destes parâmetros, foram calculadas a eficiência quântica
efetiva do fotossistema II, [Fq’/Fm’=(Fm’-Fs)/Fm’], o transporte aparente de elétrons
(ETR=Fq’/Fm’*f*Q*αfolha), onde f é a fração da energia absorvida usada pelo
fotossistema II, assumido como 0,4 para plantas C4 (EDWARDS & BAKER, 1993) e
αfolha é a absorbância da folha (0,85). Foi calculado o número de elétrons por CO2
assimilado (ETR/AN) e a eficiência da fixação de CO2 (CO2) foi calculada por
CO2=(AN+Rd)/(Q*f), sendo Rd a respiração no escuro. O coeficiente de extinção
fotoquímica (Fq’/Fv’) foi calculado por Fq’/Fv’=(Fm’-Fs)/(Fm’-Fo’). Ao final do
experimento, foram avaliadas também a fluorescência máxima (Fm) e a fluorescência
mínima (Fo) em tecidos adaptados ao escuro, sendo calculados o coeficiente de extinção
não-fotoquímica [NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’] e o excesso relativo de energia [QEXC=(Fv/Fm–
Fq’/Fm’)/Fv/Fm] (BILGER et al., 1995; MAXWELL & JOHNSON, 2000; MURCHIE &
LAWSON, 2013).
Com um clorofilômetro (CFL1030, Falker, Porto Alegre RS, Brasil), foram
medidos os teores relativos de clorofila total. As avaliações foram realizadas no dia de
máximo estresse.
2.3 Medidas do potencial da água nas folhas
Medidas do potencial da água nas folhas () foram realizadas no pré-amanhecer
com uma câmara de pressão modelo 3005 (Soil Moisture Equipment Corp. Santa
Barbara CA, EUA) antes da reidratação das plantas e no dia subsequente, após 18 h,
para avaliar a recuperação do status hídrico foliar.
2.4 Avaliação do metabolismo antioxidante
Coletas de material vegetal foram realizadas 48 horas (T48h) após adição de
PEG-8000 à solução nutritiva; no máximo déficit hídrico (TME); e 48 horas após a
reidratação (TR). Em cada tempo de coleta, as plantas foram particionadas em parte
aérea e sistema radicular, as frações imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e
depois transferidas para ultrafreezer a -80 °C. A folha 0 foi coletada para determinação
da atividade total de enzimas do metabolismo antioxidante (catalase, superóxido
45
dismutase e ascorbato peroxidase, quantificação de H2O2 e peroxidação lipídica). Parte
das raízes foi coletada para avaliação do metabolismo antioxidante e a outra parte para
avaliação da expressão gênica de transcritos de isoformas de aquaporina (ScPIP2;1, 2;3,
2;5, 2;6).
2.4.1 Peroxidação lipídica e teor de peróxido de hidrogênio em folhas e raízes
Para a estimativa da peroxidação lipídica e a determinação do teor de H2O2 nos
tecidos vegetais (folhas ou raízes), foi obtido o extrato bruto a partir de 0,16 g de tecido
congelado, que foram finamente macerados em almofariz com nitrogênio líquido. Então
foram adicionados 1,5 mL de ácido tricoloroacético (TCA) 0,1% (p/v) e realizada a
extração mecânica em almofariz resfriado por 2 minutos. Após, foi realizada a
centrifugação em 10.000 rpm por 15 minutos a 4 °C e o sobrenadante recolhido.
A peroxidação lipídica foi estimada pela detecção de aldeído malônico (MDA)
segundo método proposto por CAKMAK & HOST (1991). Após a coleta do
sobrenadante, uma alíquota de 0,5 mL do extrato foi adicionada em 1,5 mL de solução
de ácido tiobarbitúrico (TBA) 0,5% (p/v) em tubo de ensaio com rosca, que foi
incubado sob agitação em banho-maria a 90ºC por 20 minutos. O tubo foi então
colocado em banho de gelo para paralisação da reação e resfriamento, sendo
posteriormente centrifugado a 10.000 rpm por 10 minutos a 4 °C. Após, os microtubos
permaneceram em repouso por 30 minutos em temperatura ambiente para determinação
da absorbância a 532 e 600 nm em espectrofotômetro, para descontar a absorbância
inespecífica a 600 nm. Para calcular a quantidade de MDA na amostra considerou-se o
coeficiente de absortividade do MDA de 155 mM-1
cm-1
e o resultado foi expresso em
nmol g-1
MF.
A determinação do teor de H2O2 nos tecidos foi realizada seguindo o método de
ALEXIEVA et al. (2001). Alíquotas de 0,2 mL do extrato bruto foram adicionadas em
0,8 mL de KI 1,0 mol L-1
e 0,2 mL de tampão fosfato de potássio 100 mmol L-1
(pH
7,5). Os microtubos foram incubados em gelo e no escuro por 1 hora e então foi
realizada a determinação da absorbância a 390 nm. Para o cálculo da concentração de
H2O2 foi feita curva de calibração, com pontos de 0 a 15 µg mL-1
de H2O2. O resultado
foi expresso em µmol H2O2 g-1
MF.
46
2.4.2 Extrato proteico e atividade de enzimas do sistema antioxidante
Para obtenção do extrato bruto de proteínas que foi utilizado para a
quantificação de proteínas, atividades de superóxido dismutase (SOD, EC 1.15.1.1),
catalase (CAT, EC 1.11.1.6) e ascorbato peroixidase (APX, EC 1.11.1.11), 0,3 g de
tecido vegetal (folha ou raiz) foram macerados em nitrogênio líquido com 2%
de polivinilpirrolidona (PVPP). Após moagem fina do material vegetal, foram
adicionados 2,0 mL de meio de extração composto por tampão fosfato de potássio 0,1
mol L-1
(pH 6,8), etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,1 mmol L-1
e de fluoreto de
fenilmetilsulfônico (PMSF) 1,0 mmol L-1
e a extração mecânica com pistilo foi
realizada por 2 minutos. Após centrifugação do homogeneizado a 15.000 g por 15
minutos a 4 ºC, coletou-se o sobrenadante (extrato bruto) que foi mantido em gelo até o
momento das determinações. Todos os reagentes usados nas análises enzimáticas foram
da Sigma-Aldrich (St. Louis MO, EUA).
A quantificação de proteínas solúveis totais foi realizada de acordo com método
proposto por BRADFORD (1976). Foi utilizado como corante o reagente Bradford BG-
250. Alíquotas de 30 L do extrato proteico foram adicionadas em 70 L de água
deionizada e 3,0 mL do reagente de Bradford BG-250. A leitura de absorbância em
espectrofotômetro foi realizada a 595 nm. A curva padrão foi feita com quatro
concentrações de albumina de soro bovino (BSA): 0,002, 0,005, 0,010 e 0,020 mg mL-1
.
O resultado foi expresso em mg g-1
MF.
Para a determinação da atividade total da SOD nos tecidos vegetais, 30 L do
extrato proteico bruto de folhas foram adicionados em tubo de ensaio contendo 1,5 mL
de tampão fosfato de sódio 100 mmol L-1
(pH 7,8), 0,78 mL de metionina 50 mmol L-1
,
0,06 mL de EDTA 5 mmol L-1
e 0,345 mL de água deionizada. Volumes de 60 L de
riboflavina 100 µmol L-1
e 0,225 mL de cloreto de azul de nitrotetrazólio (NBT) 1,0
mmol L-1
foram posteriormente adicionados. Todos os reagentes foram mantidos em
frascos protegidos da luz. As reações foram montadas em duplicatas, pois um grupo de
tubos foi exposto à luz de lâmpada fluorescente (30 W) por 5 minutos e o outro grupo
permaneceu no escuro. A absorbância foi medida a 560 nm. Por definição, uma unidade
de SOD corresponde à quantidade da enzima necessária para inibir em 50% a
fotorredução do NBT, sendo a atividade expressa em U.A. min-1
g-1
MF, de acordo com
método proposto por GIANNOPOLITIS & RIES (1977).
47
A atividade da CAT foi determinada de acordo com o método de HAVIR &
McHALE (1987). Alíquota de 0,1 mL do extrato enzimático foi adicionada a 1,5 mL de
tampão fosfato de potássio 100 mmol L-1
(pH 6,8), 1,1 mL de água deionizada e 0,3 mL
de solução de H2O2 125 mmol L-1
e o decréscimo na absorbância em 240 nm a 25 ºC foi
monitorado por 1 minuto. A atividade da CAT foi calculada utilizando-se o coeficiente
de extinção molar 36 M-1
cm-1
e expressa em µmol min-1
g-1
MF.
A atividade da APX foi determinada de acordo com método de NAKANO &
ASADA (1981). Alíquota de 0,15 mL do extrato proteico de folhas ou 0,2 mL do
extrato proteico de raízes foi adicionada a 1,5 mL de tampão fosfato de potássio 100
mmol L-1
(pH 6,0), 0,86 mL de água deionizada, 0,24 mL de ácido ascórbico 10 mmol
L-1
e 0,3 mL de solução de H2O2 10 mmol L-1
. Acompanhou-se o decréscimo da
absorbância a 290 nm por 1 minuto a 25 ºC e a atividade da APX foi calculada
utilizando-se o coeficiente de extinção molar 2,8 mM-1
cm-1
e expressa em µmol AsA
min-1
g-1
MF.
2.4.3 Isoformas de superóxido dismutase
O extrato proteico utilizado para a avaliação das isoformas de SOD foi obtido
através da maceração de 0,4 g de amostra composta (~0,1 g por repetição) maceradas
em nitrogênio líquido com 4% PVPP. Após o tecido ser finamente moído, foi
adicionado 2,0 mL de tampão fosfato de potássio 100 mM contendo 1 mmol L-1
de
EDTA e 3 mmol L-1
de ditiotreitol (DTT) por 2 minutos. Após, o extrato foi recolhido
em microtubo e centrifugado por 30 minutos em 10.000 rpm a 4°C. O sobrenadante foi
coletado e utilizado nas análises (FERREIRA et al., 2002).
A identificação das isoformas de SOD foi realizada através de eletroforese em
gel de poliacrilamida (12,5%) em sistema não desnaturante (PAGE-nativo). O gel
principal era composto por 1,25 mL de tampão Tris HCL 3 mmol L-1
(pH 8,8), 4,16 mL
de solução de acri/bisacrilamida (30%), 4,08 mL de H2O deionizada, 0,1 mL de
persulfato de amônio (10%) e 5 L de tetrametiletilenodiamina (TEMED). O gel de
empacotamento era composto por 1,25 mL de Tris-HCL 0,5 mmol L-1
, 0,625 mL de
acri/bisacrilamida, 2,87 mL de H2O deionizada, 0,05 mL de persulfato de amônio (10%)
e 5 L de TEMED. O resfriamento da cuba de eletroforese foi realizado por sistema de
circulação forçada de água gelada. A eletroforese foi realizada em corrente constante de
48
30 mA e o tampão de corrida composto por Tris-HCl 25 mmol L-1
(pH 8,3) e 192 mmol
L-1
de glicina. O tampão da amostra foi composto por Tris-HCl 0,0625 mmol L-1
(pH
6,8), glicerol 10%, β-mercaptoetanol 5% e azul de bromofenol 0,02%. A eletroforese foi
realizada com 30 µg de proteína das folhas e 15 µg de proteína das raízes.
Para cada amostra composta a eletroforese foi realizada em triplicata. Após o
término da eletroforese uma replicata foi incubada por 30 minutos no escuro em solução
de 0,1 mmol L-1
de NBT, 1,0 mmol L-1
e EDTA, 3% de TEMED, tampão fosfato de
potássio 100 mmol L-1
(pH 7,8), 0,05 mmol L-1
de riboflavina e água destilada sob
agitação. Após esse período, o gel foi retirado da solução, lavado brevemente com água
deionizada e revelado sob a luz (30 W) até aparecimento das bandas. Neste gel todas as
bandas de SOD são reveladas (gel controle). As outras duas replicatas foram incubadas
sob agitação no escuro por 20 minutos com inibidores de SOD, em solução contendo
1,0 mmol L-1
de EDTA, 2,0 mmol L-1
KCN e tampão fosfato de potássio 100 mmol L-1
ou em solução de 1,0 mmol L-1
de EDTA, 5,0 mmol L-1
de H2O2 e tampão fosfato de
potássio 100 mmol L-1
. Após a reação com os inibidores, os géis foram revelados
conforme descrito anteriormente. As isoformas foram classificadas como Mn-SOD, Fe-
SOD e Cu/Zn-SOD, sendo a Mn-SOD resistente a ambos os inibidores, Fe-SOD
resistente apenas ao KCN e Cu/Zn-SOD inibida por ambos os inibidores (AZEVEDO et
al., 1998).
2.5 Expressão de transcritos de aquaporina na raiz
Foi realizada a análise do perfil de transcrição de quatro genes da família das
aquaporinas (ScPIP2;1, ScPIP2;3, ScPIP2;5 e ScPIP2;6) presentes nas raízes de cana-de-
açúcar (FRIGEL, 2011). Os primers foram desenhados a partir das sequências de
expressed sequence tag (EST) do banco de dados SUCEST (Projeto de Sequenciamento
de EST de Cana-de-açúcar, http://sucest-fun.org), utilizando o programa Primer3
(http://frodo.wi.mit.edu/) nas condições adequadas para o PCR quantitativo (qPCR), tais
como tamanho do produto da PCR (100 a 150 pb), temperatura de anelamento (58 a 62
oC) e ausência de formação de estruturas secundárias, e analisados no programa
NetPrimer (http://premierbiosoft.com/netprimer/). Para a determinação da eficiência dos
primers foi realizada uma reação de qPCR utilizando como molde cDNA em uma
diluição seriada de 5 pontos (1/10, 1/20, 1/40, 1/80 e 1/160). Com esses resultados foi
49
gerada uma equação de primeiro grau e a inclinação da curva utilizada para a
determinação da eficiência da reação a partir da equação [E=10(-1/inclinação)
-1].
Para a extração do RNA total, 1,0 g de raiz foi macerado em nitrogênio líquido e
então adicionado em 2,0 mL de tampão de extração (2% brometo de centrimetilamônio
(CTAB), 2% PVP, 100 mM de Tris-HCl, 25 mM de EDTA, 2,0 mM de NaCl, 0,5 g L-1
de Spermidine e 2% de β-mercaptoetanol) aquecido a 65 °C. O extrato foi
homogeneizado em vórtex por 2 minutos e incubado por 30 minutos a 65 ºC. Após a
incubação, o extrato foi resfriado a temperatura ambiente e então adicionado 2,0 mL de
CIA (clorofórmio:álcool isoamilico, 24:1), homogeneizado em vórtex por 2 minutos,
centrifugado a 12.000 g por 10 minutos a 4 ºC até a separação de fases. Posteriormente,
o sobrenadante foi transferido para um microtubo novo com ¼ de cloreto de lítio 10 M e
mantido por 12 h a -20°C. No dia seguinte, o extrato foi centrifugado a 12.000 g por 30
minutos a 4 ºC, o sobrenadante descartado e o precipitado lavado com 1 mL de etanol
75%. O material foi novamente centrifugado nas mesmas condições já descritas, o
etanol foi descartado e o precipitado seco a temperatura ambiente. O precipitado foi
então ressuspendido em 0,6 mL de SSTE (1,0 M de NaCl; 0,5% dodecil-sulfato de
sódio (SDS); 10 mM de Tris-HCl; 1,0 mM de EDTA) a 37 ºC. Após, foi adicionado 0,6
mL de CIA, homogeneizado em vórtex e centrifugado a 12.000 g por 10 minutos a
temperatura ambiente. O sobrenadante foi recuperado e adicionado a 2 volumes de
etanol absoluto e armazenado por 2 horas a -80 ºC. Após, o extrato foi novamente
centrifugado a 12.000 g por 30 minutos a 4 ºC e descartado o sobrenadante e o
precipitado lavado com 1 mL de etanol 75% e centrifugado a 12.000 g por 10 minutos a
4 ºC. Após, o etanol foi descartado e o precipitado seco em temperatura ambiente. O
RNA foi ressuspendido em 20 μL de água tratada com DEPC (1,0%
diethilpirocarbonato) e autoclavada, quantificado em espectrofotômetro NanoDrop
2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham MA, EUA) e armazenado a -80 ºC. A
integridade e qualidade dos RNAs extraídos foram determinadas através de géis de
agarose a 1%, corados com brometo de etídio.
Após a extração e quantificação do RNA, o mesmo foi tratado com DNAse
(Promega, Madison WI, EUA) para eliminar eventuais contaminações de DNA
genômico e em seguida convertido em cDNA pela ação da enzima QuantiTect Reverse
Transcription Kit (Qiagen, Hilden, Germany), conforme recomendação do fabricante.
As reações de qPCR foram realizadas em triplicatas técnicas para cada uma das três
réplicas biológicas, para cada combinação gene alvo/normalizador. Cada reação foi
50
composta por 5 µL de SYBR green qPCR Master Mix (Applied BioSystems, New York
NY, EUA), 3 µL do cDNA diluído 1:20 (v:v), primer forward e reverse a 0,2 µM, e
água ultrapura (Milli-Q) estéril em volume final de 10 µL. As reações foram realizadas
em termociclador Step One Plus (Applied BioSystems, New York NY, EUA), seguindo
recomendações do fabricante. A quantidade relativa das moléculas-alvos relacionadas
ao calibrador foi calculada a partir do método 2-ΔΔCt
(LIVAK & SCHMITTGEN, 2001).
Para a avaliação da estabilidade dos genes de referência, foram considerados
cinco genes constitutivos (Tabela 2) e a eficiência da reação e a melhor concentração
(0,2 µM ou 0,8 µM) do primer para cada gene normalizador foi determinada por uma
diluição seriada de cinco pontos.
2.6 Condutância hidráulica do sistema radicular e contribuição das aquaporinas
As determinações de condutância hidráulica do sistema radicular (Lpr) e da
contribuição das aquaporinas em Lpr (AQP%) não puderam ser realizadas nas mesmas
plantas usadas para as análises fisiológicas e moleculares. Essas plantas estavam
grandes e perfilhando, o que impossibilitava o fechamento hermético da câmara de
pressão. Portanto mudas dos dois genótipos foram produzidas e conduzidas conforme
descrito no item 2.1, sendo as medidas de Lpr e AQP% realizadas em T48h.
As determinações de Lpr foram realizadas de acordo com método descrito por
AROCA et al. (2001). A muda foi transferida da caixa de cultivo para um recipiente
plástico contendo 300 mL da mesma solução nutritiva, posicionado dentro da câmara de
pressão (3005, Soil Moisture Equipment Corp., Palo Alto CA, EUA). O sistema
radicular ficou totalmente imerso na solução e em seguida a parte aérea foi excisada a
aproximadamente 5,0 cm abaixo da inserção da folha mais velha de modo que o restante
da parte aérea passasse pelo orifício da tampa da câmara de pressão, que foi
hermeticamente fechada. Em contato com o local do corte, foi posicionado um algodão
hidrofílico seco, com a massa previamente determinada, com auxílio de um tubete
plástico. Foram exercidas pressões de 0,2, 0,4 e 0,6 MPa por 10 minutos e ao término da
medida de cada ponto o algodão úmido era pesado e substituído por algodão seco
(Figura 1). A diferença de massa do algodão úmido e seco, normalizada pelo tempo é o
fluxo de seiva através do sistema radicular. Por fim, as raízes foram armazenadas em
solução de etanol 30% para posterior medição da área radicular com o auxílio do
51
programa Safira® (JORGE & SILVA, 2010). Lpr é dado pela inclinação da regressão
entre fluxo vs. pressão e então normalizada pela área radicular. O resultado de Lpr foi
expresso em mmol m-2
s-1
MPa-1
.
Figura 1. Ilustração do método de avaliação da condutância hidráulica das raízes (Lpr).
(Adaptado de SILVA, 2014).
Para a determinação de AQP% foi utilizado H2O2 como inibidor da atividade de
AQPs (AROCA et al., 2005). Foi calculada Lpr nas plantas referência ou sob déficit
hídrico conforme descrito anteriormente. Todavia, medidas foram realizadas em plantas
com sistema radicular imerso apenas em solução nutritiva (Lpr máximo) e em solução
nutritiva com a adição de H2O2 (Lpr inibido). O tratamento com H2O2 foi realizado
expondo as raízes por 1 hora (BENABDELLAH et al., 2009) à solução com 45 mmol
L-1
de H2O2. A AQP% foi determinada através da seguinte equação: AQP%=100-(100*
Lpr inibido/ Lpr máximo).
O horário das medidas foi padronizado entre 11:00 e 14:00 h para minimizar
variações em Lpr em função do ciclo circadiano da atividade das aquaporinas
(HACHEZ et al., 2012).
Transferência da
planta decapitada para
câmara de pressão
contendo solução
nutritiva
Solução nutritiva
Corte da
parte aérea
Coleta das raízes para quantificação da área radicular
Absorção da
seiva pelo
algodão
Algodão no tubete
Aplicação da pressão
Superfície
de corte
N2
52
2.7 Biometria
Ao longo do experimento a altura das plantas (entre o colo e a inserção da folha
+1) foi monitorada com uso de régua comum. Foi realizada a contagem do número de
perfilhos e de folhas verdes (NFV) na touceira.
Após a coleta do material vegetal para as análises bioquímicas e moleculares, a
área foliar (AF) foi determinada com planímetro Li-3000C (Licor Inc., Lincoln NE,
EUA) e então todo o material vegetal foi seco em estufa de circulação forçada de ar
(MA032, Marconi, Piracicaba SP, Brasil) a 65 °C para a determinação da matéria seca.
2.8 Análise estatística
O desenho experimental adotado foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial
2x2, sendo os fatores variedade (dois níveis) e disponibilidade hídrica (dois níveis), com
n=5 para as análises fisiológicas, n=4 para as moleculares e bioquímicas e n=3 para as
análises de Lpr e AQP%. Cada parcela era composta por uma planta. Foram realizadas
análises de variância e quando detectadas diferenças significativas, as médias foram
comparadas pelo teste t-student (p<0,05).
Para a validação dos dados da expressão gênica relativa, utilizou-se a ferramenta
REST (PFAFFL et al., 2002), a qual é indicada para análises estatísticas de dados
provenientes de qPCR.
3 RESULTADOS
3.1 Trocas gasosas e atividade fotoquímica
As plantas de ambos os genótipos submetidos à restrição hídrica apresentaram
redução nas trocas gasosas e na atividade fotoquímica da fotossíntese (Figuras 2 e 3).
Apenas 48 horas após o potencial osmótico da solução nutritiva ser reduzido à -0,55
MPa (T48h), houve redução significativa (p<0,05) em AN nos dois genótipos. Após nove
dias de restrição hídrica (TME), AN foi reduzido em 81% em IACSP94-2094 e 84% em
IACSP97-7065. Nenhum dos genótipos apresentou completa recuperação (p<0,05) de
AN após 48 h da reidratação. Considerando a integração das medidas de AN ao longo do
53
período experimental, IACSP94-2094 apresentou maior acúmulo de carbono (+24%) do
que a IACSP97-7065 em situação de déficit hídrico. A integração das diferenças entre
plantas referência e sob déficit hídrico durante todo o período experimental revelou que
IACSP94-2094 teve redução de 47% e a IACSP97-7065 de 53% na assimilação de CO2
(Figura 2A,B, área hachurada).
0
10
20
30
40
50
0,0
0,1
0,2
0,3
-1
0
1
2
3
4
*
*
****
*
AN
(m
ol m
-2 s
-1)
REF
DHA
*
DAT
* *****
**
B
***
****
C
gS
(mol m
-2 s
-1)
*
*
**
***
D
*
***
*
TRTMET48h
F
IACSP97-7065
k
(m
ol m
-2 s
-1 P
a-1
)
IACSP94-2094
146146
*
0 2 4 8 10 121210842
**
TRTME
Déficit Hídrico
E
Déficit Hídrico Rec. Rec.
T48h
0
Figura 2. Assimilação de CO2 (AN, em A,B), condutância estomática (gS, em C,D) e
eficiência instantânea de carboxilação (k, em E,F) nos genótipos de cana-de-açúcar
IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos aos tratamentos referência (REF) e déficit
hídrico (DH). DAT indica dias após o início do déficit hídrico. Cada símbolo representa
as médias (n=5±dp). *indica diferença significativa (p<0,05) entre os tratamentos
comparados pelo teste t-student. As setas indicam os dias de amostragem de tecidos
vegetais: T48h, 48 h após a redução do potencial osmótico da solução nutritiva; TME,
máximo déficit hídrico; e TR, 48 h após a reidratação.
54
A abertura estomática em IACSP94-2094 e IACSP97-7065 foi reduzida de
forma similar (48% vs. 54%, respectivamente) quando se considera o momento de
máximo déficit hídrico (Figura 2C,D). Os estômatos de ambos os genótipos
apresentaram fechamento (p<0,05) após 24 h de exposição ao potencial osmótico -0,55
MPa (Figura 2C,D), porém o genótipo IACSP94-2094 apresentou redução de 35%
enquanto que o IACSP97-7065 de 51%. IACSP94-2094 mostrou recuperação de gS 24 h
após a reidratação, enquanto IACSP97-7065 mostrou recuperação após 48 h (Figura
2C,D). Integrando os nove dias de restrição hídrica, IACSP94-2094 apresentou redução
de 39% em k enquanto a redução em IACSP97-7065 foi de 58% (Figura 2E,F). Em
geral, k foi mais afetada pelo déficit hídrico em IACSP97-7065 se comparado com
IACSP94-2094. Durante a restrição hídrica não foram detectadas diferenças em EUAi
devido ao tratamento hídrico e entre os genótipos (dados não apresentados). Porém, foi
observado aumento em EUA em decorrência da restrição hídrica, com os genótipos
apresentando aumentos similares de 50% em IACSP94-2094 e 52% em IACSP97-7065,
no momento de máximo déficit hídrico (dados não apresentados).
As variáveis fotoquímicas Fq’/Fm’ e ETR foram reduzidas (p<0,05) em ambos os
genótipos devido ao déficit hídrico (Figura 3A-D). Os dois genótipos de cana-de-açúcar
apresentaram redução de 37% nesses dois parâmetros fotoquímicos, sendo que
IACSP94-2094 apresentou maior atividade fotoquímica em condições de boa
disponibilidade hídrica (Figura 3A-D). A razão ETR/AN aumentou em ambos os
genótipos ao final do período de restrição hídrica, com IACSP97-7065 apresentando
maior consumo de elétrons por CO2 assimilado se comparado a IACSP94-2094 (+33%
vs. +22%) no dia de máximo déficit hídrico (Figura 3E,F).
55
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
50
100
150
200
0
5
10
15
20
*
* ****
**
REF
DHA
**
**
***
B
*
**
***
*
D
IACSP97-7065
Fq'/F
m'
ET
R
(m
ol m
-2 s
-1)
IACSP94-2094
***
****
*C
1268 10 12 1410844 22 0
*
*
*
TRTMET48h
F
0DAT
Déficit Hídrico
146
***
TRTMET48h
Déficit Hídrico Rec.
E
ET
R/A
N
(m
ol
mo
l-1
)
Rec.
Figura 3. Eficiência quântica aparente de fotossistema II (Fq’/Fm’, em A,B), taxa de
transporte de elétrons (ETR, em C,D) e ETR/AN (E,F) nos genótipos de cana-de-açúcar
IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos aos tratamentos referência (REF) e déficit
hídrico (DH). DAT indica dias após o início do déficit hídrico. Cada símbolo representa
as médias (n=5±dp). *indica diferença significativa (p<0,05) entre os tratamentos
comparados pelo teste t-student. As setas indicam os dias de amostragem de tecidos
vegetais: T48h, 48 h após a redução do potencial osmótico da solução nutritiva; TME,
máximo déficit hídrico; e TR, 48 h após a reidratação.
Durante todo o período experimental não foram observadas diferenças em Fv/Fm
entre os genótipos IACSP94-2094 (0,788±0,008) e IACSP97-7065 (0,789±0,008)
(dados não apresentados) e o regime hídrico não causou alterações nessa variável.
Fq’/Fv’ foi reduzida (p<0,05) em ambos os genótipos após 48 h do início do déficit
56
hídrico (Figura 4A,B). Em NPQ não ocorreram diferenças entre os genótipos ou
tratamentos hídricos (Figura 4C,D). A restrição hídrica promoveu aumento (p<0,05) no
QEXC em ambos os genótipos, porém não foram detectadas diferenças entre eles (Figura
4E,F).
0
1
2
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
50
60
70
80
90
100
C
IACSP97-7065
QE
XC
(%)
NP
Q
IACSP94-2094
D
6
**
**
**
Fq'/F
v'
A
*
****
TRTMET48h
F
Rec.
**
B REF
DH
124128
Déficit HídricoDéficit Hídrico
DAT
0 2 8 10 141410642
****
TRTMET48h
E
0
Rec.Déficit Hídrico
Figura 4. Coeficiente de extinção fotoquímico (Fq’/Fv’, em A,B), coeficiente de
extinção não-fotoquímico (NPQ, em C,D) e excesso relativo de energia (QEXC, em E,F)
nos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos aos
tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). DAT indica dias após o início do
déficit hídrico. Cada símbolo representa as médias (n=5±dp). *indica diferença
significativa (p<0,05) entre os tratamentos comparados pelo teste t-student. As setas
indicam os dias de amostragem de tecidos vegetais: T48h, 48 h após a redução do
potencial osmótico da solução nutritiva; TME, máximo déficit hídrico; e TR, 48 h após a
reidratação.
57
Não foram detectadas diferenças nos teores relativos de clorofila total avaliados
no dia de máximo estresse devido à restrição hídrica ou entre genótipos, com valores
médios de 51,2±2,2 em IACSP94-2094 e 53,7±3,3 em IACSP97-7065 (dados não
apresentados).
3.2 Potencial da água nas folhas
O déficit hídrico causou redução de medido na antemanhã (p<0,05) nos dois
genótipos. Todavia, ambos os genótipos apresentaram recuperação de após 18 h da
reidratação (Tabela 1).
Tabela 1. Potencial da água na folha () em genótipos IACSP94-2094 e IACSP97-
7065 submetidos aos tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). Medidas
realizadas na antemanhã, no máximo déficit hídrico (me) e 18 h após a reidratação
(18h).
Variedade Tratamento me
(MPa)
18h
(MPa)
IACSP94-2094 REF -0,06 ± 0,01* -0,02 ± 0,01
ns
DH -1,12 ± 0,06 -0,04 ± 0,02
IACSP97-7065 REF -0,07 ± 0,02* -0,03 ± 0,00
DH -1,13 ± 0,02 -0,04 ± 0,02
Valores médios (n=4±dp) * indica diferença pelo teste t-student entre os tratamentos na mesma variedade
e ns
indica que não houve diferença significativa entre tratamentos.
3.3 Peroxidação lipídica e teor de peróxido de hidrogênio em folhas e raízes
O déficit hídrico causou aumento da peroxidação lipídica nas folhas e raízes da
IACSP94-2094 apenas em TME, enquanto que em IACSP97-7065 os aumentos foram
registrados nesses tecidos em T48h e TR (Figura 5). Comparando os tecidos, os níveis de
MDA foram sempre maiores nas folhas.
58
0
10
20
30
40
50
60
*
TRTMET48h
A
MD
A
(nm
ol M
DA
g-1 M
F)
TME
Folha
T48h
REF
DH
IACSP94-2094 IACSP97-7065
TR
Avaliações
0
10
20
30
40
50
*
CRaiz
*Folha
B
*
* *
RaizD
Figura 5. Concentração de aldeído malônico (MDA) em folhas (em A,B) e raízes (em
C,D) dos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos aos
tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). Cada histograma representa a
média (n=4±dp). * indica diferença significativa entre os tratamentos pelo teste t-
student. T48h representa a coleta realizada 48 h após redução do potencial osmótico da
solução nutritiva; TME indica a coleta realizada no máximo déficit hídrico; e TR a coleta
realizada 48 h após a reidratação.
Com a restrição hídrica também foi detectado aumento nos teores de H2O2 nas
folhas de IACSP97-7065, mas apenas em TME. Nas raízes dessa variedade também
foram verificados aumentos no teor de H2O2 em TR (Figura 6). Em geral, os teores de
H2O2 foram maiores (p<0,05) nas folhas se comparadas às raízes.
59
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
A
Avaliações
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4C
REF
DH*
BFolha
IACSP97-7065IACSP94-2094
*
DRaiz
TRTMET48h
TRTMET48h
H2
O2
(m
ol g
-1M
F)
Folha
Raiz
Figura 6. Concentração de peróxido de hidrogênio (H2O2) em folhas (em A,B) e raízes
(C,D) dos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos
aos tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). Cada histograma representa a
média (n=4±dp). * indica diferença significativa entre os tratamentos pelo teste t-
student. T48h representa a coleta realizada 48 h após redução do potencial osmótico da
solução nutritiva; TME indica a coleta realizada no máximo déficit hídrico; e TR a coleta
realizada 48 h após a reidratação.
3.4 Enzimas do sistema antioxidante
A atividade de SOD aumentou em TME e TR nas folhas de IACSP94-2094,
porém nas raízes foi detectado aumento apenas em TR (Figura 7A,C). IACSP97-7065
apresentou aumento da atividade da SOD nas raízes apenas em TME (Figura 7B,D).
60
0
10
20
30
40
**
Folha
Raiz
SO
D
(U.A
. g
-1M
F m
in-1
)
A
Avaliações
0
10
20
30
*
C
BFolha
*
DRaiz
REF
DH
TRTMET48h
T48hTME TR
IACSP94-2094 IACSP97-7065
Figura 7. Atividade de superóxido dismutase (SOD) em folhas (em A,B) e raízes (em
C,D) dos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos aos
tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). Cada histograma representa a
média (n=4±dp). * indica diferença significativa entre os tratamentos pelo teste t-
student. T48h representa a coleta realizada 48 h após redução do potencial osmótico da
solução nutritiva; TME indica a coleta realizada no máximo déficit hídrico; e TR a coleta
realizada 48 h após a reidratação.
O zimograma de SOD revelou que não houve aparecimento de isoforma em
decorrência do estresse hídrico nos tecidos dos dois genótipos (Figura 8). Foi observado
aumento da atividade das isoformas i-Mn-SOD, ii-Fe-SOD e iii-Cu/Zn-SOD das raízes
devido à restrição hídrica em TME e TR nos dois genótipos. Duas isoformas exclusivas
da IACSP94-2094 foram detectadas: v-Fe-SOD e vi-Fe-SOD. Nos dois genótipos, há
presença de mais isoformas de SOD em folhas do que em raízes (Figura 8).
61
Figura 8. Identificação de isoformas de superóxido dismutase (SOD) em PAGE-nativo
em folhas e raízes dos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065
submetidos aos tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). TME indica a coleta
realizada no máximo déficit e TR a coleta realizada 48 h após a reidratação. Cada gel é
resultante de uma amostra composta de quatro repetições, representativo de três
corridas.
Não foram detectadas diferenças significativas na atividade de CAT nas folhas
da IACSP94-2094 em função do déficit hídrico (Figura 9A). Nas folhas de IACSP97-
7065 houve aumento da atividade da CAT em T48h devido ao déficit hídrico com
posterior redução em TME (Figura 9B). Nas raízes, a atividade de CAT aumentou devido
à imposição do déficit hídrico em IACSP94-2094 em TME e TR (Figura 9C). Nas raízes
de IACSP97-7065 foi detectada redução da atividade da CAT em T48h com posterior
aumento em TME (Figura 9D). A atividade de CAT foi maior nas folhas do que nas
raízes nos dois genótipos estudados.
iv
iiiiii
Cu/Zn-SOD
Mn-SOD
Cu/Zn-SOD
Ref. DH94- 2094
Ref. DH 97- 7065
Fe-SOD
vi
i
iiiii
vii
v
iv
Cu/Zn-SOD
Cu/Zn-SOD
Fe-SOD
Mn-SOD
TME
Cu/Zn-SOD
iv
iiiiii
Ref. DH94- 2094
Ref. DH97-7065
Cu/Zn-SOD
Mn-SOD
Cu/Zn-SODFe-SOD
iiiiii
vii
v
iv
Cu/Zn-SOD
Cu/Zn-SOD
Fe-SOD
Mn-SOD
TR
vi
FO
LH
AR
AIZ
Cu/Zn-SOD
62
0
50
100
150
Folha
Raiz
IACSP97-7065
CA
T
(nm
ol g
-1 M
F m
in-1
)
IACSP94-2094
A
0
50
100
**
C
*
BFolha
REF
DH
Avaliações
**
*
TR
TME
T48h
DRaiz
T48h
TME
TR
Figura 9. Atividade de catalase (CAT) em folhas (em A,B) e raízes (em C,D) dos
genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos aos
tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). Cada histograma representa a
média (n=4±dp). * indica diferença significativa entre os tratamentos pelo teste t-
student. T48h representa a coleta realizada 48 h após redução do potencial osmótico da
solução nutritiva; TME indica a coleta realizada no máximo déficit hídrico; e TR a coleta
realizada 48 h após a reidratação.
A atividade de APX aumentou nas folhas devido ao déficit hídrico nos dois
genótipos e nos três tempos de coleta, com exceção de T48h na IACSP94-2094 (Figura
10A, B). Nas raízes também foram detectados aumentos na atividade de APX nos três
tempos de coleta, exceto em TR para IACSP97-7065 (Figura 10C, D).
63
B
* **
Folha
D
**
TRTMET48h
Raiz
Folha
REF
DH
IACSP94-2094 IACSP97-7065
T48h TME TR
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
*
AP
X
(m
ol A
sA
g-1
MF
min
-1)
*
A
Avaliações
0,0
2,5
5,0
7,5
C
** *
Raiz
Figura 10. Atividade de ascorbato peroxidase (APX) em folhas (em A,B) e raízes (em
C,D) dos genótipos de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos aos
tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH). Cada histograma representa a
média (n=4±dp). * indica diferença significativa entre os tratamentos pelo teste t-
student. T48h representa a coleta realizada 48 h após redução do potencial osmótico da
solução nutritiva; TME indica a coleta realizada no máximo déficit hídrico; e TR a coleta
realizada 48 h após a reidratação.
A restrição hídrica não induziu alterações nos teores de proteínas totais nos
tecidos nos genótipos estudados. O teor de proteínas total nas folhas se manteve
próximo entre os genótipos IACSP94-2094 (12,8±1,7 mg g-1
) e IACSP97-7065
(13,1±2,2 mg g-1
). Nas raízes, o teor de proteínas foi menor que nas folhas (p<0,05).
Também não foram detectadas diferenças entre IACSP94-2094 (4,2±1,3 mg g-1
) e
IACSP97-7065 (3,7±1,5 mg g-1
) (dados não apresentados).
3.5 Condutância hidráulica das raízes
Houve manutenção da condutância hidráulica do sistema radicular (Lpr) na
IACSP94-2094 após 48 h da exposição à restrição hídrica, enquanto que IACSP97-7065
apresentou redução de 71% em Lpr (Figura 11A). Sob déficit hídrico, Lpr em IACSP94-
2094 foi cerca de 2,3 maior se comparado a IACSP97-7065.
64
Aproximadamente 80% de Lpr foi regulada pela atividade de aquaporinas
presentes no sistema radicular das plantas de cana-de-açúcar (Figura 11B). Esse
controle não foi prejudicado pelo déficit hídrico em IACSP94-2094, ao passo que em
IACSP97-7065 houve redução significativa na contribuição das aquaporinas no fluxo de
água através do sistema radicular (Figura 11B).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0 REF
DH
*
IACSP97-7065
Lp
r
(mm
ol m
-2 s
-1 M
Pa
-1)
IACSP94-2094IACSP94-2094 IACSP97-7065
A
0
20
40
60
80
100B
*
AQ
P%
(%)
Variedades
Figura 11. Condutância hidráulica das raízes (Lpr, em A) e contribuição das
aquaporinas em Lpr (AQP%, em B) em genótipos de cana-de-açúcar submetidos a
condição de boa disponibilidade hídrica (REF) e 48 h após a exposição ao déficit
hídrico (DH).*indica diferenças significativas entre genótipos pelo teste t-student
(p<0,05). Médias (n=3±dp).
3.6 Expressão de transcritos de aquaporina nas raízes
O gene escolhido como o gene normalizador e posteriormente utilizado como
gene de referência para a quantificação relativa dos genes de AQP foi o GAPDH. Este
gene apresentou a menor variação de expressão (0,150) nas amostras testadas quando
comparados com os demais genes, associado à 100% de eficiência de amplificação
(Tabela 2). Esta análise foi determinada de acordo com a ferramenta NormFinder
(ANDERSEN et al., 2004).
65
Tabela 2. Sequência (5’-3’), concentração dos primers, eficiência da amplificação (E) e
variação da expressão de cinco genes constitutivos nas raízes de dois genótipos de cana-
de-açúcar, IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos à restrição hídrica. Gene Sequência do primer (5’- 3’) [primer]
(µM)
E*
(%)
Variação da
Expressão***
Actina F: CTCAACCCCAAGGCTAACAG 0,2 96,8 0,290
R: GGCATGAGGAAGGGCATAA
GAPDH**
F: CCGTCAACGACCCCTTCAT 0,2 100 0,150
R: GCAGCCTTGTCCTTGTCAGT
Ubiquitina-1 F: AGCCTCAGACCAGATTCCAA 0,2 95,4 0,410
R: AATCGCTGTCGAACTACTTGC
Ubiquitina-2 F: CTTCTTCTGTCCCTCCGATG 0,2 100 0,470
R: TCCAACCAAACTGCTGCTC
rpl35_
SCVPST1060B03
F: GGGAAAAGAAGCGTGAGAAGTA 0,8 99,2 0,360
R: GGAAAGAAACAGCCGATGATA *E=10
(-1/inclinação)-1,
**Glideraldeído 3-fosfato desidrogenase,
***obtida através da ferramenta NormFinder
Os níveis de transcritos de todas as isoformas de AQP foram alterados em ambos
os genótipos em função da restrição hídrica. Foi detectado aumento na expressão da
ScPIP2;1 após 48 h de déficit hídrico apenas na IACSP97-7065 (Figura 12A). Neste
mesmo momento do estudo, houve aumento na expressão da ScPIP2;5 em ambos os
genótipos (Figure 12C). Quando consideradas as avaliações no momento de máximo
déficit hídrico, apenas IACSP94-2094 apresentou aumento na expressão de ScPIP2;3,
ScPIP2;5 e ScPIP2;6 (Figura 12B-D). Novamente, apenas IACSP94-2094 apresentou
variação na expressão de ScPIP2;3, ScPIP2;5 e ScPIP2;6 após a reidratação das plantas,
com redução na quantidade de transcritos das três aquaporinas citadas (Figura 12B-D).
A isoforma ScPIP2;5 foi a mais responsiva ao déficit hídrico em ambos genótipos
(Figura 12).
66
-2
0
2
4
6
T ME
T 48h
*
T R
B
IACSP97-7065IACSP97-7065 IACSP94-2094
ScPIP 2;1
IACSP94-2094
A
T 48h
T ME T R T 48
hT M
ET R
T 48h
T ME T R
*
*
ScPIP 2;3
-2
0
2
4
6*
*
*
*
C ScPIP 2;5
*
*
*
D ScPIP 2;6
Exp
ressã
o R
ela
tiva
Figura 11. Expressão relativa dos transcritos das aquaporinas ScPIP2;1 (em A),
ScPIP2;3 (em B), ScPIP2;5 (em C) e ScPIP2;6 (em D) nos genótipos de cana-de-açúcar
IACSP94-2094 e IACSP97-7065 submetidos ao déficit hídrico. A expressão foi
quantificada por qPCR e calculada pelo método 2-ΔΔCt
. Cada histograma representa a
média (n=4±ep) e *indica diferença significativa entre os tratamentos referência e
déficit hídrico (p<0,05). T48h indica a coleta realizada 48 h após a redução do potencial
osmótico da solução nutritiva; TME representa a coleta realizada no máximo déficit
hídrico; e TR a coleta realizada 48 h após a reidratação.
3.7 Biometria
Ao término do experimento, IACSP94-2094 não teve o perfilhamento afetado
pelo déficit hídrico enquanto que IACSP97-7065 apresentou redução nessa importante
característica (Tabela 3). O número de folhas verdes foi mantido em ambos os
genótipos, porém IACSP94-2094 apresentou maior NFV que IACSP97-7065 (Tabela
3). A restrição hídrica causou redução da área foliar nos dois genótipos, com IACSP94-
2094 apresentando maior AF do que IACSP97-7065 nos dois tratamentos (Tabela 3).
67
Tabela 3. Número de perfilhos (NP), número de folhas verdes da touceira (NFV) e área
foliar (AF) avaliados 48 h após a reidratação dos genótipos IACSP94-2094 e IACSP97-
7065 submetidos aos tratamentos referência (REF) e déficit hídrico (DH).
Variedade Tratamento NP (unid.)
NFV (unid.)
AF
(cm²)
IACSP94-2094 REF 3,6
aA 13,8
aA 1539
aA
DH 3,8aA
14,6aA
580 aB
IACSP97-7065 REF 2,4
bA 9,0
bA 436
bA
DH 1,6bB
7,2bA
95 bB
Valores médios (n=5±dp) seguidos por letras diferentes diferem entre si (p<0,05) pelo teste t-student.
Letras maiúsculas comparam as médias entre os tratamentos de genótipos e letras minúsculas comparam
os tratamentos de disponibilidade hídrica.
Houve redução no acúmulo de biomassa no colmo e nas folhas da IACSP94-
2094 devido ao déficit hídrico (Figura 13A). Já em IACSP97-7065 houve redução da
biomassa em todas as frações analisadas da planta (colmo, folhas e raízes) devido ao
déficit hídrico (Figura 13B). Em geral, o acúmulo de carbono foi maior (p<0,05) na
variedade IACSP94-2094 quando comparada a IACSP97-7065, independente da fração
da planta considerada e do tratamento hídrico. As plantas do genótipo IACSPSP94-
2094 apresentaram redução de 30% e as de IACSP97-7065 de 52% no acúmulo total de
biomassa.
0
10
20
30
40
50
*
*
*
Folha
Ma
téria
Se
ca
(g)
IACSP94-2094
Colmo Raiz Total Colmo Folha Raiz Total
A
*
REF
DH
*
**
B
IACSP97-7065
Figura 12. Acúmulo de matéria seca no colmo, folha, raiz e total em genótipos de cana-
de-açúcar IACSP94-2094 (A) e IACSP97-7065 (B) submetidos aos tratamentos
referência (REF) e déficit hídrico (DH). Quantificação realizada após 48 h da
reidratação. Cada histograma representa a média (n=5±dp) e * indica diferença
significativa (p<0,05) entre os tratamentos pelo teste t-student.
68
4 DISCUSSÃO
A menor redução no crescimento da IACSP94-2094 durante o período de
restrição hídrica ocorreu em função da maior fotossíntese acumulada ao longo do
período experimental. Sob condição de restrição hídrica, AN da IACSP94-2094 foi 24%
maior que da IACSP97-7065 e a área foliar de IACSP94-2094 foi menos afetada se
comparada à da IACSP97-7065 (Área hachurada da Figura 2; Tabela 3). O período
inicial do déficit hídrico foi o que mostrou a principal diferença em AN, com IACSP94-
2094 apresentando redução de 50% em AN apenas após seis dias do início da restrição
hídrica. IACSP97-7065 apresentou menor capacidade de sustentação da assimilação de
CO2, visto que após dois dias do início do estresse hídrico a AN havia reduzido em 50%
(Figura 2A,B). A redução da assimilação de CO2 ocorreu devido, em parte, à redução de
gS, com IACSP94-2094 mantendo a abertura estomática no início do estresse (Figura
2C,D). Enquanto a IACSP94-2094 mostrou redução de 35% na abertura estomática,
IACSP97-7065 teve redução de 50% após 48 h do início do déficit hídrico. À parte da
menor limitação difusiva, IACSP94-2094 apresentou menor sensibilidade das reações
bioquímicas da fotossíntese, dadas pela k (Figura 2E,F). Uma hipótese é que tenha
havido menor inibição da Rubisco por inibidores endógenos, como a 2-
carboxiarabintol-1-fosfato (CA1P), que aumenta com a intensidade do estresse
(CARMO-SILVA et al., 2010).
Decréscimo na regeneração de PEP e RuBP devido à baixa produção de ATP
(LAWLOR & TEZARA, 2009) também poderia limitar a fotossíntese das plantas. Os
dois genótipos apresentaram alterações importantes na atividade fotoquímica três dias
após o início da restrição hídrica, com reduções em ETR e Fq’/Fm’ (Figura 3). Sabe-se
que um dos principais compartimentos afetados pela restrição hídrica são os
cloroplastos e a menor atividade fotossintética associada à contínua interceptação de
energia radiante ocasiona excesso de energia no aparato fotoquímico. Se esse excesso
não for dissipado por mecanismos não fotoquímicos (NPQ), ocorrerá aumento na
geração de EROs e o desbalanço entre a formação e o consumo poderia levar à
fotoinibição e foto-oxidação dos fotossistemas (FOYER & NOCTOR, 2005; PINTÓ-
MARIJUAN & MUNNÉ-BOSCH, 2014; SALES et al., 2013). Como nenhum dos
genótipos apresentou aumento em NPQ (Figura 4C,D) e houve aumento de QEXC
(Figura 4F,E) com manutenção de FV/FM, sugere-se que houve aumento da dissipação
69
de energia por drenos alternativos de elétrons (indicado pelo aumento de ETR/AN,
Figura 3E,F) e que as plantas tinham um sistema antioxidante atuando para limitar o
potencial dano ocasionado por EROs.
Nas folhas de ambos os genótipos foram detectados danos oxidativos nas
membranas celulares causados pela restrição na disponibilidade de água (Figura 5A,B).
Em IACSP94-2094 os danos oxidativos ocorreram apenas em TME enquanto que em
IACSP97-7065 a peroxidação lipídica ocorreu 48 h após o início do estresse e após a
reidratação. Nas folhas do genótipo IACSP94-2094 não foram observadas alterações na
atividade de enzimas do metabolismo antioxidante após 48 h do início do estresse
(Figuras 7A, 9A, 10A), tampouco foram observadas alterações no teor de H2O2 (Figura
6A). Como o processo fotossintético não havia sofrido grandes limitações, não houve
acúmulo acentuado de EROs para causar dano oxidativo ou desencadear as respostas
antioxidantes no início do déficit hídrico (T48h). No entanto, o genótipo IACSP97-7065
que apresentou redução em 50% da AN após 24 h da restrição hídrica, teve maior
peroxidação lipídica (Figura 5B) e aumento das atividades de CAT e APX (Figuras 9B,
10B), as quais aparentemente impediram o aumento do teor de H2O2 nos tecidos (Figura
6B).
Após nove dias de restrição hídrica, o genótipo IACSP94-2094 apresentou
aumento na atividade total de SOD (Figura 7A), dada provavelmente pela maior
atividade das isoformas mitocondriais (ii-Mn-SOD), cloroplastidiais (iv-Fe-SOD, v-Fe-
SOD) e citosólicas (vii-Cu/Zn-SOD) (Figura 8). Junto com a atividade de SOD, houve
aumento da atividade de APX (Figura 10A) e a ação dessas duas enzimas foi eficiente
em manter os níveis de H2O2 (Figura 6A). No entanto, foi detectado breve aumento na
peroxidação lipídica nas folhas desta variedade em TME (Figura 5A), sugerindo dano
oxidativo. Já em IACSP97-7065 foi detectado aumento somente na atividade de APX
(Figura 10B), com manutenção da atividade de SOD (Figura 7B) e redução da atividade
de CAT (Figura 9B). O declínio na atividade de CAT sugere que o aumento de EROs
ocorreu principalmente nos cloroplastos, organela que apresenta baixos níveis desta
enzima (MHAMDI et al., 2010). Além dos baixos níveis desta enzima, esta proteína
apresenta alta sensibilidade à luz, que é compensada pela taxa de síntese. Em situações
de estresse, a fotodegradação pode ser maior que a síntese, reduzindo a quantidade e
consequentemente a atividade (MHAMDI et al., 2010; SHARMA & DUBEY, 2005).
Após 48 h da reidratação, IACSP94-2094 continuou com as atividades da APX e
total de SOD aumentadas, esta última pela maior atividade das isoformas iii-Mn-SOD e
70
vi-Fe-SOD (Figura 8). A alta atividade destas duas enzimas após a reidratação está
relacionada com a recuperação mais eficiente da fotossíntese, sendo essa uma
característica importante de resistência à seca (SALES et al., 2013). De fato, a rápida
recuperação da fotossíntese é mais frequente em plantas com maior capacidade
antioxidante (FLEXAS et al., 2006).
Espera-se que os danos oxidativos causados pela seca nas raízes sejam menores
que em folhas, pois a pressão energética ocasionada pela energia radiante não ocorre nas
raízes. No entanto, sinais de estresse oxidativo também foram detectados nas raízes de
ambos os genótipos devido à restrição hídrica (Figura 5C,D). Os genótipos
apresentaram aumento na atividade de APX após 48 h da exposição ao estresse e se
sabe que esta enzima representa uma das primeiras linhas de defesa enzimática contra o
acúmulo de H2O2 devido à alta afinidade com esta espécie reativa (MITTLER, 2002).
Mesmo com a redução da atividade de CAT, não foi detectado acúmulo de H2O2 nas
raízes em IACSP97-7065.
No dia de máximo déficit hídrico, as raízes de IACSP94-2094 apresentaram
aumento da peroxidação lipídica (Figura 4D,E) e aumento da atividade da APX (Figura
10D,E), sem variação no teor de H2O2 na IACSP97-7065 (Figura 6D,E). Apesar de não
ter sido observado aumento na atividade total de SOD, sabe-se que a atividade das
isoformas pode aumentar, de forma independente, no local em que estiver ocorrendo
maior indução de estresse oxidativo (SHARMA & DUBEY, 2005). Em ambos os
genótipos observou-se maior atividade das isoformas i-Mn-SOD, presentes
principalmente em mitocôndrias, da iii-Cu/Zn-SOD, prioritariamente de citosol e
também da ii-Fe-SOD, que pode ser encontrada em cloroplastos (MITTLER, 2002) e
também em plastídios (KLIEBENSTEIN et al., 1998) presentes nas raízes. O aumento
das atividades isoladas das isoformas de SOD nas raízes do genótipo IACSP97-7065
resultaram em aumento da atividade total. Também foram detectados aumentos em
CAT e APX, sugerindo que este genótipo apresenta sistema antioxidante ativo mesmo
sob déficit hídrico severo. Após 48 horas da reidratação, não foi identificado aumento
na atividade de nenhuma das três enzimas estudadas, resultando em acúmulo de H2O2
(Figura 6D) e aumento da peroxidação das membranas (Figura 5D). Já em IACSP94-
2094 foram detectados aumentos em SOD, CAT e APX, evitando o acúmulo de H2O2 e
os danos às membranas (Figuras 7, 9 e 10). Nas raízes, assim como nas folhas, esta
variedade apresenta alta atividade antoxidante no momento de recuperação do estresse
hídrico. De fato, o genótipo de cana-de-açúcar resistente à seca apresentou metabolismo
71
antioxidante mais eficiente, dado pelas maiores atividades de APX e SOD durante a
reidratação após período de seca (SALES et al., 2013).
Não houve aumento no acúmulo de H2O2 em T48h (Figura 6A,B) nas raízes de
nenhum dos dois genótipos estudados, sugerindo que a redução de Lpr observada na
IACSP97-7065 não ocorreu devido à inibição das aquaporinas pelo H2O2 (Figura
11A,B). No entanto, o fluxo de água para a parte aérea foi mantida na IACSP94-2094
(Figura 11A), possibilitando o fechamento estomático mais lento, em comparação à
IACSP97-7065 (Figura 2C). A manutenção de Lpr não foi associada ao aumento da
expressão de ScPIP2;5 em IACSP94-2094 (Figura 12C). Embora a manutenção da Lpr
possa estar associado ao aumento da expressão de PIP2:5, os resultados indicaram que
esse padrão foi fortuito. IACSP97-7065 apresentou maior expressão dessa isoforma
(Figura 12C), porém houve redução de Lpr (Figura 11A) quando este genótipo foi
exposto à redução da disponibilidade de água. Ainda, IACSP97-7065 apresentou
aumento na expressão de transcritos das isoformas ScPIP2;1 e ScPIP2;6 após 48 horas
de restrição hídrica (Figura 12). Logo, o aumento da expressão das isoformas das
aquaporinas ScPIP2;1, ScPIP2;5, ScPIP2;6 após 48 h de exposição à restrição hídrica
representam um mecanismo de aclimatação ao déficit hídrico, cuja efetividade em
manter o fluxo de água na planta não foi comprovada.
A regulação da condutância hidráulica pelas AQPs pode ocorrer pelo nível de
expressão que determinaria a abundância de AQPs nas membranas, pela distribuição e
localização das AQPs após sua síntese, além da ativação do canal (HEINEN et al.,
2009). A abertura ou fechamento dos canais é regulada ativamente pela protonação do
resíduo H193, pela fosforilação dos resíduos S115 e S274 e ativadas por íon Ca2+
(NORDEN, 2012). Enquanto IACSP94-2094 não apresentou redução de Lpr e AQP%
sob déficit hídrico, IACSP97-7065 apresentou redução significativa de Lpr associado ao
decréscimo no controle do fluxo de água pelas aquaporinas (Figuras 11A,B).
Aparentemente, a maior sensibilidade de Lpr em IACSP97-7065 foi causada pela
redução do potencial osmótico da solução nutritiva e pela perda da regulação do
transporte de água via aquaporinas. Sabe-se que a Lpr sofre interferência de estímulos
ambientais, como a seca (EHLERT et al., 2009). Foi reportada redução de Lpr em raízes
de uva submetidas à seca (VANDELEUR et al., 2009). Essa habilidade de alterar o
fluxo de água em função de alterações ambientais sugere que a Lpr está relacionada com
a aclimatação das plantas ao ambiente (STEUDLE, 2000).
72
Para minimizar os prejuízos causados pelo déficit hídrico, a Lpr deve se ajustar a
demanda fisiológica de água da planta e as AQPs estão diretamente envolvidas com
esses ajustes (JAVOT & MAUREL, 2002). A coordenação entre as condutâncias de
raízes e estômatos resulta na regulação do potencial da água na folha da cana-de-açúcar
(TARDIEU et al., 2010). No entanto neste estudo não foi observada correlação entre Lpr
e gS após 48 h do início da restrição hídrica, pois ambos os genótipos apresentaram
redução em gS, porém apenas em IACSP97-7065 houve redução de Lp r (Figura 11A).
No entanto, o fechamento estomático foi menor em IACSP94-2094 (-35%) do que em
IACSP97-7065 (-50%), possibilitando a menor redução no fluxo de água para as folhas.
Portanto é provável que a redução em gS na IACSP94-2094 seja devido à sinalização
química, e não hidráulica (redução em Lpr). O ácido abscísico (ABA) é produzido nas
raízes e está envolvido com o fechamento estomático (ZHANG & DAVIES, 1987). Foi
detectado redução de 30% na gS, sem alteração no potencial da água na folha de cana-
de-açúcar, quando apenas metade das raízes foram expostas à seca, sugerindo que a
regulação estomática ocorre através de sinais químicos (SMITH et al., 1999). Como o
controle estomático é regulado tanto por sinais químicos quanto hidráulicos, nem
sempre a regulação estomática e Lpr se correlacionam, portanto há necessidade de mais
pesquisas a respeito da sinalização hidráulica raiz-parte aérea (MARTÍNEZ-
BALLESTA et al., 2003).
De acordo com MARTÍNEZ-BALLESTA et al. (2003), variações em Lpr e
consequentemente diferenças na condutância total da planta e também no status hídrico
foliar são características genótipo-dependente. No genótipo IACSP94-2094 não foi
observado redução de Lpr após 48 h do início do estresse, sugerindo que este genótipo
apresenta a capacidade de manter o transporte de água. Esta característica aliada à
menor sensibilidade da fotossíntese à seca (MACHADO et al., 2009; RIBEIRO et al.,
2013; SALES et., 2013) podem ser as bases para a manutenção do crescimento sob
déficit hídrico.
Apesar do maior acúmulo de H2O2 nas raízes da IACSP97-7065 após 48 h da
reidratação, é provável que não tenha havido redução de Lpr uma vez que houve
recuperação de (Tabela 1), pois não se sabe qual a concentração de H2O2 endógeno
necessária para desencadear o fechamento do canal das AQPs. Após 48 h da reidratação
a expressão dos transcritos de ScPIP2;3, ScPIP2;5 e ScPIP2;6 em IACSP94-2094, foi
inibida (Figura 12). Essa inibição pode estar envolvida com a redução da
permeabilidade da membrana e a manutenção do status hídrico celular, sendo uma
73
estratégia de conservação da água (JANG et al., 2004). Este padrão de resposta estaria
associado com a menor abertura estomática de IACSP94-2094 na recuperação e não
afetaria de forma significativa (Figura 2C e Tabela 1).
Os resultados desta pesquisa indicam que os genótipos de cana-de-açúcar
apresentam resistência diferencial à seca, indicada pela menor redução no acúmulo de
biomassa da IACSP94-2094 em relação à IACSP97-7065 (Figura 13). A menor redução
no crescimento da IACSP94-2094 esta associada à maior capacidade de realizar
fotossíntese sob déficit hídrico e à manutenção da área foliar fotossinteticamente ativa e
do perfilhamento (Tabela 3). De fato, a manutenção das folhas verdes é um bom
indicador de resistência à seca em cana-de-açúcar (INMAN-BAMBER, 2004; SMIT &
SINGELS, 2006).
5 CONCLUSÃO
IACSP94-2094 é afetado mais tardiamente pela restrição hídrica e essa
capacidade é associada à manutenção na condutância hidráulica do sistema radicular no
início do déficit hídrico, sendo as trocas gasosas menos prejudicadas. A redução na
condutância hidráulica das raízes de IACSP97-7065 não é associada à presença de H2O2
nos tecidos. Embora o padrão de expressão de ScPIP2;1, ScPIP2;3, ScPIP2;5 e ScPIP2;6
não justifique as variações na condutância hidráulica das raízes nas duas variedades
estudadas, a contribuição das aquaporinas para o fluxo de água radicular é mantida
apenas em IACSP94-2094. As respostas do sistema antioxidante na raiz variam entre os
genótipos, mas os teores de H2O2 permanecem inalterados em condição de déficit
hídrico. Em geral, as enzimas superóxido dismutase, catalase e ascorbato peroxidase são
mais responsivas ao déficit hídrico em IACSP94-2094.
74
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALEXIEVA, V.; SERGIEV, I.; MAPELLI, S.; KARANOV, E. The effect of drought
and ultraviolet radiation on growth and stress markers in pea and wheat. Plant and Cell
Environment, Oxford, v. 24, p. 1337-1344, 2001.
ANDERSEN, C.L.; JENSEN, J.L; ORNTOFT, T.F. Normalization of real-time
quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation
approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer
data sets. Cancer Research, Chicago, v. 64, p. 5245-5250, 2004.
ARBONA, V.; FLORS, V.; JACAS, J.; GARCIA-AGUSTIN, P.; GOMEZ-CADENAS,
A. Enzymatic and non-enzymatic antioxidant responses of carrizo citrange, a salt-
sensitive citrus rootstock to different levels of salinity. Plant and Cell Physiology,
Oxford, v. 44, p. 388-394, 2003.
AROCA, R.; TOGNONI, F.; IRIGOYENA, J.J.; SÁNCHEZ-DÍAZA, M.; PARDOSSI,
A. Different root low temperature response of two maize genotypes differing in chilling
sensitivity. Plant Physiology and Biochemistry, Paris, v. 39, p. 1067−1073, 2001.
AROCA, R.; AMODEO, A.; FERNÁNDEZ-ILLESCAS, S.; HERMAN, E.M.;
CHAUMONT, F.; CHRISPEELS, M.J. The role of aquaporins and membrane damage
in chilling and hydrogen peroxide induced changes in the hydraulic conductance of
maize roots. Plant Physiology, Rockville, v. 137, p. 341–353, 2005.
AROCA, R.; PORCEL, R.; RUIZ-LOZANO, J.M. Regulation of root water uptake
under abiotic stress conditions. Journal of Experimental Botany, Oxford, vol. 63, p.
43-57, 2011.
AZEVEDO, R.A.; ALAS, R.M.; SMITH, R.J.; LEA, P.J. Response of antioxidant
enzymes to transfer from elevated carbon dioxide to air and ozone fumigation, in the
leaves and roots of wild-type and a catalase-deficient mutant of barley. Physiologia
Plantarum, Lund, v. 104, p. 280 – 292, 1998.
BASNAYAKE, J.; JACKSON, P.A.; INMAN-BAMBER, N.G.; LAKSHMANAN, P.
Sugarcane for water-limited environments. Genetic variation in cane yield and sugar
content in response to water stress. Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 63, p.
6023-6033, 2012.
BENABDELLAH, K.; RUIZ-LOZANO, J.M.; AROCA, R. Hydrogen peroxide effects
on root hydraulic properties and plasma membrane aquaporin regulation in Phaseolus
vulgaris. Plant Molecular Biology, Dordrecht, v. 70, p. 647-661, 2009.
BILGER, W.; SCHREIBER, U.; BOCK, M. Determination of the quantum efficiency of
photosystem II and non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in the
field. Oecologia, Berlin, v. 102, p. 425-432, 1995.
BLUM, A. Drought resistance, water-use efficiency, and yield potential—are they
compatible, dissonant, or mutually exclusive?. Crop and Pasture Science,
Collingwood, v. 56, p. 1159-1168, 2005.
75
BLUM, A. Plant water relations, plant stress and plant production. IN: Plant breeding
for water-limited environments. Ed. Blum, A. Springer, Nova Iorque, EUA, 258 p.,
2011.
BOARETTO, L.F.; CARVALHO, G.; BORGO, L.; CRESTE, S.; LANDELL,
M.G.; MAZZAFERA, P.; AZEVEDO, R.A. Water stress reveals differential antioxidant
responses of tolerant and non-tolerant sugarcane genotypes. Plant Physiology and
Biochemistry, Paris, v. 74, p.165-75, 2014.
BODNER, G.; LEITNER, D.; NAKHFOROOSH, A.; SOBOTIK, M.; MODER, K.;
KAUL, H.P. A statistical approach to root system classification. Frontiers in Plant
Science, Lausanne, v. 4, p. 292-307, 2013.
BOLHÄR-NORDENKAMPF, H.R.; LECHNER, E.G. The determination of the
"photosynthetic capacity" using chlorophyll fluorescence to measure stress levels in
leaves. IN: Trends in photosynthesis research, advanced course. Palma de Mallorca,
Espanha, p. 71-75, 1990.
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical
Biochemistry, Bethesda, v. 72, p. 248-254, 1976.
BRADSHAW, A.D. Evolutionary significance of phenotypic plasticity in plants.
Advances in Genetics, California, v. 13, p. 115-155, 1965.
BRIGHT, J.; DESIKAN, R.; HANCOCK, J.T.; WEIR, I.S.; NEILL, S.J. ABA-induced
NO generation and stomatal closure in Arabidopsis are dependent on H2O2 synthesis.
The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology, Oxford, v. 45, p. 113-122, 2006.
CAKMAK, I.; HORST, W.J. Effect of aluminium on lipid peroxidation, superoxide
dismutase, catalase and peroxidase activities in root tips of soybean (Glycine max).
Physiologia Plantarum, Praga, v. 83, p. 463-468, 1991.
CARMO-SILVA, A.E.; KEYS, A.J.; ANDRALOJC, P.J.; POWERS, S.J.;
ARRABAÇA, M.C.; PARRY, M.A.J. Rubisco activities, properties, and regulation in
three different C4 grasses under drought. Journal of Experimental Botany, Oxford, v.
61, p. 2355–2366, 2010.
CATTIVELLI, L.; RIZZA, F.; BADECK, F.W.; MAZZUCOTELLI, E.;
MASTRANGELO, A.M.; FRANCIA, E.; MARE, C.; TONDELLI, A.; STANCA, A.M.
Drought tolerance improvement in crop plants: An integrated view from breeding to
genomics. Field Crops Research, Amsterdam, v. 105, p. 1-14, 2008.
CHAUMONT, F.; BARRIEU, F.; JUNG, R.; CHRISPEELS, M.J. Plasma membrane
intrinsic proteins from maize cluster in two sequence subgroups with differential
aquaporin activity. Plant Physiology, Rockville, v. 122, p. 1025-1034, 2000.
CHAVES, M.M.; FLEXAS, J.; PINHEIRO, C. Photosynthesis under drought and salt
stress: regulation mechanisms from whole plant to cell. Annals of Botany, Oxford, v.
103, p. 551-560, 2009.
76
CHEAVEGATTI-GIANOTTO, A.; DE ABREU, H.M.C.A,; ARRUDA, P.;
BESPALHOK FILHO, J.C.; LEE BURNQUIST, W.; CRESTE, S.; DI CIERO, L.;
FERRO, J.A.; FIGUEIRA, A.V.O.; FILGUEIRAS, T.S.; GROSSI-DE-SÁ, M.F.;
GUZZO, E.C.; HOFFMANN, H.P.; LANDELL, M.G.A.; MACEDO, N.;
MATSUOKA, S.; REINACH, F.C.; ROMANO, E.; SILVA, W.S.; SILVA FILHO,
M.C.S.; ULIAN, E.C. Sugarcane (Saccharum X officinarum): a reference study for the
regulation of genetically modified cultivars in Brazil. Tropical Plant Biology,
Gewerbestrasse, v. 4, p. 62-89, 2011.
CIA, M.C.; GUIMARÃES, A.C.R.; MEDICI, L.O.; CHABREGAS, S.M.; AZEVEDO,
R.A. Antioxidant responses to water deficit by drought-tolerant and -sensitive sugarcane
varieties. Annals of Applied Biology, Malden, v. 161, p. 313-324, 2012.
CLARKSON, D.T.; CARVAJAL, M.; HENZLER, T.; WHATERHOUSE, R.N.;
SMYTH, A.J.; COOKE, D.T.; STEUDLE, E. Root hydraulic conductance: diurnal
aquaporin expression and the effects of nutrient stress. Journal of Experimental
Botany, Oxford, v. 51, p. 61-70, 2002.
CLIFTON-BROWN, J.C.; LEWANDOWSKI, I. Water use efficiency and biomass
partitioning of three different Miscanthus genotypes with limited and unlimited water
supply. Annals of Botany, Oxford, v. 86, p. 191-200, 2000.
COMSTOCK, J.P. Hydraulic and chemical signalling in the control of stomatal
conductance and transpiration. Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 53,
p. 195-200, 2002.
COUSO, L.L.; GATTI, M.L.; CORNAGLIA, P.S.; SCHRAUF, G.E.; FERNÁNDEZ,
R.J. Are more productive varieties of Paspalum dilatatum less tolerant to drought?.
Grass and Forage Science, Malden, v. 65, p. 296-303, 2010.
COUSO, L.L.; FERNÁNDEZ, R.J. Phenotypic plasticity as an index of drought
tolerance in three Patagonian steppe grasses. Annals of Botany, Oxford, v. 110, p. 849-
857, 2012.
DOS SANTOS, H.G.; et al. Sistema Brasileiro de Classificação de Solos. 3ed.–
Brasília, DF : Embrapa, 2013. 353 p.
EDWARDS, G.E.; N.R. BAKER. Can CO2 assimilation in maize leaves be predicted
accurately from chlorophyll fluorescence analysis? Photosynthesis Research,
Dordrecht, v. 37, p. 89-102, 1993.
EHLERT, C.; MAUREL, C.; TARDIEU, F.; SIMONNEAU, T. Aquaporin-mediated reduction
in maize root hydraulic conductivity impacts cell turgor and leaf elongation even without
changing transpiration. Plant Physiology, Rockville, v. 150, p. 1093-1104, 2009.
FERNÁNDEZ, R.J.; REYNOLDS, J.F. Potential growth and drought tolerance of eight
desert grasses: lack of a trade-off?. Oecologia, Florida, v. 123, p. 90-98, 2000.
FERREIRA, R.R.; FORNAZIER, R.F.; VITORIA, A.P.; LEA, P.J.; AZEVEDO, R.A. Changes
in antioxidant enzyme activities in soybean under cadmium stress. Journal of Plant Nutrition,
Nova Iorque, v. 25, p. 327-342, 2002.
77
FLEXAS, J.; RIBAS-CARBO, M.; BOTA, J. GALMES, J.; HENKLE, M.; MARTINEZ-
CANELLAS, S.; MEDRANO, H. Decreased Rubisco activity during water stress is not induced
by decreased relative water content but related to conditions of low stomatal conductance and
chloroplast CO2 concentration. New Phytologist, Oxford, v.172, p. 73-82, 2006.
FOYER, C.H.; NOCTOR, G. Oxidant and antioxidant signalling in plants: a re-
evaluation of the concept of oxidative stress in a physiological context. Plant, Cell and
Environment, Oxford, v. 28, p. 1056–1071, 2005.
FRIGEL, L.T.M. Expressão diferencial da aquaporina ScPIP2;1 em genótipos de cana-de-açúcar
contrastantes para a tolerância à seca / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Botucatu, 2011. 51 fls.
GHANNOUM, O. C4 photosynthesis and water stress. Annals of Botany, Oxford, v.
103, p. 635-644, 2009.
GIANNOPOLITS, O.; RIES, S.K. Superoxide dismutase: I. Occurrence in higher plants. Plant
Physiology, Rockville, v. 59, p. 309-314, 1977.
HACHEZ, C.; VESELOV, D.; YE, Q.; REINHARDT, H.; KNIPFER, T.; FRICKE, W.;
CHAUMONT, F. Short-term control of maize cell and root water permeability through
plasma membrane aquaporin isoform. Plant, Cell and Environment, Oxford, v. 35, p.
185–198, 2012.
HAVIR, E.A.; McHALE, N.A. Biochemical and development characterization of
multiples forms of catalase in tobacco leaves. Plant Physiology, Rockville, v. 84, p.
450-455, 1987.
HEINEN, R.B.; YE, Q.; CHAUMONT, F. Role of aquaporins in leaf physiology.
Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 60, p. 2971–2985, 2009.
HENZLER, T.; YE, Q.; STEUDLE, E. Oxidative gating of water channels (aquaporins)
in Chara by hydroxyl radicals. Plant, Cell and Environment, Oxford, v. 27, p. 1184–
1195, 2004.
HUND, A.; RUTA, N.; LIEDGENS, M. Rooting depth and water use efficiency of
tropical maize inbred lines, differing in drought tolerance. Plant and Soil, The Hague,
v. 318, p. 311-325, 2009.
INMAN-BAMBER, N.G.; DE JAGER, J.M. The reaction of two varieties of sugarcane
to water stress. Field Crops Reserch, Amsterdam, v. 14, p. 15-28, 1986.
INMAN-BAMBER, N.G. Sugarcane water stress criteria for irrigation and drying off.
Field Crops Research, Amsterdam, v. 89, p. 107-122, 2004.
INMAN-BAMBER, N.G.; BONNETT, G.D.; SMITH, D.M.; THORBURN, P.J.
Sugarcane physiology: integrating from cell to crop to advance sugarcane production.
Field Crops Research, Amsterdam, v. 92, p. 115-117, 2005.
INMAN-BAMBER, N.G.; BONNETT, G.D.; SPILLMAN, M.F.; HEWITT, M.L.;
JACKSON, J. Increasing sucrose accumulation in sugarcane by manipulating leaf
78
extension and photosynthesis with irrigation. Australian Journal of Agricultural
Research, Victoria, v. 59, p. 13-26, 2008.
INMAN-BAMBER, N.G.; LAKSHMANAN, P.; PARK, S. Sugarcane for water-limited
environments: theoretical assessment of suitable traits. Field Crops Research,
Amsterdam, v. 134. p. 95-104, 2012.
JANG, J.Y.; KIM, D.G.; KIM, Y.O.; KIM, J.S.; KANG, H. An expression analysis of a
gene family encoding plasma membrane aquaporins in response to abiotic stresses in
Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology, Dordrecht, v. 54, p. 713-725, 2004.
JANGPROMMA, N.; THAMMASIRIRAK, S.; JAISIL, P.; SONGSRI, P. Effects of
drought and recovery from drought stress on above ground and root growth, and water
use efficiency in sugarcane (Saccharum officinarum L.). Australian Journal of Crop
Science, Hoboken, v. 6, p. 1298-1304, 2012.
JAVOT, H.; MAUREL, C. The role of aquaporins in root water uptake. Annals of Botany,
Londres, v. 90, p. 301-313, 2002.
JOHANSSON, I.; LARSSON, C.; EK, B.; KJELLBOM, P. The major integral proteins
of spinach leaf plasma membranes are putative aquaporins and are phosphorylated in
response to Ca2+
and apoplastic water potential. The Plant Cell, Waterbury, v. 8, p.
1181-1191, 1996.
JORGE, L.A.C; SILVA, D.J.C.B. SAFIRA: manual de utilização. EMBRAPA
Instrumentação Agropecuária, 2010. 28p. Disponível em: <http://www.cnpdia.
embrapa.br/labimagem/downloads/manual_safira.pdf>. Acesso 30 setembro 2012.
KATSUHARA, M.; HANBA, Y.T.; SHIRATAKE, K.; MAESHIMA, M. Review:
expanding roles of plant aquaporins in plasma membranes and cell organelles.
Functional Plant Biology, Victoria, v. 35, p. 1–14, 2008.
KLIEBENSTEIN, D.J.; MONDE, R.A.; LAST, R.L. Superoxide dismutase in
arabidopsis: an eclectic enzyme family with disparate regulation and protein
localization. Plant Physiology, Rockville, v. 118, 637-650, 1998.
KTITOROVA, I.N.; SKOBELEVA, O.V.; SHAROVA, E.I.; ERMAKOV, E.I.
Hydrogen peroxide appears to mediate a decrease in hydraulic conductivity in wheat
roots under salt stress. Russian Journal of Plant Physiology, Heidelberg, v. 49 p. 369–
380, 2002.
LAMBERS, H.; ATKIN, O.K.; MILLENAAR, F.F. Respiratory patterns in roots in
relation to their functioning. IN. Plant roots: the hidden half. Ed. Waisel Y. et al.
Marcel Dekker, Inc. 3ed., 2002. 713p.
LANDELL, M.G.A.; CAMPANA, M.P.; FIGUEIREDO, P.; XAVIER, M.A.;
VASCONCELOS, A.C.M.; BIDOIA, M.A.P.; SILVA, D.N.; DOS ANJOS, I.A.;
PRADO, H.; PINTO, L.R.; SOUZA, S.C.D.; SCARPARI, M.S.; ROSA JUNIOR, V.E.;
DINARDO-MIRANDA, L.L.; ROSSETO, R.; SILVA, M.A.; MARTINS, A.L.M.;
GALLO, P.B.; KANTHACK, R.A.D.; CAVICHIOLI, J.C.; VEIGA FILHO, A.A.;
MENDONÇA, J.R.; DIAS, F.L.F.; GARCIA, J.C. Variedades de cana-de-açúcar
79
para o centro-sul do Brasil: 15° liberação do programa cana IAC (1959-2005).
Campinas: Instituto Agronômico, 2005. 37p.
LANDELL, M.G.A.; CAMPANA, M.P.; FIGUEIREDO, P.; XAVIER, M.A.;
VASCONCELOS, A.C.M.; BIDOIA, M.A.P.; SILVA, D.N.; DOS ANJOS, I.A.;
PRADO, H.; PINTO, L.R.; SOUZA, S.C.D.; SCARPARI, M.S.; ROSA JUNIOR, V.E.;
DINARDO-MIRANDA, L.L.; AZANIA, C.A.M.; PERECIN, D.; ROSSETO, R.;
SILVA, M.A.; MARTINS, A.L.M.; CAVICHIOLI, J.C.; VEIGA FILHO, A.A.;
MENDONÇA, J.R.; DIAS, F.L.F.; GARCIA, J.C. Variedades de cana-de-açúcar
para o centro-sul do Brasil: 16° liberação do programa cana IAC (1959-2007).
Campinas: Instituto Agronômico, 2007. 37p.
LARCHER, W. Ecofisiologia vegetal. São Carlos: Rima Artes & Textos, 2000. 531p.
LAWLOR, D.W. Limitation to photosynthesis in water-stressed leaves: stomata vs
metabolism and the role of ATP. Annals of Botany, Oxford, v. 62, p. 3235-3246, 2002.
LAWLOR, D.W.; CORNIC, G. Photosynthetic carbon assimilation and associated
metabolism in relation to water deficits in higher plants. Plant, Cell and Environment,
Oxford, v. 25, p. 275-294, 2002.
LAWLOR, D.W.; TEZARA, W. Causes of decreased photosynthetic rate and metabolic
capacity in water-deficient leaf cells: a critical evaluation of mechanisms and
integration of processes. Annals of Botany, Oxford, v. 103, p. 561-579, 2009.
LI, S.; ASSMAM, S.M.; ALBERT, R. Predicting essential components of signal
transduction networks: a dynamic model of guard cell abscisic acid signaling. PLoS
Biology, Cambridge, v. 4, p. 1732-1748, 2006.
LIAN, H.; YU, X.; YE, Q.; DING, X.S.; KITAGAWA, Y.; KWAK, S.S.; SU, W.A.;
TANG, Z.C. The role of aquaporin RWC3 in drought avoidance in rice. Plant Cell
Physiology, Oxford, v. 45, p. 481–489, 2004.
LISSON, S.N.; INMAN-BAMBER, N.G.; ROBERTSON, M.G.; KEATING, B.A. The
historical and future contribution of crop physiology and modeling research to
sugarcane production systems. Field Crops Research, Amsterdan, v. 92, p. 321–335,
2005.
LIVAK, K.J.; SCHMITTGEN, T.D. Analysis of relative gene expression data using
real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt
. Methods, Amsterdan, v. 25, p. 402-408.
2001.
LOPES, M.S.; ARAUS, J.L.; VAN HEERDEN, P.D.R.; FOYER, C.H. Enhancing
drought tolerance in C4 crops. Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 62, p.
3135-3153, 2011.
MACHADO, E.C.; PEREIRA, A.R. Eficiência de conversão e coeficiente de
manutenção da planta inteira, das raízes e da parte aérea em milho e arroz submetidos
ao estresse de alumínio. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 25, p. 845-855,
1990.
80
MACHADO, D.F.S.P.; LAGÔA, A.M.M.A.; RIBEIRO, R.V.; MARCHIORI, P.E.R.;
MACHADO, R.S.; MACHADO, E.C. Baixa temperatura noturna e deficiência hídrica
na fotossíntese de cana-de-açúcar. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 48,
p. 487-495, 2013.
MACHADO, R.S.; RIBEIRO, R.V.; MARCHIORI, P.E.R.; MACHADO, D.F.S.P.;
MACHADO, E.C.; LANDELL, M.G.A. Respostas biométricas e fisiológicas ao déficit
hídrico em cana-de-açúcar em diferentes fases fenológicas. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, Brasília, v. 44, p. 1575-1582, 2009.
MARTINEZ-BALLESTA, M.C.; APARICIO, F.; PALLAS, V.; MARTINEZ, V.:
CARVAJAL, M. Influence of saline stress on root hydraulic conductance and PIP
expression in Arabidopsis. Journal of Plant Physiology, Stuttgart, v. 160, p. 689-697,
2003.
MASLE, J. High soil strength: mechanical forces at play on root morphogenesis and in
root:shoot signaling. IN: Plant Roots, the hidden half. Ed. Waisel Y. et al. Marcel
Dekker, Inc. 3ed., 2002, 713p.
MATESANZ, S.; GIANOLI, E.; VALLADARES, F. Global change and the evolution
of phenotypic plasticity in plants. Annals of New York Academy of Science, Nova
Iorque, v. 1206, p. 35-55, 2010.
MATSUOKA, S.; GARCIA, A.A.F. Sugarcane underground organs: going deep for
sustainable production. Tropical Plant Biology, Dordrecht, v. 4, p. 22-30, 2011.
MAXWELL, K.; JOHNSON, G.N. Chlorophyll fluorescence - a practical guide.
Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 51, p. 659-668, 2000.
McCUNE, B.; MEFFORD, M.J. PC-Ord: Multivariate analysis of ecological data.
Version 4.2. MjM Software Design, Gleneden Beach, Oregon, 1999.
MEIER, I.C.; LEUSCHNER, C. Genotypic variation and phenotypic plasticity in the
drought response of fine roots of European beech. Tree Physiology, Oxford, v. 28, p.
297-309, 2008.
MEINZER, F.C.; GRANTZ, D.A. Stomatal and hydraulic conductance in growing
sugarcane: stomatal adjustment to water transport capacity, Plant, Cell and
Environment, Malden, v. 13, p. 383-388, 1990.
MHAMDI, A.; QUEVAL, G.; CHAOUCH, S.; VANDERAUWERA, S.; VAN
BREUSEGEM, F.; NOCTOR, G. Catalase function in plants: a focus on Arabidopsis
mutants as stress-mimic models. Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 15, p.
4197-4220, 2010.
MITTLER, R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends in Plant Science,
Londres, v. 7, p. 405-410, 2002.
MOREIRA, J.R.; PACCA, S.A.; PARENTE, V. The future of oil and bioethanol in
Brazil. Energy Policy, Amsterdam, v. 65, p. 7-15, 2014.
81
MURCHIE, E.H.; LAWSON, T. Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good
practice and understanding some new applications. Journal of Experimental Botany,
Oxford, v. 64, p. 3983-3998, 2013.
NAKANO, Y.; ASADA, K. Hydrogen peroxide scavenged by ascorbate specific
peroxidase in spinach chloroplasts. Plant and Cell Physiology, Oxford, v. 22, p. 867-
880, 1981.
NEILL, S.J.; DESIKAN, R.; CLARKE, A.; HURST, R.D.; HANCOCK, J.T. Hydrogen
peroxide and nitric oxide as signaling molecules in plants. Journal of Experimental
Botany, Oxford, v. 53, p. 1237-1247, 2002.
NICOTRA, A.B.; ATKIN, O.K.; BONSER, S.P.; DAVIDSON, A.M.; FINNEGAN,
E.J.; MATHESIUS, U.; POOT, P.; PURUGGANAN, M.D.; RICHARDS, C.L.;
VALLADARES, F.; VAN KLEUNEN, M. Plant phenotypic plasticity in a changing
climate. Trends in Plant Science, Oxford, v. 15, p. 1-9, 2010.
NORDÉN, K.; AGEMARK, M.; LAMBERT, W.; KJELLSTRÖM, S.; ANDERSSON,
A.; DANIELSSON, R.; CEM EMEK, S.; EMANUELSSON, C.; ALBERTSSON, P.Å.;
JOHANSON, U.; KJELLBOM, P. PIP water channels of the chloroplast inner envelope
and thylakoid membranes. IN: From sequence to structure: characterizing human
and plant aquaporins. Ed. Nordém, K. 74 p. 2012.
PARIDA, A.K.; DAS, A.B.; MOHANTY, P. Defense potentials to NaCl in a mangrove,
Bruguiera parviflora: differential changes of isoforms of some antioxidative enzymes.
Journal of Plant Physiology, Stuttgart , v. 161, p. 531-542, 2004.
PARRY, M.A.; HAWKESFORD, M.J. Food security: increasing yield and improving
resource use efficiency. Proceedings of the Nutrition Society, Cambridge, v. 69, p.
592-600, 2010.
PFAFFL, M.W.; HORGAN, G.W.; DEMPFLE, L. Relative expression software tool
(REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results
in real-time PCR. Nucleic Acids Research, Oxford, v. 9, p. 30-36, 2002.
PINTÓ-MARIJUAN, M.; MUNNÉ-BOSCH, S. Photo-oxidative stress markers as a
measure of abiotic stress-induced leaf senescence: advantages and limitations. Journal
of Experimental Botany, Oxford, v. 65, p. 3845-3857, 2014.
RAMESH, P. Effect of different levels of drought during the formative phase on growth
parameters and its relationship with dry matter accumulation in sugarcane. Journal of
Agronomy and Crop Science, Hoboken, v. 185, p. 83-89, 2000.
RIBEIRO, R.V.; MACHADO, R.S.; MACHADO, E.C.; MACHADO, D.F.S.P.;
MAGALHÃES FILHO J.R.; LANDELL. M.G.A. Revealing drought-resistance and
productive patterns in sugarcane genotypes by evaluating both physiological responses
and stalk yield. Experimental Agriculture, Cambridge, v. 49, p. 212-224, 2013.
SALES, C.R.G.; RIBEIRO, R.V.; MACHADO, D.F.S.P.; MACHADO, R.S.; DOVIS,
V.L.; LAGÔA, A.M.M.A. Trocas gasosas e balanço de carboidratos em plantas de
cana-de-açúcar sob condições de estresses radiculares. Bragantia, Campinas, v. 71, p.
319-327, 2012.
82
SALES, C.R.G.; RIBEIRO, R.V.; SILVEIRA, J.A.G.; MACHADO, E.C.; MARTINS,
M.O.; LAGÔA, A.M.M.A. Superoxide dismutase and ascorbate peroxidase improve
the recovery of photosynthesis in sugarcane plants subjected to water deficit and low
substrate temperature. Plant Physiology and Biochemistry, Paris, v. 73 p. 326-336,
2013.
SALIENDRA, N.Z.; MEINZER, F.C. Relationship between root/soil hydraulic
properties and stomatal behaviour in sugarcane. Australian Journal of Plant
Physiology, Melbourn, v. 16, p. 241-250, 1989.
SALIENDRA, N.Z.; MEINZER, F.C. Genotypic, developmental and drought-induced
differences in root hydraulic conductance of contrasting sugarcane cultivars. Journal of
Experimental Botany, Oxford, v. 43, p. 1209-1217, 1992.
SARRUGE, J.R. Soluções nutritivas. Summa Phytopathologica, Jaboticabal, v. 1, p.
231-233, 1975.
SHARMA, P.; DUBEY, R.S. Drought induces oxidative stress and enhances the
activities of antioxidant enzymes in growing rice seedlings. Plant Growth Regulation,
Dordrecht, v. 46, p. 209-221, 2005.
SILVA, K.I. Respostas fisiológicas de genótipos de cana-de-açúcar ao peróxido de hidrogênio no
sistema radicular / Dissertação (Mestrado) - Agricultura Tropical e Subtropical – Instituto
Agronômico. Campinas, 2014. 47 fls.
SILVA, M.A.; JIFON, J.L.; SILVA, J.A.G.; SHARMA, V. Use of physiological
parameters as fast tools to screen for drought tolerance in sugarcane. Brazilian Journal
of Plant Physiology, Campos dos Goytacazes, v. 19, p. 193-201, 2007.
SINCLAIR, T.R.; LUDLOW, M.M. Influence of soil water supply on the plant water
balance of four tropical grain legumes. Australian Journal of Plant Physiology,
Victoria, v. 13, p. 329-341, 1986.
SINCLAIR, T.R.; ZWIENIECKI, M.A.; HOLBROOK, N.M. Low leaf hydraulic
conductance associated with drought tolerance in soybean. Physiologia Plantarum,
Lind, v. 132, p. 446-451, 2008.
SMIT, M.A.; SINGELS, A. The response of sugarcane canopy development to water
stress. Field Crops Research, Amsterdan, v. 98, p. 91-97, 2006.
SMITH, D.M.; INMAN-BAMBER, N.G.; THORBURN, P.J. Growth and function of
the sugarcane root system. Field Crops Research, Amsterdan, v. 92, p. 169-183, 2005.
SMITH, J.P.; LAWN, R.J.; NABLE, R.O. Investigations into the root:shoot relationship
of sugarcane and some implications for crop productivity in the presence of sub-optimal
conditions. Proceedings of the Australian Society of Sugar Cane Technologists,
Brisbane, v. 21, p. 108-113, 1999.
STEUDLE, E. Water uptake by roots: effects of water deficit. Journal of Experimental
Botany, Oxford, v. 51, p. 1531-1542, 2000.
83
TARDIEU, F. Drought perception by plants. Do cells of droughted plants experience
water stress?. Plant Growth Regulation, Dordrecht, v. 20, p. 93-104, 1996.
TARDIEU, F.; PARENT, B.; SIMONNEAU, T. Control of leaf growth by abscisic
acid: hydraulic or non-hydraulic processes?. Plant, Cell and Environment, Oxford, v.
33, 636-647, 2010.
TAYLOR, S.H.; RIPLEY, B.S.; WOODWARD, F.I.; OSBORNE. C.P. Drought
limitation of photosynthesis differs between C3 and C4 grass species in a comparative
experiment. Plant, Cell and Environment, Oxford, v. 34, p. 65-75, 2011.
VADEZ, V.; KHOLOVA, J.; ZAMAN-ALLAH, M.; BELKO, N. Water: the most
important ‘molecular’ component of water stress tolerance research. Functional Plant
Biology, Victoria, v. 40, p. 1310-1322, 2013.
VAIDYANATHAN, H.; SIVAKUMAR, P.; CHAKRABARTY, R.; THOMAS, G.
Scavenging of reactive oxygen species in NaCl-stressed rice (Oryza sativa L.):
differential response in salt-tolerant and sensitive varieties. Plant Science, Amsterdam,
165, p. 1411-1418, 2003.
VALLADARES, F.; CHICO, J.M.; ARANDA, I.; BALAGUER, L.; DIZENGREMEL,
P.; MANRIQUE, E.; DREYER, E. The greater seedling high-light tolerance of Quercus
robur over Fagus sylvatica is linked to a greater physiological plasticity. Trees, Santa
Monica, v. 16, p. 395-403, 2002.
VALLADARES, F.; SANCHEZ-GOMEZ, D.; ZAVALA, M.A. Quantitative estimation
of phenotypic plasticity: bridging the gap between the evolutionary concept and its
ecological applications. Journal of Ecology, Oxford, v. 94, p. 1103-1116, 2006.
VALLADARES, F.; GIANOLI, E.; GÓMEZ, J.M. Ecological limits to plant phenotypic
plasticity. New Phytologist, Oxford, v. 176, p. 749-763, 2007.
VAN DILLEWIJN, C. Botany of sugarcane, Walthham: Chronica Botanica, 1952.
371p.
VAN KOOTEN, O.; SNEL, J.F.H. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in
plant stress physiology. Photosynthesis Research, Dordrecht, v. 25, p. 147–150, 1990.
VAN OIJEN, M.; SCHAPENDONK, A.; HÖGLIND, M. On the relative magnitudes of
photosynthesis, respiration, growth and carbon storage in vegetation. Annals of
Botany, Oxford, v. 105, p. 793-797, 2010.
VANDELEUR, R.K.; MAYO, G.; SHELDEN, M.C.; GILLIHAM, M.; KAISER, B.N.;
TYERMAN, S.D. The role of plasma membrane intrinsic protein aquaporins in water
transport through roots: diurnal and drought stress responses reveal different strategies
between isohydric and anisohydric cultivars of grapevine. Plant Physiology, Rockville,
v. 149, p. 445-460, 2009.
WAHID, A.; CLOSE, T.J. Expression of dehydrins under heat stress and their
relationship with water relations of sugarcane leaves Biologia Plantarum, Praga, v. 51,
p. 104-109, 2007.
84
WALTER, A.; GALDOS, M.V.; SCARPARE, F.V.; LEAL, M.R.L.V.; SEABRA,
J.E.A.; CUNHA, M.P.; PICOLI, M.C.A.; OLIVEIRA, C.O.F. Brazilian sugarcane
ethanol: developments so far and challenges for the future. WIREs Energy and
Environment, Londres, v. 3, p. 70-92, 2014.
WILKINSON, S.; DAVIES, W.J. ABA-based chemical signalling: the co-ordination of
responses to stress in plants. Plant, Cell and Environment, Oxford, v. 25, p. 195-210,
2002.
YORDANOV, I.; VELIKOVA, V.; TSONEV, T. Plant responses to drought,
acclimation, and stress tolerance. Photosynthetica, Praga, v. 38, p. 171-186, 2000.
ZHANG, J.; DAVIES, W.J. Increased synthesis of ABA in partially dehydrated root
tips and ABA transport from roots to leaves. Journal of Experimental Botany,
Oxford, v. 38, p. 2015-2023, 1987.
ZLATEV, Z.S.; YORDANOV, I.T. Effects of soil drought on photosynthesis and
chlorophyll fluorescence in bean plants. Bulgarian Journal of Plant Physiology, Sofia,
v. 30, p. 3-18, 2004.
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