hidrolisados protéicos de peixe: caracterização e proposta de uso
Post on 09-Jan-2017
217 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Ficha CatalográficaElaborada pela Divisão de Biblioteca e
Documentação do Conjunto das Químicas da USP.
Neves, Renata Alexandra Moreira dasN514h Hidrolisados protéicos de pescado: caracterização e proposta de uso
como suporte nutricional/Renata Alexandra Moreira das Neves. -- SãoPaulo, 2000.
83p.
Dissertação (mestrado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticasda Universidade de São Paulo. Departamento de Alimentos eNutrição Experimental.
Orientador: Marquez, Ursula Maria Lanfer
1. Bioquímica dos alimentos 2. Peixes: Ciências dosalimentos I. T. n. Marquez, Ursula Maria Lanfer, orientador.
641.1 CDD
RENATA ALEXANDRA MOREIRA DAS NEVES
HIDROLlSADOS PROTÉICOS DE PESCADO:CARACTERIZAÇÃO E PROPOSTA DE USO COMO SUPORTE
NUTRICIONAL
Comissão julgadora
Dissertação para obtenção do grau de
MESTRE
Profa. Ora. Ursula M. Lanfer M~hQ€iêz
Orientadorl Presidente
Profa. Ora Vera Lúcia Signoreli Baldini
10 Examinador
Prof. Dr. Alfredo Tenuta Filho20 Examinador
/.: fJl,V . .. '1 rJ, . ..~ t?vuie I dO dt. fV(./(LUC(/ w;JOUl
" Se nesta vida, para poder sobreviver I
o homem pudesse viver daquilo que sente prazer em fazer,
o mundo seria bem mais diferente,
o mundo seria bem mais feliz. "
J aeci Cavalcanti das Neves
Dedico este trabalho,
Aos meus pais, Jaeci e Edna, por serem e terem sido ao
longo da minha existência meus primeiros incentivadores.
Agradecimentos,
À professora Ursula Maria Lanfer Marquez pela orientação, exemplo decompetência, confiança e apoio durante a realização deste trabalho;
Às amigas Andréa Moura e Ana Vládia por terem me apoiado nosmomentos difíceis, pelas palavras de carinho e estímulo;
Aos colegas de laboratório, pela companhia, colaboração, amizade e pelosmomentos de alegria;
À Inês, pela ajuda prestada no decorrer da elaboração deste trabalho epelo carinho;
Ao professor Alfredo Tenuta, agradeço o apoio recebido quandonecessitei utilizar o seu laboratório e equipamentos necessários aelaboração deste trabalho;
À todos os alunos e funcionários do Departamento de Alimentos eNutrição Experimental, que direta ou indiretamente participaram daelaboração deste trabalho;
Ao Luiz pela ajuda na utilização dos recursos de informática;
Aos bibliotecários Ângelo e Adriana pela amizade e boa vontade;
Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos;
Em especial, à toda a minha família (pais, irmãos, tios e avós), que sempre
estiveram ao meu lado, se preocupando e torcendo por mim e ao Laerte
pelo amor e paciência.
SUMÁRIO
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Resumo
Abstract
i-Introdução .
2- Revisão da Literatura .
2.1-Hidrolisados protéicos .
2.1.1- Aplicação dos hidroJisados em pacientes alérgicos ou com desordens
metabólicas .
2.1.2- Processos de hidrólise .
2.1.3- Fontes de proteína ..
2.1.4- Caracterização do hidrolisado protéico ..
2.1.5- Fracionamento dos peptídeos e caracterização química como
acompanhamento da produção de hidroJisados protéicos .
2.16- Propriedades físico-químicas e funcionais dos hidroJisados protéicos .
2.2- Suporte nutricional na fenilcetonúria (PKU) ..
2.2.1- Diagnóstico e tratamento ..
2.2.2- PKU maternal .
2.2.3- Tratamento da PKU .
2.2.4- Necessidades nutricionais dos fenilcetonúricos .
2.2.5- Composição de aminoácidos .
2.2.6- Mistura de aminoácidos livres ..
2.3- Suporte nutricional na encefalopatia hepática .
2.3.1- Tratamento da encefalopatia hepática ..
3- Objetivos ..
4- Materiais e Métodos .
4.1- Materiais .
4.1.1- Amostras .
4.1.2- Reagentes .
Renata Alexandra Moreira das Neves
11
111
V
01
03
03
04
07
09
11
14
18
23
25
26
28
29
30
32
36
37
40
41
41
41
42
4.2- Métodos................................................................................................. 43
4.2.1- Preparação do hidrolisado protéico 43
4.2.2- Determinação do grau de hidrólise 45
4.2.3- Separação das frações peptídicas por faixa de peso molecular................ 46
4.2.4- Métodos Analíticos............................................................................ 46
4.2.4.1- Análise do teor de a-aminonitrogênio 46
4.2.4.2- Análise de aminoácidos 47
4.2.4.3- Análise da composição química dos hidrolisados 48
5- Resultados e Discussão 49
5.1- Composição química do "MINCED" e dos hidrolisados 49
5.2- Rendimento dos hidrolisados enzimáticos 51
5.3- Composição em aminoácidos dos hidrolisados e comparação com
requerimentos da FAO............................................................................. 53
5.4- Relação de Fischer nos hidrolisados.......................................................... 56
5.5- Distribuição percentual dos peptídeos com diferentes pesos moleculares 57
5.6 - Perfil de aminoácidos das frações peptídicas dos diversos hidrolisados 59
6- Conclusões 65
7 R" A " S"bl" , f" 67- e.erenclas I logra Icas .
Renata Alexandra Moreira das Neves
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE FIGURAS
I
Figura 1 - Metabolismo da fenilalanina indicando o bloqueio metabólico, o 24qual leva ao acúmulo de fenilalanina e produção de fenilcetonas,adaptado de Francis, 1987
Figura 2 - Fluxograma do processo de preparação do hidrolisado de peixe 43
Figura 3 - Distribuição do peso molecular dos peptídeos nos hidrolisados 57enzimáticos
LISTA DE TABELAS
LISTA DE TABELAS
li
Tabela 1 - Fórmulas baseadas em hidrolisados protéicos 05
Tabela 2 - Composição em aminoácidos essenciais de vários substratos 10protéicos
Tabela 3 - Perfil do peso molecular de diferentes classes de hidrolisados 12protéicos
Tabela 4 - Propriedades Físico-químicas e Funcionais dos hidrolisados 20protéicos em produtos nutricionais
Tabela 5 - Enzimas utilizadas na obtenção dos hidrolisados 42
Tabela 6 - Sistemas enzimáticos utilizados para a obtenção dos 44hidroJisados e seus respectivos graus de hidrólise.
Tabela 7 - Composição centesimal do "minced" e dos seis hidrolisados 49protéicos após liofilização
Tabela 8 - Recuperação protéica nos seis hidrolisados enzimáticos 51
Tabela 9 - Conteúdo de aminoácidos do "minced" e dos hidrolisados 55obtidos e os requerimentos de aminoácidos essenciais, FAO1991
Tabela 10 - Relação de Fischer nos hidrolisados enzimáticos de 56"minced"
Tabela 11 a - Perfil de distribuição de aminoácidos no hidrolisado total e 60nas frações peptídicas obtidas a partir dos hidrolisados H1(Pepsina 1:1 O.OOO/Bromelina), H2 (Pepsina 1:60.000/Bromelina) e H3 (Pepsina 1:1O.OOO/Quimotripsina)
Tabela 11 b - Perfil de distribuição de aminoácidos no hidrolisado total e 61nas frações peptídicas obtidas a partir dos hidrolisados H4(Pepsina 1:10.000/AspergiJIusoryzae), H5 (Pepsina 1:60.000/Streptomyces griseus) e H6 (Pepsina 1:10.000/Streptomycesgriseus)
Tabela 12 - Perfil de distribuição da fenilalanina nos hidrolisados totais e 62nas frações peptídicas obtidas a partir desses hidrolisados
Renata Alexandra Moreira das Neves
RESUMO
RESUMO
Hidrolisados enzimáticos e aminoácidos livres têm sido reportados como
fontes adequadas de proteína para o tratamento clínico de pacientes que por
diversas razões, não conseguem digerir a proteína intacta. Os hidrolisados
enzimáticos têm sido preferidos por fornecer peptídeos de composição bem
definida, promovendo uma absorção mais efetiva pelo organismo. Isto se deve
ao fato de que di e tripeptídeos podem ser diretamente absorvidos por sistemas
independentes daqueles usados pelos aminoácidos, e a taxa máxima de
captação na absorção de di e tripeptídeos é maior do que a dos aminoácidos
livres. As proteínas do leite, soja e peixe são as mais utilizadas, devido ao alto
valor nutricional, disponibilidade comercial e custo moderado. Em nosso trabalho,
caracterizamos seis hidrolisados enzimáticos de "minced" sob o ponto de vista
químico, físico-químico e nutricional, visando atender grupos populacionais que
necessitem de uma alimentação especial. A composição química (proteína,
lípides, umidade e o conteúdo de resíduo mineral) e o perfil de aminoácidos dos
hidrolisados foram determinados. A caracterização do peso molecular destes
hidrolisados protéicos foi realizada por ultrafiltração em membranas de exclusão
molecular de 30, 10 e 3Kd. Os seis hidrolisados apresentaram um rendimento
variando entre 63,4 e 94,2%, dependendo do sistema enzimático utilizado. Os
hidrolisados liofilizados continham teores protéicos semelhantes entre si, em
média 74,2% e um teor lipídico muito reduzido, da ordem de 1,2%. Todos os
hidrolisados apresentaram uma composição em aminoácidos semelhantes entre
si e que atende as recomendações da FAO 1991, para crianças entre 3 e 8 anos
e para adultos. Os hidrolisados 1 (pepsina 1:10.000/bromelina) e 4 (pepsina
1:10.000/Aspergillus oryzae) são indicados para o tratamento de pacientes com
encefalopatia hepática, pois apresentaram uma relação de Fischer elevada de
3: 1. O processo de ultrafiltração mostrou ser um método de baixo custo e
eficiente para separar as frações peptídicas com diferentes pesos moleculares e
pouco interferiu na distribuição dos aminoácidos. No hidrolisado 5 (pepsina
Renata Alexandra Moreira das Neves
RESUMO IV
1:60.000/Streptomyces griseus) , a fração com peso molecular menor que 3 KDa,
apresentou uma porcentagem elevada (57%) de peptídeos com baixo peso
molecular, podendo ser utilizada no tratamento de pacientes com alergias
alimentares. Esta mesma fração apresentou uma elevada concentração de
fenilalanina livre, sugerindo o emprego de um processo de remoção deste
aminoácido, para posterior formulação de dietas para pacientes fenilcetonúricos.
Renata Alexandt'a Moreira das Neves
RESUMO
ABSTRACT
v
Protein hydrolysates and free amino acids have been used for the
nutritional management of individuais who are not able to digest intact protein.
Studies within the past two decades have shown that dipeptides and tripeptides
may serve efficiently and safely to improve protein nutrition and that in certain
instances they may be superior to free amino acids. Owing to their superior
nutritional quality, hydrolysates of cow's milk protein, soy protein and fish protein
are the most widely usado In our work, a minced fish was hydrolyzed, employing
six different systems of two sequential enzymes. lhe resultant fish protein
hydrolysates (FPH) were characterized for protein, fat, dry matter and ash
contents and their amino acid composition was analyzed either. lhe six FPH
were submitted to an ultrafiltration through a series of membranes with
molecular cut-offs (MWCO) of 30, 10 and 3 KDa. lhe results showed yields of
protein hydrolysates using different proteolytic enzymes varying from 63,4 to
94,2%. lhe protein contents on a dry basis of the six hydrolysates were similar,
on average, 74,2%. lhe lipid contents of the six hydrolysates were low (mean of
1,2%). Although decreases of some amino acids were observed after hydrolysis,
adequate amounts of essential amino acids in relation to the reference pattern of
FAO (1991) were found for children from 3-8 years and adults. lhe hydrolysates
1 . (pepsin 1:10.0001 bromelain) and 4 (pepsin 1:1O.OOOIAspergillus oryzae)
present a high Fischer ratio (molar ratio of VaI + Leu + lIe to lyr + Phe) and
seem to be interesting for clinicai treatment of patients with liver diseases. lhe
separation of peptides with different molecular weights by ultrafiltration seems to
be a low cost and efficient method and does not interfere substantially with the
amino acids distribution. lhe hydrolysate 5 (pepsin 1:60.000IStreptomyces
griseus) contained a high percentage of low molecular weight peptides (57%),
lower than 3 KDa. lhe same fraction contains a high free phenylalanine content,
suggesting the removal of this amino acid in order to formulate diets for PKU
patients.
Renata Alexandra Moreira das Neves
INTRODUÇÃO
1-INTRODUÇÃO
Hidrolisados protéicos e misturas de aminoácidos livres são utilizados
como suporte nutricional para tratamento clínico de pacientes com desordens
gastrointestinais, má nutrição associada à câncer, disfunções metabólicas e
alergias alimentares.
Os hidrolisados enzimáticos têm sido preferidos por fornecer peptídeos
de composição bem definida, promovendo uma absorção mais efetiva pelo
organismo, pela facilidade de uso e pelo menor custo. Misturas de
aminoácidos sintéticos são dispendiosas, apresentam propriedades
organolépticas desagradáveis e elevada osmolalidade que pode acarretar
disfunção intestinal.
O peso molecular dos peptídeos do hidrolisado irá definir a sua
utilização. Em fórmulas infantis hipoalergênicas é necessário que o
hidrolisado apresente peptídeos com baixo peso molecular, pois pequenas
quantidades de peptídeos de alto peso molecular podem causar
complicações em pacientes alérgicos.
Por outro lado, peptídeos com alto peso molecular (mais que 20
resíduos de aminoácidos) estão associados com uma melhor funcionalidade.
Hidrolisados enzimáticos, com baixo teor de fenilalanina, podem em
particular, serem utilizados por pacientes fenilcetonúricos, como uma
alternativa à alimentação e aos inconvenientes causados pelas misturas de
aminoácidos.
Renata Alexandra Moreira das Neves
INTRODUÇÃO 2
Para pacientes com encefalopatia hepática seria desejável
desenvolver hidrolisados enzimáticos protéicos com alto teor de aminoácidos
de cadeia ramificada e um baixo conteúdo de aminoácidos aromáticos.
As proteínas do leite, soja e peixe são as mais utilizadas, devido ao
alto valor nutricional, disponibilidade comercial e custo moderado.
O interesse pela hidrólise de proteínas de peixe iniciou-se por volta
dos anos 60: são proteínas relativamente abundantes, e consideradas
excelentes para alimentação humana. A predominancia de pequenos
peptídeos garante fácil digestão e absorção.
Estudos prévios realizados em nosso laboratório com hidrolisados
enzimáticos de "minced" de pescado (produzido a partir da mistura de
pescados de água salgada: "Maria-Luíza", "Perna-de-Moça" e Camarão),
sugerem o uso de hidrolisados protéicos à base de pescados, para a
alimentação humana.
Pretendemos neste trabalho, dando continuidade a esta linha de
pesquisa, caracterizar os hidrolisados obtidos em nosso laboratório, em
trabalho anterior, sob o ponto de vista químico, físico-químico e nutricional,
indicando uma possível utilização dos mesmos, visando a alimentação de
grupos populacionais que necessitam de uma alimentação especial.
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 3
2- REVISÃO DA LITERATURA
2.1- HIDROLlSADOS PROTÉICOS
Proteínas são componentes essenciais para a nutrição humana, como
fonte de aminoácidos e energia. A qualidade nutricional das proteínas
depende do perfil de aminoácidos e da utilização fisiológica destes, depois da
digestão e absorção, que por sua vez está relacionada com a fonte protéica,
a forma de preparo do alimento e a presença de outros componentes da dieta
(CLEMENTE et ai., 1999; FRIEDMAN, 1996).
Hidrolisados enzimáticos protéicos, ricos em di e tripeptídeos, têm sido
reportados como fontes adequadas de proteína para a nutrição humana
devido a excelente absorção gastrointestinal, sendo melhor utilizados pelo
organismo do que as proteínas intactas ou os aminoácidos livres
(SIEMENSMA etal., 1993; ZIEGLER et ai., 1990).
As propriedades funcionais e nutricionais destes hidrolisados, os
tornam uma fonte atrativa de proteínas, tanto para uso em dietas especiais
como para o consumo em geral (CALDERÓN DE LA BARCA et ai., 2000;
FROKJAER, 1994; MAHMOUD, 1994; LAHL e BRAUN, 1994).
Os hidrolisados têm sido empregados no melhoramento da textura
alimentar promovendo um aumento da capacidade de absorção de água; em
fortificação de bebidas ácidas; no desenvolvimento de fórmulas infantis com
reduzida alergenicidade ou para erros inatos do metabolismo e na formulação
de produtos nutricionais especiais para adultos, com função gastrointestinal
prejudicada, ou mesmo em doenças orgânicas específicas, como renal e
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 4
hepática (CHIANG et aI., 1995; MAHMOUD, 1994; CORDLE, 1994).
2.1.1- APLICAÇÃO DOS HIDROLlSADOS EM PACIENTES
ALÉRGICOS OU COM DESORDENS METABÓLICAS
o tratamento clinico de pacientes com desordens no trato
gastrointestinal, se estendendo a pacientes com má nutrição associada com
câncer, queimaduras e traumas, crianças com diarréia aguda ou crônica,
alergias alimentares, ou desordens no metabolismo dos aminoácidos é
baseado na utilização de fórmulas sintéticas baseadas em hidrolisados
protéicos e aminoácidos livres (ZARRABIAN et ai., 1999; SCHMIDL et aI.,
1994; MEREDITH et aI., 1990; BUZINCO et ai., 1989; KNIGHTS, 1985;
MILLA et ai., 1983).
O desenvolvimento de fórmulas enterais utilizadas para a alimentação
de pacientes hospitalizados com distúrbios vários incluíndo a alergia alimentar
foi um avanço na ciência e na medicina durante os últimos 40 anos. Em 1991,
foi estimado que há mais de 5 milhões de pacientes que são alimentados com
fórmulas enterais nos E.U.A. e que esses alimentos têm um valor no mercado
excedendo 1 bilhão de dólares (FASEB, 1991).
De acordo com a fonte protéica e o grau de hidrólise podemos
encontrar diversas fórmulas baseadas em hidrolisados protéicos, como as
apresentadas na tabela 1. Produtos à base de soja hidrolisada, elaborados
para suprir as necessidades nutricionais de um indivíduo, são os mais
frequentemente utilizados para crianças alérgicas ao leite de vaca. Bebês que
não toleram os produtos da soja podem ser alimentados com uma fórmula à
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 5
base de caseína hidrolisada, como o Nutramigen (HALKEN, 1995; TRAHMS,
1991). O Comitê de Nutrição da Academia Americana de Pediatria,
responsável pela composição de fórmulas infantis patenteadas, estabeleceu
padrões para estes produtos, baseados na composição do leite de uma mãe
sadia.
Tabela 1 - Fórmulas baseadas em hidrolisados protéicosa
FORMULA FONTE DE PROTEINA GRAU DE HIDROLl8E
EXTENSO PARCIALNutramigen Caseína Bovina *Pregestimil Caseína Bovina I *Alimentum Caseína Bovina t *Alfa-Ré Soro Bovino I *Profylac Soro Bovino I *Pepti-Junior Soro Bovino I *Nan HÁ, Beba HÁ Soro Bovino I *Nidina HÁ Soro Bovino I *Nutrilon Pepti Soro Bovino I *Nutrilon Pepti Plus Soro Bovino I *Aptamil HÁ Caseína e Soro
I *Pregomin Soja e Soro Bovino *
aAdaptado de Halken, 1995.
O grau de hidrólise da proteína determina a sua aplicação: proteínas
altamente hidrolisadas, compostas por peptídeos com pesos moleculares
inferiores a 5000 daltons (os produtos disponíveis no comércio normalmente
apresentam peso molecular menor que 1200 daltons) são utilizadas no
controle de alergias alimentares, de modo que, a necessidade de controlar a
alergia alimentar é uma das forças direcionais para o desenvolvimento
tecnológico de hidrolisados protéicos (MALDONADO et aI., 1998; CORDLE,
1994).
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 6
A alergia alimentar é mais freqüente em crianças, onde cerca de 0,5 a
10% das crianças desenvolvem algum tipo de alergia, e é mais séria em
adultos. Nas crianças, a alergia ao leite de vaca é a mais comum,
provavelmente devido a sua grande utilização na alimentação infantil
(CORDLE, 1994).
Proteínas parcialmente hidrolisadas apresentam uma certa proporção
de proteínas intactas e peptídeos com pesos moleculares entre 5000 a 20000
daltons. Não são adequadas no tratamento de alergias alimentares, mas
podem ser utilizadas como fonte de proteínas por indivíduos que possuem
necessidades nutricionais e fisiológicas específicas. Podem ser úteis,
também, como suplemento nutricional para pacientes que não consomem
grandes quantidades de alimentos convencionais, ou ainda, podem substituir
as misturas de aminoácidos sintéticos, utilizadas no tratamento de desordens
do metabolismo dos aminoácidos (MALDONADO et aI., 1998; HALKEN et aI.,
1995; MAHMOUD, 1994).
O uso de hidrolisados nos casos de desordens no metabolismo dos
aminoácidos tem sido recomendado por diversos pesquisadores. Alimentos
protéicos, parcialmente hidrolisados por uso de enzimas, liberando a
fenilalanina, vem sendo utilizados na produção de peptídeos com baixo teor
desse aminoácido, para pacientes com intolerância à fenilalanina (ARAI et aI.,
1986).
Freqüentemente nota-se a formação de peptídeos amargos durante o
processo de hidrólise. Um estudo da seqüência de aminoácidos mostrou que
os peptídeos amargos possuem um ou mais aminoácidos hidrofóbicos
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 7
(PEDERSEN, 1994). A remoção da fenilalanina, um aminoácido hidrofóbico,
de um hidrolisado destinado à fenilcetonúria, pode estar contribuindo também,
para uma melhora no sabor do produto final, apesar da remoção
concomitante e indesejável, da tirosina e do triptofano.
O carbono ativo e polifosfatos são descritos na literatura como capazes
de diminuir o sabor amargo apresentado pelos hidrolisados, pela adsorção de
peptídeos e aminoácidos hidrofóbicos liberados durante o processo de
hidrólise (PEDERSEN, 1994; LOPEZ-BAJONERO et aI., 1991; COGAN et aI.,
1981).
Quanto aos aminoácidos que são removidos, a tirosina e o triptofano,
podem ser reincorporados, por uma reação de condensação peptídeo
peptídeo denominada reação de plasteína (YAMASHITA et ai., 1976).
Após a hidrólise enzimática da proteína, o hidrolisado, em altas
concentrações, pode ser incubado com enzimas proteolíticas. A hidrólise é,
portanto, revertida, e o produto dessa reação é conhecido como plasteína.
Peptídeos de baixo peso molecular são os melhores substratos para a
síntese da plasteína. Esta reação pode ser empregada para mascarar o
sabor amargo pela condensação com outros peptídeos, ou mesmo para
reincorporar a tirosina e o triptofano (MONTECALVO et ai., 1984; ARAI et ai.,
1975).
2.1.2- PROCESSOS DE HIDRÓLlSE
A hidrólise protéica pode ser alcançada com enzimas, ácidos ou
alcális, mas a hidrólise enzimática é a preferida para a produção de
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LlTERATURA 8
hidrolisados em aplicações nutricionais. Esta tem a vantagem de ser
realizada sob condições brandas, mantendo a qualidade nutricional dos
aminoácidos, produzindo hidrolisados com um perfil de peptídeos bem
definidos (LAHL e BRAUN, 1994; SIEMENSMA et aI., 1993).
A hidrólise ácida ou alcalina resulta na hidrólise completa da proteína,
sem nenhuma seletividade no rompimento das ligações peptídicas, podendo
haver formação de estereoisômeros, não utilizáveis pelo organismo, com
conseqüente redução da biodisponibilidade (LAHL e BRAUN, 1994; LAHL e
GRIDSTAFF, 1989).
O processo de hidrólise pode ser controlado através de diversos
parâmetros, como tipo de enzima, temperatura, tempo de hídrólise e pH
(LAHL e BRAUN, 1994).
A temperatura utilizada geralmente é em torno de 30° - SO°C. O pH
está relacionado com o pH ótimo para a atividade máxima de uma
determinada enzima. O tempo de hidrólise está diretamente relacionado com
o grau de hidrólise e a escolha da enzima, numa combinação de eficácia é
custo. Dentro dos limites adequados de temperatura e pH, uma alta
concentração de enzima pode ser utilizada para acelerar o processo de
hidrólise.
O crescimento de microorganismos também deve ser controlado,
realizando assim o processo de hidrólise sob condições sanitárias
adequadas. Um processo de hidrólise mais rápido pode ser um meio de evitar
o desenvolvimento de microorganismos.
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 9
o sabor dos hidrolisados pode ser controlado pela escolha da enzima.
ADLER-NISSEN (1986) observou que hidrolisados produzidos com alcalase
ou outras enzimas com especificidade para o grupo terminal dos aminoácidos
hidrofóbicos podem ser responsáveis por um menor sabor amargo. Desta
forma, os aminoácidos hidrofóbicos livres poderão ser adsorvidos
posteriormente, por diversos processos, como o emprego de carvão ativado.
Os métodos preferidos para a interrupção do processo de hidrólise
são: alteração do pH e da temperatura, de modo a anular a atividade
enzimática, finalizando a hidrólise. A temperatura alta, no entanto, deve ser
mantida por pouco tempo, porque tempos prolongados podem destruir
nutrientes e produzir reações indesejáveis, como a reação de Maillard, ou
estimular o aparecimento de compostos desconhecidos no produto final. A
inativação ácida das enzimas não é utilizada comercialmente com freqüência,
pois pode levar a um acúmulo excessivo de sais no hidrolisado. Membranas
de ultrafiltração também são utilizadas para finalizar o processo de hidrólise,
com a vantagem de eliminar proteínas residuais, peptídeos de alto peso
molecular e enzimas utilizadas durante a hidrólise (MALDONADO et aI., 1998;
LAHL e BRAUN, 1994).
2.1.3- FONTES DE PROTEíNA
As proteínas mais comumente usadas para a produção de hidrolisados
protéicos são as derivadas do leite (caseína, lactoalbumina e proteína do
soro), da soja, e a do peixe, devido ao alto valor nutricional, disponibilidade
comercial em grandes quantidades e custo moderado. Outras têm sido
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 10
também utilizadas, incluindo a gelatina, proteína do arroz, batata e a albumina
do ovo (LAHL e BRAUN, 1994; FREITAS et ai., 1993). Observa-se, portanto,
que proteínas de origem vegetal são utilizadas na formulação de alimentos
como uma alternativa às proteínas de origem animal.
A composição de aminoácidos essenciais de algumas destas fontes
protéicas é apresentada na tabela 2, em comparação às necessidades em
aminoácidos da FAO, 1985 e 1991.
Tabela 2 - Composição em aminoácidos essenciais de vários substratosprotéicos3
Aminoácidos Mincedb Caseína Carne Soro Gelatina Soja FAO
essenciais de leite (3-10) (3-8)c d
meses anosg de aas/100 g de proteína
Histidina 2,87 2,92 3,41 2,05 0,76 2,87 2,6 1,9Isoleucina 4,70 5,41 4,82 6,92 1,70 4,90 4,6 2,8Lisina 10,01 8,12 8,90 11,20 5,74 6,18 6,6 5,8Leucina 8,56 9,51 8,11 14,01 3,36 8,01 9,3 6,6Metioninal 4,08 3,15 3,98 5,15 0,82 2,42 4,2 2,5CistinaTirosinal 7,55 11,06 8,0 7,32 2,56 8,31 7,2 6,3FenilalaninaTreonina 4,62 4,66 4,59 6,18 2,27 3,43 4,3 3,4Triptofano n.d. 1,68 1,54 2,60 ° 1,07 1,7 1,1ValiDa 5,03 6,74 5,01 6,42 2,63 5,28 5,5 3,5
<li 1'\ ~ ri
Adaptado de Adler-Nissen,1986, W DE MIRA et aI, 2000; "FAO,1985; "FAO,1991.
A proteína do peixe possui um alto valor biológico, apresentando um
perfil de aminoácidos balanceado, particularmente daqueles que costumam
ser limitantes em proteínas de origem vegetal, tais como metionina e cistina,
e uma alta sensibilidade à hidrólise proteolítica, sendo assim, fácil e
completamente digerível. Uma outra vantagem do uso de peixe como
matéria-prima para a obtenção de hidrolisados é o fato de que os peixes
normalmente utilizados são aqueles pouco adequados para o filetamento e
portanto de menor valor comercial.
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 11
o interesse por hidrolisados protéicos de peixe surgiu na década de 60
e continua sendo objeto de pesquisa até os dias de hoje. Entretanto, muitos
trabalhos têm sido direcionados para uso como ração animal por problemas
com o sabor e aparecimento de off-flavors (OLIVA-TELES et ai., 1999;
MACKIE, 1982).
GÁLVEZ et ai. (1985) estudaram a utilização de hidrolisados
enzimáticos de peixe em sopas instantâneas, conferindo-lhes um alto valor
nutritivo, razão protéica líquida de 79% em relação a caseína e um índice de
aceitação satisfatório.
Hidrolisados enzimáticos de peixe com baixo teor de gordura,
deficientes em triptofano e valina, mas com elevado teor de lisina foram
obtidos por MORALES de LEÓN et ai. (1990), utilizando-os como
suplementos em refeições ricas em cereais e devido a alta solubilidade
apresentada, podem ser utilizados também em alimentos líquidos.
L1CEAGA-GESUALDO e L1-CHAN (1999) concluíram que algumas
propriedades funcionais dos hidrolisados de peixe foram melhoradas em
relação à proteína original, podendo ser utilizados na indústria de alimentos
como alternativa para outras fontes protéicas.
2.1.4- CARACTERIZAÇÃO DO HIDROLl8ADO PROTÉICO
LAHL E BRAUN (1994) estabeleceram critérios de avaliação para
hidrolisados levando em consideração o custo, o paladar, o valor nutricional,
antigenicidade, solubilidade e funcionalidade dos mesmos. Algumas
características podem ser úteis para avaliar a funcionalidade do hidrolisado,
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 12
tais como, o grau de hidrólise (GH) e o peso molecular dos peptídeos
(TOSSAVAINEN et aI., 1997).
A determinação do GH é considerado o meio mais prático e
conveniente de controlar o processo de hidrólise e é utilizado como um
indicador para comparação de diversos hidrolisados protéicos entre si. Pode
ser expresso de várias maneiras, como a relação entre o nitrogênio presente
no hidrolisado e o nitrogênio total presente na proteína, ou como a % de
ligações peptídicas quebradas (LAHL e BRAUN, 1994; MAHMOUD et aI.,
1992; ADLER-NISSEN, 1986).
o peso molecular das frações peptídicas costuma ser inversamente
proporcional ao grau de hidrólise, ou seja, hidrolisados protéicos contendo
peptídeos com pesos moleculares menor que 500 daltons serão obtidos
quando o grau de hidrólise for elevado, de acordo com a tabela 3,
apresentada por MAHMOUD em 1994.
Tabela 3 - Perfil do peso molecular de diferentes classes de hidrolisadosprotéicosa
.
Peso molecularfrações (Oalton)
das Grau de hidrólise % em cada fraçãoBaixo Médio Alto
< 500500 - 1000
1.000 - 2.0002.000 - 5.000
> 5.000aAdaptado de Mahmoud, 1994
3,81,11,83,789,7
9,813,513,716,646,4
90,25,52,91,40,0
Métodos rápidos para caracterizar os pesos moleculares dos peptídeos
devem ser instrumentos valiosos na otimização dos processos de hidrólise e
também no controle da qualidade dos produtos.
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 13
o peso molecular dos hidrolisados protéicos é um dos mais
importantes fatores na produção de hidrolisados com propriedades funcionais
desejáveis. Pensando nisso, CALDERÓN DE LA BARCA ei aI., 2000 e JEON
et aI., 1999 utilizaram um processo de ultrafiltração (UF), através de
membranas de exclusão molecular de 30, 10, 5 e 3KDa para obter
hidrolisados ou frações peptídicas com peso molecular e propriedades
funcionais desejáveis.
A ultrafiltração com membranas de exclusão molecular apresentou
algumas vantagens incluindo produção em larga escala de frações protéicas
com características desejáveis, simplificação no processo de separação e
redução dos custos de produção quando comparado à processos
cromatográficos.
PEREA et aI. (1993) fracionaram hidrolisados protéicos em diferentes
grupos de peptídeos com peso molecular definido por ultrafiltração, com uma
série de membranas de exclusão molecular de 10, 5, 3 e 1 KDa. As frações
obtidas foram analisadas quanto ao teor protéico, sendo assim determinada a
distribuição percentual dos peptídeos com diferentes pesos moleculares em
cada fração.
Frações protéicas contendo peptídeos com baixo peso molecular foram
obtidas por BAUTISTA et aI. (1996). Os hidrolisados foram clarificados por
um processo de microfiltração com uma membrana de 0,3 mm (Filtron). O
filtrado foi fracionado em duas frações, por ultracentrifugação com membrana
de exclusão molecular de 30 KDa. A primeira fração, o ultraconcentrado (UC
30) com peso molecular maior que 30 KDa e a segunda fração, o ultrafiltrado
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 14
(UF-30), composto de peptídeos com peso molecular menor que 30 KDa. O
UF-30 foi separado novamente, com membranas de exclusão molecular de 5
KDa, em duas frações: ultraconcentrado (UC-5), compostos por peptídeos
com peso molecular entre 5-30 KDa e o ultrafiltrado (UF-5), composto por
peptídeos com peso molecular menor que 5 KDa. Essas frações foram,
então, caracterizadas quanto ao perfil de aminoácidos.
A possibilidade de separar os peptídeos de um hidrolisado protéico de
soro com membranas de ultrafiltração e nanofiltração foi estudada por
POULlOT et aI., 1999. Inicialmente, o hidrolisado foi centrifugado utilizando
uma membrana de exclusão molecular de 10 KDa, com o objetivo de remover
as enzimas e o material não hidrolisado. Posteriormente, membranas de
nanofiltração (NF), que separam os peptídeos baseando-se, ou na carga ou
no tamanho molecular, foram aplicadas ao hidrolisado, mostrando ser
possível fracionar os peptídeos de um hidrolisado, quando o objetivo é uma
caracterização dos mesmos.
2.1.5- FRACIONAMENTO DOS PEPTíDEOS E CARACTERIZAÇÃO
QUíMICA COMO ACOMPANHAMENTO NA PRODUÇÃO DE
HIDROLlSADOS PROTÉICOS
Métodos imunoquímicos como ELISA ou radioimunoensaios (RIA) são
freqüentemente usados para detectar resíduos de proteínas nos hidrolisados
e peptídeos de maior peso molecular (MÂKINEN-KlLJUNEN e SORVA, 1993;
KNIGHTS, 1985).
Cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão molecular (SE-
HPLC) ou Eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantesRenata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 15
(SDS-PAGE) têm sido empregadas para identificar o peso molecular dos
hidrolisados, mas eles não permitem uma separação precisa (SILVESTRE,
1997). Ambos os métodos fracionam bem os peptídeos, quando as amostras
contêm proteínas e peptídeos de alto peso molecular, mas não são
suficientemente sensíveis para peptídeos com peso molecular menor que 3
KDa, podendo dar resultados significativamente incorretos (TOSSAVAINEN
et ai., 1997; MOLLÉ e LÉONIL, 1995; BINDELS e BOERMA,1994; VAN et
al.,1994; LEMIEUX et ai., 1991; VISSER et ai., 1992).
SILVESTRE et ai. (1994) observaram que a Cromatografia líquida de
alta eficiência de exclusão molecular em coluna de 2-hidroxietil-aspartamida
(SE-HPLC/ PHEA) foi eficiente para separar peptídeos de hidrolisados de
caseína, especialmente os peptídeos que apresentavam peso molecular
menor que 1KDa. Porém, devido a baixa resolução e a interação dos solutos
com a fase estacionária (concentrações de sais maiores que 0,005 M
afetaram a separação dos peptídeos), não foi possível determinar
corretamente os pesos moleculares.
Cromatografia líquida de alta eficiência em coluna de fase reversa (RP
HPLC) foi eficiente na caracterização parcial de hidrolisados protéicos, dando
algumas indicações sobre a hidrofobicidade e hidrofilicidade dos peptídeos.
No entanto, o critério de separação dessas fases, baseado na hidrofobicidade
ou na carga dos peptídeos não é adequado para caracterização dos
hidrolisados protéicos do ponto de vista nutricional, uma vez que a qualidade
deles está associada com o tamanho do peptídeo (TOSSAVAINEN et a/.,
1997; VIJAYALAKHSMI et a/., 1986).
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 16
Hidrolisado de caseína eluído em SE-HPLC, mostrou peptídeos e
proteínas com peso molecular variando entre 0,24 (Ala-Pro-Gly) a 43
(ovoalbumina) KDa. As frações coletadas do SE-HPLC foram eluídas em RP
HPLC. O tamanho destes peptídeos, comparados com os obtidos por
espectrometria de massa utilizando rápido bombardeio atômico (FAB-MS),
mostrou que a separação por SE-HPLC seguida por RP-HPLC não foi
completa (LEMIEUX et ai., 1991).
Proteínas com peso molecular superior a 200 KDa podem ser
detectados por espectrometria de massa utilizando "spray" de elétrons (ESI
MS), com uma precisão melhor que, por exemplo, eletroforese em gel de
poliacrilamida (CARR et ai., 1995; MOLLÉ e LÉONIL, 1995). LEONIL et aI.
(1995) obtiveram resultados para proteínas do leite com uma precisão de
0.01% comparada ao peso molecular teórico. Apenas uma quantidade de
amostra da ordem de picomoles foi necessária para a análise espectrométrica
em massa.
Espectrometria de massa fornece apenas uma identificação do peso
molecular dos peptídeos com alto peso molecular, porém ao utilizar RP-HPLC
com espectrometria de massa utilizando rápido bombardeio atômico (ESI
MS) foram obtidos resultados precisos em relação à peptídeos menores,
onde estes são bem separados e simultaneamente a detecção por
espectrometria de massa é possível (TOSSAVAINEN et ai., 1997; MOLLÉ e
LEONIL, 1995).
Espectrometria de massa têm se tornado um método indispensável
para analisar a estrutura de peptídeos e proteínas, sendo capaz de resolver
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 17
problemas estruturais que não são facilmente resolvidos pelas técnicas
convencionais (CARR et aI., 1991).
Portanto, podemos observar que para identificar peptídeos menores no
hidrolisado protéico com mais precisão é necessário trabalhar com dois ou
mais métodos, simultaneamente, onde possamos fracionar os peptídeos para
depois identificá-los.
Entretanto, a separação de pequenos peptídeos ainda não é
satisfatória, sendo necessário desenvolver novas técnicas para fracionar os
hidrolisados protéicos. É importante continuar pesquisando um método
eficiente, capaz de separar esses peptídeos devido principalmente a
qualidade nutricional desejada para os hidrolisados estar parcialmente
relacionada ao conteúdo de di- e tripeptídeos.
O perfil do peso molecular dos hidrolisados protéicos também pode ser
determinado por cromatografia em gel (GPC). Porém, esse método apresenta
algumas desvantagens, pois apenas hidrolisados puros podem ser analisados
corretamente. Outros constituintes alimentares como, carboidratos, Iipídeos,
minerais e vitaminas de alto peso molecular, interferem com o ensaio. A
quantificação exata por espectrometria ultravioleta é dificultada e a resolução
das colunas GPC disponíveis comercialmente é baixa para peptídeos com 1 à
10 aminoácidos na cadeia peptídica (ACHOURI et aI., 1999; SIEMENSMA et
aI., 1993; KNIGHTS, 1985).
Esses processos de cromatografia não são comumente utilizados em
escala industrial devido a baixa rentabilidade e alto custo (POULlOT et aI.,
1999).
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 18
Todos OS métodos citados anteriormente para fracionamento dos
peptídeos podem ser utilizados, não diretamente para a determinação do
peso molecular, mas para separar o material em frações com características
similares.
Após o fracionamento os peptídeos podem ser caracterizados
quimicamente por vários métodos como: determinação da composição e
seqüência dos aminoácidos (CHEN et aI., 1995; ADACHI et aI., 1991); análise
do N-terminal usando um sequenciador de proteína (MACEDO et aI., 1993);
espectrometria de massa (CHEN et aI., 1995) ou espectrometria de massa
por rápido bombardeio atômico (FAB-MS) (PUCCI et aI., 1992).
Os peptídeos produzidos durante o processo de hidrólise protéica do
peixe podem ser utilizados como ingredientes protéicos pelas características
nutricionais e baixo custo em relação às outras fontes de proteína, embora
poucas informações estejam disponíveis na literatura científica sobre o
tamanho das cadeias peptídícas e as suas propriedades funcionais
(MORALES de LEON et aI., 1990; GÁLVEZ et aI., 1985).
2.1.6- PROPRIEDADES FISICO-QUIMíCAS E FUNCIONAIS DOS
HIDROLlSADOS PROTÉICOS
Durante a Segunda Guerra Mundial, ocorreu uma grande falta de ovos
para uso industrial. Começou, então, a procura por outros alimentos que
tivessem características similares. Entre os poucos produtos que puderam
ser utilizados para obter propriedades funcionais semelhantes à proteína do
ovo, encontrava-se o hidrolisado protéico da soja, obtido por uma reação de
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 19
hidrólise com pepsina. Este hidrolisado exibiu uma propriedade espumante
única, substituindo parcialmente os ovos na indústria de alimentos (ADLER
NISSEN, 1986).
Em 1970, surgiu o interesse por outras fontes de proteínas de
utilização não-convencional para a alimentação humana. Nos países em
desenvolvimento, a hidrólise enzimática era vista como um caminho para
obtenção de alimentos protéicos mais atrativos e viável à população.
Entretanto, algumas dificuldades que iam surgindo durante o processo
de hidrólise, precisavam ser controladas, como a formação de produtos com
sabor amargo, rendimento inadequado e uma falta de controle da reação
proteolítica. Atualmente, com o avanço tecnológico e várias pesquisas nessa
área, têm sido possível desenvolver processos de hidrólise onde os produtos
da hidrólise possuem características funcionais, organolépticas e nutricionais
bem definidas (LAHL e BRAUN, 1994; ADLER-NISSEN, 1986; ADLER
NISSEN et aI, 1983).
CHOBERT et aI. (1988) e FOX et aI. (1982) demonstraram que após a
hidrólise protéica, além de apresentarem peptídeos com pesos moleculares
menores e modificações nas estruturas protéicas, são esperadas mudanças
nas propriedades funcionais dos hidrolisados, como aumento da solubilidade
perto do ponto isoelétrico, diminuição da viscosidade e mudanças
significativas na capacidade espumante, gelificante e emulsificante quando
comparadas às proteínas nativas.
POUR-EL (1981) definiu funcionalidade protéica como sendo alguma
propriedade do alimento ou ingrediente alimentar, exceto nutricional, que
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 20
afeta o seu emprego. Essa definição é também útil no conhecimento do uso
alimentar do hidrolisado protéico. Deve- se ampliar a definição de
propriedades funcionais de hidrolisados de proteínas para poder incluir
àquelas propriedades físico-químicas que afetam o processamento,
estabilidade de armazenamento, qualidade organoléptica, e a eficácia
nutricional ou biológica do produto final (Tabela 4).
Tabela 4 - Propriedades Físico-químicas e Funcionais dos hidrolisadosprotéicos em produtos nutricionaisa
.
Propriedades Químicas e Físico - Químicas Propriedades Funcionais
Tamanho Molecular AlergenicidadeSolubilidade
OsmolalidadeHidrofobicidade Viscosidade
GelatinizaçãoEmulsificação
TurbidezInteração carboidrato Flavor
Capacidade EspumanteEscurecimento Maillard
Formação de corInteração mineral Estabilidade Térmica
aAdaptado de Mahmoud, 1994
As principais propriedades funcionais dos hidrolisados, isto é,
solubilidade, viscosidade, capacidade de emulsificação, capacidade
espumante, gelatinização e flavor, são comuns às proteínas intactas, mas
elas diferem destas, devido a hidrólise enzimática. Essas propriedades
dependem da extensão do grau de hidrólise, ou seja, do tamanho molecular
das frações peptídicas (MAHMOUD et aI., 1992; ADLER-NISSEN, 1986).
As propriedades funcionais dos hidrolisados protéicos são também
influenciadas pela especificidade das enzimas proteolíticas utilizadas, pela
natureza química e física das proteínas intactas e pelas condições de
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 21
hidrólise.
PHILLlPS e BEAUCHALT (1981) mostraram que a quebra das
estruturas primárias da proteína provoca uma série complexa de eventos que
alteram a funcionalidade.
Com a hidrólise das ligações peptídicas, costumam ocorrer as
seguintes alterações: Aumento no número de grupos ionizáveis (carboxilas e
aminas) com aumento concomitante na hidrofilicidade; diminuição no peso
molecular da cadeia polipeptidíca com a diminuição da antigenicidade e,
alteração da estrutura molecular levando a exposição do interior dos grupos
hidrófobos ao ambiente aquoso.
Condições como pH, força iônica, e concentração de solutos orgânicos
afetam a habilidade dos hidrolisados protéicos de interagir através de forças
de atração e repulsão. A presença de hidrocolóides, emulsificantes, proteínas
intactas, carboidratos, e suas interações com os hidrolisados, são fatores
importantes que alteram a funcionalidade dos hidrolisados. Altas
temperaturas utilizadas durante o processamento e esterilização podem
promover interações hidrófobas (peptídeo-peptídeo ou peptídeo-proteína) e
influenciar fortemente na estabilidade desses hidrolisados (MAHMOUD,
1994).
Certas propriedades funcionais desempenham funções mais
importantes que outras, direcionando a aplicação dos hidrolisados para um
uso específico final. Hidrolisados hipoalergênicos devem permitir que as
crianças que possuem alergia à proteína intacta possam consumí-Ios.
Uma das mais importantes propriedades físico-química e funcionais
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 22
dos hidrolisados protéicos é a solubilidade numa ampla faixa de pH,
temperatura, concentração de nitrogênio e condições iônicas. Muitos
trabalhos têm demonstrado que quanto maior a hidrólise protéica, maior a
solubilidade, principalmente próximo ao ponto isoelétrico da proteína original
(MAHMOUD, 1994; ADLER-NISSEN, 1986). Hidrolisados com uma alta
solubilidade são freqüentemente utilizados na suplementação de suco de
frutas, implementando a qualidade nutricional.
Quanto a capacidade de emulsificação, observa-se que quanto maior a
hidrólise, menor a capacidade emulsificante (ADLER-NISSEN, 1986).
Peptídeos pequenos e aminoácidos livres são menos eficientes na redução
da tensão superficial devido a impossibilidade de se orientar na interface
como ocorre com as proteínas. Assim, pequenos peptídeos podem ser
deslocados da interface por peptídeos maiores com forte tendência à
adsorção (PHILLlPS e BEAUCHALT, 1981).
Muitos estudos têm sugerido um tamanho molecular ou um
comprimento da cadeia polipeptídica superior a 20 resíduos de aminoácidos
como sendo ideal, para que o hidrolisado apresente uma boa capacidade
emulsificante. Amido de milho modificado com anidrido octenil succiníco têm
sido adicionado a formulações altamente hidrolisadas, na tentativa de
melhorar a capacidade emulsificante (ADLER-NISSEN, 1986).
A osmolalidade é uma propriedade funcional de particular importância
para os hidrolisados, uma vez que a sua maior aplicação é em fórmulas
infantis e em fórmulas especiais para adultos com a função gastrointestinal
prejudicada.
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 23
Soluções com alta osmolalidade, e portanto hipertônicas, atraem uma
grande quantidade de água para dentro do intestino delgado, causando
diarréia, possível desidratação e rompimento do balanço eletrolítico, bem
como induzem náusea, vômito e distensão abdominal.
Portanto, podemos observar que as propriedades físico-químicas e
funcionais dos hidrolisados protéicos precisam ser conhecidas para uma
futura aplicação em processos tecnológicos de produtos alimentares.
2.2- SUPORTE NUTRICIONAL NA FENILCETONÚRIA (PKU)
A fenilcetonúria clássica ou simplesmente PKU, é uma desordem
autossomal recessiva, devido a um erro congênito do metabolismo da
fenilalanina causada pela deficiência de uma enzima, a fenilalanina
hidroxilase hepática (PAH), responsável pela conversão do aminoácido
essencial fenilalanina em outro aminoácido, tirosina. A atividade enzimática
da PAH apresenta-se bastante reduzida, menos que 2% da atividade normal
(FREITAS et aI., 1999).
Aproximadamente, 90% dos casos apresentam deficiência da enzima
fenilalanina hidroxilase em maior ou menor grau; os 10% remanescentes têm
defeito nas vias associadas, seja na atividade da diidropteridina redutase
(deficiência de OHPR) ou na síntese de biopterina (BH4).
Esta anormalidade congênita, descoberta em 1934, pelo médico e
bioquímico norueguês Asborn Folling, resulta em altos níveis de fenilalanina
no sangue, incrementando a atividade das vias metabólicas alternativas,
produzindo quantidades anormais de ácido fenilpirúvico, fenilláctico e
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 24
fenilacetato que são excretados em grande quantidade na urina (FRANCIS,
1987). A figura 1 ilustra o bloqueio metabólico.
+FENILACETIL-GLUTAIvIINA
Q?H2
CH2 NH2
FENILE TILf>MINA
+.QCH';lICOOH
ÁCIDO *FENILACÉTICO
.....-fIl--'yCH2ICOICOOH
ÁCIDO *FENILP IRÚV IC O
~ÁCIDO
O-HIDROXIFENILACÉTICO
yCH2I
CHOHICOOH
ÁCIDO*FENILACTA TO
EXCRETADO NA PKU
PROTEINA DIETETICA
/ PAR '\.
~ ~CH2CHNH2COOH -+B- OCH2CHNH2COOH--+-
TIROSINA ~FENILALANINA~
PROTEÍNA DO TECIDO
*
...-H- BLOQUEIO METABÓUCO
FIGURA 1. Metabolismo da fenila1anina indicando o bloqueio metabólico, o qua1leva ao acúmulode fenilalanina e produção de fenilcetonas, adaptado de Francis, 1987.
o excesso de fenilalanina é tóxico para o sistema nervoso central e
causa problemas severos normalmente associados com PKU, onde o retardo
mental é a manifestação clínica mais severa (PIETZ et aI., 1997; WOO,
1989).
Uma conseqüência da falta de metabolização da fenilalanina, é uma
deficiência de tirosina, que passa a ser um aminoácido essencial para esses
indivíduos. °paciente fenilcetonúrico passa a depender da tirosina da dieta e
tende a ter uma concentração normal baixa ou reduzida deste aminoácido no
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 25
sangue (ROHR et aI., 1998). Essa deficiência de tirosina na PKU sugere que
ela também seja a causa do prejuízo intelectual observado nesses pacientes.
Na cidade de São Paulo, a incidência se situa na mesma ordem de
grandeza: 1: 12.000 a 1:15.000 recém-nascidos, de acordo com a única
estimativa a partir do levantamento realizado em postos de Saúde e berçários
da capital em 1987 por SCHMIDT et ai., 1987.
No Brasil, a partir de 1990, tornou-se obrigatório, em todo o território
nacional (Lei 8069 de 13/07/90 - Estatuto da Criança e do Adolescente), o
diagnóstico neonatal (teste do pezinho), a partir de 48 horas após o
nascimento, tendo-se reconhecido a importância da identificação correta e
precoce desta doença, como prevenção de uma doença mental grave.
2.2.1- DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO
O diagnóstico clínico é realizado apenas por volta do 6° mês de vida,
devido ao atraso no desenvolvimento e/ou convulsão e outras anormalidades
como lesões na pele e pigmentação reduzida por serem sintomas comuns a
diversas outras enfermidades (HEININGER et ai., 1986).
A fenilcetonúria não é curável, mas as suas conseqüências podem ser
prevenidas a partir de um tratamento com uma alimentação específica, desde
que a doença seja diagnosticada precocemente, nas primeiras semanas de
vida até o 3° mês de vida, antes da instalação dos danos irreversíveis,
levando a um desenvolvimento normal das crianças, tornando-as adultos
produtivos (SMITH, 1994; DEBENHAM,1992).
Esse tratamento visa basicamente reduzir os níveis plasmáticos da
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 26
fenilalanina das crianças fenilcetonúricas (2 1200 J.!moI/L), para uma
concentração semelhante à encontrada em crianças sadias (60-160 J.!moI/L).
A suplementação da dieta com tirosina é necessária para manter a
concentração plasmática deste aminoácido em nível normal (ACOSTA et aI.,
1999).
o diagnóstico de uma concentração de fenilalanina na circulação
superior a 1200 J.!mol/L (20 mg/dL), acompanhada de uma concentração de
tirosina menor que 118 J.!mollL, sugere a realização de um novo teste
laboratorial, confirmatório, após um período de 48 horas de vida, tempo
suficiente para que o recém nascido tenha mamado no peito ou na
mamadeira (MABRY, 1990).
2.2.2- PKU MATERNAL
Uma elevada concentração de fenilalanina no sangue de mulheres
fenilcetonúricas, da ordem de 1200 J.!moIlL, exerce um efeito teratogênico
sobre o desenvolvimento do feto, principalmente durante o período de
organogênese (primeiro trimestre da gravidez).
Pequenas elevações de fenilalanina no sangue materno já são
suficientes para causar danos ao feto, sendo que quanto mais alto o nível,
mais grave será o defeito (KOCH, 1994; LUKE, 1994; ROHR et a/., 1987;
COLLlNS e LEONARD, 1985; LENKE e LEVY, 1980).
As anormalidades no feto incluem baixo peso ao nascer, microcefalia,
retardo mental e doenças cardíacas congênitas nos fetos, ou complicações
que podem resultar em aborto espontâneo (FREITAS et aI., 1999; ROUSE,
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 27
1997; ACOSTA, 1995; LEWe GUAVANI, 1996; LENKE e LEW, 1980).
LENKE e LEW (1980) observaram que de 524 gestações em 155
gestantes com fenilcetonúria não tratadas, a freqüência de retardo mental,
microcefalia, doenças cardíacas congênitas e um crescimento intra-uterino
atrasado, foi significantemente mais alto que na população normal. É
interessante salientar que 99% das mães com concentração de fenilalanina
no sangue de 20 mg/dL ou mais, tiveram pelo menos um filho com retardo
mental.
O controle dos níveis sangüíneos de fenilalanina pode diminuir os
riscos para o feto, mas o sucesso não pode ser assegurado. Estudos têm
demonstrado que o nível de fenilalanina sangüíneo permitido durante a
gestação para diminuir e ou evitar os efeitos deletérios sobre o feto seria de
100-300 I-lmol/L (BRENTON, 1996); 120 - 360 I-lmol/L (KOCH, 1994; ROUSE
et aI., 1990) e 60- 120 I-lmollL (SMITH, 1990). Concentrações menores que
60 I-lmollL devem ser evitadas, pois uma deficiência de fenilalanina pode levar
a perda muscular materna e reduzido crescimento fetal (BRENTON e
L1LBURN, 1996; ACOSTA, 1995).
Suplementação da dieta com L-tirosina também é recomendada.
ROHR et aI. (1998) estudando a resposta da suplementação com L-tirosina
em cinco grávidas com PKU maternal, observaram que uma única dose de
1,3 g dessa substância foi suficiente para aumentar a concentração de
tirosina no plasma, de 34 I-lmollL para uma concentração acima da
recomendada (45 I-lmoIlL), por cerca de um período de 3 horas, mantendo um
suporte adequado de proteínas e síntese normal de catecolaminas.
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 28
Muitos pesquisadores, estão de acordo que a fenilcetonúria maternal
precisa ser controlada na gravidez e o controle dietético deve começar antes
mesmo da concepção. Recomenda-se manter o nível de fenilalanina no
sangue abaixo de 360 /-lmoIlL, mas não inferior a 60 /-lmollL (BRENTON e
L1LBURN, 1996; ACOSTA, 1995; KOCH, 1994).
Portanto, são necessários programas de orientação realizados por
profissionais especializados durante a gestação, conscientizando a mãe da
importância da dieta para a sua saúde e para o desenvolvimento normal do
feto.
2.2.3- TRATAMENTO DA PKU
Desde a descoberta dos efeitos benéficos da dieta restrita em
fenilalanina sobre o estado neurológico da criança com PKU, o tratamento
dietético destes pacientes, iniciado dentro das primeiras semanas de vida,
tem sido uma medida rotineira em diversos países (ENDRES, 1998).
Essa dieta visa reduzir e controlar a concentração plasmática de
fenilalanina em limites suficientes apenas para o crescimento e
desenvolvimento adequado da criança, sendo uma quantidade miníma
essencial para a síntese e regeneração de proteínas e enzimas (KRAUSE e
MAHAN, 1995). O resultado deste tratamento depende do rigor e do controle
da alimentação oferecida à criança durante o seu desenvolvimento.
Acreditava-se que o desenvolvimento normal dos pacientes com PKU
poderia estar garantido se a dieta fosse mantida apenas durante os primeiros
anos de vida. Porém, muitos pesquisadores, médicos, nutricionistas,
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 29
psicólogos e mesmo os pacientes fenilcetonúricos e seus familiares mais
próximos acreditam que a dieta restrita em fenilalanina deve ser continuada
durante a adolescência ou até mesmo por toda a vida (ENDRES, 1998).
HOLTZMAN et aI. (1986) demonstraram em estudo com 119 crianças
entre 8 e 10 anos de idade, com controle pouco rigoroso da dieta, uma
diminuição acentuada do 0.1., em comparação com aquelas que não
relaxaram a dieta. Animais de laboratório com altos níveis de fenilalanina no
plasma têm apresentado inibição da síntese de mielina, pelo aumento do
turnover desta (ROBISON et aI., 1986; TAYLOR et aI., 1983; HOMMES et aI.,
1982), assim como inibição da síntese de catecolaminas e serotonina
(TAYLOR et aI., 1983); portanto, os autores sugerem que a dieta seja
mantida por toda a vida em pacientes com PKU.
2.2.4- NECESSIDADES NUTRICIONAIS DOS FENILCETONÚRICOS
Os teores de fenilalanina em proteínas alimentares variam entre 4 e
6%, não existindo nenhuma proteína natural isenta deste aminoácido.
Portanto, é necessário uma redução no consumo de proteínas no tratamento
dietético.
Vegetais, frutas e outros alimentos com baixo conteúdo de proteínas,
poderão fazer parte do cardápio dos fenilcetonúricos, procurando assim,
manter a ingestão de fenilalanina nos limites de tolerância individual. Os
vegetais são boas fontes de vitaminas, minerais e de fibras alimentares
disponíveis em número elevado de tipos e variedades, sendo este um
privilégio dos brasileiros que possuem frutos tropicais bastante saborosos e
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 30
diversificados.
No entanto, a ingestão de misturas de aminoácidos livres, vegetais,
frutas e um baixo consumo de alimentos contendo proteínas de alto valor
biológico, repercute diretamente na diminuição do aporte de energia bem
como de ácidos graxos, vitaminas e minerais que então devem ser acrescidos
à dieta na forma de suplementos (BREMER et aI., 1996).
Além disso, a predominância de alimentos de origem vegetal contendo
fibras, fitatos, oxalatos e taninos, entre outros fatores, pode levar a uma
redução da biodisponibilidade de nutrientes como ferro, zinco, cálcio, selênio,
vitaminas A, complexo B entre outras (ACOSTA, 1996; GIOVANNINI et
al.,1996; HANLEY et aI., 1996; LOMBECK et aI., 1996; GROPPER et aI.,
1993).
Os resultados desses estudos comprovam que as dietas para
adolescentes fenilcetonúricos são nutricionalmente inadequadas, sendo
necessários mais estudos relativos às necessidades nutricionais e uma
revisão na composição das misturas de aminoácidos, especialmente no que
se refere à suplementação com minerais.
2.2.5- COMPOSIÇÃO DE AMINOÁCIDOS
O conhecimento sobre a composição de aminoácidos de alimentos
usados nos cardápios para os pacientes fenilcetonúricos é de particular
importância devido a restrição que esses pacientes possuem à fenilalanina.
Poucos são os alimentos que tem a sua composição de aminoácidos
conhecida. Várias são as razões: falta de interesse em quantificar os
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 31
aminoácidos quando o alimento não é fonte protéica; elevado custo da
análise; metodologia pouco precisa ou ultrapassada (LANFER MARQUEZ,
1996). Freqüentemente, a quantificação é baseada em cálculos a partir dos
teores de nitrogênio total, sem levar em consideração a presença de
nitrogênio não-protéico (BREMER et ai., 1996).
O consumo permitido de proteínas e aminoácidos (250 e 500 mg por
dia) depende do nível de fenilalanina no sangue, o qual depende da atividade
remanescente da fenilalanina hidroxilase no fígado. Essa atividade, pode
variar desde a ausência de atividade, acarretando uma concentração de
fenilalanina ~ 1200 IlmollL, até 5% ou mais de atividade residual, que resulta
em concentrações de fenilalanina no plasma, semelhante às encontradas em
pessoas sadias (40-100 Ilmol/L) (LANFER MARQUEZ, 1996; MONCH et ai.,
1996; SOTO, 1993; CLARK, 1992).
Nem todas as crianças possuem o mesmo grau de deficiência dessa
enzima, portanto, algumas apresentam alguma atividade enzimática
possibilitando uma dieta menos rigorosa, enquanto outras devem ter uma
dieta bastante restrita.
Pacientes fenilcetonúricos alimentados com misturas de aminoácidos,
hidrolisados e alimentos com baixo teor de proteína podem ter os
requerimentos protéicos e energéticos aumentados (ACOSTA, 1996).
PRZYREMBEL (1996) recomenda que seja prescrito o consumo de proteína
recomendado pela FAOIWHO/UNU (1985), corrigido pela digestibilidade e
pelo escore de aminoácidos, e com um adequado consumo de energia.
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 32
Deve ser controlada a ingesta do aminoácido envolvido para que não
ultrapasse os níveis sangüíneos considerados seguros (100 I-lmollL), porém
ao mesmo tempo, o aporte deve ser suficiente para chegar aos
requerimentos nutricionais da criança, permitindo manter um bom estado
nutricional, um adequado crescimento físico e um desenvolvimento mental
normal (COLLlNS e LEONARD, 1985; O'BRIEN, 1979; AMERICAN
ACADEMY OF PEDIATRICS, 1976).
2.2.6- MISTURA DE AMINOÁCIDOS LIVRES
A dieta com restrição em fenilalanina é planejada em torno do uso de
formulações à base de misturas de aminoácidos isentos de fenilalanina ou de
hidrolisados protéicos, sendo permitida a ingestão de alimentos de baixo teor
protéico, frutas, vegetais e pequenas quantidades de cereais e grãos
(BREMER et ai., 1996).
As fórmulas mais comumente utilizadas no mercado são Lofenalac,
95% livre de fenilalanina, produzida pela Mead Johnson e Co, usada para
lactentes e Phenyl - Free, uma fórmula 100% livre de fenilalanina, também
produzida pela Mead Johnson e Co, para crianças e adolescentes (TRAHMS,
1991 ).
Diversos novos produtos têm também sido introduzidos. PKU 1, PKU 2
e PKU 3 são módulos metabólicos especiais da produzidos pela MILUPA AG
e distribuídos pela Mead Johnson. A PKU 1 é designada para lactentes,
enquanto que a PKU 2 é para crianças e a PKU 3 é utilizada na PKU
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 33
maternal. Maxamaid XP (crianças) e Maxamum XP (mulheres) são
distribuídas pelo Ross Laboratories.
Esses produtos possuem uma quantidade reduzida ou são isentos de
fenilalanina, mas deveriam ser nutricionalmente balanceados quanto aos
outros aminoácidos. No entanto, uma análise mais aprofundada destes
produtos comerciais sob ponto de vista nutricional, demonstra não estarem de
acordo com as recomendações da FAOIWHO, algumas vezes encontram-se
excedendo os valores, ou apresentam quantidades inferiores as
recomendadas (ACOSTA, 1996; KRAUCH et aI., 1996).
Estas fórmulas contendo mistura de aminoácidos livres como fonte de
nitrogênio oferecem facilidade na prescrição e distribuição aos pacientes,
porém resultam em uma dieta dispendiosa, monótona e pouco palatável
(PRINCE et aI., 1997). Originam soluções hipertônicas, podendo acarretar
disfunção intestinal, resultando em um quadro de diarréia, devido a presença
de substâncias de baixo peso molecular (ADISI, 1989; ARAI et aI., 1986).
O f1avor desagradável dificulta a sua aceitabilidade. Desse modo, a
ingestão que deveria ocorrer em pequenas quantidades durante o dia é
freqüentemente realizada em uma única vez.
MONCH et aI., 1996 observaram que administrando a mistura de
aminoácidos em uma dose única a nove pacientes com PKU, estes
apresentavam um quadro clínico de vômitos, vertigem, náusea, dores de
cabeça e diarréia; diminuição dos níveis sangüíneos de glicose e lactose e
aumento dos níveis de insulina, levando a um estado de hipoglicemia pós
prandial e níveis altos de uréia no sangue.
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 34
Esses estudos sugerem que a mistura de aminoácidos deve ser
ingerida em pequenas porções durante o dia, sempre com outros alimentos
que contenham gordura e carboidratos. Quando os aminoácidos são
consumidos em grande quantidade, uma vez por dia, eles são utilizados
principalmente como fonte de energia e não para a síntese de proteínas
(FREITAS et aI., 1999; MONCH et aI., 1996; HERRMANN et aI., 1994).
Inicialmente, todas as fórmulas dietéticas definidas tinham aminoácidos
na forma livre como fonte de nitrogênio. A razão para isso é o conceito
clássico de absorção de proteína, o qual mantêm que as proteínas são
completamente hidrolisadas para aminoácidos livres no lúmen intestinal e que
apenas estes são transportados pela mucosa intestinal. Isso é bastante
discutido e há vários trabalhos que demonstram que esse conceito não é
válido (ADACHI etal., 1991; ADIBI, 1989).
Peptídeos podem ser melhor e mais rápido absorvidos do que
aminoácidos ou proteínas intactas de acordo com estudos em humanos e
animais. De fato, parece que depois de uma refeição protéica, os
constituintes das proteínas são absorvidos não como aminoácidos livres, mas
como dipeptídeos e tripeptídeos (SIEMENSMA et aI., 1993; ADIBI, 1989;
COOK, 1973).
Estudos em laboratórios, realizados com técnicas de perfusão
intestinal, têm mostrado que a taxa de absorção de aminoácidos de soluções
contendo dipeptídeos é muito maior em relação as que contêm aminoácidos
livres (ADIBI, 1989).
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 35
Isto se deve ao fato de que di e tripeptídeos podem ser diretamente
absorvidos no intestino por sistemas independentes daqueles usados pelos
aminoácidos, e a taxa máxima de captação na absorção de di e tripeptídeos é
maior do que o sistema transportador de aminoácidos (ROBERTS et aI.,
1999; TRAHMS, 1991; ADIBI, 1989; MATTHEWS, 1977; ADIBI, 1976).
Estudos têm mostrado que ratos crescem mais rapidamente quando
alimentados com dietas peptídicas, quando comparados à dietas com
proteína intacta, ou baseada em aminoácidos livres (ZALOGA et aI., 1991).
Portanto, a administração de produtos a base de pequenos peptídeos,
como hidrolisados protéicos enzimáticos, parece beneficiar clinicamente os
pacientes com PKU (CORDLE, 1994).
Os peptídeos são menos hipertônicos que as misturas de aminoácidos
livres, e a administração destes na alimentação enteral, como fonte de
nitrogênio, melhora a taxa de absorção e reduz problemas osmóticos (ADIBI,
1989).
Outra vantagem para o uso de hidrolisados protéicos é uma
aceitabilidade melhor que as misturas de aminoácidos livres, no que diz
respeito ao flavor (SILK et aI., 1982). Hidrolisados protéicos também
apresentam um potencial antigênico reduzido (SIEMENSMA et a/., 1993).
Além disso, a presença de carboidratos no lúmen intestinal interfere bem
menos no transporte dos dipeptídeos que no dos aminoácidos livres
(COOK,1972).
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 36
Portanto, é de interesse desenvolver hidrolisados protéicos com
peptídeos de alto peso molecular e de baixo teor de fenilalanina em
substituição à mistura de aminoácidos livres.
2.3- SUPORTE NUTRICIONAL NA ENCEFALOPATIA HEPÁTICA
A encefalopatia hepática ou também designada coma hepático, ou
encefalopatia portossistêmica é uma doença encontrada em pacientes com o
fígado gravemente danificado, particularmente naqueles que apresentam
cirrose avançada ou desvios vasculares entre os sistemas da veia porta e
cava. Pode ter curso agudo, reversível ou crônico. Casos de maior gravidade
podem levar ao coma irreversível e morte (SCHARSCHMIDT, 1997).
A etiologia da encefalopatia ainda é desconhecida. O fator significativo
na fisiopatologia da doença é o mau funcionamento das células hepáticas. A
inadequada remoção dos compostos nitrogenados e outras substâncias do
trato gastrointestinal e o desvio do sangue para a circulação sistêmica são
responsáveis pela origem do termo encefalopatia portossistêmica.
Os sinais de encefalopatia ou coma hepático incluem confusão mental,
apatia, mudanças de comportamento, contrações musculares, como asterixe
(tremor das mãos quando estendidas à frente do tórax) e espasticidade.
Durante a doença hepática, a capacidade de tolerância a glicose e aos
Iípides encontra-se diminuída, provavelmente pela disfunção hormonal, e a
intolerância à proteína é principalmente manifestada nos casos de
encefalopatia hepática (FISCHER e BOWER, 1981).
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 37
Hiperamonemia e a presença de falsos neurotransmíssores, como
octopamina, podem ser responsáveis pela encefalopatia hepática.
Quando o nível de amônia sérica está elevado, esta entra na circulação
sistêmica, aumentando a amônia do sangue e causando intoxicação do
Sistema Nervoso Central, porém a sua correlação com o grau de encefalopatia
ainda é pequeno (FISCHER e BOWER, 1981).
Uma outra proposta na exploração da etiologia da encefalopatia
hepática envolve os neurotransmissores no cérebro, como acetilcolina,
serotonina e catecolaminas e aqueles aminoácidos que são seus precursores.
Níveis anormalmente altos de aminoácidos aromáticos levam à
formação de falsos neurotransmissores, responsáveis pelo agravamento do
quadro neurológico e psiquiátrico. Estes aminoácidos dependem do fígado
para o seu catabolismo. Não sendo metabolizados, acumulam-se,
atravessando a barreira hematoencefálica, agindo como falsos
neurotransmissores (FISCHER et aI., 1976).
Outros produtos do metabolismo podem contribuir para o
desenvolvimento da encefalopatia hepática, tais como metilmercaptano,
composto derivado do metabolismo intestinal da metionina, ácidos graxos de
cadeia curta e compostos fenólicos (AUGUSTO, 1993).
2.3.1- TRATAMENTO DA ENCEFALOPATIA HEPÁTICA
O suporte nutricional é uma importante etapa no tratamento para manter
a função hepática e promover a regeneração do tecido.
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 38
Os objetivos do cuidado nutricional na encefalopatia hepática visam a
regeneração do fígado, focalizando os seguintes pontos: a) evitar o
catabolismo protéico para não haver aumento de amônia; 2) diminuir o
substrato para a formação de falsos neurotransmissores e 3) diminuir o
substrato para a síntese da uréia (AUGUSTO et aI., 1993).
O aporte protéico é diminuído e quando não há sinais de coma, é
importante uma avaliação da amônia sérica (limite superior 8J.tg/mL sangue).
Quando há sinais e sintomas de intoxicação por amônia (asterixe), a ingestão
de proteínas deve ser reduzida para 30 a 40 g/dia ou mesmo totalmente
eliminada. Quando o paciente começa a melhorar, eleva-se gradualmente a
ingestão protéica (TRAHMS, 1991).
Outro protocolo de conduta para a encefalopatia é a administração, oral
ou enteral, de soluções que contenham uma alta quantidade de aminoácidos
de cadeia ramificada (AACR), valina, leucina e isoleucina e sejam pobres em
aminoácidos aromáticos (AAA), fenilalanina e tirosina (FISCHER e BOWER,
1981; FISCHER et aI., 1976).
Segundo FISCHER e BOWER, 1981, os AACR melhoram o quadro de
encefalopatia hepática pela: promoção da síntese de proteína pelo músculo,
aumento da captação e incorporação de aminoácidos aromáticos pelo
músculo, diminuição dos níveis de aminoácidos aromáticos intracerebral
através da competição pelo sistema de transporte comum da barreira
hamatoencefálica e aumento na síntese hepática.
A relação AACRlAAA na proteína da dieta mostrou uma excelente
correlação com o grau de encefalopatia. FISCHER et aI. (1976) observaram
Renata Alexandra Moreira das Neves
REVISÃO DA LITERATURA 39
que quando a relação AACR/AAA era igual a 3,0 ou 3,5, havia uma melhora na
encefalopatia.
Proteínas parcialmente hidrolisadas, com alto teor de AACR e um
conteúdo baixo de AAA, vem sendo estudadas para serem utilizadas por
pacientes com encefalopatia. Enzimas específicas para AAA, com a finalidade
de liberá-los da proteína, membranas de ultrafiltração e géis com
características hidrófobas foram utilizados para diminuir a quantidade de AAA
nos hidrolisados (BAUTI8TA et aI., 1996; ADACHI et ai., 1991; TANIMOTO et
ai., 1991).
Renata Alexandra Moreira das Neves
OBJETIVOS 40
3- OBJETIVOS
o nosso estudo teve a finalidade de:
• Caracterizar os hidrolisados enzimáticos de peixe, quanto aos
aspectos químicos, físico-químicos e nutricionais;
• Propor a aplicação desses hidrolisados, visando atender grupos
populacionais que necessitem de uma alimentação especial.
Renata Alexandra Moreira das Neves
MATERIAIS E MÉTODOS 41
4 - MATERIAIS E MÉTODOS
4.1- MATERIAIS
4.1.1- AMOSTRA
Foram utilizados hidrolisados enzimáticos de "minced" produzidos a
partir da mistura de pescados de água salgada: Maria-Luíza (Paralonchurus
brasiliensis) , Perna-de-Moça (Pescada do gênero Cynoscion) e Camarão
(Penaus brasiliensis e Penaus pauliénsis), desossados, sem pele e vísceras,
lavados, prensados para remoção da água, sem adição de crioprotetores,
obtidos de acordo com procedimentos padronizados em trabalho anterior (DE
MIRA, N.V.M. et aI, 2000).
As amostras de "minced" de cerca de 2 Kg/mês, durante hum ano
(Junho/97-Maio/98), foram gentilmente doadas pela empresa TAKAKI Cia.
Ltda. localizada em Suzano, Estado de São Paulo. As amostras recebidas
foram homogeneizadas em triturador, liofilizadas e congeladas até o momento
de uso.
Renata Alexandra Moreira das Neves
MATERIAIS E MÉTODOS 42
4.1.2 - REAGENTES
Enzimas: As enzimas relacionadas na tabela 5 foram adquiridas da
Sigma Chemical Company, St. Louis.
- dos hidrolisadbttilizadTabela 5- E em'!ENZIMA ATIVIDADE ESPECIFICIDADE
Protease fúngica de Aspergillus oryzae 0,6 unidades Ampla especificidade,tipo 11 (P-4755) Img sólido principalmente Arg-,
Leu-COOHPepsina da mucosa de estômago de 2100-2800porco, 1:60000 (P-7012) unidades/mg Grupos -COOH e -NHz
sólido dos aas aromáticos, ePepsina da mucosa de estômago de 800-2500 Leu-, Asp-, Glu- COOHporco, 1:10000 (P-7000) unidades/mg
proteínaProtease bacteriana de Streptomyces 4 unidades I mg Ampla especificidadegriseus, tipo XIV (C-5147) de sólido
a-Quimotripsina de pâncreas bovino, 40-60 unidades I Phe-, Tyr-, Trp-COOHtipo /I (C-4129) mg de proteína
Bromelina, extraída do abacaxi (B-2252) 1190 unidades I Lys-, Arg-, Phe-, Tyr-mg de sólido COOH
Todos os reagentes e padrões para cromatografia foram obtidos da
Beckman Inst., Paio Alto, CA.
Materiais especiais: Filtros com membranas de exclusão por peso
molecular (Centricon concentrators - AMICON, INC., Beverly, MA);
Membrana de filtração com poros de 0,22 Ilm da Millipore Corporation.
Todos os demais reagentes utilizados foram de grau analítico.
Renata Alexandra Moreira das Neves
MATERIAIS E MÉTODOS 43
4.2 - MÉTODOS
4.2.1- PREPARAÇÃO DO HIDROLlSADO PROTÉICO
o processo de obtenção dos hidrolisados protéicos foi realizado
conforme procedimento padronizado em nosso laboratório em trabalho
anterior, apresentado na figura 2.
Figura 2- Fluxograma do processo de preparação do hidrolisado de pescado.
"MINCED" DE PESCADOLIOFILIZADO
IRESSUSPENSÃO EM
ÁGUA
ITRATAMENTO TÉRMICO
(95°C, 30 MIN)
IHIDRÓLISE COM SISTEMA SEQUENCIAL DE
ENZIMAS (CONDIÇÕES ÓTIMAS, 5HS)
IINATIVAÇÃO ENZIMÁTICA
(AQUECIMENTO À 95°C, 10 MIN)
ICENTRIFUGAÇÃO
(13.292 x 9, 40 MIN)
ISOBRENADANTE
(HIDROLISADO PROTÉICO DE "MINCED"
Renata Alexandra Moreira das Neves
IPRECIPITADO
MATERIAIS E MÉTODOS 44
Foi utilizada uma relação substrato/água de 2,5 g "minced"
liofilizado/50 ml de água na preparação do hidrolisado. Essas amostras
foram aquecidas por 30 minutos em água fervente, para desnaturação das
proteínas, e resfriadas em banho de gelo.
A hidrólise foi realizada utilizando um sistema seqüencial de duas
enzimas, com especificidades diferentes, de modo que pelo menos uma das
enzimas apresentasse especificidade para aminoácidos aromáticos
(pepsina, bromelina e a-quimotripsina), com a finalidade de liberar a
fenilalanina presente no substrato, conforme apresentado na tabela 6.
Tabela 6 - Sistemas enzimáticos utilizados para a obtenção dos hidrolisados- ____ • --.---- ..... -- ,""",o -..-.. ___ ••• _. _ •• ___
Ensaio Sistema Condições das reaçõesEnzimático E:S pH T (OC) Tempo(h) GH
(p/p) Enzima1/Enzima2
H1 Pepsina 1:10.000/ 1:100 / 2,0/ 45 3/2 8,1%Bromelina 1:100 4,5
H2 Pepsina 1:60.000/ 1:100/ 2,0/ 45 3/2 9,3%Bromelina 1:100 4,5
H3 Pepsina 1:10.000/ 1:100/ 2,0/ 37 3/2 9,8%Quimotripsina 1:100 8,0
H4 Pepsina 1:10.000/ 1:1001 2,01 37/ 3/2 7,8%Asper.qi/lus oryzae 1:100 8,0 45
H5 Pepsina 1:60.000/ 1:100 1 2,0/ 37 3/2 33,3%Streptomyces 1:100 6,0griseus
H6 Pepsina 1:10.000/ 1:100/ 2,0/ 37 3/2 17,2%Streptomyces 1:200 6,0qriseus
Todos os ensaios foram realizados nas condições ótimas de pH e
temperatura de cada enzima (o pH foi corrigido com soluções de NaOH 1 N
ou Hei 1N), por um período de cinco horas.
Renata Alexandra Moreira das Neves
MATERIAIS E MÉTODOS 45
Durante o período da hidrólise, as amostras foram mantidas sob
agitação constante. Após cinco horas, os hidrolisados foram aquecidos à
95°C por 10 min para inativação enzimática.
Obtivemos o sobrenadante e o precipitado, por centrifugação, à 13292
x g, por 40 min, separando o resíduo insolúvel (precipitado) do hidrolisado
(solúvel). O precipitado foi descartado e o sobrenadante foi liofilizado para
análise da composição química.
4.2.2 - DETERMINAÇÃO DO GRAU DE HIDRÓLlSE
O grau de hidrólise foi considerado como sendo o número de
aminoácidos livres formados durante o rompimento das ligações peptídicas
em relação ao número total de aminoácidos existentes na amostra.
Teoricamente, 19 de proteína origina pela hidrólise 1118,9 mg de
equivalentes de leucina. O valor encontrado foi considerado como 100% de
hidrólise, ou seja:
11gproteína =1118,9 mg equivalentes de leucina =100%1
O cálculo é o seguinte:
19 proteína = (131,2 x n1) + 18 x(n1- 1) = 100%
Onde:n1 =1000 mg proteína =7,62 x 10-3
131,2
131,2 = peso molecular da leucina
18,0 = peso molecular da água
Renata Alexandra Moreira das Neves
MATERIAIS E MÉTODOS 46
4.2.3 - SEPARAÇÃO DAS FRAÇÕES PEPTíDICAS POR FAIXA DE
PESO MOLECULAR
o isolamento das frações peptidícas por faixa de peso molecular foi
realizado por ultracentrifugação em membrana de exclusão por peso
molecular, utilizando "Centricon concentrators" (Amicon), de acordo com as
instruções do fabricante.
Peptídeos maiores que 30, entre 30 e 10 e 10 e 3 e menores que 3
KDa foram obtidos, utilizando membrana de exclusão molecular de 30 Kd, 10
Kd e 3 Kd, respectivamente.
4.2.4- MÉTODOS ANALíTICOS
4.2.4.1- ANÁLISE DO TEOR DE u-AMINONITROGÊNIO
A quantidade de nmoles de equivalentes de leucina nas amostras foi
obtida segundo método descrito por HOLT e SOSULSKI,1981, com algumas
modificações. A reação baseia-se na formação de uma coloração azul pela
reação da ninhidrina com compostos que possuem grupos amina livres. Para
a análise, acrescenta-se a 0,1 mL da amostra, 1,0 mL de solução de
ninhidrina. Os tubos são fechados com papel alumínio, para impedir a
evaporação e levados a banho-maria fervente por exatamente 20 minutos,
sendo resfriados em banho de gelo. Adiciona-se 5,0 ml de etanol 50%,
agitando os tubos vigorosamente. A absorbância é lida à 570 nm em
espectofotômetro (Beckman DU-70®) contra um branco, até 30 minutos após
a adição de etano!. Utiliza-se uma curva padrão de L-Leucina nas
Renata Alexandra Moreira das Neves
MATERIAIS E MÉTODOS 47
concentrações de 0.5 mM; 1,0 mM; 1,5 mM e 2,0 mM. Os resultados são
expressos em nmoles de equivalentes de leucina por 9 de proteína.
4.2.4.2- ANÁLISE DE AMINOÁCIDOS
o perfil de aminoácidos foi determinado nos hidrolisados e nas frações
peptídicas isoladas.
A análise de aminoácidos foi realizada após hidrólise ácida das
amostras com HCI 6 N por 22 horas à 110°C, em ampolas seladas à vácuo.
Evaporou-se os hidrolisados para remoção do HCI em dessecador à vácuo
contendo pastilhas de NaOH. O resíduo seco foi ressuspenso em tampão
citrato pH 2.2 (Na-S, Beckman Instr., Paio Alto, CA). As amostras foram
filtradas por membranas de 0.22 !J.m e convenientemente diluídas com
tampão citrato (SPACKMAN et aI., 1958).
Os aminogramas foram obtidos por cromatografia em troca iônica em
autoanalisador de aminoácidos marca Beckmam modelo 7300, acoplado a
uma interface analógica Beckman, modelo 406 (Goldsystem) e equipado com
coluna de 200 mm de comprimento contendo resina de troca iônica de sódio e
operando em condições definidas pelo fabricante, para hidrolisados protéicos.
A reação dos aminoácidos com a ninhidrina ocorre pós - coluna,
sendo a intensidade de cor medida em colorímetro. As áreas dos picos do
aminograma foram comparadas as áreas dos picos de uma mistura padrão de
aminoácidos.
Renata Alexandra Moreira das Neves
MATERIAIS E MÉTODOS 48
4.2.4.3- ANÁLISE DA COMPOSiÇÃO CENTESIMAL DOS
HIDROLlSADOS
A composição química foi determinada de acordo com métodos padrão
AOAC, 1995. A análise do teor de nitrogênio foi realizada de acordo com o
método de micro-Kjeldahl e o resultado multiplicado por 6,25 para conversão
em proteína. A umidade foi determinada por secagem em estufa à 105°C, até
peso constante. As cinzas, foram determinadas, por incineração em mufla a
550°C. Lipídeos foram determinados pela extração com solventes orgânicos,
como éter etílico, num extrator intermitente como o aparelho de Soxhlet.
Renata Alexandra Moreira das Neves
RF~TTTTAnn~ E DISCUSSÃO
5· RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1- COMPOSiÇÃO QUíMICA DO "MINCED" E DOS
HIDROL/SADOS
A composição dos seis hidrolisados, liofilizados, é apresentada na
tabela 7. Comparativamente é apresentada a composição do "minced" de
pescado homogeneizado e liofilizado.
AMOSTRA COMPOSiÇÃO QUíMICA
Proteína Lípides Umidade Cinzas(9/1009 amostra seca)
Tabela 7 - Composição química do "minced" e dos seis hidrolisadosprotéicos após liofilização.
"MINCED" 90,3 0,8 0,3 2,9
H1 Pepsina 1:10.000/ 71,6 ± 0,4 0,9 ± 0,1 4,5 ± 0,2 14,2 ± 0,0Bromelina
H2 Pepsina 1:60.000/ 74,6 ± 0,1 1,0 ± 0,0 5,7 ± 0,1 16,2 ± 0,4Bromelina
H3 Pepsina 1:10.000/ 75,7 ± 0,8 1,7 ± 0,2 4,1 ± 0,3 14,1 ± 0,0Quimotripsina
H4 Pepsina 1:10.000/ 72,2 ± 0,1 0,8 ± 0,2 4,4 ± 0,3 17,3 ± 0,3Aspergil/us oryzae
H5 Pepsina 1:60.000/ 72,9 ± 0,0 1,3 ± 0,2 4,1 ± 0,1 17,9 ± 0,2Streptomyces griseus
H6 Pepsina 1:10.000/ 77,9 ± 0,4 1,6 ± 0,4 4,3 ± 0,1 10,2 ± 0,3Streptomyces griseus
Resultados correspondem a média dos valores obtidos em triplicata.
O teor de proteína (N x 6,25) apresentou-se alto, variando entre 71,6
(H1) a 77,9% (H6) e tanto o "minced" quanto os hidrolisados apresentaram
um baixo teor de Iípides, que é um aspecto favorável para minimizar a
oxidação Iipidica, aumentando a estabilidade desses hidrolisados ao
armazenamento e mantendo a qualidade sensorial por mais tempo. Da
mesma forma, um alto teor Iipidíco poderia prejudicar também a sua
Renata Alexandra Moreira das Neves
RESULTADOS E DISCUSSÃO 50
utilização em algumas formulações de produtos (SYNOWIECKI,2000;
SHAHIDI,1995; MACKIE, 1982).
A baixa concentração lipídica, inferior ao teor original dos peixes que
deram origem ao "minced" é devida aos ciclos de lavagens empregados no
processamento do "minced" para remoção das proteínas sarcoplasmáticas,
gordura e outras substâncias indesejáveis como sangue e outros pigmentos
(PARK,1997).
Após a secagem, o teor residual de umidade nas amostras foi baixo,
variando entre 4,1 (H3 e H5) a 5,7% (H2). O conteúdo de resíduo mineral
fixo nos hidrolisados variou de 10,2 (H6) a 17,9% (H5). Esse elevado teor
em relação ao "minced", pode ser explicado pela adição de soluções como
HCI ou NaOH, para controle do pH da reação de hidrólise (L1ASET et ai,
2000; L1CEAGA-GESUALDO, 1999; DINIZ, 1997).
Renata Alexandra Moreira das Neves
RESULTADOS E DISCUSSÃO 51
5.2- RENDIMENTO DOS HIDROL/SADOS ENZIMÁTICOS
A recuperação do nitrogênio nos hidrolisados, em relação ao conteúdo
de nitrogênio no "minced", foi utilizada para descrever o rendimento do
hidrolisado. A tabela 8 mostra a variação na quantidade de proteína
recuperada após os seis ensaios enzimáticos realizados.
. hidrolisadt' .R- - . ------ .... -.-y---- r-----'--- ---- ---- -- -- ._.... -----Hidrolisado % Proteína I % Proteína I%GH
insolúvelsolúvel lNx6 25)
H1 Pepsina I Bromelina 75,7±O,9 24,4 ±0,9 8,1
H2 Pepsina I Bromelina 63,4 ±4,8 36,6 ±4,8 9,3
H3 Pepsina I Quimotripsina 84,2 ±O,1 15,8 ±0,1 9,8
H4 Pepsina I AspergJ1lus oryzae 63,7 ±2,4 36,4 ±2,4 7,8
H5 Pepsina I Streptomyces griseus 94,2 ±O,8 5,9 ±0,8 33,3
H6 Pepsina I Streptomyces griseus 89,0 ±O,6 11,0 ± 0,6 17,2
Tabel
Resultados correspondem a média dos valores em triplicata.
A porcentagem de proteína recuperada variou de acordo com o
sistema enzimático empregado no processo de hidrólise. Os hidrolisados 5 e
6, obtidos pela ação das enzimas pepsinalStreptomyces griseus
apresentaram rendimento elevado, onde o resíduo insolúvel representou no
máximo 11 % da proteína original.
Os hidrolisados 1,2 e 4 provenientes da ação da pepsinalbromelina, ou
da enzima pepsinalAspergillus oryzae, resultaram numa recuperação de
apenas 64 a 76% da proteína original.
O hidrolisado 3, obtido pela ação da pepsina/quimotripsina, apresentou
uma boa recuperação de proteína solúvel, da ordem de 84%, quando
comparado com os hidrolisados 1, 2 e 4, indicando que, apesar da enzima
Renata Alexandra Moreira das Neves
RESULTADOS E DISCUSSÃO 52
quimotripsina ter sido responsável por um reduzido grau de hidrólise, resultou
na solubilização de grande parte da proteína original.
Segundo L1ASET (2000), LAHL e BRAUN (1994) e MAHMOUD (1994),
o grau de hidrólise está positivamente relacionado a solubilidade da proteína.
Foi observado que o aumento no grau de hidrólise resultou em maior
solubilidade da proteína hidrolisada, embora o hidrolisado 2 tenha
apresentado uma diminuição da solubilidade em relação ao hidrolisado 1, que
talvez possa ser explicado por uma reação da plasteína.
Renata Alexandra Moreira das Neves
RESULTADOS E DISCUSSÃO 53
5.3- COMPOSiÇÃO EM AMINOÁCIDOS DOS HIDROLlSADOS E
COMPARAÇÃO COM REQUERIMENTOS DA FAO
Na tabela 9 estão apresentados os dados relativos a composição em
aminoácidos essenciais da amostra de "minced" e de todos os hidrolisados
obtidos, em comparação ao padrão da FAO (3-8 anos), 1991.
O perfil de aminoácidos essenciais do "minced" atende aos valores
recomendados pela FAO para crianças na idade pré-escolar (3-8 anos) e pela
FAO, 1990 para adultos, apresentando elevado conteúdo dos principais
aminoácidos essenciais. O "minced" também mostrou ser grande fonte de
metionina e lisina.
Observamos algumas variações nos perfis de aminoácidos dos
hidrolisados em relação ao "minced" que parece ser decorrente da
distribuição variável dos aminoácidos entre o hidrolisado e o resíduo protéico
insolúvel.
A separação da fração protéica insolúvel da fração solúvel do
hidrolisado, resultou em uma diminuição no conteúdo de certos aminoácidos
como a arginina, fenilalanina, histidina, metionina, prolina, serina, tirosina e
treonina, embora este decréscimo, parece não ter problema, pois a
concentração de aminoácidos essenciais continua atendendo às
necessidades da FAO. A redução da concentração de fenilalanina pode até
ser benéfica, quando o objetivo é obter um hidrolisado para pacientes
fenilcetonúricos.
Renata Alexandra Moreira das Neves
RESULTAnOS E DISCUSSÃO 54
Por outro lado, os hidrolisados apresentaram enriquecimento no
conteúdo de aminoácidos como a alanina, ácido aspártico, glicina e
glutâmico, quando comparados com a proteína original.
O aquecimento ao qual foi submetido o hidrolisado para inativação
enzimática, no final da hidrólise, também pode ter sido responsável pela
modificação na distribuição dos aminoácidos entre a fração solúvel e insolúvel
(NETTO e GALEAZZI, 1998).
Renata Alexandra Moreira das Neves
Tabela 9 - Conteúdo de aminoácidos do "minced" e dos hidrolisados obtidos e os requerimentos de aminoácidosÃJ
~~ essenciais, FAO 1990 e 1991.5.... C/.lo
AMINOÁCIDOS FAOb ~). "MINCED" H1 H2 H3 H4 H5 H6~ >-lx (9 aminoácidos I 100 9 proteína) (3-8 anos) Adultos ~o:3c- o...
Alanina 6,1 6,9 6,8 6,5 7,1 6,5 6,8o C/.l3= t'I1o
Arginina 7,6 6,8 6,5 6,2 6,3 6,2 6,3 tl...~
~r.....
Aspártico -1,3 10,5 10,6 10,9 11,1 10,8 11,0C/.l(jc- c::o
li>
Fenilalanina 4,2 3,1 3,3 3,6 2,9 3,8 3,4 C/.lz C/.l~ ;l>'~ Glicina 3,4 4,4 4,2 4,0 4,2 4,2 4,2 o
Glutâmico 14,7 19,6 19,5 19,5 21,1 18,9 19,8Histidina ~~, 1 2,2 2,2 2,2 2,1 2,1 2,1 1,9 1,6Isoleucina 4,8 4,1 4,4 4,7 4,4 5,0 4,8 2,8 1,3Leucina 8,8 8,5 8,6 8,6 8,7 8,7 8,7 6,6 1,9
Usina 10,3 10,6 10,4 9,9 10,2 9,8 10,1 5,8 1,6Metionina 3,5 3,0 3,1 3,1 2,3 3,0 2,6 2,Sa 1 7 a,Prolina 6,7 3,5 3,4 3,2 3,1 3,3 3,3Serina 4,2 3,9 3,9 3,9 3,9 4,0 3,9Tirosina 4,0 2,9 3,3 3,5 2,7 3,6 3,2Triptofano n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 1,1 O,STreonina 6,1 4,7 4,7 4,8 4,8 4,8 4,9 3,4 0,9
Valina 5,3 5,2 5,2 5,3 5,1 5,4 5,1 3,S 1,3Tirosina IFenilalanina 8,2 6,0 6,6 7,1 5,6 7,4 6,6 6,3 1,9
aEsse valor corresponde a metionina + cistina; bFAO, 1991; Resultados correspondem a média dos valores obtidos em duplicata.II
VlV'l
RESULTADOS E DISCUSSÃO 56
5.4- RELAÇÃO DE FISCHER NOS HIDROLlSADOS
Os hidrolisados 1 e 4 apresentaram uma relação de Fischer de 3,0 e
3,3, respectivamente, sendo de interesse especial para a utilização clínica no
tratamento de pacientes com encefalopatia hepática. Estes pacientes se
beneficiam com proteínas contendo peptídeos curtos e uma alta relação de
Fischer (teor total aminoácidos de cadeia ramificada I teor total aminoácidos
aromáticos). A partir dos primeiros sintomas de melhora do paciente,
recomenda-se um aumento gradual na ingestão de proteínas por via oral,
porém mantendo por algum tempo uma relação de Fischer, de 2: 1. Os
hidrolisados 2, 3, 5 e 6 atenderam à essas necessidades, apresentando uma
relação 2:1 (FISCHER et aI., 1976).
Tabela 10- Relação de Fischer nos hidrolisados enzimáticos de "minced"H1 H2 H3 H4 H5 H6
(g aminoácido 1100 g proteína)
Aminoácidos deCadeia ramificada(AACR)
Isoleucina 4,1 4,4 4,7 4,4 5,0 4,8Leucina 8,5 8,6 8,6 8,7 8,7 8,7Valina 5,2 5,2 5,3 5,1 5,4 5,1
Aminoácidosaromáticos (AAA)
Fenilalanina 3,1 3,3 3,6 2,9 3,8 1 3,4Tirosina 2,9 3,3 3,5 2,7 3,6 3,2
AACR totais 17,8 18,2 18,6 18,2 19,1 18,6
AAA totais 6,0 6,6 7,1 5,6 7,4 6,6
Relação de
Fischer3,0 2,8 2,6 3,3 2,6 2,8
Resultados correspondem à média dos valores em duplicata.
Renata Alexandra Moreira das Neves
RESULTADOS E DISCUSSÃO 57
5.5- DISTRIBUIÇÃO PERCENTUAL DOS PEPTíOEOS COM
DIFERENTES PESOS MOLECULARES
O tamanho molecular dos peptídeos resultantes da hidrólise foi
avaliado por um processo de ultrafiltração com membranas de exclusão
molecular de 30, 10 e 3 KDa. As frações isoladas foram hidrolisadas em meio
ácido e foi determinado o teor total de aminogrupos existentes em cada
fração. A distribuição percentual em cada hidrolisado é apresentada na figura
3.
Figura 3- Distribuição do peso molecular dos peptídeos nos hidrolisadosenzimáticos
~ 70:. 60o ... 50'O IVo :i 40!lU (.)
.~ ~ 30~ o~ :e 20...'tii 10c O~o
H1 H2 H3 H4 H5 H6
o> 30 KDa
.30 -10 KDa
10 - 3 KDA
Hidrolisados
Resultados correspondem à média dos valores obtidos em triplicata.
Os hidrolisados 1 e 2 mostraram perfis bastante semelhantes, com
predominância de peptídeos com pesos moleculares inferiores a 10 KDa.
Nesses hidrolisados, 78 e 68% dos peptídeos, respectivamente,
apresentaram pesos moleculares inferiores a 10 KDa, apesar do reduzido
grau de hidrólise.
No hidrolisado 3, correspondente à ação da pepsina seguida de
quimotripsina, a distribuição de peso molecular foi completamente diferente;
Renata Alexandra Moreira das Neves
RESULTADOS E DISCUSSÃO 58
devido à especificidade das duas enzimas, houve predominância de
peptídeos grandes, sendo que 40% possuíam peso molecular igualou
superior a 30 KDa.
O hidrolisado 4, pepsinalAspergíllus oryzae apresentou pesos
moleculares extremos: 62% de peptídeos com peso molecular inferior a 10
KDa, e 35% de peptídeos com peso molecular igualou superior a 30 KDa.
Como era de se esperar, o hidrolisado 5, obtido pela ação da Pepsina
seguida da enzima de Streptomyces griseus, além do elevado grau de
hidrólise, apresentou também a maior porcentagem de pequenos peptídeos e
de aminoácidos livres, sendo que 86% do hidrolisado correspondeu a pesos
moleculares inferiores a 10 KDa e destes, 58% a pesos moleculares inferiores
a 3 KDa.
Devido ao elevado custo da enzima, proveniente de Streptomyces
griseus, testamos uma menor concentração da mesma, utilizando uma
relação enzima:substrato de 1:200, correspondente ao hidrolisado 6. O perfil
de distribuição dos pesos moleculares, quando comparado ao hidrolisado 5
não foi mantido, observando-se uma distribuição equitativa entre as diversas
faixas de pesos moleculares testados.
O conhecimento do peso molecular dos peptídeos dos hidrolisados é
essencial para o desenvolvimentos de fórmulas nutricionais. Peptídeos com
pesos moleculares acima de 5KDa podem ser responsáveis por algum tipo de
alergia alimentar. Todos os hidrolisados apresentaram peptídeos com pesos
moleculares maiores que 30 KDa, não podendo ser utilizados, como um todo,
por pacientes com alergias alimentares.
Renata Alexandra Moreira das Neves
RESULTADOS E DISCUSSÃO 59
5.6- PERFIL DE AMINOÁCIDOS DAS FRAÇÓES PEPTíDICAS DOS
DIVERSOS HIDROLlSADOS
Foi determinada a distribuição percentual de cada aminoácido nos
hidrolisados de 1 a 6, bem como das frações de diferentes pesos moleculares
destes hidrolisados, com o objetivo de verificar se houve uma variação no
perfil de aminoácidos, causada pela separação das frações.
Podemos verificar que a distribuição dos aminoácidos nas diversas
frações com pesos moleculares distintos assemelha-se ao perfil de
aminoácidos do hidrolisado total., conforme apresentado nas tabelas 11a e 11
b.
No entanto, em relação à histidina e a metionina foram observadas
variações cuja extensão deverá ser avaliada, ainda sob o ponto de vista de
significância nutricional, se as frações forem utilizadas individualmente.
Renata Alexandra Moreira das Neves
1<3l'l
~~
~::sO-a~o...l'l
~r
azl'l
~
Tabela 11 a- Perfil de distribuição de aminoácidos no hidrolisado total e nas frações peptídicas obtidas a partir dos
hidrolisados H1 (Pepsina 1:10.000/Bromelina), H2 (Pepsina 1:60.000/Bromelina)e H3 (Pepsina 1:10.000/Quimotripsina) 1.
H1 H2 H3(Pepsina 1:10.000/ (Pepsina 1:60.000/ (Pepsina 1:10.000/ Quimotripsína)
Bromelina) Bromelinal
Peso Molecular em KDa Peso Molecular em KDa Peso Molecular em KDa
H1 >30 30 10 10 ~ <~ I-l? >~n ~n .1n 1n .3 < ~ H1 >30 30 10 10 3 <3
Aminoácidos % nmoles % nmoles % nmolesAlanina 9,9 9,7 8,9 9,8 10,3 9,8 9,3 9,5 9,4 10,5 9,5 9,6 7,8 10,3 8,8
Arginina 5,0 5,0 4,0 5,0 4,9 4,8 4,9 4,6 5,0 4,9 4,6 4,6 4,4 5,1 4,8
Aspártico 10,2 10,3 9,7 10,6 9,2 10,3 10,4 10,3 10,6 9,5 10,7 10,3 11,0 11,5 9,1
Fenilalanina 2,4 2,4 2,1 2,4 2,6 2,6 2,6 2,5 2,6 2,9 2,8 2,6 2,4 2,8 4,1
Glicina 7,6 7,5 7,5 7,6 7,3 7,2 7,1 7,6 6,6 7,0 6,8 7,1 5,9 7,8 5,6
Glutamina 17,2 17',2 15,8 17,0 17,0 17,1 17,1 16,6 16,9 17,3 17,2 16,3 18,3 18,6 13,6
Histidina 1,8 1,4 - 2,4 4,6 1,8 1,4 5,0 0,3 1,6 1,9 4,0 2,6 - -lsoleucina 4,1 3,9 3,5 3,8 3,7 4,4 4,2 4,0 4,2 4,0 4,6 4,0 4,6 4,4 4,1
Leucina 8,3 8,1 7,1 8,0 8,7 8,4 8,3 7,8 8,4 9,3 8,5 7,9 8,6 8,5 9,3
Usina 9,4 9,2 8,5 9,2 7,8 9,1 9,0 8,7 9,5 7,7 8,8 8,6 8,7 8,8 6,4
Metionina 2,6 2,6 2,0 2,8 3,0 2,6 2,"1 2,6 2,7 3,1 2,6 1,7 4,4 3,1 3,8
Prolina 4,0 5,3 4,4 4,8 3,4 3,8 5,2 4,0 6,4 3,6 3,6 5,9 3,7 1,5 -Serina 4,8 5,1 4,8 4,8 4,9 4,8 5,2 4,4 5,3 5,1 4,8 5,1 5,0 4,1 6,1
Tirosina 2,1 2,3 2,0 2,2 2,4 2,3 2,4 2,4 2,4 2,7 2,5 2,4 2,5 2,7 3,6
Treonina 5,1 4,8 4,5 4,7 4,8 5,1 4,9 4,7 4,6 5,1 5,2 4,9 4,1 5,3 5,1
Valina 5,7 5,3 5,4 5,1 5,5 5,7 5,4 5,3 5,3 5,7 5,8 5,0 6,0 5,3 5,8
Total 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100:r---
Resultados expressos como % de cada aminoácido em relação ao conteúdo total de aminoácidos na fração analisada.
~V2
~E;oV2
tIlt:l......V2(j
CV2V2;J>lo
0\o
fó»~
~::oQ.
Ó3:o~ã'Q.
"'"z~
~
Tabela 11 b- Perfil de distribuição de aminoácidos no hidrolisado total e nas frações peptídicas obtidas a partir dos
hidrolisados H4 (Pepsina 1:10.000/Aspergillus oryzae), H5 (Pepsina 1:60.000/Streptomyces griseus) e H6 (Pepsina
1:10.000/Streptomyces griseus) 1.
H4 H5 H6(Pepsina 1:10.000/ (Pepsina 1:60.000/ Streptomyces (Pepsina 1:10.000/
Aspergillus oryzae) griseus) Streptomyces griseus )
Peso Molecular em KDa Peso Molecular em KDa Peso Molecular em KDa
H1 >:\0 :\0-10 10-3 <3 H1 >30 ::\0 -10 10 3 < 3 H1 >30 30 -10 10 3 <3Aminoácidos % nmoles % nmoles % nmolesAlanina 10,2 9,8 10,3 9,7 9,6 9,4 8,5 9,1 9,3 9,4 9,9 9,0 9,7 9,9 9,4
Arginina 4,6 5,0 5,0 4,8 5,1 4,6 4,8 4,6 4,4 4,6 4,7 4,8 4,9 4,6 4,7
Aspártico 10,8 10,5 10,1 11,8 10,4 10,5 13,0 10,7 10,8 9,9 10,7 11,1 10,6 10,1 9,4
Fenilalanina 2,3 2,2 1,0 2,5 2,7 2,9 2,7 2,6 2,5 3,3 2,6 2,7 2.3 2,4 3,5
Glicina 7,1 8,0 8,6 6,7 7,8 7,2 7,0 7,6 7.9 6,9 7,1 7,2 7,3 7,1 6,0
Glutamina 18,5 18,8 19,0 18,3 18,7 16,6 15,1 16,9 17,3 16,3 17,4 16,6 18,1 16,4 15,2
Histidina 1,8 1,6 3,4 0,5 1,8 1,8 1,6 2,2 4,6 1,7 1,7 3,8 1,2 1,7 3,9
Isoleucina 4,3 3,8 2,9 4,2 3,8 4,9 4,5 4,9 4,5 5,2 4,7 4,1 4,2 4,0 4,5
Leucina 8,6 7,8 7,6 8,4 8,1 8,6 7,9 7,9 7,4 9.7 8,6 8,1 7,7 7,5 10,3
Usina 9,0 9,6 11,2 9,6 10,0 8,6 8,6 8,5 8,1 8,6 8,9 8,6 8,6 8,6 8,1
Metionina 1,9 2,3 2,5 2,0 1,8 2,6 1,5 2,6 2,4 3,1 2,2 1,6 2,6 3,5 2,8
Prolina 3,4 4,2 3,1 3,9 ' 3,7 3,7 6,6 6,5 3,5 4,0 3,6 5,0 6,1 6,3 3,4
Serina 4,8 4,9 4,8 4,9 4,7 4,9 5,1 4,1 4,5 4,2 4,8 5,1 4,9 5,6 5,0
Tirosina 1,9 2,0 1,9 2,1 1,8 2,5 2,4 1,5 2,3 2,1 2,3 2,5 2,2 2,2 3,0
Treonina 5,2 4,6 4,3 5,2 4,6 5,2 5,0 4,5 4,9 4,5 5,3 5,2 4,6 4,2 5,1
Valina 5,6 5,0 4,1 5,4 5,4 6,0 5,4 5,9 5,6 6,5 5,7 4,9 5,1 5,9 5,6
Total 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
1 Resultados expressos como % de cada aminoácido em relação ao conteúdo total de aminoácidos na fração analisada.
§C/)
c
~oC/)
tno.....C/)
8C/)C/)
>.o
0\>-'
RESULTADOS E DISCUSSÃO 62
A distribuição da fenilalanina nos hidrolisados e em suas frações
isoladas, foi de interesse no nosso estudo, sendo apresentada na tabela 12.
Tabela 12 - Perfil de distribuição da fenilalanina nos hidrolisados totais e nas~
frações peptídicas obtidas a partir desses hidrolisados r
Peso Molecular (KDa)Total >30 30-10 10-3 <3
Hidrolisado % Fenilalanina (nmoles)H1 2,4 2,4 2,1 2,4 2,6H2 2,6 2,6 2,5 2,6 2,9H3 2,8 2,6 2,4 2,8 4,1H4 2,3 2,2 1,0 2,5 2,7
H5 2,9 2,7 2,6 2,5 3,3H6 2,6 2,7 2,3 2,4 3,5
'IResultados expressos como % de cada aminoácido em relação ao conteúdo totalde aminoácidos na fração analisada
As frações com pesos moleculares < 3KDa, dos hidrolisados 1 e 2
apresentaram uma pequena elevação da concentração de fenilalanina, em
relação ao hidrolisado total, possivelmente devido ao baixo grau de hidrólise
(8 e 9%), respectivamente.
Observamos que o hidrolisado 3 apresentou uma maior concentração
de fenilalanina (4,1%) e de tirosina (3,6%) na fração com peso molecular
inferior a 3 KDa, em relação ao hidrolisado total. A quimotripsina, uma das
enzimas utilizadas para a obtenção do hidrolisado 3, possui uma maior
afinidade por aminoácidos aromáticos, o que explica a liberação destes
aminoácidos aromáticos, apesar do baixo grau de hidrólise (9,8%), mostrando
que essa enzima é a mais indicada para liberar a fenilalanina. Este fato é
especialmente importante quando se procura remover a fenilalanina do
hidrolisado.
Renata Alexandra Moreira das Neves
RESULTADOS E DISCUSSÃO 63
Infelizmente, devido ao reduzido grau de hidrólise. esta fração «3
KDa) representa apenas 10% do hidrolisado total, não justificando. nestas
condições. um processo tecnológico para a remoção da fenílalanina.
A fração com peso molecular entre 30 e 10 KDa do hidrolisado 4
também apresentou uma concentração reduzida de fenilalanina, em relação
ao hidrolisado total e o rendimento protéico dessa fração também foi muito
reduzido, em torno de 4%.
Os hidrolisados 5 e 6 apresentaram a fração menor que 3KDa com
uma elevada concentração de fenilalanina em relação às demais frações.
Neste caso, ao contrário do que ocorreu nos hidrolisados 3 e 4, o elevado
grau de hidrólise (33 e 17%) parece ter sido responsável pela liberação da
fenilalanina. A fração < 3KDa, correspondeu a 57 e 28%, respectivamente, do
hidrolisado total.
Eventualmente, essa fração poderia ser submetida a um processo de
remoção da fenilalanina, para se tornar útil como fonte protéica para
pacientes fenilcetonúricos. Nesse caso, a cromatografia em gel (GPC) por
exclusão do peso molecular com Sephadex-G15, por exemplo, poderia ser
utilizada para remover a fenilalanina livre. Devido a natureza hidrofóbica do
Sephadex-G15, a fenilalanina, tirosina e triptofano (aminoácidos com
características hidrofóbicas) sofrerão um retardo durante a eluição, levando a
uma marcada redução no conteúdo destes aminoácidos (BAUTISTA et aI.,
1996; ADACHI et aI., 1991; TANIMOTO et aI., 1991; ARAI et aI., 1986;
YAMASHITA et aI., 1976).
Apesar do carvão ativo ser considerado um adsorvente inespecífico.
Renata Alexandra Moreira das Neves
RESULTADOS E DISCUSSÃO 64
ele têm sido descrito na literatura como um meio de adsorção para separar as
moléculas hidrofóbicas, reduzindo o sabor amargo do hidrolisado, removendo
impurezas e clarificando o hidrolisado, tornando-se próprio para este tipo de
aplicação. Posteriormente, o carvão poderia ser removido, por exemplo, por
técnicas de filtração (SYNOWIECK e AL-KHATEEBI, 2000; PEDERSEN,
1994; LOPEZ-BAJONERO et aI., 1991).
Renata Alexandra Moreira das Neves
CONCLUSÕES 65
6- CONCLUSÕES
~ Os hidrolisados apresentaram um rendimento variando entre 63,4 e
94,2%, dependendo do sistema enzimático utilizado. Os hidrolisados
liofilizados continham teores protéicos semelhantes entre si, em média
73,6% e um teor lipídico muito reduzido, da ordem de 1,4%.
~ Todos os hidrolisados apresentaram uma composição em aminoácidos
semelhante entre si, atendendo às recomendações da FAO 1991, para
crianças entre 3 e 8 anos e para adultos.
~ Os hidrolisados 1 e 4 são indicados para o tratamento de pacientes com
encefalopatia hepática, pois apresentaram uma relação de Fischer elevada,
de 3: 1, e uma elevada concentração de peptídeos pequenos.
~ O processo de ultrafiltração, com membranas de exclusão molecular,
mostrou ser um método de baixo custo e eficiente para separar as frações
peptídicas com diferentes pesos moleculares e pouco interferiu na
distribuição dos aminoácidos.
~ No hidrolisado 5, a fração com peso molecular menor que 3 KDa,
apresentou uma porcentagem elevada (57%) de peptídeos com baixo peso
molecular, podendo ser utilizada no tratamento de pacientes com alergias
alimentares.
~ P\lém de apresentar uma porcentagem alta de peptídeos com baixo peso
molecular, a fração < 3KDa (H5), apresentou uma elevada concentração de
fenilalanina, podendo ser submetida a um processo de remoção da
Renata Alexandra Moreira das Neves
CONCLUSÕES 66
fenilalanina, para posterior formulação de dietas para pacientes
fenilcetonúricos.
Renata Alexandra Moreira das Neves
CONCLUSÕES 67
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ACHOURI, A, ZHANG, W., SHIYING, X. Enzymatic hydrolysis of soy protein
isolate and effect of succinylation on the functional properties of resulting
protein hydrolysates. Food Res. Int., Amsterdam, v.31, p.617-623, 1999.
ACOSTA, P.B., YANNICELU, S., MARRIAGE, B., STEINER, R., GAFFIELD,
B., ARNOLD, G., LEWIS, v., CHO, S., BERSTEIN, L., PARTON, P.,
LESUE, N., KORSON, M. Protein status of infants with phenylketonuria
undergoing nutrition management. J. Am. Colt. Nutr., New York, v.18,
n.2, p.102-107, 1999.
ACOSTA, P.B. Recommendations for protein and energy intakes by patients
with phenylketonuria. Eur. J. Pediatr., Berlin, v.155, suppl.1, p.S121
S124, 1996.
ACOSTA, P.B. Nutrition support of maternal phenylketonuria. Semin.
Perinatol., New York, v.19, n.3, p.182-190, 1995.
ADACHI, S., KIMURA, Y., MURAKAMI, K., MATSUNO, R., YOKOGOSHI, H.
Separation of peptide groups with definite characteristics from enzymatic
protein hydrolysate. Agric. Biol. Chem., Tokyo, v.55, nA, p.925-932,
1991.
ADIBI, S.A Glycyl-dipeptides: new substrates for protein nutrition. J. Lab.
Clin. Med., St. Louis, v.113, n.6, p.665-673, 1989.
ADIBI, S.A Intestinal phase of protein assimilation in mano Am. J. Clin. Nutr.,
Bethesda, v.29, p.205-215, 1976.
ADLER-NISSEN, J. Enzyme hydrolysis of food proteins. England: Elsevier
Applied Science Publishers, 1986. 427p.
Renata Alexandra Moreira das Neves
CONCLUSÕES 68
ADLER-NISSEN, J., ERIKSEN, S., OLSEN, H.S. Improvement of the
functionality of vegetable proteins by controlled enzymatic hydrolysis. In:
BODWELL, C.E., PETIT, L., NIJHOFF, M., JUNK, W., eds. Plant
proteins for human food. The Hague, 1983. p.207-219. (Nutrition
sciences).
AMERICAN ACADEMY OF PEDIATRICS. Committee on Nutrition. Special
diets for infants with inborn errors of amino acid metabolism. Pediatrics,
Elk Grove Village, v.57, n.5, p.783-792, 1976.
ARAI, S., MAEDA, AM., MATASUMURA, M., HIRAO, N., WATANABE, M.
Enlarged-scale production of a low-phenylalanine peptide substance as a
foodstuff for patients with phenylketonuría. Agric. Biol. Chem., Tokyo,
v.50, n. 11, p.2929-2931, 1986.
ARAI, S., YAMASHITA, M., ASO, K., FUJIMAKI, M. A parameter related to
the plastein formation. J. Food Sei., Chicago, v.40, p.342-344, 1975.
ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTRY. Official methods
of analysis. 16.ed. Arlington: AOAC, 1995.
AUGUSTO, AL.P., ALVES, D.C., MANNARINO, I.C., GERUDE, M. Terapia
nutricional. São Paulo: Atheneu, 1993. 303p.
BAUTISTA, J., HERNANDEZ-PINZON, L, ALAIZ, M., PARRADO, J.,
MILLAN, F. Low molecular weight sunflower protein hydrolysate with low
concentration in aromatic amino acids. J. Agric. Food Chem., Columbus,
vA4, nA, p.967-971, 1996.
BINDELS, J.G., BOERMA, J.A Hydro/ysed cow's milk formulae. Pediatr.
Allergy Immunol., Copenhagen, v.5, n.3, p.189-190, 1994. [Letter,
comment].
Renata Alexandra Moreira das Neves
CONCLUSÕES 69
BREMER, H.J., ANNINOS, A, SCHULZ, B. Amino acid composition of food
products used in the treatment of patients with disorders of the amino acid
and protein metabolism. Eur. J. Pediatr., Berlin, v.155, suppl.1, p.S108
S114, 1996.
BRENTON, D.P., L1LBURN, M. Maternal phenylketonuria: a study from the
United Kingdom. Eur. J. Pediatr., Berlin, v.155, suppl.1, p.S177-S180,
1996.
BUZINCO, L., CANTANI, A, LONGHI, M.A, GIAMPIETRO, P.G.
Anaphylactic reactions to cow's milk whey protein hydrolysate (Alpha-ré,
Nestlé) in infant with cow's milk allergy. Ann. Allergy, Minneapolis, v.62,
p.333-335, 1989.
CALDERÓN DE LA BARCA, AM., RUIZ-SALAZAR, R.A, JARA-MARINI,
M. E. Enzymatic hydrolysis and synthesis of soy protein to imrpove its
amino acid composition and functional properties. J. Food Sei., Chicago,
v.65, n.2, p.246-253, 2000.
CARR, S.A, HEMLlNG, M.E., BEAN, M.F., ROBERTS, G.D. Integration of
mass spectrometry in analytical biotechnology. Anal. Chem., Columbus,
v.63, p.2802-2824, 1991.
CHEN, H.-M., MURAMOTO, K., YAMAUCHI, F. Structural analysis of
antioxidative peptides from soybean f3-conglycin. J. Agrie. Food Chem.,
Columbus, v.43, p.574-578, 1995.
CHIANG, W.D., CORDLE, C.T., THOMAS, R.L. Casein hydrolysate produced
using a formed-in-place membrane reactor. J. Food Sei., Chicago, v.60,
n.6, p.1349-1352, 1995.
Renata Alexandra Moreira das Neves
CONCLUSÕES 70
CHOBERT, J.M., BERTRAND-HARB, C., NICOLAS, M.G. Solubility and
emulsifying properties of caseins and whey proteins modified
enzymatically by tripsin. J. Agrie. Food Chem., Columbus, v.36, n.5,
p.883-896, 1988.
CLARK, B.J. Afier a positive Guthrie - what next? Dietary management for the
child with phenylketonuria. Eur. J. Clin. Nutr., Basingstoke, v.46, suppl.1,
p.S33-S39,1992.
CLEMENTE, A, VIOQUE, J., SANCHEZ-VIOQUE, R., PEDROCHE, J.,
BAUTISTA, J., MILLAN, F. Protein quality of chickpea (Cicer arietinum L.)
protein hydrolysates. Food Chem., Amsterdam, v.67, p.269-274, 1999.
COGAN, V., MOSHE, M., MOKADY, S. Debittering and nutritional upgrading
of enzymic casein hydrolysates. J. Sei. Food Agrie., London, v.32, p.459
466, 1981.
COLLlNS, J.E., LEONARD, J.v. The dietary management of inborn errors of
metabolism. Hum. Nutr. Appl. Nutr., London, v.39A, n.4, p.255-272,
1985.
COOK, G.C. independent jejunal mechanism for glycine and glycyl-glycine
transfer in man in vivo. Sr. J. Nutr., Wallingford, v.30, n.1, p.13-19, 1973.
COOK, G.C. Comparasion of intestinal absorption rates of glycine and
glycilglycine in man and the effect of glucose in the perfusing fluid. Clin.
Sei., Colchester, v.43, n.3, p.443-453, 1972.
CORDLE, C.T. Control of food allergies using protein hydrolysates. Food
Teehnol., Chicago, v.48, n.10, p.72-76, 1994.
Renata Alexandra Moreira das Neves
CONCLUSÕES 71
DE MIRA, NV.M.; NEVES, R.AM., LANFER MARQUEZ, U.M. Obtenção e
caracterização de hidrolisado protéico de surimi, com baixo teor de
fenilalanina. In: XVII Congresso brasileiro de Ciência e tecnologia de
alimentos, Fortaleza, 8/10 ago. 2000.
DEBENHAM, K. Nutrition for specific disease conditions. In: WALKER, AF.,
ROLLS, B.A Nutrition and the consumer. Issues in nutrition and
toxicology I. New York: Elsevier Applied Science, 1992. cap.9, p.249
270.
DINIZ, F.M., MARTIN, AM. Optimization of nitrogen recovery in the enzymatic
hydrolysis of dogfish (Squalus acanthias) protein. Composition of the
hydrolysates. Int. J. Food Sci. Nutr., Abingdon, v.48, p.191-200, 1997.
ENDRES, W. Diet in phenylketonuria: how long? Ann. Nutr. Metab., Basel,
v.42, n.2, p.63-67, 1998.
FOOD ANO AGRICULTURE ORGANIZATION. Protein quality evaluation:
a report of joint FAOIWHO. Rome.(FAO Food and Nutrition. Paper 51,
p.21-24), 1991.
FOOD ANO AGRICULTURE ORGANIZATION, WORLD HEALTH
ORGANIZATION. Energy and protein requeriments. Geneva: FAO,
WHO, 1985. (WHO technical report series, n.724).
FASEB, 1991. Proc. of workshop on "Development of medicai foods for rare
diseases". Fed. Am. Soe. Exp. Bio!., Bethesda, Md. Apud: Food
Technol., Chicago, v.48, n.10, p.77-85, 1994.
FISCHER, J.E., BOWER, R.H. Nutritional support in liver disease. Surg. Clin.
North Am., Orlando, v.61, n.3, p.653-660, 1981.
Renata Alexandra Moreira das Neves
CONCLUSÕES 72
FISCHER, J.E., ROSEN, H.M., EBEID, AM., JAMES, J.H., KEANE, J.M.,
SOETERS, P.B. The effect of normalization of plasma amino acids on
hepatic encephalopathy in mano Surgery, St. Louis, v.80, n.1, p.77-91,
1976.
FOX, P.F., MORRISSEY, P.A, MULVIHILL, D.A Chemical and enzymatic
modification of food proteins. In: HUDSON, B.J.F., ed. Developments in
food proteins I. London: Englewood: Applied Science, 1982. p.1-60.
FRANCIS, D. Diets for sick children. 4.ed. Oxford: Blackwell Scientific
Publications, 1987.
FREITAS, O., IZUMI, C., LARA, M.G., GREENE, L.J. New approaches to the
treatment of phenylketonuria. Nutr. Rev., Secaucus, v.57, n.3, p.65-70,
1999.
FREITAS, O., PADOVAN, G.J., VILELA, L., SANTOS, J.E.D., OLIVEIRA,
J.E.D., GREENE, L.J. Characterization of protein hydrolysates prepared
for enteral nutrition. J. Agric. Food Chem., Columbus, v.41, p.1432
1438, 1993.
FRIEDMAN, M. Nutritional value of proteins from different food sources: a
review. J. Agric. Food Chem., Columbus, v.44, p.6-29, 1996.
FR0KJAER, S. Use of hydrolysates for protein supplementation. Food
Technol., Chicago, v.48, n.10, p.86-88, 1994.
GALVEZ, A., MORALES de LÉON, J., RODRíGUEZ, H.B. Development of an
enzymatic fish hydrolysate and it use in instant soup bases. Arch.
Latinoam. Nutr., Caracas, v.35, n.4, p.686-695, 1985.
Renata Alexandra Moreira das Neves
CONCLUSÕES 73
GIOVANNINI, M., AGOSTONI, C., BIASUCCI, G., ROTTOLl, A, LUOTTI, D.,
TROJAN, S., RIVA, E. Fatty acid metabolism in phenylketonuria. Eur. J.
Pediatr., Berlin, v.155, suppl.1, p.S132-S135, 1996.
GROPPER, S.S., NAGLAK, M.C., NARDELLA, M., PLYLER, A, RARBACK,
S., YANNICELLI, S. Nutrient intakes of adolescents with phenylketonuria
and infants and children with mapie syrup urine disease on semisynthetic
diets. J. Am. Co11. Nutr., New York, v.12, n.2, p.108-114, 1993.
HALKEN, S., JACOBSEN, H.P., H0ST, A, HOLMENLUND, D. The effect of
hypo-allergenic formulas in infants at risk of allergic disease. Eur. J. Clin.
Nutr., Basingstoke, v.49, suppl.1, p.S77-S83, 1995.
HANLEY, W.B., FEIGENBAUN, AS.J., CLARKE, J.T.R, SCHOONHEYT,
W.E., AUSTIN, v.J. Vitamin B12 deficiency in adolescents and young
adults with phenylketonuria. Eur. J. Pediatr., Berlin, v.155, suppl. 1,
p.S145-S147, 1996.
HERRMANN, M.-E., BROSICKE, H.G., KELLER, M., MONCH, E., HELGE, H.
Dependence of the utilisation of a phenylalanine-free amino acid mixture
on different amounts of single dose ingested: a case reporto Eur. J.
Pediatr., Berlin, v.153, p.501-503, 1994.
HOLT, N.W., SOLSULKI, F.W. Nonprotein nitrogen contents of some grain
legumes. Cano J. Plant Sei., Ottawa, v.61, p.515-523, 1981.
HOLTZMAN, N.A, KRONMAL, RA, DOORNINCK, W.V., AZEN, C., KOCH,
R Effect of age at loss of dietary contrai on intellectual performance and
behavior of children with phenylketonuria. N. Engl. J. Med., Boston,
v.314, n.10, p.593-598, 1986.
Renata Alexandra Moreira das Neves
CONCLUSÕES 74
HOMMES, F.A, ELLER, AG., TAYLOR, EH. Turnover of the fast
components of myelin proteins in experimental hyperphenylalaninemia:
relevance to termination of dietary treatment in human phenylketonuria. J.
Inherited. Metab. Dis., Dordrecht, v.5, p.21-27, 1982.
JEON, Y.J., BYUN, H.G., KIM, S.K. Improvement of functional properties of
cod frame protein hydrolysates using ultrafiltration membranes. Process
Biochem., Shannon, v.35, p.471-478, 1999.
KNIGHTS, RJ. Processing and evaluation of antigenicity of protein
hydrolysates. In: L1FESSHITZ, F. Nutrition for special needs in
infancy. New York: Dekker, 1985. p.105-115.
KOCH, R, LEVY, H.L., MATALON, R, ROUSE, B., HANLEY, W.B., TREFZ,
F., AZEN, C., FRIEDMAN, EG. The international collaborative study of
maternal phenylketonuria: status reporto Acta Paediatrica, Oslo, v.83,
p.111-119,1994.
KRAUCH, G., MÜLLER, E, ANNINOS, A, BREMER, H.J. Comparasion of the
protein quality of dietetically treated phenylketonuria patients with the
recommendations of the WHO Expert Consulation. Eur. J. Pediatr.,
Berlin, v.155, suppl.1, p.S153-157, 1996.
KRAUSE, M.V., MAHAN, L.K. Alimentos, nutrição & dietoterapia. 8.ed.
São Paulo: Roca, 1995. 981p.
LAHL, W.J., BRAUN, S.D. Enzymatic production of protein hydrolysates for
food use. Food Technol., Chicago, v.48, n.10, p.68-71, 1994.
LAHL, W.J. and GRINDSTAFF, D.A 1989. Spices and seasonings:
hydrolysed proteins. Proceedings of the 6th SIFST Symposium on Food
Ingredients-Applications, Status and Safety, 27-29 April, Singapore, p.51-
Renata Alexandra Moreira das Neves
rnl\TrT.usÕES
65. Singapore Institute of Food Science & Technology. Singapore. Apud:
Food Teehnol., Chicago, v.48, n.10, p.68-71,1994.
LANFER MARQUEZ, U.M. Fenilcetonúria: aspectos bioquímicas, nutricionais
e importância da alimentação. Cad. Nutr., São Paulo, v.11, p.51-68,
1996.
LEMIEUX, L., PIOT, J.M., GUILLOCHON, O., AMIOT, J. Study of the
efficiency of a mobile phase used in size-exclusíon HPLC for the
separation of peptide from a casein hydrolysate according to their
hydrodynamic volume. Chromatographia, Wiesbaden, v.32, p.499-504,
1991.
LENKE, R.L., LEVY, H.L. Maternal phenylketonuria and
hyperphenylalaninemia. na international survey of the outcome of
untreated and treated pregnancies. N. Engl. J. Med., Boston, v.303,
p.1202-1208, 1980.
LEVY, H.L., GUAVAMI, M. Maternal phenylketonuria: a metabolic teratogen.
Teratology, NewYork, v.53, n.3, p.176-184, 1996.
L1ASET, B.; L1ED, E.; ESPE, M. Enzymatic hydrolysis of by-products from the
fish-fil/eting industry; chemical characterisation and nutritional evaluation.
J. Sei. Food Agrie., London, v.80, p.581-589, 2000.
L1CEAGA-GESUALDO, A.M., L1-CHAN, E.C.Y. Functional properties of fish
protein hydrolysate from herring (clupea harengus). J. Food Sei.,
Chicago, v.64, n.6, p.1 000-1 004, 1999.
LOMBECK, 1., JOCHUM, F., TERWOLBECK, K. Selenium status in infants
and children with phenylketonuria and in maternal phenylketonuria. Eur.
J. Pediatr., Berlin, v.155, suppl.1, p.S140-S144, 1996.
Renata Alexandra Moreira das Neves
CONCLUSÕES 76
LOPEZ-BAJONERO, L.J., LARA-CALDERON, P., GALVEZ-MARISCAL, A,
VELAZQUES-ARELLANO, A, LOPEZ-MUNGUIA, A Enzymatic
production of a low-phenylalanine product from skim milk powder and
caseinate. J. Food Sei., Chicago, v.56, nA, p.938-942, 1991.
LUKE, B. Maternal fetal nutrition. Clin. Obstet. Gyneeol., Hagerstow, v.37,
n.1, p.93-109, 1994.
MABRY, C.C. Phenylketonuria: conteporary screening and diagnosis. Ann.
Clin. Lab. Sei., Philadelphia, v.20, n.6, p.393-397, 1990.
MACEDO, I.Q., FARO, C.J., PIRES, E.M. Specificity and kinetics of the milk
clotting enzyme from cardoon (cynara cardunculus L.) toward bovine K
casein. J. Agrie. Food Chem., Columbus, vA1, n.10, p.1537-1540, 1993.
MACKIE, l.M. Fish protein hydrolysate. Process Biochem., Shannon, v.17,
n.1, p.26-28, 1982.
MAHMOUD, M.1. Physicochemical and functional properties of protein
hydro/ysates in nutritional products. Food Technol., Chicago, vA8, n.10,
p.89-95, 1994.
MAHMOUD, M.I., MALONE, W.T., CORDLE, C.T. Enzymatic hydrolysis of
casein: effect of degree of hydrolysis on antigenicity and physical
properties. J. Food Sei., Chicago, v.57, p.1223-1229, 1992.
MAKINEN-KJLJUNEN, S., SORVA R Bovine beta lactoglobulin leveis in
hydrolysed protein formulas for infant feeding. Clin. Exp. Allergy, Oxford,
v.23, nA, p.287-291 , 1993.
MALDONADO, J., GIL, A, NARBONA, E., MOL/NA, J.A Special formulas in
infant nutrition: a review. Early Hum. Dev., Shannon, v.53, suppl.1,
p.S23-S32, 1998.
Renata Alexandra Moreira das Neves
CONCLUSÕES 77
MATTHEWS, D.M. Protein absorptíon: then and now. Gastroenterology,
Orlando, v.73, p.1267-1279, 1977.
MEREDITH, J.W., DITESHEIM, J.A, ZALOGA, G. Visceral protein leveis in
trauma patients are greater with peptide diet than with intact protein diet.
J. Trauma, Baltimore, v.30, p.825-828, 1990.
MILLA, P.J., KILBY, A, RASSAN, U.B., ERSSER, M.L., HARRIRES, J.T.
Small intestinal absorption of amino acids and a dipeptides in pancreatic
insufficiency. Gut, London, v.24, p.818-824, 1983.
MDLLÉ, O., LÉDNIL, J. Heterogeneity of the bovine k-casein
caseinomacropeptide resolved by liquid chromatography on-Iine with
electrospray ionization mass spectrometry. J. Chrom., A, Amsterdam,
v.708, p.223-230, 1995.
MDNCH, E, HERRMANN, M.E, BROSICKE, H., SCHDFFER, A, KELLER,
M. Utilisation of amino acid mixtures in adolescents with phenylketonuria.
Eur. J. Pediatr., Berlin, v.155, suppl.1, p.S115-S120, 1996.
MDNTECALVO Jr., J., CONSTANTINIDES, S.M., YANG, S.T. Enzymatic
modification of fish frame protein isolate. J. Food Sei., Chicago, vA9,
p.1305-1309, 1984.
MDRALES de LÉDN, J., MARISCAL, A.G., TÉLLEZ-SILL, V. Preparation of
fish protein isolate and hydrolyzate (MugiJ cephalus) and their
incorporation into mexican foods. Areh. Latinoam. Nutr., Caracas, vAO,
n.1, p.55-68, 1990.
NETTO, F.M., GALEAZZI, M.AM. Production and characterization of
enzymatic hydrolysate from soy protein isolate. Lebensm.-Wiss.
Teehnol., London, v.31, p.624-631, 1998.
Renata Alexandra Moreira das Neves
CONCLUSÕES 78
O'BRIEN, D. Inborn errors of metabolism. Am. J. Clin. Nutr., Bethesda, v.32,
p.482-485, 1979.
OLIVA-TELES, A, CERQUEIRA, AL., GONÇALEVES, P. The utilization of
diets containing high leveis of fish protein hydrolysate by turbot
(Scophthalmus maximus ) juveniles. Aquaeulture, Amsterdam, v.179,
p. 195-201 , 1999.
PARK, J.W., L1N, T.I.N., YONGSAWATTIJUL, J. New developments in
manufacturing of surimi and surimi seafood. Food Rev. Int., New York,
v.13, nA, p.577-610, 1997.
PEDERSEN, B. Removing bitterness from protein hydrolysate. Food
Teehnol., Chicago, v.48, n.10, p.96-98, 1994.
PEREA, A, UGALDE, U., RODRIGUEZ, 1., SERRA, J.L. Preparation and
characterization of whey bioconversion processes. Enzyme Mierob.
Teehnol., New York, v.15, pA18-423, 1993.
PHILLlPS, R.D., BEAUCHALT, L.R. Enzyme modification of proteins. In:
CHEVRY, J.P. Protein funetionality in foods. Washington: American
Chemical Society, 1981. p.275-298. (ACS Symposium series, 147).
PIETZ, J., FATKNHEWEW, B., BURGARD, P., ARMBRUSTER, M., ESSER,
G., SCHMIDT, H. Psychiatric disorders in adult patients with early-treated
phenylketonuria. Pediatrics, Elk Grove Village, v.99, n.3, p.34S-3S0,
1997.
POULlOT, Y., WIJERS, M.C., GAUTHIER, S.F., NADEAU, L. Fractionation of
whey protein hydrolysates using charged UF/NF membranes. J. Membr.
Sei., Amsterdam, v.158, p.10S-114, 1999.
Renata Alexandra Moreira das Neves
CONCLUSÕES 79
POUR-EL, A. Protein functionality: classification, definition, and methodology.
In: CHERRY, J.P., ed. Protein functionality in foods. Washington:
American Chemical Society, 1981. cap.1, p.275-298. (ACS symposium
series, 147)
PRINCE, A.P., MSMURRY, M.P., BUIST, N.R.M. Treatment products and
approaches for phenylketonuria: improved palatability and f1exibility
demonstrate safety, efficacy and acceptance in US clinicai trials. J.
Inherited Metab. Ois., Oordrecht, n.20, p.486-498, 1997.
PRZYREMBEL, H. Recommendations for protein and amino acid intake in
phenylketonuria patients. Eur. J. Pediatr., Berlin, v.155, suppl.1, p. S130
S131, 1996.
PUCCI, P., SEPE, C., MARINO, G. Factors affecting the fast atom
bombardement mass spectrometric analysis of proteolytic digests of
protein. 8iol. Mass Spectrom., Chichester, v.21, p.22-26, 1992.
ROBERTS, P.R., BURNEY, J.O., BLACK, K.W., ZALOGA, G.P. Effect of
chain length on absorption of biologically active peptides from the
gastrointestinal tract. Digestion, Basel, v.60, p.332-337, 1999.
ROHR, F.J., LOBBREGT, O., LEVY, H.L. Tyrosine supplementation in the
treatment of maternal phenylketonuria. Am. J. Clin. Nutr., Bethesda,
v.67, n.3, p.473-476, 1998.
ROHR, F.J., OOHERTY, L.B., WAISBREN, S.E., BAILEY, I.V., AMPOLA,
M.G., BENACERRAF, 8., LEVY, H.L. New England maternal PKU
project: prospective study of treated and untreated pregnancies and their
outcomes. J. Pediatrics, S1. Louis, v.110, n.3, p.391-398, 1987.
Renata Alexandra Moreira das Neves
CONCLUSÕES 80
ROUSE, B., AZEN, C., KOCH, R, MATALON, R HANLEY, W. CRUZ, F.,
TREFZ, F., FRIEDAMAN, E, SHIFRIN, H. Maternal phenylketonuria
collaborative study (MPKUCS) offspring: sequelae facial anormalies,
malformations and early neurological. Am. J. Med. Genetics, New York,
v.69, p.89-95, 1997.
ROUSE, B., LOCKHART, L., MATALON, R, AZEN, C., KOCH, R, HANLEY,
W., LEW, H., DE LA CRUZ, F., FRIEDMAN, E Maternal phenylketonuria
pregnancy outcome: a preliminary report of facial dysmorfology and major
malformations. J. Inherited. Metab. Ois., Dordrecht, v.13, p.289-291 ,
1990.
SCHARSCHMIDT, B.F. Insuficiência hepática aguda e crônica. In: BENNETT,
J.C., PLUM, F. Cecil: tratado de medicina interna. 20.ed. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 1997. v.1, cap.123, p.880-884.
SCHMIDL, M.K., TAYLOR, S.L., NORDLEE, J.A Use of hydrolysate-based
products in special medicai diets. Food Technol., Chicago, vA8, n.10,
p. 77-85, 1994.
SCHMJDT B.J., MARTINS, AM., FJSBERG, RV., MÜLLER, R, ADELL,
AC.A., SUBERO, EM. Fenilcetonúria: aspectos clínicos e terapêuticos.
Pediatr. AI Dia, Santiago, v.3, n.5, p.257-260, 1987.
SHAHIDI, F., HAN, X-Q., SYNOWIECKI, J. Production and characteristics of
protein hydrolysates from capelin ( Mal/otus villosus). Food Chem.,
Amsterdam, v.53, p.285-293, 1995.
SIEMENSMA, AO., WEIJER, W.J., BAK, H.J. The importance of peptide
lenghts in hypoallergenic infant formulae. Trends Food Sei. Technol.,
Amsterdam, vA, p.16-21, 1993.
Renata A lexandra Moreira das Neves
CONCLUSÕES 81
SILK, D.B.A., HEGARTY, J.E., FAIRCLOUGH, P.D., CLARK, M.L. Ann. Nutr.
Metab., Basel, v.26, p.337-352, 1982.
SILVESTRE, M.P.C. Review of methods for the analysis of protein
hydrolysates. Food Chem., Amsterdam, v.60, n.2, p.263-271, 1997.
SILVESTRE, M.P.C., HAMON, M., YVON, M. Analysis of protein
hydro/ysates. I. Use of poly (2-hydroxyethylaspartamide)-silica column in
size-exclusion chromatography for the fracionation of casein hydrolysates.
J. Agric. Food Chem., Columbus, vA2, n.12, p.2778-2782, 1994.
SMITH, 1., GLOSSOP, J., BEASLEY, M. Fetal damage due to maternal
phenylketonuria: Effects of dietary treatment and maternal phenylalanine
concentration around the time of conception. J. Inherited Metab. Ois.,
Lancaster, v.13, p.651-657, 1990.
SMITH, I. Treatment of phenylalanine hydroxylase deficiency. Acta Paediatr.
Suppl., vA07, p.60-65, 1994.
SOTO, Z.J. Listas de intercambio de alimentos para usar en la fenilcetonuria
y en la enfermedad de la orina con olor a miei de arce. Arch. Latinoam.
Nutr., Caracas, vA3, n.3, p.211-216, 1993.
SPACKMAN, O.H., STEIN, W.H., MOORE, S. Automatic recording apparatus
for use in the chromatography of amino acids. Analytical Chemistry,
Columbus, v.30, n.7, p.1190-1206, 1958.
SYNOWIECHI, J., AL-KHATEEB, N.A.A.Q. The recovery of protein
hydrolysate during enzymatic isolation of chitin from shrimp Crangon
crangon processing discards. Food Chem., Amsterdam, v.68, p.147-152,
2000.
Renata Alexandra Moreira das Neves
CONCLUSÕES 82
TANIMOTO, S-Y, TANABE, S., WATANABE, M., ARAI, S. Enzymatic
modification of zein to produce a non-bitter peptide fraction with a very
high fischer ratio for patients with hepatic encephalopathy. Agric. Bio!.
Chem., Tokyo, v.55, nA, p.1119-1123, 1991.
TAYLOR, EH., HOMMES, F.A, STEWART, D.E Effect of experimental
hyperphenylalaninemia on biogenic amine synthesis at later stages of
brain development. Biochem. Med., New York, v.29, p.307-317, 1983.
TOSSAVAINEN, O., SYVAOJA, EL, TUOMINEN, M., HEINANEN, M.,
KALKKINEN, N. Determination of the peptide size range of an
extensively hydrolysed protein hydrolysate, Milchwissenschaft,
Muenchen, v.52, n.2, p.63-67, 1997.
TRAHMS, C.M. Cuidado nutricional para crianças com distúrbios metabólicos.
In: KRAUSE, MM.V., MAHAN, L.K. Alimentos, nutrição & dietoterapia.
São Paulo: Rocca, 1991. cap.39, p.796-820.
VAN BERESTEIJN, EC. H., PEETERS, R.A, KAPER, J., MEIJER, R.J.G.M.,
ROBBEN, AJ.P.M., SCHMIDT, D.G. Molecular mass distribuition,
immunological properties and nutritive value of whey protein hydrolysates.
J. Food Prat., Des Moines, v.57, n.7, p.619-625, 1994.
VIJAYALAKHSMI, M.A, LEMIEUX, L., AMIOT, J. High performance size
exclusion Iiquid chromatography of small molecular weight peptides from
protein hydrolysates using methanol as a mobile phase additive. J. Liq.
Chromatogr., New York, v.9, p.3559-3576, 1986.
VISSER, S., SLANGEN, C.J., ROBBEN, J.P.M. Determination of molecular
mass distribuition of whey protein hydrolysates by high-performance size
exclusion chromatography. J. Chromatogr., Amsterdam, v.599, p.20S
209,1992.
Renata Alexandra Moreira das Neves
CONCLUSOES 83
WOO, S.L.C. Molecular basis and population genetics of phenylketonuria.
Bioehemistry, Columbus, v.28, n.1, 1989.
YAMASHITA, M., ARAI, S., FUJIMARI, M. A low-phenylalanine, high-tyrosine
plastein as an acceptable dietetic food. J. Food Sei., Chicago, v.41,
p.1029-1032, 1976.
ZALOGA, G.P., WARD, K.A., PRIELlPS, R.C. Effect of enteral diets on whole
body and gut growth in untresses rats. JPEN, J. Parenter. Enteral Nutr.,
Silver Spring, v.15, p.42-47, 1991.
ZARRABIAN, S., BUTS, J.P., FROMONT, G., TRAN, T., MACRY, J.,
MENDY, F., ROGER, L., CEZARD, J.P. Effects of alimentary intact
proteins and their oligopeptide hydrolysate on growth, nitrogen retention,
ans small bowel adaptation in inflamatory turpentine rat. Nutrition, v.15,
n.6, p.474-480, 1999.
ZIEGLER, F., OLLlVIER, J.M., CYNOBER, L., MASINI, J.P., COUDRAY
LUCAS, C., LEVY, E., GIBONDEAU, J. Efficacy of enteral nitrogen
support in surgical patients; small peptides vs. Nondegraded proteins.
Gut, London, v.31, p.1277-1283, 1990.
Renata Alexandra Moreira das Neves
top related