gustavo garcia luiz gustavo gardinassi thais herrero pdcs play off scratch

Gustavo Garcia

Luiz Gustavo Gardinassi

Thais Herrero

pDCs play off scratch

Modelo de desenvolvimento das células dendríticas

Função das células dendríticas

Subpopulações de Células Dendríticas

CD45+

LC- células de Langerhans

IDEC- células dendríticas epidermal inflamadas.

PDC- células dendríticas plasmocitóides

CD123- cadeia alfa do receptor da IL-3

RT-PCR

J. Exp. Med- September 17, 2001

Nature Reviews Immunology 8, 259-268 (April 2008)

Importância da produção dos IFNs do tipo 1

•Expressam TLR7 e TLR9

•Produz grande quantidade de interferons tipo 1

•pDC são população de células circulantes

• Ausentes na pele normal, porém migram para pele inflamada

LL37/CRAMP- peptídeo antimicrobiano catelicidina

Controle da infecção/lesão Autoimunidade

Objetivo: Avaliar o papel das células dendríticas plasmocitóides

(pDCs) durante a lesão da pele e no processo de cicatrização

Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs?

Derme Quantificação das células dérmicas

Digestão com 1mg/ml de colagenase por 2h

Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs?

Assim,  lesões na pele induz uma infiltração rápida e robusta de

pDCs paralela à infiltração por neutrófilos no local da lesão.

Lesão da pele induz uma ativação de pDCs para produzir IFNs do tipo I?

Pele total (0, 6, 24, 48 e

72h)

Análise da expressão gênica por Real-time PCR

As pDCs são a principal fonte de IFN-α/β na lesão, enquanto as citocinas

inflamatórias IL-6 e TNF são produzidas por outros tipos celulares que não as

pDCs.

Lesão da pele induz uma ativação de pDCs para produzir IFNs do tipo I?

48hs

24hs

2 Acs (PDCA1 e

mAb 927) ou IgG como controle antes da

lesão

48hs

24hs

Acs (anti-Ly6C) ou IgG

como controle antes da

lesão

24h

Demonstrando que a pele danificada induz uma rápida infiltração e ativação de

pDCs.

Os TLRs estariam envolvidos na ativação pDCs e produção de INF-α/β?

MyD88 -/-

Pele total (24h)

Análise da expressão gênica por

Real-time PCR

Lesão

IRS 954 (0, 1, 10 ou 100μg)

Lesão Pele total (24h)Análise da

expressão gênica por real-time

PCR

As catelicidinas são induzidas neste modelo de injúria de pele?

Pele total (0, 6, 24, 48 e

72h)

Análise da expressão de catelecidina

(CRAMP) por Real-time PCR

pDCs do baço

Overnight

• DNA

• CRAMP

• CRAMP+DNA

• scCRAMP+DNA

• scCRAMP

ELISA

Sugere-se um potencial papel das catelicidinas na quebra da tolerância inata para ácidos

nucléicos próprios.

As catelicidinas estariam também envolvidas com a quebra da tolerância inata contra ácidos nucléicos in vivo?

CRAMP

scCRAMP

Salina

Pele total (0, 24 e 48h)

• FACs

• Real-time PCR

Sim, CRAMP é suficiente para quebrar a tolerância inata e induzir a ativação de

pDCs e produção de IFNs na pele in vivo.

Pele total (24h)Análise da

expressão gênica por Real-time PCR

Com ou sem lesão

CRAMP -/-

As catelicidinas são necessárias para a ativação das pDCs na pele danificada?

Assim, as cetelicidinas são suficientes, mas não necessárias para a quebra da

tolerância inata a ácidos nucléicos e induz a produção de IFN-α/β pelas pDCs

na pele danificada.

As pDCs induzem uma resposta inflamatória na pele danificada?

2 Acs (PDCA1 e

mAb 927) ou IgG como controle antes da

lesão

Pele total (24h)Citocinas

inflamatórias por Real-time PCR

Com ou sem lesão

Estes resultados demonstram que as pDCs infiltrantes, desenvolvem um papel importante na indução da resposta imune inflamatória na pele danificada, e em particular a indução de IL-6 e citocinas Th17

As pDCs teriam um papel na reepitelização da pele danificada?

Pele com lesão Análise da expressão de Keratina 6 (K6)

Imunofluorescência

Estes resultados indicam que a infiltração das pDCs na pele danificada

desenvolvem um papel importante na pele danificada promovendo uma rápida

reepitelização da lesão.

Qual seria o papel dos IFN-α/β neste processo?

IFNAR -/-

Pele com lesão Quantificação da Keratina 6 (K6) e análise da expressão das citocinas inflamatórias por Real-time PCR

Estes resultados sugerem que a capacidade das pDCs dispararem uma rápida resposta

inflamatória e promoverem o reparo do tecido esta relacionado a ativação dos TLR mediada

por ácidos nucléicos e produção de IFN-α/β.

E na pele humana? As pDCs apresentam a mesma capacidade?

Biópsias antes e 24h depois da lesão

7 voluntários

• Fita adesivaImunoistoquímica para

BDCA2 (marcador específico de pDCs

humana) e Real-time PCR

Sim, similar aos resultados obtido no modelo murino, as pDCs foram ativadas e

produziram IFN-α na pele danificada.

E na pele humana? As pDCs apresentam a mesma capacidade?

Biópsias antes e 24h depois da lesão

7 voluntários

• Lauril sulfato de sódio (SLS)

Imunoistoquímica para BDCA2 (marcador específico de pDCs

humana)

Assim como no modelo de lesão mecânica, o modelo de lesão química induziu

uma rápida infiltração de pDCs e uma significante indução da expressão de mRNA

de IFN-α na pele danificada.

Conclusão

Controle da infecção/reparo tecidual

Objetivo:Investigar o papel das pDCs na inflamção da

pele de indivíduos suscetíveis a doença autoimune

Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs e Neutrófilos?

Linhagem 129

Tape stripping

24hCitometria de fluxo

Lesão da pele normal induz infiltração e ativação das pDCs e Neutrófilos?

Após a inflamção, pDCs e neutrófilos infiltram-se na pele, onde pDCs produzem IFN- e neutrófilos produzem NETs.

Linhagem 129

Tape stripping

24hImunomarcação

INFAR-/- ou WT

Naive/Tape stripping

24hReal Time PCR

Os IFN tipo I atuam na indução de genes pró-inflamatórios na pele lesionada?

A indução de genes pró-inflamatórios na pele lesionada envolve a sinalização via

TLR?MyD88-/- ou WT

Naive/Tape stripping

24hReal Time PCR

O requerimento de MyD88 na indução de genes pró-inflamatórios demonstra um importante papel da

sinalização via TLR.

Naive/Tape stripping

24hReal Time PCR

Os TLR7 e TLR9 estão envolvidos na indução de genes pró-inflamatórios na

pele lesionada?IRS 954

Sim, a sinalização via TLR 7 e TLR 9 é necessária para mudanças na expressão de genes pró-inflamatórios na

pele danificada.

pDC e Neutrófilos são necessários para a indução de genes pró-inflamatórios na pele

lesionada?

Naive/Tape stripping

24hReal Time PCRAnti-120G8

Anti-GR1-Ly-6GWT

pDC e Neutrófilos são requeridos para a indução de genes pró-inflamatórios, porém promovem respostas

inflamatórias diferentes.

Quais as características da resposta inflamatória de (NZBXNZW)F1 na pele

lesionada?Tape

stripping

1, 4, 20d

Real Time PCRQuant. Lesão abertaHistologia

(NZBxNZW)F1

C57/BL6129

Quais as características da resposta inflamatória de (NZBXNZW)F1 na pele

lesionada?

Após a inflamação, (NZBXNZW)F1 desenvolvem lesões crônicas na pele, semelhantes a lesões observadas em CLE

de humanos.

pDCs e a sinalização via TLR7 e TLR9 são requeridas para iniciar e manter lesões

cutâneas?

Tape stripping

15-23d Quant. Lesão

aberta

(NZBxNZW)F1

Anti-120G8 ouIRS 954

pDCs e a sinalização via TLR7 e TLR9 são requeridas para iniciar e manter lesões

cutâneas?

As pDCs e a sinalização via TLR7 e TLR9 são requeridas, pois a depleção de pDC e a inibição dos receptores tanto antes, quanto durante a inflamação, resultam em uma

melhora da cicatrização.

Tape stripping

15-23d Quant. Lesão

abertaHistologia

(NZBxNZW)F14d

IRS 954

Conclusão

AutoimunidadeControle da infecção/reparo tecidual

?

Doença

Exacerbação da lesão