genética molecular dos sistemas eritrocitários: importância na prática clínica lilian castilho
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Genética molecular dos Genética molecular dos sistemas eritrocitários: sistemas eritrocitários: importância na prática importância na prática
clínicaclínica
Lilian CastilhoLilian Castilho
SC
CO
I
GLOBGIL
DO
YTXG
LW
GE
CH/RG
KELL (24) LU (20)
OK JMHRAPH
ABOIN
KN
P
KX
H
RH (48)
MNS (43)
CR(12)
DI (21)
FY
LE
JK
Diversidade:Diversidade:
SistemasSistemas 2929
Locus Locus 3434
AntígenosAntígenos 239239
Alelos Alelos >620>620
www.bioc.aecom.yu.edu/bgmut/index.htm
. . Constituídos por Constituídos por antígenos de grupos antígenos de grupos sanguíneos definidos sanguíneos definidos por aloanticorpospor aloanticorpos
Sistemas eritrocitáriosSistemas eritrocitários
Modelo de membrana: inserção dos Modelo de membrana: inserção dos antígenos de grupos sanguíneosantígenos de grupos sanguíneos
Outside
NH2
NH2
NH2 NH2
NH2
COOH
GPI-linked
COOH
COOH COOH
P1PPk
ABOHhLewisI
GPA/GPB (MNSs)GPC/GPD (Gerbich)
CD99 (Xg)CD147 (Ok)CR1 (CD35; Knops)
CD239 (Lutheran, B-CAM)ICAM-4 (LW)ERMAP (Sc)CD44 (Indian)
CD234 (Duffy)
Band 3 (Diego)RhKxAQP-1 (Colton)KiddAQP-3 (GIL)CD151 (Raph)
AChE (Yt)Dombrock (ART4)DAF (CD55, Cromer) CD108 (JMH)Emm
CD238 (Kell)
Carbo-hydrate
Type IISingle-pass
MultipassType ISingle-
passReid, 2004
Antígenos de grupos sanguíneos: Antígenos de grupos sanguíneos: produtos de genesprodutos de genes
• 28/29 genes identificados28/29 genes identificados
• polimorfismos de GS definidos ao nível genéticopolimorfismos de GS definidos ao nível genético
• antígenos carreados em proteínas são codificados antígenos carreados em proteínas são codificados diretamente pelos genesdiretamente pelos genes
• antígenos carbohidratos estão sob o controle de genes antígenos carbohidratos estão sob o controle de genes que codificam glicosiltransferasesque codificam glicosiltransferases
• análise molecular dos genes de GS pode ser útil na análise molecular dos genes de GS pode ser útil na clínica clínica
• entendimento das bases moleculares de GS permite entendimento das bases moleculares de GS permite explorar a função da proteína explorar a função da proteína
www.bioc.aecom.yu.edu/bgmut/index.htm
Antígenos de grupos sanguineos estão Antígenos de grupos sanguineos estão localizados em moléculas funcionaislocalizados em moléculas funcionais
PABO
LewisGLOB
HI
MNS
Scianna
Dombrock
Gerbich
Ch/RgCromerKnops
LWXg
DuffyLutheran
IndianRaphJMHOka
Rh
Kidd
Diego
Colton
GIL
Kx
KellYt
Carboidratos
Glicoproteinas de estrutura ou funçãodesconhecida
Regulação de complemento
Moléculas de adesão
Transporte e canais
Enzimas
• SNPs (single nucleotide SNPs (single nucleotide
polymorphisms)polymorphisms) : :
maioriamaioria
• Transcrição: Transcrição: GATAGATA
• DeleçãoDeleção
Gene, Exon, Gene, Exon,
Nucleotídeo (s):Nucleotídeo (s):
ABO, MNS, Rh, Kell, ABO, MNS, Rh, Kell,
Duffy, Dombrock, etcDuffy, Dombrock, etc
• Inserção:Inserção:
Nucleotídeo (s) :Nucleotídeo (s) : Rh, Rh,
ColtonColton
• DuplicaçãoDuplicação
Exon:Exon: Gerbich Gerbich
• Splicing alternativo: Splicing alternativo: S-s-S-s-
• Conversão gênica ou Conversão gênica ou
recombinaçãorecombinação
MNS, Rh, Ch/RgMNS, Rh, Ch/Rg
Mecanismos moleculares que levam à Mecanismos moleculares que levam à diversidade dos antígenos de grupos diversidade dos antígenos de grupos
sanguíneossanguíneos
SNPs (mutações de ponto SNPs (mutações de ponto missenses) missenses)
AAGTCAGCTGGACTTCGAAGATGTATGGAATTCTTCCTATGGTGTGAATGATTCCTTCCCAAGTCAGCTGGACTTCGAAGATGTATGGAATTCTTCCTATGGTGTGAATGATTCCTTCCC
AGATGGAGACTATGAGATGGAGACTATGAATCCAACCTGGAAGCAGCTGCCCCCTGCCACTCCTGTAACCTGTCCAACCTGGAAGCAGCTGCCCCCTGCCACTCCTGTAACCTG
((FY BFY B) A (Asp)) A (Asp)
((FY AFY A) ) GG (Gly) (Gly)
• RH: RH: C/c; E/eC/c; E/e
• MNS: MNS: S/sS/s
• Kell: Kell: K/k, KpK/k, Kpaa/Kp/Kpbb, Js, Jsaa/Js/Jsbb
• Diego:Diego: Di Diaa/Di/Dibb
• Duffy: Duffy: FyFyaa/Fy/Fybb
• Kidd: Kidd: JkJkaa/Jk/Jkbb
• Lutheran: Lutheran: LuLuaa/Lu/Lubb
• Dombrock: Dombrock:
DoDoaa/Do/Dobb
TranscriçãoTranscrição
1TATC 2
1TACC 2
FY A/FY B
FY B
FY Normal
FY Mutado*
Mutações no gen promotor que afetam a expressão do antígeno na hemáciaGATA box
* Fenótipo Fy(a-b-)
Rearranjos gênicosRearranjos gênicos
DANIELS, 2002
2211 33 88 9944 55 66 77
RHCE
10
RHD
RHD SMP1 RHCE
SM
P1
Rhesus box
Rhesus box
Métodos de análise de DNAMétodos de análise de DNA
• Amplificação do DNA por PCRAmplificação do DNA por PCR
– PCR-RFLPPCR-RFLP
– PCR-alelo-especificoPCR-alelo-especifico
– PCR-multiplexPCR-multiplex
• Amplificação (PCR) + sonda-Amplificação (PCR) + sonda-
especifica (probe)-Real time PCRespecifica (probe)-Real time PCR
– TaqManTaqMan
– Molecular beaconsMolecular beacons
• Microarray – chipsMicroarray – chips
PCR-RFLP (Polimorfismo PCR-RFLP (Polimorfismo Duffy)Duffy)
TCCCCCTCAACTGAGAACTCTCCCCCTCAACTGAGAACTCAAGTCAGCTGGACTTCGAAGATGTATAAGTCAGCTGGACTTCGAAGATGTAT
GGAATTCTTCCTATGGTGTGAATGATTCCTTCCCAGATGGAGACTATGGAATTCTTCCTATGGTGTGAATGATTCCTTCCCAGATGGAGACTAT
GGAATCCTCC AACCTGGAAGCAGCTGCCCCCTGCCACTCCTGTAACCTGAACCTGGAAGCAGCTGCCCCCTGCCACTCCTGTAACCTG
(FY B) GATCC (ausência de sítio (FY B) GATCC (ausência de sítio Ban Ban I)I)
G (FY A) GGTCC (sítio G (FY A) GGTCC (sítio Ban Ban I)I)
CTGGATGACTCTGCACTGCCCTTCTTCATCCTCACCAGTGTCCTGGGCTGGATGACTCTGCACTGCCCTTCTTCATCCTCACCAGTGTCCTGGG
TATCCTAGCTAGCAGCACTGTCCTCTTCATGCTTTTCAGACCTCTCTTTATCCTAGCTAGCAGCACTGTCCTCTTCATGCTTTTCAGACCTCTCTT
CCGCTGGCAGCTCTGCCCTGGCTGGCCTGTCCTGGCACAGCTGGCTCCGCTGGCAGCTCTGCCCTGGCTGGCCTGTCCTGGCACAGCTGGCT
GTGGGCAGTGCCCTCTTCAGCATTGTGTGGGCAGTGCCCTCTTCAGCATTGT GGTCCGGTCC CGTCTTGGCCCC CGTCTTGGCCCC
AGGGCTAGGTAGCACTCGCAGCTCTGCCCTGTGTAGCCTGGGCTACAGGGCTAGGTAGCACTCGCAGCTCTGCCCTGTGTAGCCTGGGCTAC
TGTTGTGTCTGGTATGGCTCAGCCTTGTCTGGTATGGCTCAGCCTT
RFLP para genotipagem Duffy RFLP para genotipagem Duffy
306pb
210pb 86pb
86pb
96pb
Ban Inovo sítio
BanBan I I
sítio comumsítio comum
FY B
FY A
PC
R
FY
B/F
Y B
FY
A/F
Y B
FY
A/F
Y A
306pb
210pb
86pb
392 pb
96pb100pb
200pb
300pb
400pb
100
bp
PCR Alelo-Especifico (AS-PCR): PCR Alelo-Especifico (AS-PCR): SsSs
S-específico s-específico
100
pb
100
pb
S+
S-
s-
s+
1 12 3
S+
s-
2 34 5S
+
S+
s+
s+
4 5 BB
CI
205pb
PCR Multiplex: RHCE Cc e PCR Multiplex: RHCE Cc e RHD
RHc
RHD Ex7
RHC
RHD I410
0bp
RH
Dcc
RH
D
R
HD
/RH
Cc
RHD
Real Time PCRReal Time PCR
DNA fetal noPlasma materno
0.3 mm
4000 ENCODED BEADS
Microarray – Tecnologia ChipMicroarray – Tecnologia Chip
Oligo 3
Oligo 1
Oligo 2
ON-CHIP ELONGATION
PAIRS OF GENETIC MARKERS
SIG
NA
L IN
TEN
SIT
Y
ASSAY IMAGE
C
Mismatch
TC
C
C
C
T
A
G
G
T
T
T
C
C
C
A
GG
G
X
C
C
TC
C
C
T
T
T
A
T
C
C
G
G
C
Match
AG
GA
A
AG
G
MULTIPLEXED ANALYSIS OF POLYMORPHISMS
Microarray – Tecnologia ChipMicroarray – Tecnologia Chip
FY A FY B
ASSAY IMAGE
DECODING IMAGE
Microarray – Tecnologia ChipMicroarray – Tecnologia Chip
Aquisição da imagem automática
HEA-18
GENÓTIPO:FY, Fy-265 , GATA AB, AA, AA Do-624, -793, -323, -350.-378 AAK BBJK ABGPB BBGPA AB
LW, Co, Sc & Di AA Lu AB
Microarray – Tecnologia ChipMicroarray – Tecnologia Chip
Fontes de DNA que podem ser Fontes de DNA que podem ser utilizadas para genotipagem utilizadas para genotipagem
• Sangue (Leucócitos) Sangue (Leucócitos)
• Células do epitélio bucal Células do epitélio bucal
• Urina (células no sedimento urinário)Urina (células no sedimento urinário)
• Líquido amniótico (amniócitos) Líquido amniótico (amniócitos)
• DNA fetal em plasma maternoDNA fetal em plasma materno
Genotipagem em larga escala para identificação de Genotipagem em larga escala para identificação de antígenos comuns e raros (Programa de hemácias antígenos comuns e raros (Programa de hemácias fenotipadas)fenotipadas)
Produção de painéis complementaresProdução de painéis complementares
Zigozidade D, FyZigozidade D, Fyaa, Fy, Fybb : controle de qualidade de : controle de qualidade de reagentesreagentes
Determinação dos tipos de D fraco e D parcialDeterminação dos tipos de D fraco e D parcial
Identificação de novos alelosIdentificação de novos alelos
Em doadores• Seleção limitada de anti-soros Seleção limitada de anti-soros
Genética molecular dos sistemas Genética molecular dos sistemas
eritrocitários: aplicaçõeseritrocitários: aplicações
Em pacientes
Genética molecular dos sistemas Genética molecular dos sistemas
eritrocitários: aplicaçõeseritrocitários: aplicações
– Resolução de casos clínicos em situações que os testes de Resolução de casos clínicos em situações que os testes de
hemaglutinação não fornecem resultados seguros (pacientes recém-hemaglutinação não fornecem resultados seguros (pacientes recém-
transfundidos, pacientes portadores de AHAI aloimunizados)transfundidos, pacientes portadores de AHAI aloimunizados)
– Resolução de discrepâncias ABO e RhResolução de discrepâncias ABO e Rh
– Determinação de microquimerismo após transplante de stem cell Determinação de microquimerismo após transplante de stem cell
alogênicoalogênico
– Identificação de fenótipos fracos e deprimidos Identificação de fenótipos fracos e deprimidos (D(D fraco, fraco, e e fraco)fraco)
– Investigação e confirmação de fenótipos raros (DI, DO, SC, CO)Investigação e confirmação de fenótipos raros (DI, DO, SC, CO)
– Identificação de variantes raras (D parcial + e parcial)Identificação de variantes raras (D parcial + e parcial)
– Identificação de novos alelosIdentificação de novos alelos
• Zigozidade do gene Zigozidade do gene RHDRHD paterno paterno
• Genotipagem Genotipagem RHDRHD fetal fetal
– DNA de amniócitos DNA de amniócitos
– DNA de origem fetal na circulação DNA de origem fetal na circulação
materna materna (usar DNA de plasma materno)(usar DNA de plasma materno)
Medicina materno-fetal
Genética molecular dos sistemas Genética molecular dos sistemas
eritrocitários: aplicaçõeseritrocitários: aplicações
Genotipagem eritrocitária na prática Genotipagem eritrocitária na prática clínicaclínica
Caso clínico 1:Caso clínico 1:
Paciente politransfundido aloimunizado com Paciente politransfundido aloimunizado com
anti-E e provável anti-Jkanti-E e provável anti-Jkb b e história de e história de
transfusão recentetransfusão recente
Fenotipagem: R2r, K-k+, Fy(a+b-), Jk(a-b+) Fenotipagem: R2r, K-k+, Fy(a+b-), Jk(a-b+) Teste complementar: genotipagem Teste complementar: genotipagem RH, KEL, FY e JKRH, KEL, FY e JK
Caso clínico 1:Caso clínico 1:
Genotipagem:Genotipagem:RHD+ RHCERHD+ RHCE cc cc ee ee, K2K2, , K2K2, FY A/FY AFY A/FY A, , JK A/JK A JK A/JK A
Componente selecionado para a transfusão:Componente selecionado para a transfusão:
Fenótipo deduzido do genótipo: R0r, K-, Fenótipo deduzido do genótipo: R0r, K-,
Fy(b-), Jk(b-)Fy(b-), Jk(b-)
100p
b
RH
Dcc
100
pb
RH
ee
100
pb
K2K
2
FY
A/F
Y B
FY
A/F
Y B
FY
A/F
Y A
FY
A/F
Y A
10
0 p
b1
00
pb
JK
A/J
K B
JK
A/ J
K B
JK
B/J
K B
JK
B/ J
K B
JK
A/J
K A
JK
A/ J
K A
Genotipagem eritrocitária na prática Genotipagem eritrocitária na prática clínicaclínica
Caso clínico 2:Caso clínico 2:
Paciente politransfundido com TDA positivo (4+) eluato e soro Paciente politransfundido com TDA positivo (4+) eluato e soro
positivos 4+ com todas as células, história de transfusão recente e positivos 4+ com todas as células, história de transfusão recente e
evidência clínica de diminuição da sobrevida de hemácias evidência clínica de diminuição da sobrevida de hemácias
transfundidastransfundidas
– Fenotipagem do paciente: ?Fenotipagem do paciente: ?
– Genotipagem do paciente:Genotipagem do paciente:
RHD-, RHCE cc ee, K2K2, FY A/FY B, JK A/JK B, Ms/NsRHD-, RHCE cc ee, K2K2, FY A/FY B, JK A/JK B, Ms/Ns
– Análise sorológica complementar sorológica complementar
adsorções alogênicas com hemácias rr, K-, S- para retirada do autoacadsorções alogênicas com hemácias rr, K-, S- para retirada do autoac
– Conclusão: Aloanticorpos detectados:anti-E, -KConclusão: Aloanticorpos detectados:anti-E, -K
Componente selecionado para a transfusãoComponente selecionado para a transfusão:: Fenótipo rr, Fenótipo rr,
K-, S-K-, S-
Genotipagem eritrocitária na prática Genotipagem eritrocitária na prática clínicaclínica
Caso clínico 3:Caso clínico 3:
Paciente falciforme aloimunizado com anti-E, anti-K e Paciente falciforme aloimunizado com anti-E, anti-K e
anti-Jkanti-Jka a recebendo sangue fenótipo compatívelrecebendo sangue fenótipo compatível
Fenotipagem do paciente: R0r, K-k+, Fy(a-b-), Jk(a-b+)Fenotipagem do paciente: R0r, K-k+, Fy(a-b-), Jk(a-b+)
Genotipagem do paciente: Genotipagem do paciente: RHD+, RHCE cc eeRHD+, RHCE cc ee , , K2K2,K2K2, FY FY
B/FY BB/FY B (Gata mutado), (Gata mutado), JK B/JK BJK B/JK B
Conclusão: Paciente pode receber sangue Fy(b+)Conclusão: Paciente pode receber sangue Fy(b+)
Componente selecionado para a transfusão:Componente selecionado para a transfusão:
Fenótipo Fenótipo R0r, K-, Fy(a-b+), Jk(a-)R0r, K-, Fy(a-b+), Jk(a-)
Genotipagem eritrocitária na prática Genotipagem eritrocitária na prática clínicaclínica
Caso clínico 4:Caso clínico 4:
Paciente sexo feminino, 27 anos, história de 1 Paciente sexo feminino, 27 anos, história de 1
transfusão anterior, nenhuma gestação ou abortotransfusão anterior, nenhuma gestação ou aborto
Aloimunizada com anti-D Aloimunizada com anti-D
Fenotipagem da paciente: D-Fenotipagem da paciente: D-
Fenotipagem do doador da hemácia transfundida: Fenotipagem do doador da hemácia transfundida:
D- D-
Genotipagem eritrocitária na prática Genotipagem eritrocitária na prática clínicaclínica
Genotipagem da paciente: Genotipagem da paciente: RHD-RHD-Genotipagem do doador: D fraco tipo Genotipagem do doador: D fraco tipo 11
(RH CE)(RH CE) 236pb 236pb
((RH D)RH D) 115pb 115pb
245pb (245pb (RH D)RH D)160pb (160pb (RH CE)RH CE)
Exon 10Exon 10
50p
b50
pb
Intron 4Intron 4
RH
D+
RH
D+
RH
D-
RH
D-
RH
DF
1
Ctl
100p
b
Exon 6Exon 6
Caso clínico 4:Caso clínico 4:
Genotipagem eritrocitária na prática Genotipagem eritrocitária na prática clínicaclínica
Caso clínico 5:Caso clínico 5:
Paciente falciforme aloimunizado com anti-D e anti-KPaciente falciforme aloimunizado com anti-D e anti-K
Fenotipagem do paciente: RFenotipagem do paciente: R00r (D fraco), K-k+r (D fraco), K-k+
Genotipagem do paciente: Genotipagem do paciente: RHD+, RHCE cc eeRHD+, RHCE cc ee , , K2K2K2K210
0bp
RH
Dcc
100
pb
RH
ee
100
pb
K2K
2
Genotipagem eritrocitária na prática Genotipagem eritrocitária na prática clínicaclínica
Genotipagem complementar: D parcial DARGenotipagem complementar: D parcial DAR
Componente selecionado para a transfusão:Componente selecionado para a transfusão:
Fenótipo rr, K-Fenótipo rr, K-
PC
R
DA
R
DA
R
262pb234pb
45pb
Genotipagem eritrocitária na prática Genotipagem eritrocitária na prática clínicaclínica
Caso clínico 5:Caso clínico 5:
• D fracos tipos 1> 4> 3> 2 mais frequentesD fracos tipos 1> 4> 3> 2 mais frequentes
• Anti-D IgM: pacientes; anti-D IgG:doadoresAnti-D IgM: pacientes; anti-D IgG:doadores
• Reatividades < 1+ com anti-D IgG na AGH podem indicar a presença de DAR, DVI, DHMiReatividades < 1+ com anti-D IgG na AGH podem indicar a presença de DAR, DVI, DHMi
Aspectos práticosAspectos práticosAspectos práticosAspectos práticos
Caso clínico 6:Caso clínico 6:
Paciente falciforme aloimunizado com anti-e like, anti-E e Paciente falciforme aloimunizado com anti-e like, anti-E e
provável anti-Dprovável anti-D
Fenotipagem do paciente: B, D+C+E-c+e+Fenotipagem do paciente: B, D+C+E-c+e+
Sangue selecionado para a transfusão: RSangue selecionado para a transfusão: R22RR22 e rr e rr
(incompatível) (incompatível)
Genotipagem do paciente: Genotipagem do paciente: RHD+, RHCE cc eeRHD+, RHCE cc ee , ,
Genotipagem complementar (e-parcial): Genotipagem complementar (e-parcial): ceces s (hr(hrBB-)-)
Genotipagem complementar (D-parcial): Genotipagem complementar (D-parcial): DIIIa DIIIa
Componente selecionado para a transfusão: Componente selecionado para a transfusão:
Fenótipo hrFenótipo hrBB-, D--, D-
Genotipagem eritrocitária na prática Genotipagem eritrocitária na prática clínicaclínica
Pacientes descendentes de Africanos com Pacientes descendentes de Africanos com
variantes do gene variantes do gene RHCERHCE ( (ceMO, ceEK, ceAR, ceMO, ceEK, ceAR,
ceBIceBI) podem desenvolver anti-e-like, incluindo ) podem desenvolver anti-e-like, incluindo
anti-hranti-hrBB, anti-hr, anti-hrs s
Estes pacientes podem também desenvolver Estes pacientes podem também desenvolver
anti-D (DIIIa, DAR)anti-D (DIIIa, DAR)
RHD parcialRHD parcial
RHDRHD
RHD parcialRHD parcial
RhCeRhCe
e parciale parcial
e parciale parcial
Anti-D
e-parcial: -hrB/-hrs
Anti-D+e-like(-hrB/-hrs)
Aspectos práticosAspectos práticosAspectos práticosAspectos práticos
Pacientes
Normal D
2
DIIIa/DAR
2
DAR
3,1 1,5
4
1,5
Castilho et al, 2004
DIIIa
130
%
122
94
3 pacientes desenvolveram anti-D (1 DAR e 2 DIIIa/ DAR)
DIIIa e DAR em pacientes com anemia falciforme
Aspectos práticosAspectos práticosAspectos práticosAspectos práticos
Caso clínico 7:Caso clínico 7:
Paciente falciforme aloimunizado com anti-C e anti-K Paciente falciforme aloimunizado com anti-C e anti-K
Fenotipagem do paciente: R2R2, K-k+Fenotipagem do paciente: R2R2, K-k+
Genotipagem do paciente: Genotipagem do paciente: RHD+, RHCE cc EeRHD+, RHCE cc Ee , , K2K2K2K2
Genotipagem complementar: VS+, Cys16 Genotipagem complementar: VS+, Cys16
Conclusão: e+Conclusão: e+ff (variante): paciente R2r (variante): paciente R2r
Componente selecionado para a Componente selecionado para a
transfusão:transfusão:Fenótipo R2r K-Fenótipo R2r K-
Genotipagem eritrocitária na prática Genotipagem eritrocitária na prática clínicaclínica
* Anti-soros monoclonais
anti-e (MS63)
anti-e (MS16, MS21)
HaplótiposHaplótipos
Ror (56)Ror (56) 5656
22
1616CysCys 1616TrpTrp VS+VS+
5050
r r (2)r r (2) 00
00
VS-VS-
66
00 22
Cys16 e VS associados ao alelo Rhce em pacientes falciformesCys16 e VS associados ao alelo Rhce em pacientes falciformesCys16 e VS associados ao alelo Rhce em pacientes falciformesCys16 e VS associados ao alelo Rhce em pacientes falciformes
*R*R22r (2)r (2) 22 00 22 00
Rodrigues & Castilho, Vox Sang.2002
Aspectos práticosAspectos práticosAspectos práticosAspectos práticos
Caso clínico 8:Caso clínico 8:
Paciente talassêmico aloimunizado com anti-c, anti-K, Paciente talassêmico aloimunizado com anti-c, anti-K,
anti-Jkanti-Jkaa e outro aloac? Recebendo sangue fenótipo e outro aloac? Recebendo sangue fenótipo
compatívelcompatível
Fenotipagem do paciente: R0r, K-k+, Fy(a+b-), Jk(a-b+), Fenotipagem do paciente: R0r, K-k+, Fy(a+b-), Jk(a-b+),
M+N+S+s+M+N+S+s+
Genotipagem do paciente: Genotipagem do paciente:
RHD+ RHCE cc ee, K2K2, FY A/FY A, JK B/JK B, MS/NsRHD+ RHCE cc ee, K2K2, FY A/FY A, JK B/JK B, MS/Ns
Genotipagem eritrocitária na prática Genotipagem eritrocitária na prática clínicaclínica
Caso clínico 8:Caso clínico 8:
Análise molecular complementar: Análise molecular complementar:
DO A/DO ADO A/DO A
Análise sorológica complementar Análise sorológica complementar
adsorção com hemácias R0r, K-, Fy(b-), Jk(a-), Do(b+) /eluição): anti-adsorção com hemácias R0r, K-, Fy(b-), Jk(a-), Do(b+) /eluição): anti-
DoDobb
Conclusão: Paciente portador de anti-c, -K, -JkConclusão: Paciente portador de anti-c, -K, -Jkaa, Do, Dobb
Componente selecionado para a transfusão:Componente selecionado para a transfusão: Fenótipo R0r, K-, Fy(b-), Fenótipo R0r, K-, Fy(b-),
Jk(a-), Do(b-) Jk(a-), Do(b-)
DOA/A DOA/ADOB/B
Genotipagem eritrocitária na prática Genotipagem eritrocitária na prática clínicaclínica
• Identificação de anticorpos anti-DoIdentificação de anticorpos anti-Do
• Possibilidade de genotipar os doadores e Possibilidade de genotipar os doadores e
selecionar hemácias antígeno-negativas selecionar hemácias antígeno-negativas
• Maior aproveitamento transfusionalMaior aproveitamento transfusional
IMPORTÂNCIA CLÍNICA
Aspectos práticosAspectos práticosAspectos práticosAspectos práticos
Genotipagem DombrockGenotipagem DombrockGenotipagem DombrockGenotipagem Dombrock
Caso clínico 9:Caso clínico 9:
Gestante aloimunizada (20Gestante aloimunizada (2000 semana) semana)
Anticorpo identificado: Anti-D (título: 512)Anticorpo identificado: Anti-D (título: 512)
Fenótipo da paciente: rr Fenótipo da paciente: rr
Genotipagem eritrocitária na prática Genotipagem eritrocitária na prática clínicaclínica
Teste complementarTeste complementar: Zigozidade paterna,: Zigozidade paterna,
genotipagem fetal através do plasma maternogenotipagem fetal através do plasma materno
Zigozidade paterna Genotipagem RHD Zigozidade paterna Genotipagem RHD fetalfetal
Gestação não monitoradaGestação não monitorada
PC
R
RH
D+
/D-
1888pb 1888pb
744pb 744pb
3100pb3100pb
397pb 397pb 564pb 564pb
Ctl
+
Ctl
+
RH
D-
RH
D-
Genotipagem eritrocitária na prática Genotipagem eritrocitária na prática clínicaclínica
I4 Ex10
Caso clínico 10:Caso clínico 10:
Gestante aloimunizada (12Gestante aloimunizada (1200 semana) semana)
Anticorpo identificado: Anti-D (título: Anticorpo identificado: Anti-D (título:
512)512)
Fenótipo da paciente: rr Fenótipo da paciente: rr
Genotipagem eritrocitária na prática Genotipagem eritrocitária na prática clínicaclínica
Zigozidade paterna Genotipagem RHD Zigozidade paterna Genotipagem RHD fetalfetal
PC
R
RH
D+
/D+
1888pb 1888pb
744pb 744pb
3100pb3100pb
397pb 397pb
RH
D+
RH
D+
RH
D-
RH
D-
Gestação sistematicamente Gestação sistematicamente
monitoradamonitorada
Genotipagem eritrocitária na prática Genotipagem eritrocitária na prática clínicaclínica
Situações em que genótipo e Situações em que genótipo e fenótipo podem não fenótipo podem não
correspondercorresponder• Transfusões crônicas/maciçasTransfusões crônicas/maciças
• Alteração no gene afetando: transcrição (Fyb-); splicing Alteração no gene afetando: transcrição (Fyb-); splicing
(S-s-); introdução de stop codon (Fy(a-b-), Rh(S-s-); introdução de stop codon (Fy(a-b-), Rhnullnull), ou ), ou
mutação que afeta a estabilidade da proteina na mutação que afeta a estabilidade da proteina na
membrana da célula (Fymembrana da célula (Fyxx))
• Crossing overs e outros rearranjos gênicos (Crossing overs e outros rearranjos gênicos (RHD/RHCERHD/RHCE))
• Alteração em outro gene que está associado com a Alteração em outro gene que está associado com a
expressão do gene : expressão do gene : RHAGRHAG RhRhnullnull
Implementação da Implementação da genotipagem para uso clínicogenotipagem para uso clínico
• Amostras de sangue fenotipadas devem ser analisadas Amostras de sangue fenotipadas devem ser analisadas
por PCR em estudo cego para avaliação do métodopor PCR em estudo cego para avaliação do método
• O número de amostras usadas na validação de um O número de amostras usadas na validação de um
teste deve incluir o máximo de variantes genéticas teste deve incluir o máximo de variantes genéticas
presentes na população para a qual o teste vai ser presentes na população para a qual o teste vai ser
utilizadoutilizado
• População Europeia Vs População BrasileiraPopulação Europeia Vs População Brasileira
• Revalidação do teste com novas variantesRevalidação do teste com novas variantes
• Participação em testes de proficiênciaParticipação em testes de proficiência
Genética molecular dos sistemas eritrocitários na Genética molecular dos sistemas eritrocitários na população brasileirapopulação brasileira
• Melhoria da qualidade e exatidão dos resultados Melhoria da qualidade e exatidão dos resultados
imunohematológicosimunohematológicos
• Determinação de novas variantes alélicas não descritas em Determinação de novas variantes alélicas não descritas em
outras populações (outras populações (DIA/166ADIA/166A, , FY145, RhnullFY145, Rhnull))
• Identificação de variantes alélicas de origem Africana Identificação de variantes alélicas de origem Africana
(GATA, (GATA, RHDRHD, , RHD-CE-DRHD-CE-Dss, , VSVS, , DIIIaDIIIa, , DARDAR))
• Elaboração de protocolos de genotipagem eficientes Elaboração de protocolos de genotipagem eficientes
Genotipagem de grupos sanguíneos na clínica requer:Genotipagem de grupos sanguíneos na clínica requer:
– Conhecimento em grupos sanguíneos Conhecimento em grupos sanguíneos
– Experiência na interpretação das reações de PCR utilizadasExperiência na interpretação das reações de PCR utilizadas
– Obtenção dos achados sorológicos e da história clínica do Obtenção dos achados sorológicos e da história clínica do
paciente antes de interpretar os resultados da paciente antes de interpretar os resultados da
genotipagemgenotipagem
– Conhecimento dos genes que codificam os antígenos de GS Conhecimento dos genes que codificam os antígenos de GS
e suas formas variantes (fenótipos e genótipos podem não e suas formas variantes (fenótipos e genótipos podem não
correlacionar) na população estudadacorrelacionar) na população estudada
Genética molecular dos sistemas Genética molecular dos sistemas eritrocitárioseritrocitários
Genética molecular dos sistemas Genética molecular dos sistemas eritrocitárioseritrocitários
• A genotipagem de grupos sanguíneos é uma ferramenta A genotipagem de grupos sanguíneos é uma ferramenta útil na medicina transfusional e apresenta gradualmente útil na medicina transfusional e apresenta gradualmente um número crescente de aplicações. Torna-se poderosa um número crescente de aplicações. Torna-se poderosa quando associada a hemalutinaçãoquando associada a hemalutinação
• Os métodos moleculares permitem obter um melhor Os métodos moleculares permitem obter um melhor conhecimento da distribuição dos grupos sanguíneos e conhecimento da distribuição dos grupos sanguíneos e suas bases moleculares na população brasileirasuas bases moleculares na população brasileira
• Achados moleculares na população brasileira ajudam a Achados moleculares na população brasileira ajudam a desenvolver protocolos mais seguros para genotipagem de desenvolver protocolos mais seguros para genotipagem de grupos sanguíneos em nossos laboratóriosgrupos sanguíneos em nossos laboratórios
Genética molecular dos sistemas Genética molecular dos sistemas eritrocitárioseritrocitários
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