lilian castilho, phd sistema rh simpósio hemopasso passo fundo, 24 a 26/03/2008

Lilian Castilho, PhDLilian Castilho, PhD

Sistema RhSistema RhSistema RhSistema Rh

Simpósio Hemopasso Passo Fundo, 24 a 26/03/2008

Sistema RhSistema Rh Sistema RhSistema Rh

Sistema complexo 49 antígenos muitos fenótipos no mínimo 200 alelos um fenótipo pode gerar vários genótipos

Principais antígenos D; C/c; E/e 8 haplótipos: Dce(R1),Ce(r’), DcE(R2), cE(r”),

Dce(R0), ce(r), DCE(RZ), CE(ry)

Sistema Rh:TerminologiaSistema Rh:Terminologia Sistema Rh:TerminologiaSistema Rh:Terminologia

Rh não Rhesus Sistema ISBT: 004 Símbolo ISBT: RH Fenótipo: D+C+E-c+e+

RH:1,2-3,4,5 Dce/ce ou Dce/dce=R1r Provável genótipo: DCE/ce, RH*1,2,5/RH*4,5 ou R1r

Questões frequentemente realizadasQuestões frequentemente realizadas Questões frequentemente realizadasQuestões frequentemente realizadas

1. Por que RhD é tão imunogênico? Principal causa da DHFR 40-75% dos D- tornam-se aloimunizados quando expostos a hemácias D+

2. Por que o sistema Rh é tão complexo? - Número elevado de antígenos D, C/c, E/e (comuns) ~outros 40 Variantes - Diferenças na expressão de D D positivo ou D negativo? - D fraco - D parcial

3. Por que grupos étnicos Africanos/ Hispânicos desenvolvem anticorpos RhD complicados? Anti-D em D+, D fraco

Locus RHLocus RHDuplicação de 2 GenesDuplicação de 2 Genes

Locus RHLocus RHDuplicação de 2 GenesDuplicação de 2 Genes

antígeno D antígenos CcEe

ce “Rh negativo” Deletado XEuropeus- 15-17%

X

“Rh positivo”RHD RHCE

ce, Ce, cE, or CE

Circulos- representam 32-35 diferentes amino acidos entre RhD e RhCE

RhCERhD

C/c E/e

1. Esta diferença explica por que RhD é tão imunogênico Maioria dos antígenos de grupos sanguíneos diferem em um (ou poucos)

aa

2. Por que o sistema Rh é tão 2. Por que o sistema Rh é tão complexo ?complexo ?2. Por que o sistema Rh é tão 2. Por que o sistema Rh é tão complexo ?complexo ?

antígeno D antígenos CcEe

RHD5’ 3’

RHCE5’ 3’ ce, Ce, cE, or CE

- Localização no cromossomo- genes muito próximos - Orientação – final 3’ face a face um com outro

5’

RH

D5’

RH

CE

3’3 Durante a replicação cromossômica formação de hair-pinstrocas ocorrem

- um atua como template para a porção do outro

“Conversão gênica” Principal causa para a diversidade RH

Diferenças na expressão de RhDDiferenças na expressão de RhD Diferenças na expressão de RhDDiferenças na expressão de RhD

D-positivo – Maioria tem o gene RHD – MAS HÁ EXCEÇÕES

D-negativo - 15-17% Europeus- devido a deleção RHD 3-7% Africanos, 0.5-1% Asiáticos – devido a mutações RHD

D Fraco – requer teste indireto da antiglobulina para detecção trocas de único amino ácido (transmembrana)

diminuição na QUANTIDADE DE RhD 53 “tipos de D fracos” diferentes

Del - expressão muito fraca de D- não detectável por sorologia adsorve e elui anti-D

mais comum em populações Asiáticas

D Parcial –epítopos de D alterados tipam como D+ mas desenvolvem anti-D

Causas – Troca de único amino ácido na superfície da hemácia - Parte do gene RHD substituído pelo RHCE

1. Alguns são difíceis de detectar com reagentes sorológicosDiscrepâncias na tipagem: D- com um reagente; D+ com outro Se unidades de sangue de doador são rotuladas como D- podem

estimular anti-D em receptores D-

Exemplos: D Fraco tipo 2 D Fraco com RHCe em trans Del- nenhum reagente detecta

Problemas devido a D Fraco e DProblemas devido a D Fraco e DelelProblemas devido a D Fraco e DProblemas devido a D Fraco e Delel

RhDFraco

V270GTipo 1

2. Alguns pacientes desenvolvem anti-D Preconizado- maioria dos pacientes com D fraco não desenvovem anti-D - altera quantidade da proteína, mas não os epítopos D da supefície - Não é regra para todos os tipos de D fracos – difícil de pré determinar

Proteína D FracoProteína D FracoProteína D FracoProteína D Fraco RhD: 10.000 a 25.000 sítios/hemácias

D Fraco: densidade antigênica varia de acordo com o tipo de D fraco: 66 a 5.000 sítios/hemácia

300

500

1000

1500

2500 tipo 4tipo 4

tipo 3tipo 3

tipo 1tipo 1

tipo 2tipo 2

tipo 5tipo 5

Cut off sorológico= 500 ags/hemácias

D fraco tipo 5: geralmente tipados como RhD-negativo

Proteína Del

RhD: 10.000 a 25.000 sítios/hemáciasDel: densidade antigênica: < 50

sítios/hemácia

Cut off sorológico=500 ags/hemácias

Del: geralmente tipados como RhD-negativo

DEL encontrado nos raros Asiáticos RhD-negativos e são C+ ou E+

Hemácias D Parcial tipam como D+ e não são identificadas até que o paciente desenvolva anti-D

possuem epítopos de D alterados

Problemas com D ParcialProblemas com D Parcial Problemas com D ParcialProblemas com D Parcial

NH2

DMH- L54P DFW- H166P DHMi- T283I DII- A354DDVII- L110P DHR- R229K DNU-G353R DNB- G355S

- Devido a mutações localizadas na região extracelular

- Devido a proteínas RhD/RhCE híbridas DIII DIV DV DVI DBT DAR DOL DAU etc.

Proteína D Parcial

RhD: 10.000 a 25.000 sítios/hemáciasD parcial: densidade antigênica: 500 a 25.000

sítios/hemácia

D Cat VI e DAR: podem ser tipados como RhD-negativo

Tipagem RhD: positivo ou negativo?Tipagem RhD: positivo ou negativo? Tipagem RhD: positivo ou negativo?Tipagem RhD: positivo ou negativo?

* até resolver a discrepância: painel de monoclonais ou genotipagem

Anti-D#1Anti-D#1

(IgM)(IgM)

Anti-D#2 Anti-D#2

(IgM)(IgM)

ResultadoResultado TransfusãoTransfusão

POSPOS POSPOS RhD+RhD+ RhD+RhD+

NEGNEG NEGNEG RhD-RhD- RhD-RhD-

POSPOS NEGNEG DF/DP?DF/DP? RhD-*RhD-*

NEGNEG POSPOS DF?DP?DF?DP? RhD-*RhD-*

Pacientes

Tipagem RhD: positivo ou negativo?Tipagem RhD: positivo ou negativo? Tipagem RhD: positivo ou negativo?Tipagem RhD: positivo ou negativo?

* genotipagem?** até resolver a discrepância: genotipagem

Anti-D#1Anti-D#1

(IgG/AGH)(IgG/AGH)

ResultadoResultado Transfundir Transfundir para para

pacientespacientes

POSPOS RhD+RhD+ RhD+RhD+

NEGNEG RhD-RhD- RhD-*RhD-*

POS FracoPOS Fraco DF/DP?DF/DP? RhD-**RhD-**

Doadores

Voce sabe qual é sua unidade

RhD-negativo?

D Fraco ou D parcial?D Fraco ou D parcial?D Fraco ou D parcial?D Fraco ou D parcial?

Identificação em gelIdentificação em gel

Painel com 12 soros monoclonais Painel com 12 soros monoclonais (DII, DNU, DIII, DIV, DV, DVI, DVII, DFR, DBT, (DII, DNU, DIII, DIV, DV, DVI, DVII, DFR, DBT,

DHAR, DAR, DCS, DOL, DHK/DAU-4, Weak D 5,7, Weak D type 38)DHAR, DAR, DCS, DOL, DHK/DAU-4, Weak D 5,7, Weak D type 38)

D Fraco ou D parcial?D Fraco ou D parcial?D Fraco ou D parcial?D Fraco ou D parcial?

D Fraco ou D neg?D Fraco ou D neg?D Fraco ou D neg?D Fraco ou D neg?

D FracoD FracoD FracoD Fraco

D-neg, D fraco ou DD-neg, D fraco ou Delel ? ?D-neg, D fraco ou DD-neg, D fraco ou Delel ? ?

–

D conf.

D-neg, D fraco ou DD-neg, D fraco ou Delel ? ?D-neg, D fraco ou DD-neg, D fraco ou Delel ? ?

–

D Fraco tipo 38

D-neg, D Fraco ou DD-neg, D Fraco ou Delel ? ?D-neg, D Fraco ou DD-neg, D Fraco ou Delel ? ?

DEL RHD(M295I)

D FracoD FracoD FracoD Fraco

IgG IgM

PAP

DF1

DF4

DV

I

Problemas nos testes sorológicos

Testes sorológicos não distinguem D fraco de D parcial com fraca expressão

Testes sorológicos não detectam alguns D fracos, Del e D parcial

Testes sorológicos associados a testes moleculares auxiliam na identificação de

variantes do antígeno D

Testes sorológicos associados a testes moleculares auxiliam na identificação de

variantes do antígeno D

D Fraco e D parcial

Imunizam receptores D-negativos

Desenvolvem anti-D

Casos enviados ao nosso laboratório para Casos enviados ao nosso laboratório para genotipagem RHD (2007)genotipagem RHD (2007)

Casos enviados ao nosso laboratório para Casos enviados ao nosso laboratório para genotipagem RHD (2007)genotipagem RHD (2007)

TuboTubo GelGel

Variações de DVariações de D IgMIgM PoliPoli DVI+DVI+ DVI-DVI- Dconf.Dconf.

DF1DF1 0/(+)0/(+) 0/1+0/1+ 0/2+0/2+ 0/1+0/1+ 1+/3+1+/3+

DF2DF2 00 00 0/2+0/2+ 00 2+/3+2+/3+

DF3DF3 0/2+0/2+ 0/1+0/1+ 2+2+ 2+2+ 4+4+

DF4DF4 0/2+0/2+ 0/2+0/2+ (+)/3+(+)/3+ 1+/3+1+/3+ 4+4+

DVIDVI 0/1+0/1+ 0/1+0/1+ 0/2+0/2+ 00 1+/4+1+/4+

DF1+DF2DF1+DF2 0/3+0/3+ 02+02+ (+)/2+(+)/2+ (+)/2+(+)/2+ 3+3+

DF1+DF4DF1+DF4 0/2+0/2+ 0/1+0/1+ (+)/4+(+)/4+ (+)/4+(+)/4+ 4+4+

DF1+DF2+DF3DF1+DF2+DF3 3+3+ 2+2+ 2+2+ 3+3+

Amostras Tipos de D fraco e D parcial

Graus de aglutinação Densidades antigênicas

Anti- D mono (gel)

Anti-D conf(gel)

9 DF1 2+ 3+ 1273

4 DF2 0 1+ 462

1 DF3 1+ 3+ 1936

13 DF4 2+ 4+ 2184

2 DAR 0 1+ 988

1 DHMi 0 1+ 1112

3 DVI (+) 1+ 1050

2 DF1/DHMi (+) 2+ 1577

1 DF4/DAR (+) 2+ 1432

ReagentesReagentes anti-D na detecção de D fraco e D parcialanti-D na detecção de D fraco e D parcialReagentesReagentes anti-D na detecção de D fraco e D parcialanti-D na detecção de D fraco e D parcial

Genotipagem RHD em doadores de sangueGenotipagem RHD em doadores de sangue Genotipagem RHD em doadores de sangueGenotipagem RHD em doadores de sangue

Indicações:Indicações: Discriminar D neg de DEL e D posDiscriminar D neg de DEL e D pos Discriminar D parcial e D FracoDiscriminar D parcial e D Fraco LimitaçõesLimitações CustoCusto TempoTempo Imunogenicidade de DEL?Imunogenicidade de DEL? Quem deveria ser testado?Quem deveria ser testado? Doadores de primeira vezDoadores de primeira vez Doadores de repetição (discrepâncias) Doadores de repetição (discrepâncias)

Esta unidade é RH

compatível?

Aplicações clínicasAplicações clínicasGenotipagem RHGenotipagem RH

Aplicações clínicasAplicações clínicasGenotipagem RHGenotipagem RH

Pacientes com fenótipos D fracoPacientes com fenótipos D fraco D fracos mais frequentes devem ser transfundidos com D fracos mais frequentes devem ser transfundidos com

hemácias RhD pos hemácias RhD pos (3 a 6% das unidades RhD-neg são (3 a 6% das unidades RhD-neg são preservadas)preservadas)

Doadores de sangueDoadores de sangue Triagem para DEL e D fraco entre doadores sorológicamente Triagem para DEL e D fraco entre doadores sorológicamente

D neg D neg (prevenção da aloimunização)(prevenção da aloimunização)

Fenótipo D fraco Transfusão

D fraco tipo 1 RhD-positivo



D fraco tipo 4.0 RhD-positivo

D fraco tipo 4.1 RhD-positivo

D fraco tipo 4.2 RhD-negativo

D fraco tipo 5 RhD-negativo



Outros tipos RhD-negativo

Recomendações clínicas para pacientes com o fenótipo D fraco

Recomendações clínicas para pacientes com o fenótipo D fraco

Caso ClínicoCaso ClínicoCaso ClínicoCaso Clínico

Paciente Afro brasileira, sexo feminino, 36 anos Paciente Afro brasileira, sexo feminino, 36 anos com sangramento vaginalcom sangramento vaginal

Solicitado 2 unidades de sangueSolicitado 2 unidades de sangue2 gestações2 gestaçõesTipada como O Tipada como O RhD+RhD+Anti-DAnti-D fraco detectado no soro fraco detectado no soroSem história de profilaxia Rh (óbvio!)Sem história de profilaxia Rh (óbvio!)

Anti-D DIII DIV DV DVI DVII DAR DFR Paciente

1 + + +/- - + + + 3+

2 + - + + + + + 3+

3 + +/- +/- - + - - 3+

4 + + + - + + + 3+

5 + - +/- - + - + 3+

6 + - + + + + + 3+

Soro testado com painel de 6 monoclonais para detectar D parcial


Suspeitas:Suspeitas: D Normal – mas por que o anticorpo?D Normal – mas por que o anticorpo? DDIIIIII? ? DDVIIVII?? Outro D parcial?Outro D parcial?

Análise Molecular – screening rotina mostou Análise Molecular – screening rotina mostou RHD RHD normalnormal

Nenhum gene híbrido presenteNenhum gene híbrido presente


Análise do DNAAnálise do DNAAnálise do DNAAnálise do DNA

PCR-SSP para DVII: negativoPCR-SSP para DVII: negativoPCR-RFLP para DIIIa: positivoPCR-RFLP para DIIIa: positivoDIIIa!DIIIa!Paciente possuía o fenótipo D parcialPaciente possuía o fenótipo D parcialAnti-D era um aloanticorpoAnti-D era um aloanticorpoPaciente ficou muito brava porque seu tipo de Paciente ficou muito brava porque seu tipo de

sangue estava errado!sangue estava errado!


Paciente Caucasóide, sexo masculino, suspeita Paciente Caucasóide, sexo masculino, suspeita de AHAI de AHAI

PAI positiva, Auto e TDA positivosPAI positiva, Auto e TDA positivosAnti-D detectado no soro e eluatoAnti-D detectado no soro e eluatoPaciente tipado como D+ Paciente tipado como D+ Anti-D: Anti-D: auto ou alo?auto ou alo?Genotipagem!!!!Genotipagem!!!!


Análise molecular de rotina demonstrou um Análise molecular de rotina demonstrou um gene gene RHDRHD normal normal

Nenhum gene híbrido presente, não era DIII e Nenhum gene híbrido presente, não era DIII e nem DVIInem DVII

Sequenciamento do gene Sequenciamento do gene RHDRHD: : normalnormalConclusão: Conclusão: auto-anti-Dauto-anti-D


Doador com 9 doações préviasDoador com 9 doações préviasFenotipado como O RhD-neg em todas as doaçõesFenotipado como O RhD-neg em todas as doaçõesNa 10Na 1000 doação: Suspeita de doação: Suspeita de D Fraco ou DelD Fraco ou Del??Genotipagem!!!!Genotipagem!!!!


Análise molecular demonstrou um gene Análise molecular demonstrou um gene RHDRHD deletadodeletado

Nenhum D fraco, DEL e D parcial detectadoNenhum D fraco, DEL e D parcial detectadoConclusão: Doador Conclusão: Doador RhD-negativoRhD-negativo

Muitas regiões do gene devem ser analisadas Muitas regiões do gene devem ser analisadas Geralmente requer sequenciamento do gene inteiroGeralmente requer sequenciamento do gene inteiroNecessidade de genotipagem por microarrayNecessidade de genotipagem por microarrayConhecimento das mudanças no gene que alteram Conhecimento das mudanças no gene que alteram

os epítopos da proteína = clinicamente significantesos epítopos da proteína = clinicamente significantes

Problemas para resolver variantes RHDProblemas para resolver variantes RHDProblemas para resolver variantes RHDProblemas para resolver variantes RHD

Em Africanos, Hispânicos, e grupos étnicos mistos com um gene híbrido D-CE-D específico

Este haplótipo RH é frequente em pacientes falciformes aproximadamente 22% Africanos

15 %

Fenótipo C positivo; desenvolve anti-C Gene híbrido D-CE-D associado a variante e; desenvolve anti-e

L245Vces

W16C

D/Ce/D híbrido: D-negativo C-positivo

RHD RHCE

Variante ce

Variantes RHCEProblemas na fenotipagem do antígeno C

Variantes RHCEProblemas na fenotipagem do antígeno C

Frequentes em pacientes falciformes

G336CL245Vces

W16C

V223F

ceMOW16C

M238V L245V R263G M267K I306V ceAR

W16C

M238V A273V L378V ceBI

W16C

ceEKM238V R263G M267K W16C

ce “convencional”

Muitos genes diferentes, todos com expressão alterada do antígeno e

Fenótipo e-positivo Desenvolvem anti-e e/ou anti-ce

Em Africanos, Hispânicos, e grupos étnicos mistos

Variantes RHCEProblemas na fenotipagem do antígeno e

Variantes RHCEProblemas na fenotipagem do antígeno e

Antígenos Rh (D, C/c, E/e) são resistentes ao tratamento por enzimas, DTT, cloroquina

Antígenos do Sistema RhAntígenos do Sistema Rh Antígenos do Sistema RhAntígenos do Sistema Rh

Anticorpos do Sistema RhAnticorpos do Sistema Rh Anticorpos do Sistema RhAnticorpos do Sistema Rh Alo-anticorpos

anti-D, -E, -c, -C, -e

IgM ou IgG

reativos a 37oC, AGH, enzimas

clinicamente significantes

Auto-anticorpos

frequentes (anti-e)

Alo-anticorpos

anti-D, -E, -c, -C, -e

IgM ou IgG

reativos a 37oC, AGH, enzimas

clinicamente significantes

Auto-anticorpos

frequentes (anti-e)

Anticorpos do Sistema RhAnticorpos do Sistema Rh Anticorpos do Sistema RhAnticorpos do Sistema Rh

Alo-anticorposanti-C associado a anti-G Anti-C associado a anti-eanti-E associado a anti-canti-e detectado em hemácias e-positivas

Alo-anticorposanti-C associado a anti-G Anti-C associado a anti-eanti-E associado a anti-canti-e detectado em hemácias e-positivas

PerspectivasPerspectivasPerspectivasPerspectivasGenótipoGenótipo FenótipoFenótipo

aglutinação DNA

+

Tipagem RhD: positivo ou negativoTipagem RhD: positivo ou negativo?? Tipagem RhD: positivo ou negativoTipagem RhD: positivo ou negativo??

Obrigado pela atenção!

lilian castilho, phd sistema rh simpósio hemopasso passo fundo, 24 a 26/03/2008

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