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Genômica

Desenvolvimento e Aplicações

Prof. Manoel

Victor

Definições

• Genoma: informações do complemento genético de um indivíduo ou de sua espécie– freqüentemente entendido como a seqüência de

nucleotídeos do genoma

• Genômica: o estudo dos genomas (ou de suas • Genômica: o estudo dos genomas (ou de suas seqüências)

• Transcriptoma: o conjunto de mRNAs presentes em um indivíduo, orgão ou célula

• Proteoma: o conjunto de proteínas presentes em um organismo, órgão ou célula

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Perspectivas históricas

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Total de Projetos Genoma (15/05/07)

• 2516 Projetos

– 556 genomas completos

• em andamento

– 1108 Eubacterias– 1108 Eubacterias

– 59 Archaea-bacterias

– 720 eucariotos

– 73 metagenomas (DNA extraído do meio: solo, água, etc)

• organismos não cultiváveis por métodos tradicionais

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Construção de um metagenoma

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Primeiro genoma bacteriano

– Fleishmann et al. (1995)

• Haemophilus influenzae - Rd

• Publicação: Science v. 269: 496-512 (1995)• tamanho do genoma: 1,83 Mb

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Segundo genoma bacteriano

– Fleishmann et al. (1995)

• Mycoplasma genitalium – G37• Mycoplasma genitalium – G37

• Publicação: Science v. 270: 397-404(1995)

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Causadora da tuberculose

• Mycobacterium tuberculosis

– Whole-Genome Comparison of

Mycobacterium tuberculosis Clinical and

Laboratory Strains.

J. Bacteriol. v. 184:5479-5490 2002.J. Bacteriol. v. 184:5479-5490 2002.

tamanho do genoma: 4,40 Mb

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Causadora de úlceras gástricas

• Helicobacter pylori

– The complete genome sequence of

the gastric pathogen Helicobacter

pylori. Nature 7;388(6642):539-47,

1997

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Eucariotos

• Saccharomyces cerevisae (1996) – 13 Mb

• Plasmodium falciparum (2002) – 22.9 Mb

• Caenorhabditis elegans (2002) – 100 Mb• Caenorhabditis elegans (2002) – 100 Mb

• Anopheles gambiae (2003) – 278 Mb

• Homo sapiens (2003) – 2900 Mb

• etc

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Objetivos dos Projetos Genoma

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Utilização das informações dos genomas

• informações úteis para compreensão de problemas causados envolvendo:

– saúde pública

– elaboração de estratégias para controle ou – elaboração de estratégias para controle ou erradicação dos agentes etiológicos

– descoberta de terapias

– etc

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Projeto Genoma Humano

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Projeto Genoma Humano 1991

• conseguir as seqüências completas dos 46 cromossomos (todos os genes)

• duração da proposta: cerca de 15 anos

• custo: alguns bilhões de dólares

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Começar com o quê?

• O DNA é o material genético

• A informação genética é codificada na ordem dos nucleotídeos (A, T, C e G)

• O genoma teria ao redor de 109 pb• O genoma teria ao redor de 109 pb

• Estudos de genética molecular indicavam:

– um nível básico de organização do genoma

– a natureza dos genes, existência de elementos de regulação e outros componentes do genoma

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Objetivos a serem atingidos

• a seqüência bruta do genoma humano

– bilhões de As, Ts, Cs e Gs

• a partir daí deduzir:

– a seqüência de todos nossos genes– a seqüência de todos nossos genes

– a seqüência de todas proteínas expressas

• estudos de doenças e/ou malformações genéticas

– estabelecer relações evolutivas

– mecanismos de regulação gênica

– determinar as bases das doenças genéticas e suas suscetibilidades

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Abordagens e estratégias

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Abordagem: seqüenciamento por shotgun

Vetores podem ser

de diferentes tipos:

• plasmidios

• cosmidios

• BACs

• YACs

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Abordagem: seqüenciamento por shotgun

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Abordagem: seqüenciamento por shotgun

• gerar enorme quantidade de seqüências defragmentos de DNA humano utilizandoprocedimentos automatizados

• montagem destas seqüências com auxilio de• montagem destas seqüências com auxilio decomputadores gerar seqüênciascompletas

• anotar as seqüências (identificação dos genes,etc) por computação

– surgimento da BIOINFORMÁTICAProf. Manoel

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Abordagem: seqüenciamento por shotgun

• na media são obtidas seqüências de cerca de 500 pb com boa qualidade

• cobertura de aproximadamente 5 X o tamanho do genoma em estudo

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Montagem das seqüências obtidas por shotgun

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Estatísticas do genoma humano:

• total de seqüências: 3,09 x 109 pb

– lote haplóide

– incluindo ambos os cromossomos X e Y

• existem cerca de 400 “gaps” em lugares • existem cerca de 400 “gaps” em lugares conhecidos (isto de refere a 1% do total de DNA)

• porcentagem de acerto: 99,99%

• custo: US$ 2,7 x 109

• site para download:

– http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seqProf. Manoel

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Banco de genes do NCBI

Crescimento do banco de

genes entre 08/2000 - 2005

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Composição do genoma humano

• montagens de pedaços de seqüências com boa qualidade obtidos de vários indivíduos

• não se trata do genoma de nenhuma pessoa • não se trata do genoma de nenhuma pessoa em particular

• presumivelmente poderá gerar um individuo humano funcional

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A busca por genes!!!!

• proteínas que estão relacionadas à maioria dos processos que ocorrem nas células vivas

– proteínas normais – processos adequados

– proteínas anormais – quadros de doenças!!!!– proteínas anormais – quadros de doenças!!!!

• metabolismo

• desenvolvimento

• susceptibilidade de acometimento

• as proteínas são codificadas por genes

– assim a identificação dos genes passa a ser o objetivo mais importante do Proj. Genoma Humano

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A busca por genes!!!!

• identificação automatizada de ORFs (“open reading

frames”) ou fase de leitura aberta

– seqüências de nucleotídeos do DNA que podem ser usadas para predizer a seqüência de aminoácidos de proteínas em geralaminoácidos de proteínas em geral

• utilização do código genético

– sinais genéticos típicos da linguagem genética dos sistemas celulares

• TATA boxes; genes promotores; genes reguladores; códons de inicio e de término, etc

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Funções dos genes

• cerca de 30.000 genes foram identificados no genoma humano

– duas vezes mais do que na Drosophila

– cinco vezes mais do nas leveduras– cinco vezes mais do nas leveduras

• cerca de 50 % dos genes do genoma humano são idênticos ou muito semelhantes a outros já descritos (rato, verme, etc)

– mas 50 % são únicos (típicos de humanos!!!)

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Contabilidade ...

• a quantidade total de genes corresponde a 1,5% do total de DNA do genoma

– introns contam uma parcela muito grande deste valorvalor

– outra parte grande corresponde aos transposons (que são elementos genéticos móveis) sem função conhecida

• muitos de nossos genes foram recebidos de bactérias e/ou outros invertebrados

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Introgressões ao genoma...

• velocidade: + ou – 600 Megabases/ano (depois da divergência entre Procariotos e Eucariotos)

• tais genes codificam para:•

– proteínas comuns à espécies filogeneticamente mais próximas

• enzimas

• proteínas estruturais

• proteínas de defesa

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Contribuições dos pesquisadores da UNESP/Campus de Jaboticabal

Laboratórios envolvidos:• Lab de Biologia Molecular

• Lab de Bioquímica de Microrganismos

• Lab de Genética de Bactérias

Dpto de Tecnologia

Dpto de Biologia

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Características de alguns genomas bacterianos

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Comparações de tamanho

Xylella fastidiosa

Xanthomonas citri

Xylella fastidiosa

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Causadora do Amarelinho

• Xylella fastidiosa

– The genome sequence of the

plant pathogen Xylella fastidiosa.

Nature 406, 151 - 157 (2000).

CVCProf. Manoel

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Nature 406, 151 - 157 (2.000)Prof. Manoel

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Participação pessoal

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Esquema das fimbrias

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Causadora do Mal de Pierce

• Comparative Analyses of the Complete Genome Sequence of Pierce’s disease and Citrus variegated Chlorosis strains of Xylella fastidiosa. J. Bacteriol. Xylella fastidiosa. J. Bacteriol. v.185:1018-1026, 2003.

PDProf. Manoel

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J. Bacteriol. v.185:1018-1026, 2003

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Comparações entre as duas Xylellas

(MUMmer) Delcher et al 1999

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Comparação PD X CVC

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Comparação de três genomas

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Comparação das 3 Xylellas

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Uso de informações do genoma para definição de rotas metabólicas

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Criação de meios definidos

• inclusão de aminoácidos

específicos e necessários

Curvas de Curvas de

CrescimentoCrescimento

Formação de biofilme

• fechas indicam o local de crescimento do biofilme

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Detecção do Transposon TN1721 em X. fastidiosa

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Avaliação de diversidade genética

• detecção da presença deelementos transponíveis oude suas “pegadas” deixadasno genoma de bactériashospedeirashospedeiras

• isolados de citrus, café,videira e etc.

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Padrões de RFLP dos produtos de PCR do TN1721

Alinhamento de seqüências do TN1721

Causadoras do cancro cítrico

• Xanthomonas

axonopodis pv. citri

• Xanthomonas campestris pv. campestris pv. campestris.

• Comparison of the genomes of two Xanthomonas pathogens with differing host specificities.Nature 417, 459 - 463 (2002).

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Comparação dos genomas

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Comparação dos genomas

Comparações entre as duas Xanthomonas (MuMmer) Delcher et al 1999

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Características das bactérias

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Comparações entre as duas Xanthomonas

• Genes específicos

– 800 genes para X. axonopodis pv. criti

– 646 genes para X. campestris pv. campestris

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Ilhas Genômicas e evolução das bactérias

• ilhas genômicas– Hacker & Kaper

Ann. Rev. Microbiol.

v. 54:641-679 (2000)

• definição– variação no conteúdo de pares – variação no conteúdo de pares

C+G

• surgimento– transferência lateral de genes

• composição– genes de virulência;

patogenicidade,etc

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Perspectivas futuras

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Genomas já disponíveis:

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