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1
Flávia Regina Greiffo
EFEITOS DO TREINAMENTO FÍSICO AERÓBIO NA
INFLAMAÇÃO PULMONAR ALÉRGICA CRÔNICA EM
CAMUNDONGOS:
PAPEL DA SINALIZAÇÃO PURINÉRGICA
Trabalho apresentado à Universidade Nove de Julho como requisito para
obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação.
Orientador: Prof. Dr. Rodolfo de Paula Vieira
São Paulo, SP
2
FLÁVIA REGINA GREIFFO
EFEITOS DO TREINAMENTO FÍSICO AERÓBIO NA
INFLAMAÇÃO PULMONAR ALÉRGICA CRÔNICA EM
CAMUNDONGOS:
PAPEL DA SINALIZAÇÃO PURINÉRGICA
Trabalho apresentado à Universidade Nove de Julho como requisito para
obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação.
Orientador: Prof. Dr. Rodolfo de Paula Vieira
São Paulo, SP
3
Greiffo, Flávia Regina.
Efeitos do treinamento físico aeróbio na inflamação pulmonar alérgica
crônica em camundongos: papel da sinalização purinérgica./ Flávia Regina
Greiffo. 2015.
57 f.
Dissertação (mestrado) – Universidade Nove de Julho - UNINOVE, São
Paulo, 2015.
Orientador (a): Prof. Dr. Rodolfo de Paula Vieira.
1. Asma. 2. Exercício. 3. Doenças respiratórias/ reabilitação. 4. Alergia e
imunologia, I. Vieira, Rodolfo de Paula. II. Titulo
CDU 615.8
4
5
DEDICATÓRIA
Dedico meus estudos à minha mãe Tania e à minha avó Marilia.
6
AGRADECIMENTOS
À minha família e amigos.
Ao professor orientador Rodolfo de Paula Viera, muito obrigada pelas
oportunidades.
À professora e amiga Ana Paula Ligeiro de Oliveira.
Aos demais professores da Universidade Nove de Julho.
À professora Deborah de Camargo Hizume Kunzler - Universidade do Estado de
Santa Catarina.
Ao laboratório de imunologia pulmonar e exercício e Renata, Nicole, Léia e
Vanessa.
Ao professor Milton de Arruda Martins, Fernanda Lapa e Nilsa Damasceno, pela
colaboração neste estudo.
Ao grupo de funcionários da Universidade Nove de Julho, em especial à técnica
Ângela.
À Universidade Nove de Julho, pela concessão da bolsa de estudo.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pelo apoio financeiro
(Processos 2012/23305-9 e 2013/23763-0).
The intellect has little to do on the road to discovery.
There comes a leap in consciousness, call it intuition
or what you will, and the solution comes to you and
you don’t how or why.
—Albert Einstein (1879-1955)
7
SUMÁRIO
Lista de abreviaturas e siglas
Resumo.................................................................................................................................10
Abstract................................................................................................................................12
Introdução............................................................................................................................14
Asma
Definição
Epidemiologia
Fisiopatologia
Inflamação
Receptor purinégico
P2X7
Exercício e asma
Objetivos..............................................................................................................................24
Objetivo Geral
Objetivos Específicos
8
Metodologia.........................................................................................................................26
Animais e grupos experimentais
Modelo de inflamação pulmonar alérgica crônica
Modelo de treinamento físico aeróbio de intensidade moderada
Eutanásia dos animais, coleta do soro sanguíneo e níveis de citocinas no soro
sanguíneo
Avaliação da inflamação pulmonar, dos níveis de ATP e níveis de citocinas no
lavado broncoalveolar (LBA)
Avaliação da inflamação e remodelamento das vias aéreas através da
histomorfometria
Avaliação da expressão do receptor purinérgico P2X7 no pulmão por meio da
técnica de western blotting
Avaliação da expressão do receptor purinérgico P2X7 no pulmão por meio da
técnica de imunohistoquímica
Avaliação hiperresponsividade brônquica
Resultados............................................................................................................................34
Avaliação da inflamação pulmonar, dos níveis de ATP e níveis de citocinas no
lavado broncoalveolar (LBA) e soro sanguíneo
9
Avaliação da inflamação e remodelamento das vias aéreas através da
histomorfometria
Avaliação da expressão do receptor purinérgico P2X7 no pulmão por meio da
técnica de western blotting
Avaliação da expressão do receptor purinérgico P2X7 no pulmão por meio da
técnica de imunohistoquímica
Avaliação hiperresponsividade brônquica
Discussão..............................................................................................................................52
Considerações finais............................................................................................................56
Referências Bibliográficas..................................................................................................57
Anexos
Anexo I - Aprovação do estudo pelo comite de ética da Universidade Nove de Julho
- UNINOVE
Anexo II - Vieira RP, Silva RA, Oliveira-Junior MC, Greiffo FR, Ligeiro-Oliveira AP, Martins
MA, Carvalho CR. Exercise deactivates leukocytes in asthma. Int J Sports Med. 2014 Jun;35(7):629-
35. doi: 10.1055/s-0033-1358477. Epub 2013 Nov 20.
Anexo III - Oliveira MC Jr, Greiffo FR, Rigonato-Oliveira NC, Custódio RW, Silva VR,
Damaceno-Rodrigues NR, Almeida FM, Albertini R, Lopes-Martins RÁ, de Oliveira LV, de
Carvalho Pde T, Ligeiro de Oliveira AP, Leal EC Jr, Vieira RP. Low level laser therapy reduces
acute lung inflammation in a model of pulmonary and extrapulmonary LPS-induced ARDS. J
Photochem Photobiol B. 2014 May 5;134:57-63. doi:0.1016/j.jphotobiol.2014.03.021. Epub 2014
Apr 4
Anexo IV – Artigo para submeter: Exercise Immunology Review (IF 9.9)
Allergic lung inflammation is reduced by aerobic exercise training: role of purinergic receptor P2X7
10
Lista de abreviaturas e siglas
ADP - do inglês, Adenosine Diphosphate
AMP - do inglês, Adenosine Monophosphate
ATP - do inglês, Adenosine Tri-phosphate
ELISA - do inglês, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
IL-1 beta – Interleucina 1 beta
IL-5 – Interleucina 5
IL-6 – Interleucina 6
IFN-gama – Interferon gama
LBA – Lavado bronco-alveolar
OVA – Ovalbumina
PBS – do inglês, Phosphate Buferred Saline
TFA – Treinamento Físico Aeróbio
UDP – do inglês, Uridine Diphosphate
UTP – do inglês, Uridine Triphosphate
11
Greiffo FR. Efeitos do treinamento físico aeróbio na inflamação pulmonar alérgica crônica
em camundongos: papel da sinalização purinérgica [dissertação]. São Paulo: Pós
Graduação em Ciências da Reabilitação, Universidade Nove de Julho, 2014.
RESUMO
Nos últimos anos um crescente número de estudos tem demonstrado que o
treinamento físico aeróbio (TFA), quando realizado de maneira adequada em termos de
intensidade, duração e freqüência, apresenta inúmeros benefícios para o paciente asmático,
incluindo melhora na qualidade de vida, diminuição dos níveis de ansiedade e depressão,
melhora da ventilação minuto, diminuição do número de crises, diminuição dos níveis de
óxido nítrico exalado, além de diminuir a necessidade diária de corticoesteróides.
Recentemente, foi demonstrado pela primeira vez que o TFA apresenta um efeito
antiinflamatório direto sobre as vias aéreas do paciente asmático, uma vez que o TFA
diminuiu o número de eosinófilos no escarro induzido desses pacientes. Entretanto,
inúmeras perguntas e hipóteses foram levantadas sobre os possíveis mecanismos
envolvidos nesse efeito antiinflamatório do TFA na asma. Nesse sentido, um crescente
número de estudos com animais de experimentação em modelos de asma tem sido
publicado, os quais têm revelado possíveis vias de atuação do TFA na asma. Entretanto, até
o momento não existem publicações sobre os efeitos do TFA sobre a via dos receptores
purinérgicos, os quais têm um papel central na fisiopatologia da asma. Portanto, o presente
estudo teve com objetivo avaliar se os efeitos antiinflamatórios do TFA na asma é mediado,
pelo menos em parte, pela inibição da expressão dos receptores purinérgicos, assim como
pela diminuição dos níveis do principal ativador dos receptores purinérgicos, a adenosina
trifosfato (ATP) extracelular. Para isso, foram utilizados 40 camundongos C57Bl/6
12
divididos em 4 grupos experimentais (n=10 / cada) Controle, Exercício, Asma e Asma +
Exercício. O modelo de asma (inflamação pulmonar alérgica crônica) foi induzido por meio
de injeção intra-peritoneal com ovalbumina nos dias 0, 14, 28 e 42 seguidos por inalação
com solução de ovalbumina (1, 3 e 5%) três vezes por semana, a partir do dia 21 até o dia
53 do protocolo experimental. Com o intuito de avaliar o efeito terapêutico do TFA sobre a
inflamação e sobre a via dos receptores purinérgicos, o TFA de baixa intensidade foi
realizado 5x/semana, 60 minutos/sessão, iniciando no dia 27 do protocolo experimental até
o dia 53, quando a inflamação das vias aéreas já estava estabelecida. Vinte e quatro horas
após a última inalação e sessão de treinamento, os animais foram anestesiados,
traqueostomizados, canulados e o lavado broncoalveolar foi coletado e analisado para os
níveis de ATP e também para o número de células totais e contagem diferencial. A
avaliação da expressão do receptor purinérgico P2X7 foi realizada no homogenato do
tecido pulmonar por meio da técnica de western blotting, e também nos cortes histológicos
por meio da técnica de imunohistoquímica. Através da técnica de histologia foi
quantificado o número de linfócitos e eosinófilos nas vias aéreas, assim como o
remodelamento brônquico. A hiperresponsividade brônquica das vias aéreas foi avaliada
através do sistema Buxco. Os resultados obtidos neste trabalho corroboram com a literatura,
uma vez que o TFA reduz a inflamação crônica das vias aéreas. Nossos resultados também
sugerem que o TFA atua na via dos receptores purinégicos diminuindo a inflamação
pulmonar.
Descritores: asma, exercício, doenças respiratórias/ reabilitação, alergia e imunologia,
pulmão, inflamação, ATP, receptores purinérgicos, camundongos.
13
Greiffo FR. Effects of Aerobic Physical Training on the Chronic Allergic Pulmonary
Inflammation in Mice: Role of Purinergic [master thesis]. São Paulo: Pós Graduação em
Ciências da Reabilitação, Nove de Julho University, 2014.
ABSTRACT
In the last years, a growing number of studies have demonstrated that the aerobic
physical training (APT), performed in the proper intensity, duration and frequency, display
several benefits to asthmatic patients, including improvement in quality of life, reduction in
the levels of anxiety and depression, improvements in minute ventilation, reduction in the
number of crisis, reduction in the levels of exhaled nitric oxide, beyond reduced daily
needing of corticosteroids. More recently, was demonstrated for the first time that APT
presents a direct anti-inflammatory effect on the airways of asthmatic patient, since that
APT reduced the number of eosinophils in the induced sputum of these patients. However,
several questions and hypothesis were raised up about the possible mechanism involved in
these anti-inflammatory effects of APT for asthma. In this way, a growing number of
experimental studies using models of asthma have been published, revealing possible
mechanism involved of action APT for asthma. On the other hand, until this moment no
study evaluated the effects of APT on the via of purinergic receptors, a family of receptors
that present a central role in the physiopathology of asthma. Therefore, the present study
aim is to evaluate if the anti-inflammatory effects of APT for asthma is mediate, at least
partially, by the inhibition of expression of purinergic receptor P2X7, as well as the
extracellular adenosine triphosphate (ATP). Thus, using 40 C57Bl/6 mice, divided in 4
experimental groups (Control, n = 10), (Exercise, n = 10), (Asthma, n = 10) and (Asthma +
14
Exercise, n = 10). The experimental model of asthma (chronic pulmonary allergic
inflammation) was induced through the intra-peritoneal injection of ovalbumin solution on
days 0, 14, 21 and 42 followed by inhalation of 1%, 3% and 5% ovalbumin, 3x/week, and
beginning on 21st day until the 53rd day of experimental protocol. To evaluate the
therapeutic effects of APT on the inflammation and on the via of purinergic receptors, the
low intensity APT was performed 5x/week, 60 min/session, begining on 27th day of
experimental protocol until the 53rd day, when the airways inflammation is already
established. Twenty-four hours after the last inhalation and training session, mice were
anesthetized, tracheotomized, canuled and the bronchoalveolar lavage was collected and
analyzed for the ATP levels and also the total number of cells as well as the differential
number of cells. The analysis of hyperresponsiveness was performed. The histological
analysis was performed to evaluate and quantify the number of lymphocytes and
eosinophils in the airways wall, and also the airway remodeling. The expression of
purinergic receptor P2X7 in the lung tissue homogenate was performed using western
blotting and also the immunohistochemistry technique.
Keywords: asthma, exercise, respiratory diseases/ rehabilitation, allergy and immunollogy,
lung, inflammation, ATP, purinergic receptors, mice.
15
1. INTRODUÇÃO
1.1 Asma
1.1.1 Definição
A asma é uma doença predominantemente alérgica causada pela inflamação
crônica das vias aéreas a qual resultará em remodelamento brônquico, associados à
ativação de células inflamatórias como eosinófilos, mastócitos, basófilos,
macrófagos e linfócitos 1,2. Os sintomas da asma são conjugados, de uma maneira
geral, por episódios recorrentes de chiados (sibilos), falta de ar, aperto no peito e
tosse derivados da hiperresponsividade brônquica 3. De acordo com Webb et al.,
esta sintomatologia demonstra correlação consistente não somente com a gravidade
da doença, mas também com os níveis aumentados de leucócitos e seus produtos
nos pulmões 1.
1.1.2 Epidemiologia
Na última década, a incidência da asma tem aumentado de maneira significativa,
tornando-se uma das doenças respiratórias mais comuns nos países industrializados
4. Por ano ocorrem cerca de 350 mil internações por asma no Brasil, constituindo-se
ela na quarta causa de hospitalizações pelo Sistema Único de Saúde (2,3% do total)
16
e sendo a terceira causa entre crianças e adultos jovens 5. Na maioria dos casos, a
asma é desencadeada pela exposição alergênica a antígenos como ácaros, pêlos de
animais, baratas, fungos, pólen e produtos químicos, como perfumes e pesticidas.
Todavia, fatores como exposição ao ar frio, inalação de poluentes atmosféricos,
fumaça de cigarro e fatores emocionais podem desencadear uma crise de asma 6.
1.1.3 Fisiopatologia
A primeira etapa para o desenvolvimento do quadro asmático é a sensibilização
a algum antígeno. As células dendríticas, presentes na mucosa brônquica, atuam
como células apresentadoras de antígenos (APC). A interação das células dentríticas
com os linfócitos T auxiliadores resulta na estimulação de linfócitos B, iniciando a
produção de imunoglobulinas E (IgE). Uma vez liberadas na circulação, as
imunoglobulinas ligam-se aos receptores de alta afinidade presentes na superfície
dos mastócitos e em consequência desse processo, a grande maioria dos asmáticos
desenvolve uma fase imediata e uma fase tardia no próximo contato com o alérgeno
7.
A fase imediata se instala rapidamente e caracteriza-se pela obstrução das vias
aéreas como resultado da contração da musculatura lisa. As imunoglobulinas
liberadas na circulação ligam-se aos receptores de alta afinidade presentes nos
mastócitos 8,9 que, uma vez degranulados, liberam mediadores como aminas
vasoativas (histamina e serotonina), proteases, heparina, prostaglandinas,
17
tromboxanos e leucotrienos. Estas substâncias possuem potente atividade
constritora sobre a musculatura lisa das vias aéreas, além de promoverem aumento
da permeabilidade vascular e edema local 10.
A fase tardia ocorre, geralmente, a partir de 3 horas de contato com o alérgeno,
e pode perdurar por vários dias. O processo inflamatório nessa etapa decorre de uma
grande migração leucocitária para as vias aéreas 8,9, contribuindo para a cronicidade
do processo inflamatório por meio do envolvimento de muitos mediadores e
aumento da expressão de moléculas de adesão, com favorecimento da ativação e
migração de macrófagos, basófilos e eosinófilos para o espaço perivascular 10.
Macrófagos alveolares carecem de expressão do receptor de IgE de alta
afinidade. A inflamação alveolar na asma, faz com que os mastócitos alveolares
expressem um fenótipo com alta afinidade de IgE, que caracteriza a asma não
controlada 11. A asma grave é uma condição heterogênea que consistem em
fenótipos de asma eosinofílica. O tratamento com anti-IgE, metotrexato, antibióticos
macrolídeos, antifúngicos e termoplastia brônquica é revisto e recomendações são
feitas. Muitos estudos sugerem que a investigação para fenotipagem de asma grave
irá proporcionar tanto abordagens eficazes em biomarcadores como novas terapias
para a gestão de asma grave 12.
Há evidências que a predisposição genética para o desenvolvimento do
processo asmático é fundamentada através da mediação de imunoglobulinas E (IgE)
em resposta ao alérgeno correspondente, sendo a forma mais comum da doença
representada na infância e na idade adulta 13. Slager e colaboradores ao realizarem
18
uma meta-análise sobre os fatores genéticos para o desenvolvimento da asma
apresentaram que a interação dos genes que induzem a bronconstrição e a exposição
ao meio (alérgenos, tabaco, poluição) determinam a expressão e progressão da
doença 14. No mesmo estudo ao levantarem os dados dos genes suscetíveis à asma
foi relatado um maior índice dos genes característicos na população com etnia
européia do que afriana 14.
1.1.4 Inflamação
As células inflamatórias no processo asmático estão envolvidas no
desenvolvimento da hiperresponsividade bronquica, broncoconstrição, secreção de
muco e remodelamento das vias aéreas, estes processos são ocasionados através da
liberação de mediadores inflamatórios tais quais como quimiocinas, fatores de
crescimento e citocinas inflamatórias 15.
Conroy & Willians em uma revisão de literatura sugerem que quimiocinas
como eotaxinas, proteínas quimiotáticas para monócitos (MCP) e RANTES podem
sinalizar a via dos receptores CCR3 e CCR4 que são expressos em eosinófilos,
basófilos, mastócitos e em subpopulações de linfócitos Th2 16
.
Do ponto de vista imunológico, a asma pode ser definida, de forma geral, por
uma resposta denominada Th2, com liberação de citocinas pró inflamatórias típicas
dessa resposta, como as interleucinas 4 (IL-4), 5 (IL-5) e 13 (IL-13) 17. Apesar da
19
asma ser tradicionalmente descrita como uma doença de vias aéreas, evidências
experimentais têm sugerido que as alterações mecânicas nas áreas adjacentes aos
brônquios, próximas ao parênquima pulmonar, também são importantes nessa
doença 18.
Hizume et al., em um protocolo experimental murino, observaram que animais
asmáticos apresentaram um infiltrado leucocitário significativo na região
compreendida entre a membrana basal e a adventícia nos pulmões, resultando em
uma diminuição substancial da complacência pulmonar desses animais 19. Em um
estudo recente o qual investigaram a expressão do receptor A1-adenosina e seu
mecanismo de ação, em um modelo animal de inflamação aguda induzida por
ovoalbumina, encontraram que os animais com aumento de células inflamatórias
apresentaram concomitante um aumento na hiperresponsividade bronquica 20.
A inflamação na asma, portanto, situada diretamente na via aérea ou em suas
proximidades, pode resultar em episódios recorrentes de chiado, dispnéia, aperto
torácico e tosse. Situações como estas são comumente associados à obstrução ao
fluxo do ar, que é revertida espontaneamente ou após tratamento 21.
1.1.5 Receptor purinérgico
Estudos recentes demonstraram um acúmulo de nucleotídeos,
particularmente de adenosina trifosfato (ATP), nos pulmões de pacientes asmáticos,
e também em animais com inflamação pulmonar alérgica crônica, este acúmulo de
20
nucleotídeos no espaço extracelular ativam receptores purinérgicos (P2r) que
também irão modular a inflamação e o remodelamento na asma 22–24. Os receptores
purinérgicos são receptores transmembranais ionotrópicos P2X (P2X1 – P2X7) ou
metabotrópicos P2Y (P2Y1 – P2Y14; receptores acoplados às proteínas G) e são
expressos em inúmeros tipos celulares, como leucócitos e também sobre células
estruturais, como o epitélio brônquico e o epitélio alveolar 22–25.
Os receptores purinérgicos (P2r) têm emergido como uma potente e
importante família de receptores que modulam a inflamação e o remodelamento na
asma, através da ativação de células do sistema hematopoiético, assim como células
estruturais22–25. Esses receptores são ativados através do acúmulo de
purinas/nucleotídeos (ATP, ADP, AMP, UDP, UTP, etc) no espaço extracelular 22–
25. O acúmulo de nucleotídeos (particularmente de ATP) nos pulmões de pacientes
asmáticos, assim como de animais com inflamação pulmonar alérgica crônica tem
sido demonstrado em muitos estudos 22–25. O acúmulo extracelular de ATP ativa os
receptores purinérgicos, o que resulta na ativação de eosinófilos, linfócitos T,
células dendríticas, células epiteliais brônquicas e células epiteliais alveolares, e por
fim o aumento da inflamação e remodelamento das vias aéreas, e também
hiperresponsividade brônquica 22–25.
Mediadores inflamatórios e moléculas de adesão permeiam o tráfego de
reação alérgica-inflamatória pulmonar 26, modelos experimentais de asma têm
demonstrado uma maior expressão celular das moléculas de adesão VCAM-1 na
região perivascular de animais com inflamação pulmonar alérgica 27. Vanderstocken
et al., em um estudo realizado com camundongos deficientes em receptores
21
purinérgicos P2Y2 [P2Y2(-)], demonstrou que, quando submetidos à inflamação
pulmonar alérgica crônica, os animais P2Y2(-) mostraram níveis de VCAM-1
solúveis abolidos, com visível diminuição do infiltrado leucocitário 28.
Vieira e colaboradores ao estudarem a especificidade do receptor
purinérgico do tipo P2Y6 em um modelo agudo e crônico de asma induzida por
OVA e por ácaro doméstico (HDM) apresentaram que a expressão de P2Y6 nas
células epiteliais da via áerea é regulada durante a inflamação, tanto aguda como
crônica 24. Os resultados também constataram que o bloqueio ou a deficiencia de
P2Y6 na estrutura das células reduz as características principais da asma 24. Assim
como Vieira e colaboradores outros estudos apontam que o estudo a partir dos
receptores purinérgicos é uma hipóstese de elucidação e tratamento para asma 24,29.
Sumamente em uma revisao de literatura Idzko e colaboradores defendem
que as condições inflamatórias estão associados com a liberação extracelular de
nucleotídeos, exclusivamente o ATP 30. No compartimento extracelular a molécula
de ATP funciona como uma molécula de sinalização através da ativação de
receptores purinérgicos (P2r)30. Uma discussão baseada na via da sinalização dos
receptores P2R em doenças inflamatórias ou infecciosas o estudo verificou que os
receptores purinérgicos atuam nas respostas inflamatórias em doenças pulmonares
30.
22
1.1.6 P2X7
O receptor prurinérgico do tipo P2X7 é altamente ativado pelo acúmulo de
quantidades elevadas de ATP no espaço extracelular e está envolvido com a
inflamação aguda e a inflamação crônica na fisiopatologia da asma 22,25,31. P2X7
pode ser expressado em muitos tipos celulares, como mastócitos neutrófilos,
eosinófilos, monócitos, macrófagos, células B, células T, células dentíticas e
também em células estruturais, por exemplo céluals epitelias das vias aéreas,
pneumócitos tipo II, células endoteliais, fibroblastos e células musculares lisas 30.
Neste contexto o receptor purinérgico do tipo P2X7 pode regular vários aspectos
relacionados da resposta imune inata e adaptativa 30.
Manthei e colaboradores ao estudarem a função do receptor P2X7 nas
amostras de sangue total de neonatos com alto risco para desenvolvimento da asma
sugerem que a funcionalidade do receptor está relacionada com o risco e gravidade
da doenca 32.
O principal papel do P2X7 na resposta imunológica contra tumores e
patógenos está relacionado a polarização de células T efetoras especificas do
antígeno por células dentríticas, a qual contribui para a indução e manutenção da
inflamação crônica 30. A sinalização da expressão do receptor P2X7 está presente na
fase de sensibilização de doenças alérgicas, tal como a asma 30.
A inibição dos receptores purinérgicos resulta em diminuição da inflamação
das vias aéreas na asma 22,33. Vieira et al. em estudo com camundongos verficou que
23
o treinamento físico aeróbio diminui a expressão do receptor P2X7 pelas células do
epitélio brônquico de camundongos em modelo experimental de asma 6.
1.2 Exerício e asma
O controle da asma é primariamente farmacológico, porém o treinamento
físico aeróbio (TFA) pode se constituir em um complemento importante no
tratamento da doença. O TFA resulta no aumento das capacidades respiratória e
ventilatória, além de propiciar atenuação da sintomatologia do quadro asmático 34–
36.
Em um modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica em murinos,
o treinamento aeróbio de intensidade moderada induziu a redução do número de
células polimorfo e mononucleares no lavado broncoalveolar, além de diminuição
da infiltração leucocitária, produção de citocinas, expressão de moléculas de adesão
e remodelamento estrutural dos pulmões 37. Observou-se também que o treinamento
aeróbio diminuiu a ativação do fator de transcrição NF-kB nos pulmões destes
animais 37.
Vieira e colaboradores, em um estudo realizado com camundongos,
utilizaram um modelo experimental de inflamação pulmonar crônica, o qual foi
constatado que tanto o treinamento aeróbio de baixa intensidade quanto de
moderada intensidade diminuíram substancialmente o infiltrado eosinofílico na
parede das vias aéreas e a densidade das células positivas para IL-4 e IL-5. Os
24
grupos submetidos ao treinamento físico aeróbio apresentaram redução significativa
na deposição de colágeno e fibras elásticas nas paredes das vias aéreas, no
espessamento da musculatura lisa e no índice de broncoconstrição. Os resultados
demonstraram que o treinamento físico aeróbio também induziu um aumento na
expressão de células positivas para IL-10, uma citocina reconhecida por suas
características regulatórias e anti-inflamatórias 38.
Evidências na literatura demonstraram que a inibição dos receptores
purinérgicos é capaz de inibir a secreção da potente citocina pró-inflamatória IL-
1beta, além de aumentar a produção da citocina antiinflamatória IL-10 39,40. Existem
ainda inúmeros estudos demonstrando que a IL-10 apresenta importantes efeitos
antiinflamatórios na asma 41–43.
Apesar de todo o conhecimento atual sobre a imunopatologia da asma, o
efeito terapêutico do TFA sobre a inflamação não está compreendido na sua
totalidade, devido à sua complexidade e interatividade imunológica. Nesta esfera a
interação do TFA com a via dos receptores purinérgicos torna-se uma importante
via de atuação. Sendo assim, os modelos experimentais de asma induzida com
ovoalbumina (OVA) constituem-se em uma boa alternativa para investigação dos
mecanismos e progressão da doença. Este modelo reproduz características
específicas da asma, e desta forma, representam uma importante ferramenta para a
pesquisa da fisiopatologia, bem como para a elucidação dos mecanismos de ação do
TFA.
25
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar se os efeitos antiinflamatórios do TFA em um modelo experimental
de asma são mediados por alterações nos níveis de ATP extracelular e também por
alterações na expressão do receptore purinérgico P2X7.
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar os efeitos do TFA em um modelo experimental de asma nas
seguintes variáveis:
Inflamação alérgica crônica das vias aéreas;
Hiperresponsividade brônquica;
Níveis de ATP extracelular no lavado broncoalveolar (BAL);
Níveis de citocinas pelas células inflamatórias no lavado
broncoalveolar (LBA);
Níveis de citocinas pelas células inflamatórias no soro
sanguíneo;
Expressão do receptor purinérgico P2X7, no homogenato do
tecido pulmonar por meio da técnica de western blotting;
26
Expressão do receptor purinérgico P2X7 nos cortes
histológicos dos pulmões por meio da técnica de imunohistoquímica.
27
3. METODOLOGIA
3.1 Animais e grupos experimentais
Os animais foram obtidos do biotério de criação da Universidade Nove de
Julho e mantidos em condições controladas de humidade (50%-60%), luminosidade
(12h claro/12 h escuro) e temperatura (22°C - 25°C) no biotério de experimentação
da Universidade Nove de Julho.
Foram utilizados 40 Camundongos C57Bl/6 com 8 semanas de idade,
pesando aproximadamente 20 gramas, os quais foram distribuídos aleatoriamente
nos seguintes grupos experimentais (n= 4x10 animais em cada grupo):
1.Controle (Con – não sensibilizado e não treinado), 2. Exercício (Exe – não
sensibilizado e treinado), 3. OVA (OVA – sensibilizado com OVA e não treinado),
4. OVA+Exe (OVA+Exe – sensibilizado com OVA e treinado).
3.2 Animais Modelo de inflamação pulmonar alérgica crônica
Os animais foram sensibilizados com injeção intraperitoneal de 20ug de
Ovalbumina OVA (Salto, MG, Brasil) nos dias 0, 14, 28 e 42. A partir do dia 21 os
animais foram submetidos a desafios inalatórios com solução de 1% (duas semanas)
28
3% (duas semanas) e 5% (uma semana) de OVA, 30 minutos por sessão, 3 vezes
por semana durante 5 semanas.
3.3 Modelo de treinamento físico aeróbio de intensidade moderada
Os animais foram adaptados em esteira ergométrica para camundongos
(Imbramed, RS, Brasil) durante 3 dias (0,5km/h) por 15 minutos. Os animais foram
treinados a uma intensidade moderada, correspondendo a 60% da máxima
velocidade alcançada no teste de esforço. O treinamento de intensidade moderada
foi realizado durante 4 semanas, 5 vezes por semana, 1 hora por sessão de
treinamento.
3.4 Eutanásia dos animais e coleta do soro sanguíneo
Os experimentos foram realizados 24 horas após o último desafio com
alérgeno (OVA) e última sessão de treinamento, e após anestesia dos animais com
quetamina e xilazina (100mg/kg e 10mg/kg, respectivamente). Em seguida, foi
realizada incisão cirúrgica na linha mediana do abdômen do animal e coletada uma
amostra de sangue da artéria aorta abdominal. As amostras foram centrifugadas
(6000 rpm, a 4ºC, por 10 minutos). O soro resultante foi aliquotado e armazenado a
-20 ºC para análise das citocinas IL-1 beta, IL-5, IL-6, IL-10 e IFN-gama. A técnica
29
imunoenzimática – ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) foi utilizada
para esse fim.
3.5 Avaliação da inflamação pulmonar e dos níveis de ATP e nível de citocinas
no lavado broncoalveolar (LBA)
Após anestesia e traqueostomia, os animais foram canulados e os pulmões
foram lavados com 3 x 1 ml de PBS. Cem microlitros do volume do lavado
recuperado foi imediatamente utilizado para quantificação dos níveis de ATP
através de técnica de quimioluminescência. O restante foi centrifugado a 1200 rpm a
4°C por 5 minutos. O sobrenadante foi armazenado a -70°C para possíveis análises
posteriores. O botão celular foi ressuspendido em 1 ml de PBS e a determinação do
número de células totais no LBA foi realizada por meio de contagem na Câmara de
Neubauer (5-8, 20). Alíquotas do material ressuspendido foram utilizadas para
preparação de lâminas de cytospin as quais foram coradas com May-Grunwald-
Giemsa (onde 100 células foram contadas para a determinação da contagem
diferencial) (5-8, 20).
Para análise da expressão de citocinas IL-1 beta, IL-5, IL-6, IL-10 e IFN-
gama no LBA foi realizada a técnica imunoenzimática – ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay).
30
3.6 Avaliação da inflamação e remodelamento das vias aéreas através da
histomorfometria
Com o intuito de avaliar os efeitos do treinamento físico aeróbio sobre a
proporção de volume de fibras colágenas e elásticas na parede das vias aéreas, o
pulmão esquerdo foi coletado e armazenado em formol 10% por 24 horas, seguindo
das passagens em álcool os pulmões foram armazenados em parafina para posterior
corte no micrótomo, por meio da técnica clássica de histologia. As lâminas foram
coradas com o corante Picrossírius para detecção das fibras de colágeno e com
resorcina e fucsina com oxidação para detecção das fibras elásticas. A análise
quantitativa da proporção de volume de fibras de colágeno e elástica na parede das
vias aéreas foi realizada através da técnica morfométrica.
3.7 Avaliação da expressão do receptor purinérgico P2X7 no pulmão por meio
da técnica de western blotting
A avaliação da expressão do receptore P2X7 no homogenato dos pulmões
foi realizada com o intuito de avaliar se os efeitos antiinflamatórios
desencadeados pelo treinamento aeróbio no modelo de asma é resultante de
31
um efeito do treinamento aeróbio sobre a expressão do receptor purinérgico
P2X7.
A avaliação da expressão deste receptor foi realizada através da técnica de
Western Blotting. O pulmão direito foi coletado 24horas após o último desafio com
alérgeno (OVA) e último teste físico e homogenizados em 1 ml de solução para o
lysis celular (RIPA Lysis
Buffer, Santa Cruz, EUA) contendo inibidores de proteases e fosfatases e
incubadas por 30 minutos em gelo, para a extração das proteínas. Após esse período
de incubação o material obtido da quebra celular foi centrifugado a 13300 rpm a
4°C e o conteúdo protéico (sobrenadante) foi coletado e imediatamente armazenado
a -70°C. A quantificação de proteínas foi realizada pelo método de BCA (BCA
Pierce Thermo Scientific, EUA). Cinqüenta microgramas de proteína foram
carregadas em um gel de poliacrilamida 10% e então transferidas para uma
membrana de nitrocelulose. A membrana foi incubada com os seguintes anticorpos
primários: anti-P2X7 e revelada através do sistema com quimiluminescência. A
avaliação densitométrica das bandas foi realizada utilizando-se o software Image J
(NIH, EUA).
3.8 Avaliação da expressão do receptor purinérgico P2X7 no pulmão por meio
da técnica de imunohistoquímica
32
Para avaliação da imunolocalização das células alvo da sinalização
purinérgica no modelo experimental de asma, assim como dos efeitos do TFA no
modelo experimental de asma o pulmão esquerdo foi coletado e armazenado em
formol 10% por 24 horas, seguindo das passagens em álcool os pulmões foram
armazenados em parafina para posterior corte no micrótomo, por meio da técnica
clássica de histologia. Lâminas previamente preparadas com 3-aminopropil-trietoxi-
silano (Silane-Sigma) foram utilizadas para fixação dos cortes. Para a realização da
técnica de imunohistoquímica os cortes histológicos foram inicialmente
desparafinados e hidratados. Em seguida, foram submetidos aos procedimentos
descritos abaixo:
Etapa 1 – Recuperação Antigênica: por meio de alta temperatura, utilizando
a panela à vapor por 40 minutos, seguidos de descanso de 20 minutos em
temperatura ambiente. Após esse período, as lâminas foram lavadas em água
corrente, água destilada e TBS.
Etapa 2 – Bloqueio e Incubação com Anticorpo Primário: O bloqueio da
peroxidase endógena foi realizado com água oxigenada (H2O2) 10V 3% (3x5
minutos). Em seguida os cortes foram lavados em água corrente, água destilada e
TBS. O anticorpo primário P2X7 diluído em BSA na proporção de 1:300, o qual foi
aplicado sobre os cortes de tecido. A incubação foi realizada à 4°C, “overnight”.
Etapa 3 – Incubação com o Anticorpo Secundário e Complexo: As lâminas
foram lavadas em TBS e com o anticorpo secundário, anti-rabbit por 30 minutos a
33
37°C. Em seguida as lâminas foram lavadas em TBS e incubadas com o complexo
por 30 minutos a 37°C.
Etapa 4 – Revelação: seguiu-se com a lavagem das lâminas em TBS e
revelação pelo cromógeno 3,3-diaminobenzedine (DAB).
Etapa 5 – Contra-coloração e Montagem das lâminas: As lâminas foram
lavadas abundantemente em água e Hematoxilina de Harris. Em seguida, as mesmas
foram lavadas em água corrente, desidratadas, diafanizadas e montadas com resina
para microscopia.
A análise foi realizada por meio da fotografia de 5 vias aéreas/animal com a
marcação específica do anticorpo escolhido – Image Pro Plus Software 4.0.
3.8 Avaliação hiperresponsividade brônquica
Para a avaliação da hiperresponsividade brônquica foi utilizado o sistema
Buxco, onde foi avaliado o Penh (índice de hiperresponsividade brônquica), que
leva em conta o tempo inspiratório e expiratório, conforme previamente descrito
(21). O agente broncoconstritor que foi utilizado para a realização da curva dose-
resposta foi a metacolina, conforme previamente descrito.
34
Ressalto que a da hiperresponsividade brônquica foi realizada em
colaboração com o prof. Dr. Milton de Arruda Martins, da Faculdade de Medicina
da USP.
3.9 Análise estatística
Os dados foram analisados através do software SigmaStat 3.1 (Califórnia,
EUA). A distribuição da normalidade dos dados foi avaliada pelo teste de
Kolmogorov-Smirnov. Os dados com distribuição paramétrica foram submetidos ao
teste One-way ANOVA seguido pelo teste de Newman-Keuls para comparação
entre os grupos. Os dados com distribuição não paramétrica foram submetidos ao
teste One-way ANOVA on Ranks seguido pelo teste de Dunn’s para a comparação
entre os grupos. Os níveis de significância foram ajustados para 5% (p<0.05). Os
gráficos foram elaborados utilizando-se o software GraphPad Prism 3.1 (Califórnia,
EUA).
35
4. RESULTADOS
4.1 Avaliação da inflamação pulmonar, dos níveis de ATP e nível de citocinas no
lavado broncoalveolar (LBA) e soro sanguíneo
O protocolo experimental deste estudo sugere que o treinamento físico
aeróbio resultou em diminuição do conteúdo celular obtido do LBA. O grupo OVA
apresentou um aumento do número total de células, bem como de eosinófilos,
linfócitos, neutrófilos e macrófagos quando comparado aos demais grupos. O
treinamento físico aeróbio, por sua vez, atenuou significativamente tanto o número
total como a contagem diferencial de células (p<0,05) (Figuras 1 a 5). Os dados
abaixo ilustram os efeitos antiinflamtórios locais e sistêmicos via treinamento físico
aeróbio, uma vez que o grupo OVA+Exe apresentou dados inflamatórios
signicantemente diminuidos em relação ao grupo OVA.
Os resultados abaixo sugerem que os efeitos antiinflamatórios do exercício
físico podem ser mediados pela diminuição do influxo de células inflamatórias para
os pulmões, e que o treinamento físico aeróbio atuou potencialmente a inflamação
nos pulmões dos animais dos animais do grupo OVA.
36
Controle Exe OVA OVA+Exe0
10
20
30
40
***
*C
élu
las T
ota
is L
BA
(x10
6/m
L)
Figura 1. Efeitos do TFA sobre o número total de células no LBA. Os valores estão
expressos como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão.
***p<0,001 quando comparado ao grupo controle; *p<0,05 quando comparado ao
grupo OVA.
Controle Exe OVA OVA+Exe0
5
10
15
20
**
**
Macró
fag
os L
BA
(x10
6/m
L)
Figura 2. Efeitos do TFA sobre o número macrófagos no LBA. Os valores estão expressos
como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão. **p<0,05 quando
comparado aos demais grupos.
37
Controle Exe OVA OVA+Exe0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5***
**N
eu
tró
filo
s L
BA
(X
10
6/m
L)
Figura 3. Efeitos do TFA sobre o número neutrófilos no LBA. Os valores estão expressos
como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão. ***p<0,001 quando
comparado ao grupo controle; **p<0,05 quando comparado ao grupo OVA.
Controle Exe OVA OVA+Exe0
2
4
6***
**
Lin
fócit
os L
BA
(x10
6/m
L)
Figura 4. Efeitos do TFA sobre o número linfócitos no LBA. Os valores estão expressos
como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão. ***p<0,001 quando
comparado ao grupo controle; **p<0,05 quando comparado ao grupo OVA.
38
Controle Exe OVA OVA+Exe0
5
10
15
***
###E
osin
ófi
los n
o L
BA
(x10
6/m
L)
Figura 5. Efeitos do TFA sobre o número eosinófilos no LBA. Os valores estão expressos
como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão. ***p<0,001 quando
comparado aos demais grupos; ###p<0,001 quando comparado ao grupo OVA.
Ao verificar os níveis de ATP no lavado broncoalveolar o grupo OVA
apresentou estatiscamente aumentado quando comparado com os demais grupos, o
treinamento físico aeróbio, per se, dimunui os níveis de ATP no lavado broncoalveolar
(Figura 6). O treinamento físico aeróbio modificou os níveis de adenosina trifosfato no
lavado broncoalveolar, uma vez que o grupo OVA apresentou um aumento de mais de
100 vezes e o treinamento físico aeróbio dimuniu os níveis para os valores controle.
39
Controle Exe OVA OVA+Exe
0
50
100
150
200**
AT
P L
AB
(n
mo
l/m
L)
Figura 6. Efeitos do TFA sobre os níveis de ATP no LBA. Os valores estão expressos
como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão **p<0,01 quando
comparado ao demais grupos.
As figuras 7 a 11 representam os níveis de IL-1beta, IL-5, IL-6, IL-10 e
IFN-gamma (respectivamente) obtidos do lavado broncoalveolar. A exposição à
OVA aumentou os níveis de IL-5 quando comparam-se os grupos OVA e Controle
(p<0,05), mas diminuiu no grupo OVA+Exe quando comparado ao grupo OVA
(p<0,05) (Figura 8). Ao analisar os níveis de IL-1beta, IL-6, IL-10 e IFN-gamma, os
grupos não apresentaram diferença estatisticamente significativa (Figura 7 e -11).
40
Control Exe OVA OVA+Exe0
100
200
300
400
IL-1
beta
LB
A (
pg
/mL
)
Figura 7. Efeitos do TFA sobre os níveis de IL-1beta no LBA. Os valores estão expressos
como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão.
Controle Exe OVA OVA+Exe0
20
40
60
*
**
IL-5
LB
A(p
g/m
L)
Figura 8. Efeitos do TFA sobre os níveis de IL-5 no LBA. Os valores estão expressos
como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão *p<0,05, quando
comparado ao grupo controle; **p<0,01 quando comparado ao grupo OVA.
41
Controle Exe OVA OVA+Exe0
50
100
150
IL-6
LB
A (
pg
/mL
)
Figura 9. Efeitos do TFA sobre os níveis de IL-6 no LBA. Os valores estão expressos
como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão.
Control Exe OVA OVA+Exe0
50
100
150
200
IL-1
0 L
AB
(p
g/m
L)
Figura 10. Efeitos do TFA sobre os níveis de IL-10 no LBA. Os valores estão expressos
como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão.
42
Controle Exe OVA OVA+Exe0
20
40
60
80
IFN
-g L
BA
(p
g/m
L)
Figura 11. Efeitos do TFA sobre os níveis de IFN-gamma no LBA. Os valores estão
expressos como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão.
Na análise da expressão da citocinas IL-1beta, IL-5 e IL-6 no soro sanguíneo
os grupos não apresentaram diferença significante (Figura 12-14). Ao analisar a
expressão de IL-10 no soro todos os grupos apresentaram um aumento significativo
ao serem comparados com o grupo controle (p<0.05) (Figura 15). Simultaneamente,
existe diferença estatística na expressão de IFN-gamma quando os grupos são
comparados ao grupo exercício (p<0,05) (Figura 16).
43
Controle Exe OVA OVA+Exe0
500
1000
1500
2000
2500
IL-1
beta
So
ro (
pg
/mL
)
Figura 12. Efeitos do TFA sobre os níveis de IL-1beta no soro. Os valores estão expressos
como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão.
Control Exe OVA OVA+Exe0
200
400
600
800
IL-5
So
ro (
pg
/mL
)
Figura 13. Efeitos do TFA sobre os níveis de IL-5 no soro. Os valores estão expressos
como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão.
44
Controle Exe OVA OVA+Exe0
1000
2000
3000
IL-6
So
ro (
pg
/mL
)
Figura 14. Efeitos do TFA sobre os níveis de IL-6 no soro. Os valores estão expressos
como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão.
Controle Exe OVA OVA+Exe0
500
1000
1500
****
**
IL-1
0 S
oro
(p
g/m
L)
Figura 15. Efeitos do TFA sobre os níveis de IL-10 no soro. Os valores estão expressos
como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão **p<0,05, quando
comparado ao grupo controle.
45
Controle Exe OVA OVA+Exe0
100
200
300
* * *
IFN
-gam
ma S
oro
(p
g/m
L)
Figura 16. Efeitos do TFA sobre os níveis de IFN-g no soro. Os valores estão expressos
como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão *p<0,05, quando
comparado ao grupo exercício.
4.2 Avaliação da inflamação e remodelamento das vias aéreas através da
histomorfometria
Ao avaliar a porcentagem de fibras colágenas nas vias aéreas de
camundongos, observa-se que a OVA é capaz de proporcionar um aumento da
expressao de colágeno e o treinamento físico aeróbio por sua vez é capaz de reduzir
a expressão de fibras colágenas em camundongos do grupo OVA+Exe (p<0,05)
(Figura 17). Porém, o treinamento físico aeróbio nao apresentou o mesmo efeito
sobre a proporção de volume de fibras elásticas (Figuras 18).
46
Controle Exe OVA OVA+Exe0
20
40
60***
Fib
ras c
olá
gen
as(%
)
Figura 17. Efeitos do TFA sobre a proporção de volume de fibras colágenas. Os valores
estão expressos como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão *p<0,05
quando comparado ao grupo OVA+Exe; **p<0,01 quando comparado aos grupos Controle
e Exe.
Controle Exe OVA OVA+Exe0
5
10
15
20
25
Fib
ras e
lásti
cas
- m
m2
Figura 18. Efeitos do TFA sobre a proporção de volume de fibras colágenas. Os valores
estão expressos como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão.
47
4.3 Avaliação da expressão do receptor purinérgico P2X7 no pulmão por meio
da técnica de western blotting
O treinamento físico aeróbio não modificou a expressão do receptor
purinérgico P2X7. Através da técnica clássica de western blotting foi possível
verificar que os animais do grupo OVA não apresentaram um aumento da expressão
de P2X7 (Figura 19). Neste estudo não foi possível verificar o efeito positivo do
receptor purinérgico P2X7 através da técnica de western blotting, o qual foi inibido
nos grupos.
Figura 19. Efeitos do TFA sobre na expressão de P2X7 no homogenato de pulmão.
4.4 Avaliação da expressão do receptor purinérgico P2X7 no pulmão por meio
da técnica de imunohistoquímica
Ao quantificar a expressão do receptor purinergico P2X7 abserva-se que o
grupo OVA apresenta um aumento quando é comparado aos grupos Controle e
Cont. Exe OVA OVA+Exe
48
grupo OVA+Exe (p<0,05) (Figura 20). Na figura 21 este fenomeno é ilustrado e
pode-se observar que na fotomiografia referente ao grupo OVA a expressão de
P2X7 é mais evidente do que nos demais grupos (Figura 21).
Controle Exe OVA OVA+Exe0
5
10
15
20
*P
2X
7 E
pit
éli
o B
ron
qu
ico
(%
)
Figura 20. Efeitos do TFA sobre a expressao do receptor purinérgico P2X7 no pulmão. Os
valores estão expressos como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão
*p<0,05 quando comparado aos grupos Controle e OVA+Exe.
49
Figura 21. Efeitos do TFA sobre na expressão de P2X7 no pulmão. A – Controle; B –
Exercício; C – OVA; D – OVA+Exe.
4.4 Avaliação hiperresponsividade brônquica
A avaliação da hiperresponsividade pulmonar foi realizada através da
pletismografia de corpo inteiro (Buxco) a doses crescentes de metacolina (agente
constritor) – 6,25 a 50 mg/mL. Nos graficos 21 a 24 o indice de hiperreponsividade
não é diferente entre os grupos, entretanto, ao utilizar concentrações mais elevadas
A B
C D
50
do agente constritor (metacolina) o grupo OVA apresentou um aumento estatísco
em comparação aos demais grupos (p<0,05) (Figuras 25 e 26).
Controle Exe OVA OVA+Exe
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Pen
h (
Baseli
ne)
Figura 21. Efeitos do TFA sobre a hiperresponsividade brônquica. Os valores estão
expressos como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão.
Controle Exe OVA OVA+Exe
0.0
0.5
1.0
1.5
Pen
h (
PB
S)
Figura 22. Efeitos do TFA sobre a hiperresponsividade brônquica. Os valores estão
expressos como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão.
51
Controle Exe OVA OVA+Exe
0.0
0.5
1.0
1.5
Pen
h (
6,2
5 M
Ch
)
Figura 23. Efeitos do TFA sobre a hiperresponsividade brônquica. Os valores estão
expressos como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão.
Controle Exe OVA OVA+Exe
0.0
0.5
1.0
1.5
Pen
h (
12,5
MC
h)
Figura 24. Efeitos do TFA sobre a hiperresponsividade brônquica. Os valores estão
expressos como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão.
52
Controle Exe OVA OVA+Exe
0
1
2
3
4
*
Pen
h (
25 M
Ch
)
Figura 25. Efeitos do TFA sobre a hiperresponsividade brônquica. Os valores estão
expressos como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão. *p<0,05
quando comparado aos demais grupos.
Controle Exe OVA OVA+Exe
0
2
4
6
**
Pen
h (
50 M
Ch
)
Figura 26. Efeitos do TFA sobre a hiperresponsividade brônquica. Os valores estão
expressos como média dos grupos, e as barras representam o desvio padrão. **p<0,01
quando comparado aos demais grupos.
53
5. DISCUSSÃO
O treinamento físico aeróbio tem atuado com uma importante ferramenta
para o controle da inflamação, estudo recente de Viera e colaboradores, em um
modelo experimental de asma, evidenciou a dimunuição de leucócitos no espaço
peribrônquico, bem como a diminuição de citocinas Th 2, moléculas de adesão
(ICAM-1 Intracellular Adhesion Molecule, e VCAM-1 Vascular Adhesion
Molecule) e espécies reativas de oxigenio (GP91phox and 3-nitrotyrosine) dos animais
asmáticos que praticaram exercício por 4 semanas 44.
Neste estudo, foi observado que o treinamento físico aeróbio realizado por 1
hora diária num período de 4 semanas é capaz de diminuir o número de células
totais e diferencias no lavado broncoalveolar bem como os níveis de ATP no lavado
broncoalveolar, diminuir os níveis de citocinas Th2 (IL-5) no lavado broncoalveolar
e aumentar os níveis de IL-10, um citocina pró-inflamátoria, no soro. A expressão
do receptor purinérgico P2X7 nos animais inflamados também demostrou um
aumento significativo quando comparado com os outros grupos. O remodelamento
das vias aéreas no grupo OVA também mostrou um aumento significativo quando
comparado aos demais grupos. Nos resultados de hipperesponsividade brônquica
com altas doses do agente constritor pode-se observar um aumento estatisticamente
significativo no grupo OVA quando comparado aos grupos Controle, Exe e
OVA+Exe. Estes dados sugerem que o treinamento físico eoróbio tem um efeito
imunomodulador sobre a inflamação e que a via dos receptores purinérgicos pode
elucidar os questionamentos da inflamação nos modelos experimentais de asma.
54
Idzko e coloboradores descrevem a importância da via dos receptores
purinéricos, e que o receptor purinérgico P2X7 tem grande relevancia na
fisiopatologia dos processos inflamatotórios cronicos 30. Um estudo já descreve a
importancia da via dos receptores purinérgicos na asma e que a expressão de P2X7
está diretamente relacionada com a inflamação, macrófagos alveolares e eosínófilos
no sangue humano 22. No presente estudo o aumento do conteúdo celular obtido no
LBA e aumento dos níveis de IL-5 pode ser explicado, em parte, pelos resultados de
P2X7. Os dados de P2X7 deste estudo podem sugerir, assim como Müller e
colaboradores, que a sinalização purinérgica tem grande envolvimento na asma e
pode atuar como uma importante via farmacológica. Os estudos acima citados
descrevem que a via dos receptores purinérgicos é ativado pelo acúmulo de ATP no
espaço perivascular 22,30, os resulatdos deste estudo corroboram com o descrito na
literatura, e enfatiza a sinalização purinérgica nos modelos experimentais de asma.
Estudos do grupo de Viera mostram que a IL-10 tem um papel importante
no treinamento físico aeróbio, uma vez que seus estudos mostram um aumento nos
níveis de IL-10 no grupo exercício 6,38,44. A IL-10 é capaz de inibir a apresentação
do antígeno pelos monócitos/macrófagos, abolindo respostas proliferativas e com
consequente queda dos níveis de citocinas pelos linfócitos T 44. Os dados referentes
a IL-10 não mostraram-se diferentes nos grupos de treinamento físico aeróbio,
porém os níveis de IL-5 mostraram-se diferentes. O que sugere que mesmo a IL-10
não aprensentando aumento entre os grupos, o treinamento físico aeróbio
apresentou suas características imunomodulatórias encontradas na literatura.
55
Evidências têm emergido para aclarar aspectos da resposta mecânica
broncoconstritora em modelos experimentais. Uma hipótese a ser considerada,
basicamente, ao influxo de células inflamatórias. As características histopatológicas
do processo inflamatório da asma consistem em um aumento da permeabilidade
vascular, formação de exsudato (edema) e um grande afluxo de mastócitos,
macrófagos, neutrófilos, linfócitos (principalmente do subtipo CD4+) e,
predominantemente, eosinófilos, do compartimento intra para o extravascular, com
hipersecreção de muco e descamação da superfície epitelial 46,47. De acordo com
Barnes, estas alterações epiteliais promovem maior sensibilidade e reatividade da
superfície de vias aéreas aos agentes constritores, que, somadas ao espessamento da
membrana basal, podem contribuir para o aumento da rigidez da parede de vias
aéreas, resultando em uma resposta de maior intensidade nos parâmetros de
mecânica respiratória avaliados na asma 47.
Estudos pós-mortem demonstram que a camada de músculo liso das vias
aéreas de pacientes asmáticos está aumentada, podendo resultar em
hiperresponsividade brônquica se a contratilidade das células permanecer constante
47. Porém, tal espessamento é atribuído, em parte, a deposição da matrix extracelular
ao redor das células do músculo liso, podendo atuar inversamente ao encurtamento
celular 48.
Os dados de fibras colágenas e hiperresponsividade brônquica deste estudo
são esclarecidos de acordo com a literatura descrita, sugere-se que os a dimuniuição
das fibras colágenas estão relacionadas com o aumento da hiperresponsividade
brônquica.
56
A asma é uma doença inflamatória crônica crônica das vias aéreas e muitos
estudos demostram que as células inflamatórias tanto no processo inflamatório,
como no processo de remodelamento, e ambos estão associados a obstrução
brônquica 48. Pastva e colaboradores publicaram os primeiros resultados do efeito
imunomodulador do treinamento físico aeróbio, uma vez que reduziu a inflamação
alergica das vias aéreas em um modela experimental em camundongos 50.
Recentemente Silva e colaboradores em ao estudarem o efeito do
treinamento físico aeróbio sobre a via dos glicocorticóides em um modelo
experimental de asma (OVA), mostrou que os animais treinados apresentaram um
aumento nos receptores de glicorticóides, bem como citocinas pró-inflamatórias,
tais como IL-10 e IL-1ra e reduziu a e expressão de mediatores inflamatórios (NF-
κB, IL-4, IL-5, TGF-β, RANTES, VEGF, ICAM-1, VCAM-1) 51. Estudos como de
Silva e colaboradores, sugerem que o tratamento da asma não exclusivamente
farmacológico, bem como neste estudo o treinamento físico aeróbio atuou como
uma ferramenta de tratamento para a inflamação crônica das vias aéreas.
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6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
O presente estudo descreve dados de um modelo experimental de inflamação
pulmonar alérgica e sugere que a via dos receptores purinérgicos tem importância
em processos inflamatórios, tais como a asma. Os modelos experimentais
reproduzem características específicas da asma, e desta forma, representam uma
importante ferramenta para a pesquisa de sua fisiopatologia, bem como para a
prescrição segura de exercícios por profissionais da área de saúde. A via do receptor
purinégico P2X7 pode elucidar a atuação do treinamento físico aeróbio na asma, o
qual é estudado e com grande benefício para pacientes asmáticos. Neste sentido,
sugerimos que o treinamento físico aeróbio reduz o fenótipo da asma, reduz os
níveis de ATP no lavado broncoalveolar e reduz a exopressão de P2X7 no pulmão
de camundongos com inflamação pulmonar alérgica.
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