estresse oxidativo e dano ao dna em queratinócitos...

Danielle Lima Corrêa de Carvalho, Flávia Cristina Prado Rosin, Mariana Henriques Ferreira, Fernanda de Paula Eduardo, Letícia Mello Bezinelli, Nelson Hamerschlak, Luciana Corrêa

Estresse oxidativo e dano ao DNA em queratinócitos tratados com bussulfano

veiculado em saliva artificial

INTRODUÇÃO

QUIMIOTERÁPICOS:

• Agentes terapêuticos contra neoplasias malignas;

• Atingir doses plasmáticas destruição das células neoplásicas;

• Podem estar presentes na saliva, com doses iguais ou abaixo da terapêutica plasmática;

• 5-FU, MTX, ciclofosfamida e bussulfano.

Jansman et al. 2002, Rodin et al. 2013, Ritschel et al. 1981, Bezinelli et al. 2017

INTRODUÇÃO

BUSSULFANO

• Agente alquilante doenças hematológicas/TCTH;

• Gera toxicidade intensa mucosite, danos hepáticos e renais e distúrbios no SNC;

• Induz estresse oxidativo, levando a danos do DNA e produção de EROs;

• Níveis salivares próximos aos séricos.

Palmer et al. 2016, McCune & Holmberg, 2009, Mangerich et al. 2016, Rauh et al. 2016; Bezinelli et al., 2017

OBJETIVO

Analisar o estresse oxidativo e o possível dano ao DNA em queratinócitos expostos ao bussulfano encontrado em doses

salivares.

MATERIAIS E MÉTODOS

• Cultura celular HaCat (comercial);

• Saliva Aritficial (Malpass et al., 2013);

• Bussulfano: 4.0, 4.5, 5.0 e 5.5µg/mL (Bezinelli et al, 2017);

• Grupos: Viabilidade celular; TUNEL; DPPH; SOD; CAT; Peroxidação Lipídica/TBARS; Ensaio Cometa.

• ControleC

• Controle Saliva

CS

• BussulfanoBU

RESULTADOS – Viabilidade Celular

Figura 1 – Média (±desvio-padrão) da viabilidade celular (normalizada pela da do controle (A) e controle saliva(B)) após tratamento com bussulfano em diferentes concentrações, inserido no meio sem saliva (A) e com saliva (B). Teste de Tukey, *p<0.05; **p<0.01

Efeito dose-dependente; 5.5µg/ml sem saliva 76%

viabilidade celular; Todas as doses de BU com saliva menor viabilidade;

Optamos por utilizar BU 5.5µg/ml;

RESULTADOS - TUNEL

Figura 2 - Box-plot para a porcentagem de células positivas para TUNEL em cada grupo. Traço horizontal espesso - mediana; Altura do box -intervalo interquartis; whiskers - valores mínimo e máximo; - outliers. * p<0.05 (Kruskal-Wallis seguido do teste de Dunn)

Maior fragmentação de DNA no grupo BU, quando comparado com os grupos controles (p<0.05).

Figura 3 – Exemplos de padrões de marcação no ensaio TUNEL, dos grupos Controle Saliva (CS) e Bussulfano (BU). Aumento de 400X

RESULTADOS - TUNEL

Figura 4 - Box-plot para a porcentagem de sequestro do radical livre DPPH em cada grupo. Traço horizontal espesso - mediana; Altura do box -intervalo interquartis; whiskers - valores mínimo e máximo. (Kruskal-Wallis seguido do teste de Dunn)

RESULTADOS - DPPH

Grupo BU apresentou menor potencial de sequestro do radical DPPH.

Figura 5 - Média (±desvio-padrão) da atividade da catalase, normalizada pela quantidade de proteínas em cada grupo e expressa em U/mg proteína. **p<0.01 (análise de variância Anova seguida do teste de Tukey)

RESULTADOS - CAT

**

**

Atividade da CAT foi maior no grupo BU.

Figura 6 - Média (±desvio-padrão) da quantidade de malondialdeído (MDA) em cada grupo. **p<0.01 (análise de variância Anova seguida do teste de Tukey)

RESULTADOS – TBARS**

**

Quantificação de malondialdeído (MDA);

Grupo BU maior quantidade de MDA.

RESULTADOS – SOD

Figura 7 – Média (± desvio-padrão) da densidade de banda obtida na técnica de Western-blotting para análise da superóxido dismutase. Foi realizada normalização com a densidade de banda da actina em todos os grupos. Sem diferenças significativas (teste de variância Anova)

Western Blot;Densidade do BU ligeiramente

maior;Manutenção nos níveis da SOD

(Gonçalves et al., 2009).

Figura 8 - Imagens representativas do espalhamento de fragmentos de DNA no ensaio cometa (DAPI, aumento original 400X). C: Ausência de cometas no grupo Controle. CS: Presença de cometas no grupo Controle Saliva, porém com caudas discretas. BU: Grande quantidade de cometas, com caudas nítidas

RESULTADOS – Ensaio Cometa

Figura 9 - Box-plot para a porcentagem de DNA na cauda do cometa. Traço horizontal espesso - mediana; Altura do box - intervalo interquartis; whiskers - valores mínimo e máximo; - outliers. * p<0.05 (Kruskal-Wallis seguido do teste de Dunn)

RESULTADOS – Ensaio Cometa

*

Grupo BU maior % de fragmentação de DNA.

A concentração salivar de bussulfano é tóxica para queratinócitos, induzindo estresse oxidativo e maior dano no

DNA.

CONCLUSÃO

danielle.correa@einstein.br