elisa, rie, if e wb

ELISA

HISTÓRIA

Antes do desenvolvimento dos Ensaios Imu-

noenzimáticos/ELISA, a única opção era o

Radioimunoensaio, uma técnica que usa

antígenos ou anticorpos marcaDos radio-

ativamente.

O Radioimunoensaio foi primeiramente des-

crito em um estudo por Rosalyn Sussman

Yalow e Solomon Berson publicado em 1960.

Continuação

Certas enzimas (como a peroxidase) reagem com substratos apropriados(como a 3,3’,5,5’-Tetrametilbenzidina), resultando em mudan-ças de cor, que podem ser usadas como um sinal.

Este sinal tem de estar associado com a pre-sença de anticorpo ou antígeno.

Este processo foi desenvolvido independe-mente por Stratis Avrameas e G.B. Pierce

INTRODUÇÃO AO ELISA

ELISA, ou enzyme-linked immunosorbent assay

(ensaio imunoadsorvente ligado a enzima), é um

técnica de immunoensaio envolvendo a reação de

antígeno e anticorpo in vitro. ELISA é um ensaio

sensível e específico para a detecção e quantificação

de antígenos ou anticorpos. Os testes de ELISA são

usualmente feitos em placas com micropoços.

O teste de ELISA foi o primeiro teste de rastreio

comumente empregado para o HIV. Ele tem alta

sensibilidade.

A 96-WELL MICROTITER PLATE USED FOR ELISA

COMPONENTES DO ELISA

Anticorpo: fração IgG de soro purificado por cromatografia de alta

afinidade

Enzima: peroxidase, beta-galactosidase ou fosfatase alcalina

Substrato: O produto final corado surge por ação da enzima que

converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o

substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma

substância indicadora – ABTS: sal diamônio de 2,2´-azino-di (3-

etil-benzotiazolina-6 sulfonato cor verde com peroxidase; p-

nitrofenil fosfato cor amarela com a fosfatase alcalina

ETAPAS DO ELISA

1. Os reagentes fixados à fase sólida são misturados

com o analito.

2. Adição do conjugado e incubação.

3. Lavagem com solução tampão contendo detergentes.

4. Substrato cromogênico é adicionado para o desen-

volvimento da cor.

5. A reação da enzima é interrompida.

6. A intensidade da cor resultante é lida em um espec-

trofotômetro ou fotocolorímetro.

ELISA

TIPOS DE ELISA

ELISA INDIRETO

ELISA SANDUÍCHE

ELISA COMPETITIVO

ELISA INDIRETO

O ELISA indireto utiliza um anticorpo primário não marcado em conjunção com um anticorpo secundário marcado.

ELISA INDIRETO

Vantagens da detecção indireta

Grande variedade de anticorpos secundários marca-

dos estão disponíveis comercialmente.

Imunorreatividade do anticorpo primário não é afe-

tada pelo anticorpo secundário.

Sensibilidade é aumentada porque cada anticorpo

primário contêm vários epítopos que podem se ligar

ao anticorpo secundário marcado, permitindo a

amplificação do sinal.

Desvantagens da detecção indireta

Reações cruzadas podem ocorrer com o

anticorpo secundário, resultando num sinal

não específico.

Uma etapa de incubação extra é necessária

no procedimento.

ELISA INDIRETO

ELISA INDIRETO

ELISA SANDUÍCHE OU DIRETO

1. A placa é recoberta com o anticorpo de

captura.

2. A amostra é adicionada, e qualquer antígeno

presente liga-se ao anticorpo de captura.

3. O anticorpo secundádrio ligado a enzima é

adicionado, ligando-se ao antígeno

4. O substrato é finalmente adicionado, e é

convertido pela enzima na forma detectável.

ELISA SANDUÍCHE OU DIRETO

DIRETO OU SANDUÍCHE

INDIRETO

ELISA INDIRETO X SANDUÍCHE

ELISA COMPETITIVO

Neste caso o anticorpo não-marcado é incubado na presença de seu antígeno.

Estes complexos de ligação antígeno-anticorpo são então adicionados a uma placa recoberta com o antí-geno.

A placa é lavado e o anticorpo não-ligado é removido. O anticorpo secundário marcado, específico para o

anticorpo primário é adicionado. O substrato é adicionado, e a enzima remanescente

produz um sinal cromogênico. Para o ELISA competitivo, quanto maior a concentra-

ção do antígeno original, menor a intensidade do sinal cromogênico.

ELISA COMPETITIVO

PRECAUÇÕES

Controle negativo com sinal forte Um excessivo sinal pode ser causado por:

1. Lavagem inadequada das placas. 2. Reagentes não suficientemente diluídos3. Ligação não-específica da enzima

conjugada. 4. O aparecimento de cor nos poços de contro-

le negativo podem também indicar reativida-de cruzada do anticorpo secundário com componentes da amostra de antígeno.

Controle positivo sem sinal Microplacas recobertas inapropriadamente. Reagentes aplicados em ordem incorreta ou

etapa omitida. O anticorpo secundário e o anticorpo primário

são incompatíveis. Enzima conjugada defeituosa ou inibida por

contaminantes. Anticorpo detector não compatível com o an-

ticorpo de captura (para ensaios sanduíche).

PRECAUÇÕES

ELISA com sinal fraco Tampão de lavagem não adequadamente

drenado após cada etapa de lavagem. Tempos de incubação inadeguados. Reagentes muito diluídos. Enzima conjugada

defeituosa ou inibida por contaminantes. Substrato defeituoso ou contaminado. Microplacas pouco recobertas. Perda do anticorpo de captura durante a

lavagem.

PRECAUÇÕES

APLICAÇÕES

Pesquisa de doadores de sangue para evidencição de contaminação viral por: HIV-1 e HIV-2 (presenca de anticorpos anti-HIV) Hepatite C (presença de anticorpos) Hepatitis B (testagem para anticorpos e o antígeno

viral) Dosagem de níveis hormonais

HCG (como teste para gravidez) LH (determinação do tempo de ovulação) TSH, T3 and T4 (para função tireioideana)

Detecção de infecções: Agentes sexualmente transmissíveis como HIV,

sífilis e clamídia Hepatite B e C Toxoplasma gondii

Detecção de alergenos em alimentos. Dosagem de "fatores reumatoides" e outras doenças

autoimunes como lupus eritematoso. Dosagem de toxinas alimentos conamindaos Detecção de drogas ilícitas:

cocaína opiáceos

APLICAÇÕES

RADIOIMUNOENSAIO

Histórico

Yalow e Benson – Desenvolvimento da primeira técnica utilizado radioisótopos para o estudo do metabolismo iodo. Mais tarde, eles adaptaram este método para o estudo de hormônios, principalmente a insulina.

Os pesquisadores provaram que a diabetes do Tipo II era causada pela ineficiência da utilização da insulina.

Histórico

• No ano de 1959, Drs. Rosalyn Yalow & Soloman Berson desenvolveram o radioimunoensaio, que apli-caram para quantificação da insulina.

• O RIE é o predecessor dos imunoensaios..

Dra. Rosalyn Yalow se tornou a primeira mulher a ganhar o Prêmio Nobel pelo seu traba-lho em Radioimunoensaio.

PRINCÍPIO

O Radioimunoensaio é baseado na reação antígeno-anticorpo no qual pequenas quantidades de antígenos radioconjugados competem com antígenos endógenos pelos locais de ligação de anticorpos específicos contra o mesmo antígeno.

Em princípio, o antígeno radioconjugado de ser similar em bioatividade e/ou imunoatividade ao antigeno natural .

Ag + Ag* + Ab AgAb + Ag*Ab + Ag* + Ag

Ag* não-ligado e Ag são lavadosRadioatividade do resíduo ligado é medidadaA concentação do antígeno é inversamente

proporcional a radioatividade

[Ag: ligantea ser medido; Ag * ligante radioconjugado]

PRINCÍPIO

REQUIREMENTOS

Um antígeno conjugado altamente purificado

Um antissoro específicoUm método de separaçãoUm método de quantificação

PRODUÇÃO DE ANTÍGENO CONJUGADO

Radiomarcação - Procedimento de conjugação

3 H 14 C 125 I podem ser usados como marcadores radioativos

Antígenos são conjugados com 3 H 14 C 125I

A conjugação não deve afetar especificidade antigênica & atividade de antigênica

A maioria dos RIEs atualmente utiliza 125 I como marcador:

i. Aceleração do processo de conjugação

ii. Retenção da atividade biológica dos reagentes O método da cloramina-T é comumente utilizado

para conjugação de 125 I com proteínas. A separação do antígeno radioconjugado do

isótopo livre é feita por Filtração em gel ou HLPC

QUANTIFICAÇÃO

Varios instrumentos sao utilizados para detecção e medida/quantificaçãoda radioatividade:

Contador de CintilaçãoContador Geiger-MullerContadores de Gás, etc..

METODOLOGIAS

Imunoensaios Competitivos

Imunoensaios Não-Competitivos

Imunoensaios Competitivos

O analito não ligado na amostra teste é mensurado pela sua habilidade de competir com o antígeno marcado por um número limitado de locais de ligação ao anticorpo.

A menor medição do Ag conjugdo no ensaio significa que mais do antígeno não conjugado na amostra teste está presente.

A quantidade de antígeno na amostra teste é inversamente proporcional a quantidade do conjugado medido nos formatos competitivos.

Enquanto um aumenta, o outro dimunui.

Imunoensaios Competitivos

Imunoensaios Competitivos

Maior nível sensiblidade e especificidade.

Este formato é referido como um ensaio sanduiche porque o analito está ligado entre dois anticorpos altamente específicos

Imunoensaios Não-Competitivos

A reação tipicamente inclui um excesso de anticorpo marcado no qual toda a droga ou metabólito está ligado. A quantidade do complexo Ag-Ac é então mensurada para determinar a quantidade de analito (droga/metabólito) presente na amostra. A quantidade do ragente marcado , normalmente um anticorpo, é diretamente proporcional a quantidade de antígeno presente na amostra.

Imunoensaios Não-Competitivos

Precisão e alta sensibilidade (detecta picogramamas de antígenos)

Facilidade de conjugação do isótopo. Detecção dos sinais sem otimização.Estabilidade contra interferência do ambiente

do ensaio.

VANTAGENS

DESVANTAGENS

CustoVida média curta dos reagentes.Requerem equipamento contador especial.Necessidade de proteção contra os efeitos

adversos da radiotividade.Descarte dos reagentes utilizados.

APLICAÇÕES

FarmáciaQuantificação de fármacos no soro. Detecção de abuso de drogas e intoxicação

por fármacos.Quantificação estereoespecífica– formas D &

LEstudo da cinética dos fármacos.

APLICAÇÕES

Pesquisa

Estudo da atividade metabólica hepática in vitro

Quantificação – hormônios, mediadores, fatores de crescimento, citocinas, prostanoides etc..

Endocrinologia Insulina, HCG, VasopressinaDetecção de desordens edocrinológicasFisiologia da função endócrina

EpidemiologiaHepatite B

APLICAÇÕES

Imunologia ClinicaAnticorpos para Alergenos InalatóriosDiagnóstico de Alergia

OncologiaAntígeno CarcinoembriônicoDetecção precoce do Câncer e Diagnóstico

APLICAÇÕES

RIA

IMUNOFLUORESCÊNCIA

IMUNOFLUORESCÊNCIA

Em 1941, Coon introduziu pela primeira vez o emprego de compostos fluores-centes como marcadores imunoquímicos para detecção de antígenos.

Os ensaios de imunofluorescência são rotineiramente utilizados atualmente nos laboratórios clínicos.

PRINCÍPIO DA TÉCNICA

Anticorpos ou antígenos são conjugados (liga-dos de modo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por ra-diações UV, emite luz no espectro visível.

Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa.

PRINCÍPIO DA TÉCNICA

A reação é feita em lâminas de mi-

croscopia (um pouco mais finas que as

comuns) e a observação tem lugar num

microscópio com luz UV.

(Microscópio de Fluorescência)

PRINCÍPIO DA TÉCNICA

Microscópio de fluorescência com epiluminação

luz UV atinge o ma- terial examinado

fluorescência emitida chega ao observador

PRINCÍPIO DA TÉCNICA

PRINCÍPIO DA TÉCNICA

SELEÇÃO DO FLUOROCROMO

O marcador deve ser estável.Apresentar alto coeficiente de absortivi-

dade molar.Bom rendimento quântico.Emissão de comprimento de onda ade-

quando.Não interferir nas reações ligante-anti-

corpo.

SELEÇÃO DO FLUOROCROMO

(Fluoresceína)

TIPOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

Existem três tipos principais de ensaios de

Imunofluorescência:

Imunofluorescência Direta

Imunofluorescência Indireta

Imunofluorescência Sanduíche

TIPOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA

1. Ag é fixado na lâmina.

2. Ac conjugado à Fluoresceína é adicionado.

3. A lâmina é lavada para remover o Ac não ligado.

4. Exame sob luz UV em um micoroscópio de fluorescência.

5. Os locais onde o Ac se ligou ao seu Ag espe-cífico apresentará fluorescência esverdead.a

Usos: Detecção direta de patógenos ou seus Ags em tecidos ou outras amostras.

IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

É uma técnica de dupla-camada

1. Ac não conjugado (analito) é aplicado diretamente no substrato.

2. Lavagem

3. Tratamento com anti-imunoglobulina fluorocromo-conjugada.

4. Lavagem

5. Observação em microscópio de imu-nofluorescência.

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

VANTAGENS DA IF INDIRETA

A fluorescência é melhor visualizada

(mais intensa) devido a maior quan-

tidade de anti-imunoglobulinas fluo-

rescentes que podem ligar-se a cada

Ac presente na primeira camada.

Alta especificidade.

USOS

IF Direta

Detecção direta de microrganismos em

secreções, na urina, nas fezes, em

cortes de tecidos, etc. Também é

utilizada na fenotipagem de células

tumorais

USOS

IF Indireta:

Diagnóstico sorológico de várias do-

enças infecciosas como a Doença de

Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e

complexos em doenças auto-imunes.

IF IMAGENS

HIV REAGENTE HIV NÃO-REAGENTE

IF IMAGENS

Confocal image to detect phosphorylated AKT (green) in cardiomyocytes infected with adenovirus

IF IMAGENS

IF IMAGENS

Concentrated groundwater methanotrophic bacteria on 0.2 m filter labeled with fluorescent antibodies.

IF IMAGENS

IF Trypanosoma cruzi

IF IMAGENS

IF Trypanosoma cruzi

IF IMAGENS

 Immunofluorescence image of Cryptosporidium parvum oocysts

IF IMAGENS

IFA reaction of a positive human serum on Rickettsia rickettsii

IF IMAGENS

Immunofluorescence - Glutamyl Prolyl tRNA synthetase antibody

WESTERN BLOTTING

HISTÓRICO

O western blotting, também chamado de imunoblotting, foi introduzido por Harry Towbin e col. em 1979.

“Electrophoretic transfer of proteins from poly-acrylamide gels to nitrocellulose sheets: proce-dure and some applications” Friedrich Miescher-Institut,Basel, Switzerland

HISTÓRICO

Atualmente é uma técnica rotineira para análise de proteínas.

A especificidade da interação antígeno-anticorpo permite uma proteína alvo ser identificada numa mistura complexa de proteínas.

O western blotting pode produzir dados quantitativos e semiquantitativos sobre esta proteína alvo.

WESTERN BLOTTING

Etapas do western blotting:

1. Separação das macromoléculas utilizan do eletroforese em gel.

2. As moléculas separadas são transferi-das (blotted) para uma secunda matriz: nitrocelulose ou difluoreto de polivinili-deno (PVDF).

WESTERN BLOTTING

3. A membrana é bloqueada para prevenir a ligação não específica de anticorpos na superfície da membrana.

4. Detecção utilizando anticorpos es-pecíficos para a proteína alvo.

MÉTODOS DE DETECÇÃO

i. Detecção enzimática

ii. Detecção radioativa

iii. Detecção fluorescente

iv. Detecção quimioluminescente

DETECÇÃO QUIMIOLUMINESCENTE

TIPOS DE DETECÇÃO

Detecção Direta

Detecção Indireta

TIPOS DE DETECÇÃO

DETECÇÃO DIRETA

Vantagens:

i. Rápida

ii. Inexistência de reatividade cruzada com Ac secundário

Desvantagens:

i. Conjugação pode reduzir a imunorrea-tividade do Ac primário.

ii. Ac primários conjugados são caros

iii. Pouca flexibilidade na escolha do Ac primário conjugado.

iv. Sinal de amplificação baixo.

DETECÇÃO DIRETA

DETECÇÃO INDIRETA

DETECÇÃO INDIRETA

Vantagensi. O Ac secundário pode amplificar o sinal.ii. Uma variedade de Ac secundários conju-

gados estão disponíveis.iii. Um Ac secundário pode ser utilizado com

vários Ac primários.iv.Conjugação não afeta a imunorreatividade

do Ac primário.v. Mudando o Ac secundário permite a mu-

dança do método de detecção.

DETECÇÃO INDIRETA

Desvantagens

i. Anticorpos secundários podem produ-zir reações não específicas.

ii. Etapas adicionais são requeridas em comparação com método direto.

ELETROFORESE EM GEL

A separação das proteínas é feita de a-cordo com suas propriedades físicas:

Ponto isolétrico (pI) Peso molecular Carga elétrica

A proteínas são separadas por eletrofo-rese em gel de poliacrilamida (PAGE).

ELETROFORESE EM GEL

As amostras são colocadas em poços no gel. Quando uma voltagem é aplicada ao longo do gel,

as proteínas irão migrar em velocidades diferentes. Estas diferentes taxas de avanço separam as ptns

em bandas dentro de cada raia.

ELETROFORESE EM GEL

TRANSFERÊNCIA (Blotting)

A fim de fazer as proteínas acessíveis à detecção do anticorpo, elas são movidas do gel para uma membrana de nitrocelulose ou de PVDF.

A membrana é colocada face-a-face com o gel, e uma corrente elétrica é aplicada entre as placas de cada lado, então as proteínas carregadas se movem do gel para a membrana enquanto mantém a mesma dis-posição que continham no gel.

TRANSFERÊNCIA (Blotting)

TRANSFERÊNCIA (Blotting)

TRANSFERÊNCIA (Blotting)

Como resultado desse processo de "borramento" (blotting), as proteínas são expostas a uma fina camada para detecção.

A ligação das proteínas à membrana é baseada tanto em interações hidrofóbicas quanto em interações de cargas entre a membrana e as proteínas.

As membranas de nitrocelulose são mais baratas que as de PVDF, porém são mais frágeis e não suportam bem a repetidas amostragens.

TRANSFERÊNCIA (Blotting)

A uniformidade e efetividade da transferência das proteí-nas do gel para a membrana pode ser comfirmada com a utilização de corantes: Coo-massie Brilliant Blue G-250 e Ponceau S.

Coomassie

Ponceau S

TRANSFERÊNCIA (Blotting)

Membrana de nitrocelulose após coloração com Ponceau S

BLOQUEIO

A membrana foi escolhida por sua habilidade de ligar proteínas.

É necessário impedir as interações não espe-cíficas entre a membrana e o anticorpo usado para a detecção da proteína alvo.

O bloqueio da ligação não específica é alcan-çado pondo-se a membrana em uma solução diluída de uma proteína - tipicamente albumi-na de soro bovino (BSA) ou leite seco desna-tado, com uma pequena quantidade de deter-gente como Tween 20 ou carbono coloidal.

ETAPAS DE LAVAGEM

Assim com outros imunoensaios, o Western Blotting consiste numa série de incubações com diferentes reagentes imunoquímicos se-paradas por etapas de lavagem.

As etapas de lavagem são necessárias para:

i. Remover reagentes não ligados.

ii. Aumentar a sensibilidade.

iii. Amplificar o sinal. Soluções tampões: TBS (tris buffered saline) e

PBS (phosphate buffered saline).

APLICAÇÕES DO WESTERN BLOTT

Teste confirmatório de HIV:

i. Proteínas de células conhecidas infectadas com HIV são separadas e “blotadas” em u-ma membrana.

ii. O soro a ser testado é aplicado.iii. Ac livre é lavado.iv. Adição de Ac anti-Ig humana secundário con

jugado a enzima.v. Substrato é adicionado.vi. As bandas impregnadas indicam os Ac do

paciente.

WESTERN BLOTT - HIV

É o teste confirmatório padrão.

Quando testado combinado com ELISA apresenta especificidade maior que 99,9%.

WESTERN BLOTT - HIV

Os antigenos virais do HIV são separados como: gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p31, p24, p17, e p15.

A interpretação depende da pre-sença/ausência de reatividade a antígenos específicos.

WESTERN BLOTT - HIV

Os anticorpos no soro devem re-agir com pelo menos dois dos an-tígenos seguintes:

gp 160/120

gp 41

p 24

WESTERN BLOTT - HIV

Ausência de qualquer reativida-

de às bandas é declarado como NEGATIVO.

Falsos positivos são raros.

WESTERN BLOTT - HIV

Pode dar resultados indetermina-dos na:

i. Gravidez

ii. Após administração de Toxóide Tetânico

iii. Condições autoimunes

WESTERN BLOTT - HIV

Teste definitivo para diagnóstico da Ence-falopatia espongiforme bovina (BSE - Do-ença da vaca louca).

Diagnóstico de algumas formas de Doença de Lyme.

Pode ser também utilizado como teste con firmatório para Hepatite B.

APLICAÇÕES DO WESTERN BLOTT

SISTEMA ABO & Rh(D)

ANTÍGENOS ERITROCITÁRIOS

Mais de 700 antígenos eritrocitários fo-ram descritos na literatura.

25 sistemas de grupos sanguíneos são descritos pela Sociedade Internacional de Transfusão Sanguínea.

Muitos antígenos eritrocitários são de al-ta frequência na maioria dos doadores, enquanto outros são extremamente ra-ros

ANTÍGENOS ERITROCITÁRIOS

SISTEMA ABO

Descoberto em 1901 pelo Dr. Karl Landsteiner

4 Fenótipos principais (A, B, AB, O)

Gen ABO localizado no cromosoma 9.

PopulationO A B AB

  Aborigines 61 39 0 0  Basques 51 44 4 1  Blackfoot (N. Am. Indian) 17 82 0 1  Bororo 100 0 0 0  Chinese-Canton 46 23 25 6  Chinese-Peking 29 27 32 13  English 47 42 8 3  Hawaiians 37 61 2 1  Irish 52 35 10 3  Mayas 98 1 1 1  Navajo (N. Am. Indian) 73 27 0 0  Peru (Indians) 100 0 0 0  United Kingdom (GB) 47 42 8 3  USA (blacks) 49 27 20 4  USA (whites) 45 40 11 4

DISTRIBUIÇÃO DOS ANTÍGENOS ABO

DISTRIBUIÇÃO DO ALELO “A”

DISTRIBUIÇÃO DO ALELO “B”

DISTRIBUIÇÃO DO ALELO “O”

Ligados a Proteínas ou Lipídeos na superfície dos eritrócitos

Substrato Molecular é o antígeno H (fucose)

Antígeno A N-acetyl-galactosamina (GalNAc)

Antígeno B Galactose (Gal)

SISTEMA ABO

SISTEMA ABO

ANTICORPOS ABO

Os anticorpos dirigidos contra os antíge-nos ABO são os mais importantes na medicina transfusional.

Os anticorpos ABO são de ocorrência na-tural.

O estímulo imune para formação de Ac ABO pode ser a exposição a substâncias semelhantes a ABH encontrados na natu-reza (ex. polissacarídeos bacterianos).

A maioria dos Ac ABO de ocorrência na-tural pertencem ao isotipo IgM.

Os anticorpos ABO podem ocorrer após estimulção imune por transfusão ou gra-videz isotipo IgG.

Os anticorpos ABO são uma causa de reações hemolíticas transfusionais e do-ença hemolítica do recém-nato.

ANTICORPOS ABO

Allele from the mother

Allele from the father

Genotype ofoffspring

Blood types ofoffspring

A A AA A

A B AB AB

A O AO A

B A AB AB

B B BB B

B O BO B

O O OO O

HEREDITARIEDADE DO GRUPAMENTO ABO

SISTEMA Rh (D)

O sistema Rh(D) é mais com-plexo, com mais de 50 antíge-nos.

Descoberto em 1940 por Wie-ner e Landsteiner e após o trabalho em macacos Rhesus.

O gene RH está localizado no cromosoma 1.

População Rh(D) pos Rh(D) neg

Caucasianos 86% 14%

Afro-Americanos

95% 5%

Orientais >99% <1%

DISTRIBUIÇÃO DO FATOR Rh(D)

SISTEMA Rh

80% das pessoas Rh(D) neg expostas ao sangue Rh(D) pos desenvolverão Ig anti-D.

Ig anti-D pode também ser estimulado pela gravidez de um bebê Rh(D) po-sitivo. Sensibilização pode ser prevenida pelo uso

de anti-D imunoglobulina, pré-natal e pós-natal.

ANTÍGENO Rh

Antígeno D

Antígeno D fraco

Antígeno D parcial

Fenótipo Rh nulo

ANTÍGENOS Rh

O Rh consiste de 3 proteínas integrais da membrana eritrocitária: RhD, RhCcEe e uma glicoproteína com Rh (RH50, Rh A G).

O antígeno D, o mais imunogênico de todos os Ag Rh, consiste na proteína D.

A proteína D possui 9 aminoácidos especí-ficos identificados como epítopos funcionais: (Met169, Met170, Ele172, Fe223, Ala226, Glu233, Asp350, Ala353 e Gli354)

Aproximadamente 1% dos indivíduos D-pos é tipado como D fraco, caracterizado pela aglutinação fraca ou inexistente com anti-D proteína RhD mutante.

Os antígenos D parciais são proteínas RhD com perda dos epítopos D.

Rh-neg (D-) reflete a deleção de todo o gene RHD – mas não da ptn RhCcEe.

ANTÍGENOS Rh

FENÓTIPO Rhnulo

Os eritrócitos Rhnulo não possuem nenhum dos antígenos Rh como resultado da au-sência aparente da proteína RhD e RhCcEe.

As células Rhnulo são extremamente raras (<1 por 6 milhões de indivíduos).

Uma vez que indivíduos Rhnulo podem ser sensibilizados a múltiplos Ag Rh, a trans-fusão de suporte pode ser bastante difícil.

Os genes ABO & RH não são ligados.Os antígenos ABO & Rh(D) são herados

separadamente.

Por exemplo:Uma mãe A Rh(D) pos

e um pai B Rh(D) pos

podem ter um filho O Rh(D) neg.

HEREDITARIEDADE ABO E Rh(D)

ABO & Rh(D) 130

HEREDITARIEDADE ABO E Rh(D)

Mother

Group A AO

Rh(D) pos Dd

Father

Group B BO

Rh(D) pos Dd

Group A AO

Rh(D) pos Dd

Group B BO

Rh(D) pos Dd

Group O OO

Rh(D) neg dd

Group AB AB

Rh(D) pos Dd

TESTES PRÉ-TRANSFUSIONAIS

O teste pré-transfusão é realizado para selecionar o hemocomponente mais a-dequado para o receptor. Os passos ge-rais neste processo incluem:

1. Identificação adequada do receptor e a-mostra coletada.

2. Revisão de todos os registros anterio-res do receptor e comparação com os resultados atuais.

TESTES PRÉ-TRANSFUSIONAIS

3. Determinação do tipo sanguíneo ABO/ Rh e teste para anticorpos irregulares (Coombs Indireto).

4. Seleção de um hemocomponente apro-priado, compatível para o ABO/Rh do receptor.

5. Realização de exames a fim de inves-tigar incompatibilidade entre o soro do receptor e a células do doador.

TESTE DE COOMBS

O teste de Coombs indireto permite a identifica-ção de anticorpos antieritrocitários no soro. É importante para a avaliação de gestantes Rh (-) (avaliação de sensibilização), em pacientes com Rh (-) para avaliação da variante Du e nas fases pré-transfusionais, especialmente em pacientes já transfundidos, em que pode ter ocorrido sem-sibilização para Rh e outros sistemas. .

PROVA DE COMPATIBILIDADE

TÉCNICA COM ALBUMINA BOVINA 22%

a) Marcar dois tubos de ensaio com a identificaçãoo I e II;b) Colocar em cada tubo 100 ul de soro do paciente e 100 ul de suspensão de hemácias a 5%; c) Colocar 2 gotas de albumina bovina a 22% no tubo I;d) Centrifugar a 2700 rpm por 1minuto e fazer a leitura dos dois tubos;e) Incubar os dois tubos a 37o C por 15 minutos, centrifugar a 2700 rpm por 1 minuto e fazer a leitura;

f) Deixar o tubo II no Banho Maria como reserva e continuar apenas com o tubo I;g) Lavar três vezes com salina, desprezando bem a salina da última lavagem;h) Adicionar 2 gotas de antiglobulina humana centrifugar e fazer a leitura;i) Se o teste for negativo, adicionar 1 gota de controle de Coombs, centrifugar a 2700 rpm por 1minuto e fazer a leitura;j) Esse resultado deverá ser positivo pois essas hemácias servem como controle da reação.

PROVA DE COMPATIBILIDADE

PROVA DE COMPATIBILIDADE