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2009/2010
Mariana Marques Santos Pintalhão
EFEITOS MIOCÁRDICOS DA
ANGIOTENSINA 1-7 E SEU PAPEL
NA FUNÇÃO CONTRÁCTIL APÓS
HIPÓXIA-REOXIGENAÇÃO
Abril, 2010
Mestrado Integrado em Medicina
Área: Fisiologia
Trabalho efectuado sobre a Orientação de:
Prof. Doutor Paulo Manuel Barreiros de Castro Chaves
Prof. Doutor Joaquim Adelino Leite Moreira
Mariana Marques Santos Pintalhão
EFEITOS MIOCÁRDICOS DA
ANGIOTENSINA 1-7 E SEU PAPEL
NA FUNÇÃO CONTRÁCTIL APÓS
HIPÓXIA-REOXIGENAÇÃO
Abril, 2010
Trabalho estruturado de acordo com as Normas para Publicação da revista
Arquivos Brasileiros de Cardiologia
Projecto de Opção do 6º ano - DECLARAÇÃO DE REPRODUÇÃO
Nome: __Mariana Marques Santos Pintalhão______________________________________________
Endereço electrónico: m04143@med.up.pt____________
Título da Dissertação/Monografia/Relatório de Estágio: ____Efeitos miocárdicos da_________
angiotensina 1-7 e seu papel na função contráctil após hipóxia-reoxigenação_____________________
Nome completo do Orientador:
____Paulo Manuel Barreiros de Castro Chaves _____________________________________________
Nome completo do Co-Orientador:
____Joaquim Adelino Correia Ferreira Leite Moreira _________________________________________
Ano de conclusão: _2010____
Designação da área do projecto de opção:
____Fisiologia_______________________________________________________________________
É autorizada a reprodução integral desta Dissertação apenas para efeitos de investigação, mediante
declaração escrita do interessado, que a tal se compromete.
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 20 / 04 /2010
Assinatura: ________________________________________________
Projecto de Opção do 6º ano - DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE
Eu, __Mariana Marques Santos Pintalhão_________________, abaixo assinado, nº
mecanográfico_040801143__, aluno do 6º ano do Mestrado Integrado em Medicina, na Faculdade de
Medicina da Universidade do Porto, declaro ter actuado com absoluta integridade na elaboração deste
projecto de opção.
Neste sentido, confirmo que NÃO incorri em plágio (acto pelo qual um indivíduo, mesmo por omissão,
assume a autoria de um determinado trabalho intelectual, ou partes dele). Mais declaro que todas as
frases que retirei de trabalhos anteriores pertencentes a outros autores, foram referenciadas, ou
redigidas com novas palavras, tendo colocado, neste caso, a citação da fonte bibliográfica.
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 20 / 04 / 2010
Assinatura: ________________________________________________
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
1
Efeitos miocárdicos da angiotensina 1-7 e seu papel na função contráctil após
hipóxia-reoxigenação
Angiotensin 1-7 myocardial effects and its role on contractile function after hypoxia-
reoxygenation
Título abreviado: Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
Mariana Pintalhao, Rui Cerqueira, Paulo Castro-Chaves, Ricardo Fontes-Carvalho,
Adelino Leite-Moreira
Departamento de Fisiologia, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, Portugal
Endereço para correspondência:
Prof. Dr. Adelino Leite-Moreira
Departamento de Fisiologia, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Alameda Prof. Hernâni Monteiro, 4200-319 Porto, PORTUGAL
Tel. +351-22.551.36.44; Fax. +351-22.551.36.46;
E-mail: amoreira@med.up.pt
Palavras-Chave: sistema renina-angiotensina, contracção miocárdica, relaxamento,
isquemia miocárdica, endotélio
Key-words: renin-angiotensin system, myocardial contraction, relaxation, myocardial
ischemia, endothelium
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
2
RESUMO
FUNDAMENTO: A angiotensina 1-7 (Ang1-7) é um heptapeptídeo do sistema renina-
angiotensina (SRA) com acções cardiovasculares contra-reguladoras da angiotensinaII.
OBJECTIVOS: Neste trabalho pretendemos descrever os efeitos da Ang1-7 sobre a
função miocárdica aguda e num modelo de hipóxia-reoxigenação.
MÉTODOS: Os efeitos da Ang1-7 foram avaliados em músculos papilares isolados de
coelho. Inicialmente, avaliaram-se os efeitos de concentrações crescentes de Ang1-7
(10-9
-10-5
M) em condições basais; na presença de antagonistas dos receptores Mas
(A779), AT1 (ZD-7155) ou AT2 (PD-123,319) ou do inibidor da NO síntase L-NA; e
após a remoção selectiva do endotélio endocárdico (EE). Numa segunda fase, após o
pré-tratamento com Ang1-7 ou veículo (controlo), procedeu-se a 30min de isquemia e
40min de reperfusão, seguidos da adição de concentrações crescentes de isoprenalina.
RESULTADOS: A Ang1-7 induziu uma diminuição significativa da tensão activa (TA),
dT/dtmax e dL/dtmax de 10,5±3,6%, 5,3±2,6% e 5,7±2,3%, respectivamente. Estes efeitos
não se alteraram significativamente na presença de ZD-7155 ou PD-123,319, mas foram
abolidos após a remoção do EE e na presença de A-779 ou L-NA. Após a
hipóxia-reoxigenação, a resposta muscular à isoprenalina foi significativamente superior
no grupo Ang1-7 vs. controlo (elevação da TA 434,4%±69,0% vs. 238,6%±26,9%,
dT/dtmax 525,9%±51,7% vs. 373,4%±40,3% e dT/dtmin 552,9%±74,9% vs.
333,2%±40,8%).
CONCLUSÃO: Nesta espécie animal, a Ang1-7 induz um efeito inotrópico negativo,
dependente do receptor Mas e modulado pelo EE e pelo NO, e melhora a resposta
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
3
miocárdica à estimulação beta-adrenérgica na hipóxia-reoxigenação. Estes resultados
sublinham o papel contra-regulador da Ang1-7 no coração e o seu potencial efeito
benéfico na disfunção contráctil pós-isquémica.
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
4
INTRODUÇÃO
O sistema renina-angiotensina (SRA) é um regulador crucial da homeostasia
cardiovascular. O seu principal efector clássico é a angiotensina II (AngII), que actua
através da ligação aos receptores AT1 e AT21. A inibição farmacológica do SRA com
inibidores da enzima de conversão da angiotensina (IECAs) e antagonistas dos
receptores AT1 (ARAs) é actualmente uma importante abordagem na terapêutica da
hipertensão arterial, do pós-enfarte agudo do miocárdio, da insuficiência cardíaca e da
nefropatia diabética2.
Nos últimos anos, o SRA foi alvo de intensa investigação, tendo sido descritos
vários sistemas locais independentes do sistema circulante e identificadas novas vias,
envolvendo novas enzimas, receptores e peptídeos bioactivos3. Entre estes, o
heptapeptídeo angiotensina 1-7 (Ang1-7) tem recebido uma atenção crescente, sendo
actualmente considerado um produto major do SRA4, com um papel crítico na contra-
regulação das acções cardiovasculares da AngII5.
A síntese de Ang1-7 está dependente da actividade da enzima de conversão da
angiotensina tipo 2 (ECA2) sobre a AngII6. Uma vez sintetizada, a Ang1-7 pode ligar-se
a vários receptores do SRA7, como os receptores AT1 e AT2, embora com baixa
afinidade8,9
. Em 2003, a Ang1-7 foi identificada como o ligando endógeno de um
receptor previamente órfão, o receptor Mas, através do qual este peptídeo parece exercer
as suas acções fisiológicas mais relevantes10
.
O coração foi identificado como um dos principais alvos da Ang1-7,
verificando-se uma elevada expressão cardíaca de ECA2 e do receptor Mas11
. Assim,
este novo eixo parece ter um papel fundamental nas acções cardíacas do SRA, onde
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
5
pode exercer efeitos anti-arritmogénicos e anti-hipertróficos5,12
e apresentar um
potencial efeito cardioprotector após a isquemia-reperfusão13,14
. A nível vascular, a
Ang1-7 induz um efeito vasodilatador e antiproliferativo15
.
Actualmente, propõe-se uma nova visão do SRA, em que o eixo ECA2/Ang1-
7/Mas se torna um potencial braço alternativo ao eixo clássico ECA/AngII/AT1 (Fig.1).
No entanto, o papel deste novo eixo na modulação aguda da função miocárdica
permanece ainda por esclarecer. Este trabalho tem como objectivos descrever os efeitos
agudos da Ang1-7 sobre a função contráctil miocárdica, bem como avaliar o papel deste
peptídeo na modulação da função miocárdica num modelo de hipóxia-reoxigenação.
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
6
MÉTODOS
Este trabalho foi realizado de acordo com as Normas de Utilização de Animais
de Laboratório do National Institute of Health (publicação do NIH nº. 85-23, revista em
1996).
Preparação experimental
Coelhos brancos neozelandeses machos (Oryctolagus cuniculus; 2.0–3.0kg;
n=39) foram anestesiados com pentobarbital de sódio endovenoso (25 mg.kg-1
). Foi
executada uma toracotomia esquerda, seguida da extracção imediata do coração e sua
imersão numa solução de Krebs-Ringer modificada (composição em mM: 98 NaCl; 4,7
KCl; 2,4 MgSO4·7H2O; 1,2 KH2PO4; 4,5 glicose; 1,8 CaCl2·2H2O; 17 NaHCO3; 15
C3H3NaO3; 5 CH3COONa) a 35ºC com o composto cardioplégico 2,3-butanediona
monoxima (BDM;3%) e 5% de soro de vitelo. As soluções foram estabilizadas com O2
a 95% e CO2 a 5%, mantendo o pH entre 7.38 e 7.42.
Após a dissecção, os músculos papilares do ventrículo direito (n=66;
comprimento em Lmax: 3,1±1,2mm; peso: 2,7±0,2 mg; pré-carga: 3,6±0,2 mN) foram
montados verticalmente em banhos próprios plexiglas de 10 ml contendo a solução
referida. A extremidade inferior dos músculos foi fixada num clip de fosfobronze e a
extremidade superior, tendinosa, foi fixada a um transdutor electromagnético tensão-
comprimento (Universidade de Antuérpia, Bélgica). A pré-carga aplicada inicialmente
variou entre 3 e 4 mN, de acordo com as dimensões musculares. As preparações foram
estimuladas electricamente a uma frequência de 0,6Hz e a uma voltagem 10% acima do
limiar (tipicamente 3 a 6 mV), com pulsos rectangulares com a duração de 5 ms, através
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
7
de dois eléctrodos de platina orientados paralelamente ao músculo papilar. Vinte
minutos depois, as soluções foram substituídas por outras em tudo semelhantes, mas
sem BDM e, 30 minutos após, por outras sem BDM nem soro. Durante as 2 horas
seguintes, os músculos foram estabilizados.
Finalmente, os músculos foram estirados até ao comprimento fisiológico
máximo (Lmax,mm), que consiste no comprimento muscular para o qual o
desenvolvimento de tensão activa (TA) é máximo. Os protocolos foram iniciados após a
obtenção de duas contracções isotónicas e isométricas controlo sobreponíveis, separadas
por um intervalo de 10 minutos.
No final de cada protocolo experimental, os músculos foram cuidadosamente
removidos do banho e pesados. A área de secção transversal dos músculos foi calculada
através da divisão do peso pelo comprimento muscular. Foi assumido um formato
muscular cilíndrico e uma gravidade específica de 1,016
e a tensão muscular foi expressa
como força normalizada para a área de secção transversal (mN·mm-2
).
Protocolo experimental:
1. Caracterização dos efeitos agudos da Ang1-7 na função miocárdica
Os efeitos de concentrações crescentes de Ang1-7 (10-9
,10-8
,10-7
,10-6
e 10-5
M)
na função cardíaca sistólica e diastólica foram avaliados em preparações de músculos
papilares de coelho com o endotélio endocárdico intacto (n=12) e após a sua remoção
selectiva (n=9). Vários métodos químicos, mecânicos e farmacológicos têm sido
desenvolvidos para a destruição selectiva do endotélio endocárdico in vitro, sem
danificar o miocárdio subjacente. Neste protocolo experimental, a remoção selectiva do
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
8
endotélio endocárdico foi realizada de acordo com a metodologia clássica descrita e
validada por Brutsaert et al17
, que consiste na imersão dos músculos papilares numa
solução de Triton X-100 (0,5%) durante 1 segundo, seguida de uma lavagem abundante.
As mesmas concentrações de Ang1-7 foram ainda adicionadas a músculos com o
endotélio intacto na presença de um antagonista do receptor Mas (A779, 10-5
M,n=6), de
um antagonista selectivo dos receptores AT1 (ZD-7155, 10-5
M, n=9), de um antagonista
selectivo dos receptores AT2 (PD-123,319, 10-6
M, n=7) ou de um inibidor da síntase do
NO (NG-nitro-L-arginina (L-NA), 10-5
M; n=11).
Estas substâncias foram adicionadas à solução superfusora de Krebs-Ringer e as
contracções musculares foram registadas após a obtenção de uma resposta estável.
2. Efeitos da Ang1-7 na contractilidade miocárdica após a hipóxia-reoxigenação
Com o objectivo de avaliar os efeitos da Ang1-7 na performance miocárdica
após hipóxia-reoxigenação, realizou-se o protocolo esquematizado na Fig.2. Após a
estabilização das preparações musculares, conforme descrito na secção acima,
procedeu-se à adição de Ang1-7 (grupo Ang1-7, 10-5
M, n=6) ou de um volume
semelhante de veículo (grupo controlo, 200μl H2O, n=6) à solução superfusora. De
seguida, induziu-se em ambos os grupos hipóxia muscular através da substituição da
mistura gasosa inicial (95%O2 / 5%CO2) por uma mistura de N2 a 95% e CO2 a 5%. A
hipóxia foi mantida durante um período de 30 minutos, no fim do qual se procedeu à
reoxigenação, através da reposição da mistura gasosa inicial, durante 40 minutos. A
ausência de recuperação da TA desenvolvida para níveis pré-hipóxicos foi tomada como
evidência de disfunção contráctil pós-hipóxica.
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
9
Após a reoxigenação, a reserva contráctil miocárdica foi avaliada através da
resposta à adição de concentrações crescentes de isoprenalina (10-8
,10-7
,10-6
M)18
. Estas
concentrações foram adicionadas à solução superfusora de Krebs-Ringer e as
contracções musculares foram registadas quando se atingiu a resposta máxima para cada
concentração, tipicamente 3 a 5 minutos após a adição.
Todos os reagentes foram adquiridos na Sigma Aldrich, com excepção do ZD-
7155, que foi adquirido na Tocris.
Aquisição e análise dos dados
Neste trabalho foram registadas contracções isotónicas e isométricas, permitindo
a análise dos seguintes parâmetros: TA (mN·mm-2
), velocidade máxima de elevação de
tensão (dT/dtmax; mN·mm-2
·s-1
), velocidade máxima de queda de tensão (dT/dtmin;
mN·mm-2
·s-1
), encurtamento muscular (EM, %Lmax), velocidade máxima de
encurtamento (dL/dtmax; Lmax·s-1
), velocidade máxima de reextensão (dL/dtmin; Lmax·s-1
)
e tempo de abalo muscular (tHR; ms).
Análise estatística
Os valores são apresentados como média±erro padrão. Para a análise dos efeitos
de concentrações crescentes de Ang1-7 ou de isoprenalina na função muscular, as
significâncias estatísticas foram determinadas utilizando o teste ANOVA e Student-
Newman-Keuls para comparações múltiplas emparelhadas. No segundo protocolo, para
comparação da resposta à dose máxima de isoprenalina nos dois grupos (controlo e
Ang1-7), as significâncias estatísticas foram determinadas utilizando o teste t para
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
10
distribuição normal e o teste Mann-Whitney Rank Sum para distribuições não normais.
P<0.05 foi aceite como significativo.
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
11
RESULTADOS
1. Caracterização dos efeitos agudos da Ang1-7 na função miocárdica
A performance basal dos músculos papilares de coelho foi idêntica em todos os
protocolos experimentais. Nenhum inibidor alterou significativamente a performance
muscular basal.
Em condições basais, com o endotélio endocárdico intacto, a Ang1-7 induziu
uma diminuição da contractilidade muscular dependente da concentração, sem alterar os
parâmetros do relaxamento (Fig.3). Os efeitos estabilizaram cerca de 20 minutos após a
adição de cada dose de Ang1-7, sendo máximos na concentração de 10-5
M. Esta última
concentração de Ang1-7 induziu uma diminuição de 10,5±3,6% TA, 8,0±3,0% dT/dtmax,
5,3±2,6% EM, 5,7±2,3% dL/dtmax e 4,4±1,2% tHR. Não se verificaram alterações
estatisticamente significativas do dT/dtmin e do dL/dtmin.
Na presença de ZD-7155, um antagonista dos receptores AT1, a resposta
muscular à Ang1-7 não se alterou significativamente (Fig.3). De facto, o efeito
inotrópico negativo manteve-se, com uma diminuição de 10,7±4,4% TA para a
concentração de 10-5
M. À semelhança do protocolo anterior, os parâmetros do
relaxamento dT/dtmin e dL/dtmin não variaram significativamente. O efeito inotrópico
negativo também se manteve quando se procedeu à adição de Ang1-7 na presença de
PD-123,319, um antagonista selectivo dos receptores AT2 (Fig.3). Neste protocolo, a
concentração máxima do heptapeptídeo induziu uma diminuição significativa de
15,3±2,7% TA.
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
12
Os efeitos da Ang1-7 na contractilidade miocárdica foram abolidos na presença
do antagonista do receptor Mas A-779 (Fig.3), verificando-se, por exemplo, uma
diminuição não significativa de 1,4±2,9%TA na concentração máxima de Ang1-7.
Quando a adição da Ang1-7 foi realizada após a remoção selectiva do endotélio
endocárdico, os efeitos deste peptídeo na contractilidade miocárdica também foram
abolidos (Fig.4). Verificou-se mesmo um aumento da TA de 8,9±4,8%, apesar de não
significativo. Na presença de L-NA, um inibidor da síntase do NO, o efeito inotrópico
negativo basal da Ang1-7 também foi antagonizado (Fig.4), observando-se uma
diminuição não significativa de 2,3±2,7% TA (10-5
M Ang1-7).
2. Efeitos da Ang1-7 na contractilidade miocárdica após a hipóxia-reoxigenação
Relativamente aos efeitos da hipóxia-reoxigenação na função muscular, não se
observaram diferenças estatisticamente significativas entre o grupo Ang1-7 e o grupo
controlo no final dos períodos de hipóxia e reoxigenação. Verificou-se uma tendência
para uma melhor recuperação da contractilidade durante a reoxigenação no grupo
Ang1-7, evidenciada por uma maior percentagem de aumento da TA relativamente ao
seu valor no final do período de hipóxia (634%±197% Ang1-7 versus 398%±133,7%
controlo). No entanto, a comparação dos valores dos parâmetros contrácteis no final da
reoxigenação com os seus valores pré-hipóxia não mostrou diferenças significativas
entre os dois grupos (diminuição da TA de 68,6%±5,0% Ang1-7 versus 52,5%±7,0%
controlo, relativamente aos seus valores pré-hipóxicos).
Após a lesão de hipóxia-reoxigenação, a reserva contráctil miocárdica foi
avaliada através da determinação da curva dose-efeito da isoprenalina18
. Neste
protocolo, a resposta inotrópica e lusitrópica à estimulação beta-adrenérgica foi
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
13
significativamente superior no grupo Ang1-7, quando comparada com a resposta no
grupo controlo (Fig.5). Apesar de se observar um efeito inotrópico e lusitrópico positivo
significativo em ambos os grupos após a adição de concentrações crescentes de
isoprenalina, o pré-tratamento com Ang1-7 permitiu uma melhor resposta a esta
estimulação. Enquanto que no grupo controlo, para a concentração máxima de
isoprenalina (10-6
M), se verificou um aumento significativo de cerca de 238,6%±26,9%
TA e de 373,4%±40,3% dT/dtmax, a resposta contráctil no grupo Ang1-7 foi
significativamente superior, com um aumento de cerca de 434,4%±69,0% TA e de
525,9%±51,7% dT/dtmax.
No que diz respeito à função cardíaca diastólica, o grupo Ang1-7 apresentou
também uma aceleração do relaxamento relativamente ao grupo controlo após
estimulação com isoprenalina, verificando-se um aumento do dT/dtmin de
552,9%±74,9% Ang1-7 versus 333,2%±40,8% controlo (10-6
M isoprenalina). Não se
verificaram alterações significativas no tHR.
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
14
DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
O presente trabalho reforça o papel da Ang1-7 na modulação aguda da função
miocárdica. Por um lado, descrevemos pela primeira vez que, nesta espécie animal, a
Ang1-7 induz um efeito inotrópico negativo dependente da activação do receptor Mas e
modulado pelo endotélio endocárdico e pelo NO, o que realça o seu papel contra-
regulador do SRA. Por outro lado, num modelo experimental de hipóxia-reoxigenação
em músculos papilares isolados de coelho, a Ang1-7 mostrou ter um potencial efeito
benéfico na disfunção contráctil associada à hipóxia, melhorando a resposta à
estimulação beta-adrenérgica.
A Ang1-7 tem um papel biológico conhecido desde 1988, altura em que foi
associada à libertação de vasopressina19
. Actualmente, parece ter acções
contrarreguladoras da AngII, opondo-se aos efeitos do eixo AngII/AT1 em vários
tecidos-alvo, através da inibição da proliferação e migração celulares, deposição de
matriz extracelular, inflamação e trombose4,5
(Fig.1 e 6).
A síntese da Ang1-7 é mediada pela acção da ECA2, uma enzima descoberta em
200011,20
, sobre a AngII6; uma vez formada, a Ang1-7 é rapidamente inactivada pela
ECA ou por aminopeptidases21
. Curiosamente, a degradação da AngII em Ang1-7 pela
ECA2 tem uma eficiência catalítica superior à degradação da angiotensina I em AngII
pela ECA (Kcat/Km 2,2x106M
-1·s
-1 versus Kcat/Km 1,8x10
5M
-1·s
-1)22
. Estes dados
sugerem que a síntese da Ang1-7 é assim uma via central no SRA e depende
fundamentalmente da degradação da AngII, pelo que a sua relevância fisiopatológica
pode ser mais marcada em condições associadas a uma hiperactivação do SRA com
aumento dos níveis de AngII. Este heptapeptídeo contrapõe-se aos efeitos deletérios da
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
15
AngII por duas vias: 1) através da diminuição dos níveis de AngII, uma vez que é um
produto da degradação deste octapeptídeo; e 2) através dos seus efeitos compensatórios
e contrários aos da AngII, mediados pela sua ligação ao receptor Mas.
Relativamente aos efeitos cardíacos da Ang1-7, este heptapeptídeo, actuando nos
cardiomiócitos e nos fibroblastos, modula a remodelagem cardíaca através dos seus
efeitos anti-proliferativos e anti-hipertróficos23,24
. Num modelo knockout para a eca2 em
ratinho, Crackower et al observaram uma diminuição marcada da contractilidade
cardíaca, sem qualquer efeito na hipertrofia, dilatação, fibrose ou deposição de
colagénio cardíacas e sem aumento da tensão arterial25
. Outros autores, utilizando uma
estirpe diferente de ratinhos knockout para a eca2, não verificaram alterações estruturais
ou funcionais cardíacas, mas sim um aumento ligeiro da tensão arterial em condições
basais e, sobretudo, uma resposta hipertrófica aumentada à AngII23
. Por outro lado, a
sobre-expressão da ECA2 tem sido associada a episódios de taquicardia e fibrilhação
ventriculares, mas os seus efeitos na performance miocárdica são ainda
desconhecidos26
.
O papel da Ang1-7 na modulação aguda da função miocárdica permanecia ainda
por esclarecer. Pela primeira vez, com este trabalho, observámos que, neste modelo de
músculo papilar isolado do ventrículo direito de coelho, a adição de concentrações
crescentes de Ang1-7 induz um efeito inotrópico negativo ligeiro, mas significativo,
sem alteração dos parâmetros do relaxamento.
A Ang1-7 pode ligar-se a vários receptores com diferentes afinidades. Liga-se
aos receptores AT1, mas com uma baixa afinidade e de modo não específico,
aparentemente sem consequências fisiológicas8,27
. Pode também ligar-se aos receptores
AT2, com baixa afinidade, sendo algumas das suas acções abolidas com antagonismo
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
16
destes receptores27
. No entanto, liga-se com alta afinidade e especificidade a um
receptor recentemente descrito, o receptor Mas, sendo a maior parte dos seus efeitos
abolidos na presença de A-779, um antagonista deste receptor. O receptor Mas parece
assim ser o receptor específico da Ang1-7, sendo responsável pelas acções fisiológicas
deste peptídeo10
. De facto, no presente trabalho não observámos alterações
significativas nos efeitos miocárdicos agudos da Ang1-7 após o antagonismo dos
receptores AT1 ou AT2 com ZD-7155 ou PD-123,319, respectivamente. No entanto, o
seu efeito inotrópico negativo foi inibido na presença de um antagonista do receptor
Mas, o A-779, pelo que, em consonância com trabalhos prévios, também este efeito da
Ang1-7 parece ser dependente da activação do receptor Mas.
Por outro lado, no que diz respeito ao papel do endotélio nas acções fisiológicas
da Ang1-7, o efeito vasodilatador regional e sistémico da Ang1-728
está dependente da
libertação de vários factores endoteliais, como a bradicinina, o factor hiperpolarizante
derivado do endotélio e o NO7,28,29
. Assim, o endotélio vascular parece não só estar
envolvido na síntese da Ang1-7, mas é também um alvo funcional muito importante
deste peptídeo. Neste trabalho, procurámos clarificar os mecanismos subjacentes ao
efeito inotrópico negativo observado e verificámos que, à semelhança dos estudos
anteriores referentes às estruturas vasculares, os efeitos miocárdicos deste heptapeptídeo
estão dependentes da integridade do endotélio endocárdico, uma vez que foram abolidos
após a destruição desta camada. Estes efeitos foram também atenuados na presença de
um antagonista da síntase do NO, pelo que o NO pode estar envolvido na modulação
endotelial do efeito inotrópico negativo descrito. Estes resultados estão de acordo com
estudos prévios que demonstram que a Ang1-7, através da sua ligação ao receptor Mas,
pode estimular a síntase do NO endotelial, por vias dependentes do Akt30
. Tendo em
conta que os efeitos descritos são influenciados pelo endotélio endocárdico, poderão
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
17
estar perturbados em situações associadas a disfunção endotelial, como a insuficiência
cardíaca ou a isquemia miocárdica.
No que diz respeito ao papel da Ang1-7 na isquemia-reperfusão, esta parece
proteger a função miocárdica neste contexto e atenuar o desenvolvimento da
insuficiência cardíaca pós-enfarte do miocárdio, sobretudo devido aos seus efeitos
contra-reguladores do eixo AngII/AT1. O grupo de Almeida et al verificou que, num
modelo de isquemia-reperfusão em coração isolado de rato, uma concentração baixa de
Ang1-7 diminui a incidência e a duração de arritmias associadas à isquemia-
reperfusão31
. Além disso, o enfarte do miocárdio resulta no aumento da expressão de
ECA2 cardíaca no rato e no ser humano13
e estudos em modelos animais têm
demonstrado um aumento da expressão de ECA2 e do seu produto major, a Ang1-7, nos
cardiomiócitos ventriculares à volta da área de enfarte13,32
. Isto sugere que o eixo
ECA2/Ang1-7 poderá actuar como um mecanismo contra-regulador dos efeitos
adversos do eixo ECA/AngII, modulando a resposta à agressão e a remodelagem
cardíaca pós-enfarte13
. Por outro lado, a infusão crónica de Ang1-7 no período pós-
enfarte do miocárdio parece atenuar o posterior desenvolvimento de insuficiência
cardíaca, melhorando a função endotelial, a perfusão coronária e a função cardíaca no
rato14
.
Os resultados descritos no presente trabalho vêm assim reforçar o papel
cardioprotector da Ang1-7 em situações de isquemia-reperfusão. Apesar de não termos
observado uma diferença significativa na performance basal pós-reoxigenação dos
músculos papilares expostos à Ang1-7, o pré-tratamento com este peptídeo permitiu
uma melhor resposta inotrópica e lusitrópica à isoprenalina, ressaltando o potencial
efeito benéfico deste heptapeptídeo na disfunção contráctil associada à isquemia. A
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
18
resposta à estimulação beta-adrenérgica tem sido extensamente utilizada na literatura
como marcador da reserva contráctil miocárdica. Está diminuída em vários contextos
patológicos, como a hipertrofia e a insuficiência cardíaca18,33,34
, sendo um dos
marcadores mais precoces de disfunção contráctil nestas patologias18,34
. Nos estadios
iniciais, compensados, da hipertrofia cardíaca, a função sistólica basal pode estar normal
ou mesmo superior ao normal, mas verifica-se uma redução da tolerância ao exercício35
.
A dessensibilização da resposta beta-adrenérgica indica assim uma diminuição da
reserva contráctil com incapacidade de resposta ao stress, apesar da função em repouso
poder estar preservada18,35
. Deste modo, o aumento da resposta à estimulação com
isoprenalina induzida pela Ang1-7 neste trabalho sublinha o papel da Ang1-7 na
modulação da função miocárdica, através da melhoria da reserva contráctil muscular
pós-isquémica.
A inibição farmacológica do SRA com IECAs ou ARAs é actualmente uma
abordagem terapêutica chave nas doenças cardiovasculares, como a hipertensão arterial,
a insuficiência cardíaca e a remodelagem cardíaca pós-enfarte do miocárdio2. Os seus
mecanismos de acção são complexos mas, tendo em conta as vias de síntese e
degradação da Ang1-7, parte dos seus efeitos poderão ser mediados por este
heptapeptídeo36
. Os níveis plasmáticos de Ang1-7 estão aumentados durante o
tratamento crónico com IECAs e ARAs, devido à inibição da sua degradação ou ao
aumento da disponibilidade de AngII para conversão em Ang1-7, respectivamente36,37
.
Além disso, parte dos efeitos dos ARAs e dos IECAs pode ser inibida com a utilização
de A-779, um antagonista do receptor Mas38,39
. Tendo em conta que o antagonismo do
SRA aumenta os níveis de Ang1-7 e parece potenciar os seus efeitos, a melhoria da
reserva contráctil pós-isquémica induzida pela Ang1-7 poderá constituir um mecanismo
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
19
de acção dos IECAs e dos ARAs, fármacos associados a uma redução muito
significativa da morbimortalidade no pós-enfarte do miocárdio.
Em conclusão, este trabalho reforça o papel do SRA na modulação aguda da
função miocárdica, sublinhando o efeito contra-regulador do eixo Ang1-7/Mas a nível
cardíaco. Uma vez que o efeito inotrópico negativo descrito é influenciado pelo
endotélio endocárdico, poderá estar perturbado em situações associadas a disfunção
endotelial, como a insuficiência cardíaca e a isquemia do miocárdio. Por outro lado, em
condições de hipóxia-reoxigenação, o pré-tratamento com Ang1-7 permite uma melhor
resposta inotrópica e lusitrópica à isoprenalina, corroborando o potencial efeito benéfico
deste heptapeptídeo na disfunção contráctil associada à isquemia. A descoberta e
subsequente estudo do eixo ECA2/Ang1-7/Mas tem aberto novas opções que poderão
constituir armas terapêuticas futuras na abordagem das patologias cardiovasculares.
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
20
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Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
25
FIGURAS
Figura1. Nova visão do sistema renina-angiotensina: balanço entre o eixo
ECA/AngII/Receptor AT1 e o eixo ECA2/Ang1-7/Receptor Mas. NEP: endopeptidase
neutra; PEP: prolilendopeptidase.
Figura 2. Desenho experimental do protocolo de isquemia-reperfusão.
Figura 3. Efeitos de concentrações crescentes de angiotensina 1-7 (Ang1-7) na tensão
activa, dT/dtmax e dT/dtmin em condições basais, na presença de um antagonista dos
receptores AT1 (ZD-7155), de um antagonista dos receptores AT2 (PD-123,319) ou de
um antagonista do receptor Mas (A-779). Os dados são apresentados como média ± erro
padrão. P<0,05: α vs basal, β vs 10-9
M Ang1-7, γ vs 10-8
M Ang1-7, δ vs 10-7
M Ang1-7,
τ vs 10-6
M Ang1-7.
Figura 4. Efeitos de concentrações crescentes de angiotensina 1-7 (Ang1-7) na tensão
activa, dT/dtmax e dT/dtmin em condições basais, após remoção selectiva do endotélio
endocárdico (sem EE) e na presença de um inibidor da síntase do NO (L-NA). Os dados
são apresentados como média±erro padrão. P<0,05: α vs basal, β vs 10-9
M Ang1-7, γ vs
10-8
M Ang1-7, δ vs 10-7
M Ang1-7, τ vs 10-6
M Ang1-7.
Figura 5. Efeito da adição de concentrações crescentes de isoprenalina na tensão activa,
dT/dtmax e dT/dtmin após a lesão de isquemia-reperfusão no grupo controlo e no grupo
angiotensina 1-7 (Ang1-7). Os dados são apresentados como média±erro padrão.
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
26
P<0,05: α vs basal, β vs 10-8
M isoprenalina, γ vs 10-7
M isoprenalina, * vs grupo
controlo.
Figura 6. Efeitos fisiológicos da angiotensina 1-7. A figura foi desenhada utilizando o
Servier Medical Art.
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
27
Figura 1.
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
28
Figura 2.
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
29
Figura 3.
Tensão Activa
[Ang 1-7], log M
Basal -9 -8 -7 -6 -5
%
basal
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15 Ang 1-7
Ang 1-7 com ZD-7155
Ang 1-7 com A-779
Ang 1-7 com PD-123,319
dT/dtmax
[Ang 1-7], log M
Basal -9 -8 -7 -6 -5
%
basal
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15 Ang 1-7
Ang 1-7 com ZD-7155
Ang 1-7 com A-779
Ang 1-7 com PD-123,319
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
30
dT/dtmin
[Ang 1-7], log M
Basal -9 -8 -7 -6 -5
%
basal
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15 Ang 1-7
Ang 1-7 com ZD-7155
Ang 1-7 com A-779
Ang 1-7 com PD-123,319
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
31
Figura 4.
Basal -9 -8 -7 -6 -5
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15Ang 1-7
Ang 1-7 sem EE
Ang 1-7 com L-NA
[Ang 1-7], log M
%
basal
Tensão Activa
Basal -9 -8 -7 -6 -5
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
Ang 1-7
Ang 1-7 sem EE
Ang 1-7 com L-NA
dT/dt max
[Ang 1-7], log M
%
ba
sa
l
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
32
Basal -9 -8 -7 -6 -5
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20Ang 1-7
Ang 1-7 sem EE
Ang 1-7 com L-NA
dT/dtmin
%
Ba
sa
l
[Ang 1-7], log M
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
33
Figura 5.
Tensão Activa
Isoprenalina, log MBasal -8 -7 -6
b
asal
0
200
400
600
Ang 1-7
Controlo
dT/dtmax
Isoprenalina, log M
Basal -8 -7 -6
b
as
al
0
200
400
600 Ang 1-7
Controlo
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
34
dT/dt
min
Isoprenalina, log MBasal -8 -7 -6
b
asal
0
200
400
600
Ang 1-7
Controlo
Efeitos miocárdicos agudos da angiotensina 1-7
35
Figura 6.
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