disciplina de biologia molecular (60 h) prof. leonardo crema

Disciplina de Biologia Molecular(60 h)

Prof. Leonardo Crema

Ementa

• EMENTA: 1) Mecanismos moleculares da replicação do

DNA, transcrição e tradução gênica. Características do código genético. Tipos de mutações. Polimorfismos. Organização do genoma. Técnicas de biologia molecular. Bioinformática. Genética forense. Clonagem. Transgenia. Tipos de células tronco. Prática Profissional Integrada.

Bibliografia Básica

• ALBERTS, B.; et al. Biologia molecular da célula. 5 ed. Porto Alegre: Artmed. 2010.

• GRIFFITHS, A. J. F.; et al. Introdução à genética. 7 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 2002.

• SNUSTAD, P. & SIMMONS, M. J. Fundamentos de Genética. 2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.

Bibliografia Básica• ALBERTS, B.; ANDRADE, A. E. Fundamentos da biologia

celular. 3 ed. Porto Alegre: Artmed, 2011.• COOPER, G. M.; HAUSMAN, R. E. A célula: uma abordagem

molecular. 3 ed. Porto Alegre: Artmed. 2009.• JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Biologia celular e molecular.

8 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 332 p. 2011.• RAVEN, P. H.; EVERT, R. F. Biologia Vegetal. 7 ed. Rio de

Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.• SADAVA, D.; HELLER, C.; ORIANS, G.H.; PURVES, W.K.; HILLIS,

D.M. Vida: A Ciência da Biologia - Célula e Hereditariedade. V. 1, 8 ed. Porto Alegre: Artmed. 2009.

Introdução à Biologia Molecular

Prof. Leonardo Crema

ORGANISMO

CÉLULA

NÚCLEO

CROMOSSOMOS(DNA+PROTEÍNAS)

- Informação das proteínas e RNAs que serão sintetizadas pelas células do organismo ao longo da sua vida.-Capacidade de se auto- duplicar para originar outras células.

DNADNA

NOS SERES HUMANOSNOS SERES HUMANOS

•1953: Watson and Crick

Estrutura do DNA

Dogma Central da

Biologia Molecular

• 1961 – BRENNER, JACOB e MESELSON

• mRNA é a molécula que leva informação do DNA no núcleo para a maquinaria de produção de proteínas no citoplasma

1966 – NIRENBERG, KHORANA e OCHOA

Sequências sucessivas de três nucleotídeos do DNA (codon) determinam a sequência de aminoácidos de uma proteína

O CÓDIGO GENÉTICO É DESVENDADO!!!

DNA

1. Regulação transcricional

mRNA 2. Regulação no processamento do RNA primário

3. Regulação no transporte do mRNA para o citoplasma

RETÍCULO ENDOPLASMÁTICORUGOSO

4. Regulação da síntese proteíca

Proteínasintetizada

5. Regulação pós-síntese

A CÉLULA

- DIFERENCIAÇÃO- CRESCIMENTO- FUNÇÃO CELULAR- RESPOSTA AO AMBIENTE

DNACromossoma

Gene

Promotor IntronExon

Núcleo

DNA

ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA)

Contém toda a informação genética de um organismo

Esta informação está arranjada em unidades hoje conhecidas como genes

ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

As moléculas de DNA e RNA são compostas por quatro diferentes nucleotídeos:

• Adenina, Guanina e Citosina – comum para DNA e RNA

• Timina – encontrada somente no DNA

• Uracila – encontrada somente no RNA

ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Todos os nucleotídeos apresentam uma estrutura em comum:

radical fosfato

pentose

ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

As bases nitrogenadas podem ser divididas em dois grupos de acordo com sua estrutura:

ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

O grupo hidroxil ligado ao carbono 3 da pentose de um nucleotídeo forma uma ligação fosfodiéster com o fosfato do outro nucleotídeo

DNA

• Duas fitas de polinucleotídeos associadas formando uma estrutura de dupla hélice onde as pentoses e os radicais fosfato compõe a fita e as bases projetam-se para o interior da mesma

• As fitas mantêm-se unidas através da formação de pontes de hidrogênio entre as bases o que contribui para a estabilidade da dupla hélice

. Adenina (A) pareia com Timina (T) através de 2 pontes de hidrogênio

. Guanina (G) pareia com Citosina (C) através de 3 pontes de hidrogênio

DNA

As fitas do DNA estão dispostas em

direções opostas

Antiparalelismo

Cada base de uma fita é pareada com a base complementar da outra fita

Complementariedade

Durante a replicação do DNA as duas fitas velhas

ou mães servem de molde para cada fita

nova ou filha complementar, que

está sendo sintetizada.

Fita nova

Fita velha

Complementariedade

Fatores que estabilizam a dupla hélice:

• interações hidrofóbicas• forças de van der Walls• pontes de hidrogênio

• interações iônicas

Entre as bases nitrogenadas

Entre os grupos fosfato do DNA e os cátions (Mg2+) presentes na solução fisiológica

A Dupla Hélice

Sulco menor

Sulco maior

A dupla hélice apresenta dois tipos de sulcos aos quais se ligam as

proteínas da cromatina

A Dupla Hélice

Proteínas:níveis de complexidade estrutural

O Empacotamento do DNA:a estrutura terciária do DNA

DNA em procariontes: DNA circular nas formas não-super-helicoidal (esquerda) e super-helicoidal (direita)

A forma predominante de torção da espiral do DNA é para a direita ou sentido horário

A Dupla Hélice

Propriedades Químicas e Físicas do DNA

REPLICAÇÃO DO DNA

Conservativa ou Semiconservativa?

Unidirecional ou Bidirecional?

REPLICAÇÃO

SEMICONSERVATIVA

Evidência baseada em um experimento clássico de Meselson-Stahl em 1958

• Células de E. coli foram inicialmente colocadas em um meio para crescimento contendo sais de amônia preparados com 15N (nitrogênio pesado – “heavy”) até todo o DNA celular conter o isótopo.

• As células foram, então, transferidas para um meio contendo 14N (nitrogênio leve – “light”).

• As amostras foram analisadas com gradiente de densidade que separa as duplas H-H, L-L e H-L em bandas distintas.

•The Meselson-Stahl experiment

A replicação é semi-conservativa

ORIGEM DA REPLICAÇÃO

Experimento com SV40 (Simian Virus)

• DNA viral de células infectadas com SV40 foi cortado com a enzima de restrição EcoRI, que reconhece um sítio único.

• A partir de um “ponto” vai se formando uma bolha chamada bolha de replicação comprovando a existência de um ponto de origem da replicação

Características da origem de replicação:

. estrutura repetitiva

. seqüências ricas em AT

ORIGEM DA REPLICAÇÃO

ORIGEM Sítio de restrição EcoRI

Cromossomo viral circular

EcoRI

Bolha de replicação

ORIGEM DA REPLICAÇÃO

Biologia – Campbell & Cols.

Procariontes vs Eucariontes

Síntese de DNA em Eucariontes: As “Bolhas de Replicação”

• Nos eucariontes, a replicação requer “múltiplas origens”, devido ao tamanho de seu genoma. A replicação é bidirecional e, em ambas as fitas, simultânea.

• Este processo gera “bolhas de replicação”.

Região Gênica É a porção que codifica para

um produto final, que pode ser uma cadeia polipeptídica ou

um RNA

O DNA é formado por 2 regiões:

Gênicas Intergênicas

Região IntergênicaÉ a porção regulatória, que

sinaliza o início ou o final de um gene, que influencia a

transcrição gênica, ou que é o ponto de início para a

replicação do DNA

Intergênicas Gênicas

Regiões Codificadoras e Não-Codificadoras do DNA

PROCESSO DE REPLICAÇÃO

Os mecanismos celulares responsáveis pela replicação do DNA foram descobertos primeiramente em bactérias.

A replicação em eucariotos ocorre através de proteínas análogas e com processos semelhantes à replicação do DNA de E. coli

PRINCIPAIS ENZIMAS ENVOLVIDAS (SISTEMA DE REPLICAÇÃO DO DNA)

1. DNA Polimerases2. Endonucleases3. Helicases 4. Topoisomerases5. Primases6. Telomerases

DNA POLIMERASE

• São incapazes de quebrar as pontes de hidrogênio que ligam as duas fitas do DNA

• Só alongam uma fita de DNA/RNA pré-existente

• Catalisam a adição de um nucleotídeo no radical hidroxil da extremidade 3’ da cadeia que está se formando. Desta forma, as fitas só podem crescer no sentido 5’ 3’

Biologia – Campbell & Cols.

DNA Polimerases

• principais enzimas envolvidas no processo; responsáveis pela adição de nucleotídeos e reparo

• requerem um modelo e um primer (segmento de RNA sintetizado pela primase) complementares para início – alongamento

• 3 tipos principais : I, II e III; existem pelo menos 11 I : importante no sistema de reparo III: principal e mais complexa (mais de 10 subunidades)

Adição de nucleotídeos

1

2

3

FORQUILHA DE

REPLICAÇÃO

• Fita contínua“leading”

FORQUILHA DE

REPLICAÇÃO

• Fita descontínua I“Lagging”

FORQUILHA DE

REPLICAÇÃO

• Fita descontínua II• “Lagging”

OUTRAS ENZIMAS ENVOLVIDAS NO PROCESSO DE REPLICAÇÃO

HELICASES – constituem uma classe de enzimas que podem se mover ao longo da fita dupla de DNA utilizando a energia da hidrólise de ATP para separar as duas fitas da molécula.

SSB (“single-strand-binding”- proteínas de ligação à fita simples) – ligam-se a cada uma das fitas impedindo o reanelamento das mesmas.

PRIMASE – RNA polimerase que sintetiza pequenas moléculas de RNA utilizadas como iniciadores durante o processo de replicação do DNA.

TOPOISOMERASES – Responsáveis por aliviar a torção na parte da fita que não está sendo replicada.

PROCESSO DE REPLICAÇÃO

O movimento da forquilha de replicação revela uma fita molde no sentido 3’ 5’ e outra no sentido oposto 5’ 3’

Desta forma, as fitas novas são sintetizadas em sentidos opostos

FITA “LEADING” – crescimento segue a direção do movimento da forquilha de replicação

FITA “LAGGING” – crescimento no sentido oposto ao movimento da forquilha de replicação

PROCESSO DE REPLICAÇÃO

FITA “LEADING” – sintetizada continuadamente a partir de um iniciador na fita molde 3’ 5’

FITA “LAGGING” – sintetizada descontinuadamente a partir de múltiplos iniciadores

• Sítios descobertos no molde da fita “lagging” são copiados em pequenos iniciadores de RNA pela primase.

• Cada iniciador é alongado pela DNA polimerase resultando na formação dos FRAGMENTOS DE OKAZAKI.

•DNA polimeraseI remove o primer do RNA do fragmento adjacente e preenche os “gaps” entre os fragmentos que, então, são unidos pela DNA ligase.

PROCESSO DE REPLICAÇÃO

PROCESSO DE REPLICAÇÃO

A síntese de DNA é feita na direção 5´ 3´ e é semidescontínua

ENCURTAMENTO DAS EXTREMIDADES DE

MOLÉCULAS LINEARES DE DNA

ENCURTAMENTO DAS EXTREMIDADES DE

MOLÉCULAS LINEARES DE DNA

TELOMERASE

• Os cromossomos de eucariotos são lineares e apresentam seqüências repetitivas em suas extremidades denominadas telômeros

• A síntese da fita “leading” continua até o término da fita molde de DNA, no entanto, no telômero a extremidade feita pela primase na fita “lagging” não é digerida.

• Como o iniciador é instável, ele se degrada com o tempo diminuindo, assim, o tamanho do cromossomo.

• Telomerase age evitando a perda do fim do cromossomo.

TELOMERASE

REGULAÇÃO

-única fase regulada da replicação, de forma que só ocorra uma vez por ciclo celular ;

-afetada pela metilação de DNA

-DAM metilase na (5´) GATC sobre a fita parental

Gene

RNA polimerase

hnRNA

mRNA

Citoplasma

Transcrição

Processamento

Núcleo

Tradução

proteína

O RNA ou ARN

• O açúcar é uma Ribose;• É formado, geralmente, por

uma fita simples que pode enrolar-se;

• Não existe a base pirimídica Timina e no seu lugar se encontra a base Uracila.

• Os pareamentos seguem a ordem A-U e G-C).

O Ácido Ribonucléico é um polinucleotídeo que difere do DNA em três aspectos básicos:

A-UU-AG-CC-G

A-TT-AG-CC-G

DNA

RNA

RNA - É o ácido ribonucléico; possui a função de síntese protéica. O RNA é encontrado no núcleo principalmente no nucléolo, e no citoplasma (ribossomos). Composição química - é formada por ácido fosfórico, pentose (ribose) e pelas bases nitrogenadas ( A, G, C e uracila (U )).

A molécula de DNA é responsável pela formação do RNA. O RNA apresenta-se constituído por um único filamento de nucleotídeo, cuja seqüência de bases é determinada a partir de um molde de DNA.

1-RNA mensageiro (RNAm) - É formando no núcleo tendo como molde uma das fitas de uma molécula de DNA. A produção de um RNAm, cujas bases são complementares as bases de uma das hélices de uma molécula de DNA, recebe o nome de transcrição. Este fenômeno pode ser definido de forma mais simples como sendo a passagem das bases de uma linguagem do DNA para a linguagem de RNAm. EX:

T - A - C - T - G - A - DNA 3 bases correspondem a um aa, e um ! ! ! ! ! ! conjunto de bases uma proteína.

A - U - GA - U - G - A - C - U RNAmCódon início códon proteínaaa A aa B

Tipos de RNA

Síntese Protéica

• A enzima RNA-polimerase abre a dupla hélice do DNA e inicia a produção de uma molécula de RNAm, no sentido 5’ 3’.

• Os nucleotídeos são ligados respeitando a ordem A-U, G-C.

• Ao final da transcrição a RNA-polimerase se desliga do DNA, a molécula de RNAm está formada e segue para o citoplasma onde será traduzida.

A TranscriçãoA Transcrição

Observe a complementação de uma fita de DNA para RNA

A T A C A T G G G C T A G A A

UU U U U UGG C C CC AAA

Sempre com a adenina se ligando a uracila e a guanina se ligando a citosina.

DNA

RNARNAm

2-RNA transportador (RNAt) - é produzido nos cromossomos a partir de DNA especiais. É uma molécula cadeia curta, (é o menor RNA) que transporta os aa que estão dispersos no citoplasma até os ribossomos. O RNAt tem formato de “folhas de trevo” e contém outros tipos de bases, além das comumente encontradas nos outros RNAs. Cada RNAt é capaz de reconhecer um determinado aa determinado códon, no RNAm. Todo RNAt tem um filamento livre de sua molécula composta pela seguinte seqüência de bases: ACC. É nesse local que ocorre a associação com o aa. Em cada região da molécula existe uma seqüência de 3 bases denominadas anticódon, que reconhece a posição do aa no RNAm.

Tipos RNAs (2/2)

RNA TRANSPORTADORRNA TRANSPORTADOR

3-RNA ribossômico (RNAr) é o RNA que ocorre em maior quantidade nas células. Esse RNA é encontrado no nucléolo, onde é produzido, e no citoplasma, associado às proteínas, formando os ribossomos.

Tipos de RNA• RNAm O RNA mensageiro é formado no núcleo e contém a

“mensagem” - o código transcrito a partir do DNA - para a síntese das proteínas. Cada conjunto de três nucleotídeos no RNAm é chamado de CÓDON.

• RNAt O RNA transportador está presente no citoplasma e é responsável pelo transporte dos aminoácidos até os ribossomos para a síntese protéica. No RNAt existe uma seqüência de nucleotídeos correspondente ao códon chamada de ANTI-CÓDON.

• RNAr O RNA ribossômico ou ribossomal faz parte da estrutura dos ribossomos e participa do processo de tradução dos códons para construção das proteínas.

SÍNTESE DE PROTEÍNAS:

A síntese começa quando ocorre a transcrição das bases de DNA para RNA. Essa transcrição é o código genético. O RNAm formado no núcleo passa para o citoplasma, deslocando-se para os ribossomos. Os RNAt que estão no citoplasma, através de suas moléculas, unem-se ao aa livre levando até o ribossomo. Lá o anticódon do RNAt reconhece no códon do RNAm o aa, que será codificado. Assim, ocorrendo sucessivamente, até dar origem a uma proteína.

Núcleo

DNA RNAm RNAm Transcrição Proteínas TraduçãoNúcleoDNA-RNAm

A síntese completa de uma proteína leva de 20 a 60 seg, e o mesmoRNAm pode ser traduzido por vários ribossomos, que mantêm uma Distância entre si de aproximadamente 80 nucleotídeos.

Os Íntrons e os Éxons

Nos eucariontes, o RNA transcrito pelo gene é normalmente chamado de pré-RNA, no sentido de que ele ainda não está pronto para ser traduzido, produzindo proteínas. O pré-RNA seria, assim uma versão ainda não acabada do RNAm, que precisa ser primeiro processado no núcleo para, em seguida, migrar ao citoplasma.

A

Éxon Íntron Éxon ÉxonÍntron Íntron

Os Íntrons são retirados e os éxons são soldados um ao outro

Síntese Protéica• O RNAm transcrito no núcleo

chega ao citoplasma e se liga a um ou mais ribossomos.

• O ribossomo “lê” o primeiro códon e um RNAt com o anticódon correspondente transporta um aminoácido e se liga ao códon.

• O ribossomo se desloca, no sentido 5’3’ e lê o próximo códon.

• Os aminoácidos são unidos por ligações peptídicas.

• Ao final da tradução o polipeptídeo se desliga e se constituí na proteína.

A TraduçãoA Tradução

O ribossomo acomoda dois tRNAs carregados

4. Terminação

Dogma Central da Biologia Molecular

• Foi estabelecido em 1956 por Francis Crick.• Postulava que o sentido da construção das moléculas é sempre de DNA à

Proteína – fluxo unidirecional da informação.• O DNA é o “molde” para formar DNA (replicação) e RNA (transcrição). Este

por sua vez é o “molde” para formação das proteínas (tradução).• Hoje se sabe que, em alguns vírus, o RNA pode replicar-se e, em outros, o

RNA pode produzir DNA (transcrição reversa) utilizando o maquinário genético da célula-hospedeira.

• Porém, não é possível se sintetizar ácidos nucléicos a partir de proteínas.• Os novos conhecimentos permitiram que se ampliasse o dogma central

sem contudo perder a unidirecionalidade, ou seja, de ácido nucléico à proteína.

• Projeto Proteômico.

Diferenças entre RNA e DNAO RNA é uma molécula intermediária na síntese de proteínas, ela faz a intermediação entre o DNA e as proteínas.

Ele é formado por uma cadeia de ribonucleotídeos, que, por sua vez, são formados por um grupo fosfato, um açucar (ribose), e uma base nitrogenada (veja abaixo).

As principais diferenças entre o RNA e o DNA são sutis, mas fazem com que o último seja mais estável do que o primeiro. O RNA é formado por uma fita simples, o açúcar de seu esqueleto é a ribose e uma de suas bases pirimídicas (de anel simples) é diferente da do DNA (uracila ao invés de timina), além disso o açucar do RNA é a ribose invés da desoxirribose do DNA.

DNA

RNA

Os processos de síntese de proteínas na célula são controlados pelo metabolismo de controle.As duas principais personagens do metabolismo de controle são as moléculas de DNA e RNA. O DNA (ácido desoxirribonucléico) é o patrimônio genético, que contém as instruções para a síntese de todas as proteínas que a célula é capaz de realizar. O RNA atua como mensageiro (RNA mensageiro) entre o DNA e o ribossomo, local de síntese de proteínas.

DNA (ácido desoxirribonucléico) RNA (ácido ribonucléico)

Se localiza somente no núcleo Se localiza no núcleo e no citoplasma

Apresenta forma de dupla hélice com duas fitas

Apresenta apenas uma fita

É formado com a pentose (açúcar) desoxirribose

É formado com a pentose ribose

Bases nitrogenadas participantes: A, T, C, G

Bases nitrogenadas participantes: A, U, C, G

DNA e RNA

Código Genético

Codon que dá origem à síntese dequalquer proteína

Código Genético – correspondência entre cada tripleto (codon) de RNA e cada um dos 20 aminoácidos habituais das proteínas (desde 1964)No código genético há 64 trincas possíveis, apenas 61 delas correspondem a aminoácidos. As tres trincas restantes são usadas como pontuação; elas dizem à célula o ponto em que termina a codificação de cada proteína.

Genoma Conjunto de moléculas de DNA

Oração do DNA

Creio no DNA todo poderosocriador de todos os seres vivos,creio no RNA,seu único filho,que foi concebido por ordem a graça do DNA polimerase.Nasceu como transcrito primáriopadeceu sobre o poder das nucleases, metilases e poliadenilases.Foi processa, modificado e transportado.Desceu do citoplasma e em poucos segundos foi traduzido à proteína.Subiu pelo retículo endoplasmático e o complexo de Golgi E está ancorado à direita de uma proteína GNa membrana plasmáticaDe onde há de vir a controlar a transdução de sinaisEm células normais e apoptóticasCreio na Biologia MolecularNa terapia gênica e na biotecnologiaNo seqüenciamento do genoma humanoNa correção de mutaçõesNa clonagem da DollyNa vida eterna.Amém